Criopreservação de embriões

Criopreservação de
embriões
Vicente J.F. Freitas
Biotecnologia da Reprodução
Animal
Laboratório de Fisiologia e Controle
da Reprodução
www.uece.br/lfcr
Aula ministrada por:
M.Sc. Ribrio Ivan T. P. Batista
1. 
PRINCÍPIO DA CRIOPRESERVAÇÃO
1. 
Danos causados pela criopreservação
2. 
Proteção contra danos
2. 
TÉCNICAS DE CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES
3. 
FATORES QUE AFETAM O SUCESSO DA TÉCNICA
4. 
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Conceito
Redução ou mesmo parada de todos os fenômenos biológicos
(movimentos moleculares, reações químicas e atividades
enzimáticas), as temperaturas inferiores a - 150 °C.
Histórico
– Embrião de camundongo (Whittingham et al., 1972) – Embrião de bovino (Wilmut e Rowson, 1973)
– Embrião de ovino (Willadsen et al., 1976)
– Embrião de caprino (Bilton e Moore, 1976)
Vantagens
1. 
Otimização das biotecnologias reprodutivas.
2. 
Conservação de material genético – extinção/produção.
a. 
3. 
Preservação de raças em vias de extinção.
Prevenção de perdas de animais vivos durante o
transporte.
4. 
Adequação a época de parições.
Princípio da
criopreservação
O
protocolo
empregado
na
criopreservação de uma célula deve ser
suficientemente lento para prevenir a
cristalização da água intracelular e
suficientemente rápido para prevenir a
exposição das células a elevadas
concentrações de eletrólitos antes da
congelação.
Danos
Lesões nas membranas
Danos
Desnaturação proteíca
Danos
Desnaturação do citoesqueleto
Proteção
Ø  Crioprotetores
ü  Proteção celular
ü  Reduzem a formação de cristais de gelo
ü  Reduzem do ponto crioscópico da água
ü  Maior estabilidade a membrana celular
Proteção
¨ 
Crioprotetores
¨ 
Substituem e/ou removem a água intracelular
¨ 
Intracelulares (penetrantes)
¨ 
Etilenoglicol, dimetilsufóxido, glicerol,
propanodiol, butanodiol e metanol
¨ 
Extracelulares (não penetrantes)
¨ 
Lactose, glicose, sacarose, polivinilpirrolidona,
manitol, trealose e albumina sérica bovina
(BSA)
Proteção
¨ 
Crioprotetores
¨ 
Moléculas protetoras do citoesqueleto
¨ 
Citocalasina B
Proteção
—  Toxicidade de Crioprotetores
¨ 
¨ 
Concentração
¨ 
Entre 1 e 2 M
¨ 
Tempo de exposição 10 a 20 min.
Nível de toxicidade
¨ 
Etilenoglicol
¨ 
Glicerol
¨ 
Propilenoglicol
Métodos
¨ 
Métodos de criopreservação
¨ 
¨ 
Congelamento lento
¨ 
Convencional
¨ 
One-Step
Vitrificação
¨ 
OPS
¨ 
Em grade de microscopia eletrônica de transmissão
¨ 
Cryollop
¨ 
Micropipetas de vidro – GMP
¨ 
Em superfície sólida de vitrificação – SSV
¨ 
Microgotas
¨ 
Hemi-palhetas (“Hemi Straw”)
Congelação lenta
São utilizados taxas de resfriamento que permitem a
troca de água intracelular por crioprotetor, sem
grandes efeitos osmóticos ou mudanças na forma
celular, prejudiciais á funcionalidade das células.
