Regulação e Diferencia - Biologia Molecular e Genética

Regulação e Diferenciação
2010/2011
Objectivos gerais da disciplina
O programa da disciplina de “Regulação e Diferenciação” engloba dois temas gerais: os
principais pontos de controlo e mecanismos operam na regulação do ciclo celular e as bases
moleculares da diferenciação celular.
O principal objectivo desta disciplina é o de contribuir para o desenvolvimento de uma visão
global e integrada, mas simultaneamente aprofundada, de mecanismos moleculares que regulam o
ciclo celular e a diferenciação celular em determinados processos biológicos. Esta disciplina também
pretende fomentar nos alunos a pesquisa científica e desenvolver um elevado espírito crítico, sendo
pontualmente desenvolvidos ou redefinidos alguns conceitos, dogmas e paradigmas, aprendidos
anteriormente, perspectivando os conhecimentos de regulação da expressão génica, como o factor
indutor da diferenciação celular. Considerando a importância da correlação entre a experimentação e
os conceitos teóricos, sempre que possível serão discutidas estratégias experimentais relevantes e
apresentados métodos alternativos ou tecnologias recentes, utilizadas no estudo da expressão génica.
Pré-requisitos
Os alunos que vão frequentar a disciplina de “Regulação e Diferenciação”, já deverão ter
adquirido os conhecimentos moleculares e celulares básicos, em disciplinas de carácter mais
fundamental como, Bioquímica, Biologia Celular, Genética e Biologia Molecular, Engenharia
Genética, Genética de Procariotas e Genética de Eucariotas, ou disciplinas conteúdos programáticos
similares. Assim, para além de todos os conceitos relativos à expressão génica, tópicos como os da
divisão celular, células estaminais, diferenciação e desenvolvimento, comunicação celular, vias de
transdução de sinal, adesão intercelular e repro gramação molecular, abordados nestas e noutras
disciplinas, serão aqui desenvolvidos numa óptica integrativa, em articulação com processos
bio lógicos específicos de regulação génica e celular, estabelecendo comparações, tanto quanto
possível, entre bactérias e organismos mais complexos.
Programa Teórico
1. Regulação do ciclo celular
1.1
Os acontecimentos do ciclo celular eucariótico. Variações na estrutura do ciclo em
diferentes tipos celulares. Principais pontos de controlo. Descoberta das ciclinas, MPF
e SPF. Análise genética em leveduras e identificação de mutantes CDC. Estrutura do
MPF. CDC14, Wee1, CAK e lógica da regulação da entrada em mitose. Regulação por
fosforlação/desfosforilação. Diferentes complexos CDK promovem as transições G1/S
e G2/M. CDKs e ciclinas: estrutura e função. Mecanismos de activação das CDKs pelas
CAKs. Regulação das CDKs por fosforilação/desfosforilação e proteólise das ciclinas.
Via da ubiquitina e saída de mitose. APC/C. Regulação das CDKs por CKIs, Cks1 e
Ringo/Speedy. Activação mitogénica e complexos CDKs activos em cada transição do
ciclo. Sinalização mitogénica pela via Ras. Sinalização mitogénica pela via das cinases
PI3. Regulação da ultrapassagem do ponto de controlo G1/S. SPF e progressão na
fase-S. Factores de licenciamento da replicação. Irreversibilidade e proteólise (SCF e
APC/C). Entrada e saída de mitose. Transição metafase-anafase. CDC20, Cdh1 e
activação do APC/C. Principais pontos de regulação do ciclo celular. Conceito de
checkpoint. Importância da regulação negativa. Tensão e efeitos bioquímicos.
Regulação da organização do fuso mitótico. Mutantes Bub e Mad. Componentes do
SAC. Tensão, ocupação dos microtúbulos e silenciamento do checkpoint. SAC e
rearranjo dos complexos Mad2. Complexo MCC. Activação e silenciamento do SAC.
Papel da cinase aurora-B na correcção de interacções erradas entre os microtúbulos
do cinetocoro e cada pólo. Relações epistáticas dos componentes do SAC. Shugoshin,
PP2A e coesão centromérica.
