Exercício extra 02 A enzima COMT (catecol-O

Exercício extra 02
A enzima COMT (catecol-O-metiltransferase) atua metilando o 4-hidroxi-estradiol, um metabólito
carcinogênico derivado da metabolização do estrogênio. Esta reação química é uma importante etapa
na detoxificação do 4-hidroxi-estradiol (um catecol), transformando-o em 4-metoxi-estradiol (um
guaiacol) como esquematizado na reação abaixo.
Guaiacol
Sabendo que mulheres que desenvolvem câncer de mama (do subtipo dependente de estrogênio)
frequentemente apresentam variantes desta enzima com atividade reduzida, uma industria
farmacêutica resolveu desenvolver um medicamento para mulheres contendo esta enzima com o
objetivo de ajudar a prevenir o surgimento ou a reincidência do câncer de mama. Para purificar
grandes quantidades desta enzima, os investigadores envolvidos no desenvolvimento deste
medicamento, obtiveram orgãos bovinos que sabidamente expressam a COMT. O primeiro passo que
antecedeu a purificação envolveu o preparo de lisados celulares de cada orgão. Estes lisados foram
submetidos aos dois ensaios descritos abaixo. Considerando os resultados experimentais abaixo,
calcule (justificando seu raciocínio) para cada lisado:
a) a concentração de proteína (mg/mL).
b) a concentração enzimática (U/mL).
c) a atividade enzimática específica (U/mg de tecido e U/mg de proteína).
Com base nos cálculos acima, qual é o melhor orgão a ser utilizado para purificação da COMT?
Justifique.
ETAPAS EXPERIMENTAIS
Preparo do lisado
orgãos
fígado
Glândulas mamárias
(GM)
cérebro
Rins
Tabela 1
Quantidade de
tecido usada
20g
Volume do lisado
obtido
25ml
12g
16ml
17g
6g
23ml
9ml
Ensaio de Bradford:
O lisado original de cada órgão foi diluído 100X e usado segundo o protocolo da tabela abaixo
(Tabela 2). Após 5 minutos de incubação foi lida a absorbância a 595nm e os resultados foram
também registrados na Tabela 2.
1
tubos
L100X
(µL)
branco
fígado
GM
cérebro
rins
10
20
30
40
Tabela 2
reagente de
H2O
Bradford
(µL)
(mL)
100
1,0
90
1,0
70
1,0
70
1,0
60
1,0
A595
0,003
0,382
0,686
0,838
0,813
Para este experimento, a curva padrão com albumina forneceu o gráfico 1.
Gráfico 1
Absorbância a 595nm
Curva Padrão da Albumina
1.4
f(x) = 0.08x + 0.06
R² = 0.98
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
[Albumina] ug
Reação enzimática colorimétrica
Para medir a atividade da COMT, foi utilizado um ensaio colorimétrico usando-se os dois substratos
da COMT: o doador de grupos metil s-adenosil-L-metionina (SAM) e um substrato artificial contendo
um grupo catecol, que passa a apresentar um pico de absorção a 320nm quando metilado. Os
lisados originais de cada órgão foram diluídos 20X e usados para monitorar a atividade enzimática
segundo o protocolo da tabela abaixo (Tabela 3). Após diferentes tempos de incubação a 37°C, a
absorbância a 320nm das amostras foi medida e colocada na tabela 3.
Tabela 3
Volum Volume
e (ml)
(ml)
tubo Lisado
1
0,2
2
0,2
3
0,2
4
0,2
SAM
0,1
0,1
0,1
0,1
Volume
(ml)
Substrat
o
artificial
0,1
0,1
0,1
0,1
Incubação
a 37°C
fígado
Tempo
(min)
5
10
15
20
A320
0,11
0,28
0,4
0,51
Glândulas
cérebro mamárias
A320
0,04
0,09
0,15
0,19
A320
0,06
0,12
0,2
0,25
rins
A320
0,08
0,15
0,21
0,32
2
A curva padrão obtida para relacionar a quantidade de substrato artificial metilado da COMT (produto)
com a Absorbância a 320 nm é apresentada no gráfico 2.
Gráfico 2
Curva Padrão da atividade da COMT
0.7
Absorbância a 320nm
0.6
f(x) = 0.01x - 0.01
R² = 1
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
5
10 15
20
25
30
35
40
45
50
55
micromol de produto
3