Congelação lenta
Etapas de congelação lenta com etilenoglicol
1.  Lavar embriões em PBS com 0,4% de BSA
2.  Equilíbrio com 1,5 M de etileno glicol em PBS com 0,4% de BSA
por pelo menos 5’;
Congelação lenta
Etapas de congelação lenta com etilenoglicol
3.  Envase durante o equilíbrio (mínimo de três colunas, separadas por
bolhas de ar; embrião na coluna do meio)
4.  Levar palhetas ao congelador de embriões (já estabilizado entre -5
e -7ºC);
5.  Deixar por 5 minutos a -5/-7ºC;
Congelação lenta
Etapas de congelação lenta com etilenoglicol
Congelação lenta
Etapas de congelação lenta com etilenoglicol
6.  Realizar o seeding;
7.  Confirmar formação do gelo nas palhetas;
8.  Deixar mais 5 min. a -5/-7ºC;
Congelação lenta
Etapas de congelação lenta com etilenoglicol
8.  Deixar mais 5 min. a -5/-7ºC;
9.  Iniciar curva de congelação (-0,3 a -0,6ºC/min);
10. Após atingir 32ºC, mergulhar palheta em N2 liquido (não tocar
palheta com as mãos).
Congelação lenta
Etapas de descongelação lenta com etilenoglicol
1.  Descongelação: 5” no ar e 30” em banho-Maria a 35-37ºC
2.  Palheta é montada diretamente no inovulador ;
3.  R e c o m e n d a d o n ã o l e v a r m a i s d o q u e 2 0 ’ e n t r e a
descongelação e a inovulação;
4.  Não existe avaliação prévia do embrião.
Vitrificação
Ø 
Estado líquido
Ø 
Crioprotetores com alto grau de viscosidade
Ø 
Ø 
estado vítreo (amorfo)
Crioprotetores: etilenoglicol e DMSO
Alta velocidade na congelação (imersão direta
no N2)
Vitrificação
Vitrificação por OPS (Vajta, 1998).
Ø Palheta de 0,25 ml esticada (diâmetro interno pequeno)
Ø Crioprotetores:
Ø Meios
Ø Solução I (VS1):
Ø TCM Hepes + SFB (20%)
Ø Etilenoglicol (7,5%) e DMSO (7,5%)
Ø Solução II (VS2):
Ø TCM Hepes + SFB (20%)
Ø Etilenoglicol (16,5%) e DMSO (16,5%) + sacarose (0,5 M)
Vitrificação
VS1: 7,5% EG + 7,5%
DMSO - 1 min
VS2: 16,5% EG + 16,5% DMSO
- 20 seg
Vitrificação
Vitrificação
ü  Reaquecimento:
ü  Meios:
ü  SM (sacarose 0,5 M): PBS+5%SFB
ü  Poço 1: 800 μl HM, 400 μl SM
ü  Poço 2: 800 μl HM, 400 μl SM – 5 min
ü  Poço 3: 800 μl HM, 200 μl SM – 5 min
ü  Poço 4: 800 μl HM
P-1
P-2
P-3
P-4
Vitrificação
Ø 
Vitrificação X Congelamento lento
Ø 
Ø 
Inconvenientes:
Ø 
Estresse osmótico
Ø 
Toxicidade químico de crioprotetor
Vantagens:
Ø 
Não precisa de um congelador programável
Ø 
Técnica muito rápida
Fatores influenciando
o sucesso da técnica
q 
Qualidade do embrião
Fatores influenciando
o sucesso da técnica
q 
Estádio de desenvolvimento embrionário
Fatores influenciando
o sucesso da técnica
q 
Raça – Bos taurus x Bos indicus
q 
Espécies zebuínas – menor taxa de sobrevivência
embrionária
Fatores influenciando
o sucesso da técnica
q 
Origem do embrião
Fatores influenciando
o sucesso da técnica
Tabela 1. Taxa de fertilidade ao parto e sobrevivência embrionária após
inovulação de embriões vitrificados obtidos pela produção in vivo ou in vitro
(COGNIÉ e BARIL, 2002).
Parâmetro
observado
Ovinos
In vivo In vitro
Caprinos
In vivo In vitro
Número de receptoras
33
34
27
20
Parto (%)
70a
15ª
52
45
Sobrevivência embrionária (%)
49b
9b
37
30
Letras diferentes na mesma coluna: P < 0,001
Considerações Finais
Ø  Ambas as técnicas (congelação lenta e vitrificação)
podem ser utilizadas para criopreservação de embriões.
Ø  A eficiência das duas técnicas podem variar de acordo
com diversos fatores.