1.2
Desregulação do ciclo celular e cancro. Proto -oncogenes e genes supressores de
tumores. Checkpoints que operam em G1, S e G2/M. Checkpoints de verificação de
danos no DNA. Regulação da p53. Integração da sinalização ATR/ATM com a CDC25 e
as CDKs. Regulação da dinâmica microtubular, MTOCs e cancro.
2. Bases moleculares da diferenciação celular
2.1
Os conceitos de “Regulação” e de “Diferenciação”. O início da diferenciação celular.
Diferenciação e especialização celular. Noção de compromisso e de diferenciação.
Factores moleculares intrínsecos e extrínsecos associados à diferenciação celular.
Diferenciação celular na evolução dos organismos multicelulares. A conservação dos
processos moleculares de diferenciação celular na origem da adaptação e diversidade. O
conceito de evolvabilidade, e as propriedades dos processo s reguladores e de
desenvolvimento conservados. A “teoria da variação facilitada”.
2.2
Diferenciação das células estaminais, como modelo de estudo das etapas mais precoces
da indução e especialização das células. Origem e evolução do termo “célula estaminal”.
Conceito de célula estaminal. Classificação das células estaminais de acordo com o seu
potencial de desenvolvimento. Origem das células estaminais embrionárias. Células
estaminais adultas. Potencial de diferenciação, irreversibilidade e plasticidade da
diferenciação. Conceitos de desdiferenciação e transdiferenciação. Análise molecular da
pluripotência e determinação da pluripotência das células estaminais embrionárias.
Factores envolvidos na manutenção do estado indiferenciado e na estimulação da
diferenciação das células estaminais. Regulação epigenética das células estaminais
embrionárias: propriedades gerais da cromatina e assinaturas epigénicas da cromatina;
proteínas envolvidas na marcação de histonas. Manutenção do estado de indiferenciação
e diferenciação in vitro das células estaminais embrionárias. Investigação em células
estaminais. Técnicas de reprogramação nuclear; células pluripotentes induzidas (iPS).
2.3
Divisão celular simétrica vs. assimétrica na auto-renovação das células e na geração da
diferenciação e diversidade celular. Factores que conduzem à assimetria da divisão
celular.
Consequências
da
assimetria da
divisão
celular na
expressão
génica.
Mecanismos moleculares da divisão simétrica e assimétrica em diferentes modelos de
diferenciação: zigoto de Caenorhabditis. elegans, neuroblastos de Drosophila e células
estaminais da pele dos mamíferos.
2.4
A hematopoiese como paradigma do estudo da diferenciação das células estaminais dos
mamíferos.
2.4.1
Diversificação de linhagens e mapas de linhagens. Características biológicas dos
progenitores hematopoiéticos nos pontos de ramificação. Vias moleculares de
regulação da auto-renovação, diferenciação e maturação das células do sangue. A
opção
de
diferenciação:
concentração
e
transcricionais.
Regulação
homeostática
hematopoiéticos
na
das
função
células
timing
e
da
expressão
papel
estaminais
dos
de
factores
microambientes
hematopoiéticas
(HSC,
hematopoietic stem cells). Destino das HSC na medula óssea. Moléculas que
medeiam a sinalização e as interacções de adesão entre as HSC e os seus nichos.
Estudos
da
divisão
celular
simétrica
vs.
assimétrica
na
auto-renovação
e
diferenciação das HSC.
2.4.2
A hematopoiese durante o desenvolvimento embrionário de ratinho e humano.
Fases da hematopoiese: hematopoiese primitiva e definit iva. Padrões de expressão
génica durante a hematopoiese. Controlo espacial e temporal da expressão génica
durante a diferenciação das células hematopoiéticas. Locais de hematopoiese.
Formação das células do sangue: uma origem comum ou duas fontes separadas, YS
vs. AGM. Da formação da mesoderme à diferenciação ou especificação do primeiro
precursor hematopoiético – o hemangioblasto: ponto de divergência entre as linhas
endotelial e hematopoiética durante a embriogénese. Controvérsia sobre a evidência
do hemangioblasto.
2.4.3
A eritropoiese e a expressão diferencial dos genes das hemoglobinas durante o
desenvolvimento dos mamíferos. Estrutura, função e tipos de hemoglobinas. A
família multigénica das hemoglobinas: os agrupamentos
e
dos genes globínicos.
Os diferentes mecanismos de regulação da expressão diferencial dos genes
globínicos. O papel das regiões reguladoras proximais e da região distal LCR (locus
control region) do locus
. Factores de transcrição e a activação de domínios da
cromatina; o papel do factor de transcrição GATA1; etapas moleculares na activação
dos domínios da cromatina durante a diferenciação hematopoiética. Mecanismo
multistep na activação da transcrição do locus .
3. Bases moleculares da adaptação a novos nichos bióticos e abióticos.
3.1
Factores e agentes determinantes nas alterações da expressão génica e modificações do
genoma.
3.2
Adaptação bacteriana mediada pelo mecanismo regulador intrínseco, o locus mar.
Componentes do locus mar de Escherichia coli. Os reguladores da transcrição, MarR e
MarA. A transcrição do locus mar. Os circuitos reguladores MarA, e seus homólogos
SoxS e Rob. A marbox. Mecanismos de regulação transcricional por MarA. Identificação
e regulação diferencial dos componentes do regulão mar. Fenótipos e mecanismos de
resistência mediados pelo operão mar. Importância clínica dos sistemas tipo -mar;
desenvolvimento de terapias através do controlo da expressão do operão mar.
2.1 Patogenicidade
microbiana como modelo
de
diferenciação. Diversidade
de
mecanismos
moleculares de diferenciação durante o processo infeccioso. Mecanismos genéticos na origem
da patogenicidade e responsáveis pelo aumento e diversidade de processos patogénicos.
Variação de fase e variação antigénica. Ilhas de patogenicidade (PAI): evolução, transferência,
local de integração e estrutura das PAI; bactérias patogénicas sem PAI. Etapas do processo
infeccioso. Mecanismos de patogenicidade. Tipos de factores de virulência e o seu modo de
acção. Regulação dos factores de virulência. Interacção dos agentes patogénicos com o sistema
imunitário do hospedeiro e mecanismos de escape à resposta imune.
2.4.1
Modelo de estudo: Helicobacter pylori
A infecção por H. pylori na origem de diferentes patologias gástricas. Mecanismos de
sobrevivência e factores importantes de adaptação a um nic ho específico. O dinamismo
e plasticidade do genoma de H. pylori. Estratégias e aproximações experimentais
utilizadas na identificação de genes importantes no processo infeccioso. O papel dos
polimorfismos na resposta imune e prognóstico da infecção. Os principais factores de
virulência: factores de adesão, e as toxinas VacA e CagA. A multifuncionalidade da
citotoxina VacA. A resposta imune do hospedeiro: os mecanismos de evasão da bactéria
ao sistema imunitário e de persistência da infecção.
2.4.2
Modelo de estudo: Plasmodium falciparum
Ciclo de vida de P. falciparum. Variação antigénica do factor de virulência PfEMP1.
Estrutura, organização e origem da família multigénica var. Expressão mutuamente
exclusiva dos genes da famíla var. Controlo epigenético da variação antigénica:
modificações das histonas, RNA não-codificante de intrões envolvidos no silenciamento
dos genes var, e silenciamento de promotores var. Localização perinuclear e activação
dos genes var. O início do desenvolvimento sexual em P. berghei: mecanismos de
regulação génica pós-transcricional que medeiam o silenciamento traducional nos
gametócitos e o papel dos P-bodies.
2.4.3
Modelo de estudo: Chlamydiales
Taxonomia. Chlamydiales ambientais e Chlamydiales patogénicas. Doenças humanas
associadas a infecção por Chlamydia trachomatis e Chlamydophila pneumoniae. C iclo
bifásico de desenvolvimento de bactérias Chlamydiales. Corpos elementares e corpos
reticulados. A inclusão, um vacúolo membranar. Diferentes etapas do ciclo infeccioso.
Transcritoma das Chlamydiales ao longo do ciclo infeccioso. Mecanismos moleculares
que determinam a interconversão de corpos elementares e corpos reticulados: o papel
das proteínas de tipo histona, HctA e HctB, e de um snRNA. Mecanismos moleculares e
celulares da interacção das Chlamydiae com as células do hospedeiro durante o ciclo
infeccioso: funções do sistema de secreção de tipo III; funções de algumas proteínas
efectoras – a proteína TARP e a proteína IncA.
Programa Prático
O papel da sinalização Notch na diferenciação das células estaminais hematopoiéticas.
Programa Teórico-Prático
Métodos de análise do ciclo celular. Métodos de indução dos pontos de controlo do ciclo
celular. Métodos de sincronização de células de mamífero e de levedura. Métodos de detecção de
células em fases específicas do ciclo celular. Métodos de detecção de actividades cinásicas e
fosfatásicas. Métodos de mapeamento das origens de replicação. Métodos de DNA combing.
Drosophila como organismo-modelo em genética, no estudo do desenvolvimento e do c iclo celular.
Técnicas de análise genética. Cromossomas balanceadores. Cruzamentos genéticos. Uso de
transposões e transgénese. Transformação de células da linha germinal mediada por elementos -P.
Mapeamento das inserções transgénicas. Isolamento de sequências genómicas adjacentes ao local de
inserção por recuperação do plasmídeo. Armadilhas para enhancers (enhancer trapping) e padrões de
expressão. Sistema Gal4-UAS para expressão dirigida e sobreexpressão. Análise de mosaicos
mitóticos produzidos pelo sistema FLP-FRT. Uso da técnica de esterilidade feminina dominante para
obtenção
de
clones
homozigóticos
da
linha
germinal
e
rastreio
Programa
de
efeitos
maternos.
Prático
Observação de Drosophila e técnicas básicas de utilização. Exemplos de cromossomas balanceadores,
marcas fenotípicas e simbologia genética em Drosophila. Elaboração de um esquema de cruzamentos
para mapear grosseiramente uma nova mutação letal no cromossoma 3 por recombinação meiótica
com um stock multimarcado. Observação de cromossomas politénicos das glândulas salivares
larvares.
Formato da disciplina
Duração semestral: 15 semanas
ECTS
Aula teóricas
2h x 15 sem
4
Aulas práticas
3h x 7 sem
1
Aulas teórico-práticas
3h x 7 sem
1
Total
6
Bibliografia Geral
- Artigos de Revisão e Específicos
- Livros de texto exclusivamente de apoio:
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (2008). Molecular Biology of
the Cell. 5 th ed. Garland Science, New York
Gilbert, Scott F. (2006). Developmental Biology. 8 th ed Sunderland (MA), Sinauer Associates, Inc
Lengeler, J. W., Drews, G., Schlegel, H. G (1999). Bio logy of Prokaryotes. Blackwell Science. Thieme
Stuttgart, NY
Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, C., Krieger, M., Scott, M., Zipursky, S. L., Darnell, J.
(2005). Molecular Cell Biology. 5 th ed. Freeman, New York
Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J. (2003). Brock Biology of Microorganisms. 10 th ed.
Prentice Hall Pearson Education, NJ
Strachan, T., Read, A. P. (2004). Human Molecular Genetics. 3 rd ed. Garland Science, Taylor and
Francis Group, London
Avaliação
A avaliação constará de um teste teórico e teórico-prático a meio do semestre, e de um
exame final (1ª época) com consulta e que incluirá toda a matéria teórica, teórico-prática e questões
sobre o trabalho experimental realizado. Os alunos que tiverem realizado o teste intercalar só
respondem à 2ª metade da matéria. A 2ª época consta de um exame final com consulta abrangendo
toda a matéria. Os alunos com nota final inferior a 9,5 valores serão reprovados, podendo repetir o
teste na 2ª época de avaliação. Os alunos com nota igual ou superior a 9,5 valores obtêm
aprovação. Os alunos podem fazer melhoria na 2ª época de avaliação, ou no ano lectivo seguinte.
Não há provas orais.