DETECÇÃO DO VÍRUS DA HEPATITE E EM

DETECÇÃO DO VÍRUS DA HEPATITE E EM FÍGADOS DE SUÍNOS DE
ABATEDOURO
Livia Bodnar (CNPq-Balcão), Brígida Kussumoto de Alcântara (PIBIC/CNPqUEL), Bruna Letícia Domingues Molinari (Fundação Araucária-UEL), Daniel de
Almeida Moraes (Fundação Araucária-UEL), Rafael Cascales (PIBIC/CNPqUEL), Noemi Rovaris Gardinali (Pós-graduação-Mestrado-UEL), Raquel de
Arruda Leme (Pós-graduação-Mestrado-UEL) Amauri Alcindo Alfieri
(Orientador), e-mail: [email protected].
Universidade Estadual de Londrina/Centro de Ciências Agrárias/Departamento
de Medicina Veterinária Preventiva (DMVP) – Londrina – PR
Palavras-chave: suíno, hepatite E, fígado, RT-PCR
Resumo
O suíno tem sido descrito como o principal reservatório do vírus da hepatite E
(HEV) em todo o mundo. As estirpes virais identificadas em suínos têm sido
classificadas no mesmo genótipo das estirpes de HEV humanas, o que tem
demonstrado o potencial zoonótico dessas estirpes. Com o objetivo de reduzir
o número e o custo das reações e ratificar a sensibilidade da técnica de RTPCR, as 115 amostras de fígado de suíno foram divididas em 23 pools de cinco
amostras cada. Dos 23 pools analisados em um (1/23) foi possível detectar a
presença do RNA viral. Com a avaliação individual das cinco amostras em
duas (2/5) foi possível detectar a presença do vírus. O presente estudo
demonstrou que a técnica utilizada em pool foi capaz de detectar o vírus na
região estudada. Os fatores de risco envolvidos na transmissão dessa virose
entre suínos e mesmo seu potencial zoonótico, em face da gravidade da
infecção em humanos precisam ser estabelecidas com urgência.
Introdução
O vírus da hepatite E (HEV) é um vírus RNA, não envelopado (7.5-kb)
recentemente classificado na família Hepeviridae que apresenta até o momento
um único gênero, o Hepevirus (Aggarwal and Krawczynski, 2000). A hepatite E
(HE) é uma doença autolimitante, de gravidade variável apresentando-se de
forma aguda ou como hepatite ictérica com achados clínicos e morfológicos
semelhantes aos da Hepatite A (Beniwal et al., 2003). A hepatite E ocorre
tanto de forma endêmica quanto esporádica. A infecção pelo HEV em seres
humanos na maioria dos casos determina hepatite aguda autolimitante, porém,
em mulheres gestantes pode ocasionar hepatite fulminante com taxas de
mortalidade de até 25% (Kasorndorkbua et al., 2002).
São descritas quatro vias de transmissão do HEV, sendo a principal
delas a fecal-oral caracterizada pela ingestão de água contaminada por fezes.
As demais vias ocorrem pelo consumo de carne crua ou mal cozida
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proveniente de animais selvagens infectados, como veados e javalis; através
de transfusão sanguínea (parenteral) e pela transmissão do HEV da mãe para
o feto (vertical) (Mushahwar, 2008).
Estudos recentes detectaram anticorpos IgG para o HEV (anti-HEV) em
várias espécies de animais selvagens e domésticos em países
subdesenvolvidos e desenvolvidos (Meng, 2000). Evidências moleculares de
infecções naturais pelo HEV em suínos foram descritas em países endêmicos e
não endêmicos em todo o mundo (Van der Poel, 2001). Entretanto, para a
sanidade suína, a infecção não representa diretamente um problema, já que os
animais infectados não apresentam sinais clínicos. Sendo assim, o suíno tem
sido descrito como o principal reservatório do HEV em todo o mundo
(Bouwknegt et al., 2008). As estirpes virais de HEV detectadas em suínos são
classificadas no mesmo genotipo das estirpes de HEV humanas havendo,
portanto, grande similaridade genética entre elas. A capacidade dos suínos em
gerar progênie viral tanto de estirpes de origem suína quanto humana de HEV
indica que os suínos infectados amplificam o vírus presente no ambiente,
expondo outros animais susceptíveis, e, principalmente, os seres humanos à
infecção pelo HEV.
Pessoas em contato direto e freqüente com suínos apresentaram maior
taxa de soropositividade do que aquelas sem contato com esses animais,
mesmo em regiões geográficas onde a hepatite E não é endêmica. Essa
constatação sugere que a ocupação profissional e o tempo de exposição ao
vírus são fatores de risco para a infecção. Os estudos realizados no Brasil
avaliaram a presença de anticorpos e do vírus em seres humanos e suínos,
comprovando a circulação do HEV em nosso país (Guimarães et al., 2005;
Meng et al., 1997). Essas informações caracterizam a enfermidade como
zoonose de grande importância clínica, mas que tem sido pouco estudada no
Brasil e mesmo no mundo (Kasorndorkbua et al., 2002).
Recentemente, alguns casos de hepatite E aguda no Japão foram
relacionados epidemiologicamente e geneticamente ao consumo de fígado mal
cozido de suíno e carne mal cozida de veado (Yazaki et al., 2003; Tei et al.,
2003). Portanto o objetivo deste trabalho foi detectar o vírus da hepatite E em
pool de amostras de fígados provenientes de um abatedouro situado na região
oeste do Paraná.
Material e Métodos
Amostras
Foram coletadas 115 amostras de fígado de suínos assintomáticos provenientes de um
abatedouro da região oeste do estado do Paraná. Os fígados foram coletados de dez lotes
distintos, pertencentes a dez granjas oriundas da mesma região. Para facilitar a
realização da técnica e reduzir o custo e o número das reações, as amostras foram
divididas em 23 pools contendo cinco amostras de fígado do mesmo lote.
Extração do RNA viral
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Amostras frescas de fígado suíno foram maceradas a 10% (peso/volume) com
a solução tampão fosfato salina PBS 0,01M pH 7.2 (137mM NaCl; 3mM KCl;
8mM Na2HPO4; 15mM KH2PO4) e centrifugadas por 15 minutos a 3000xg a
4ºC. A extração do ácido nucléico foi realizada de acordo com a técnica
descrita por Alfieri et al. (2006). O RNA foi eluído em 50μL de água tratada
DPEC e mantido à -20ºC até seu uso. Como controle negativo da reação, uma
alíquota de água DPEC foi incluída em cada extração e como controle positivo
foi utilizado uma amostra de fezes positiva para HEV da coleção de amostras
do Laboratório de Virologia Animal.
RT-PCR (Transcrição reversa - Reação em Cadeia pela Polimerase)
Com 5μL do RNA eluído a RT-PCR foi realizada de acordo com a técnica
descrita por Van der Poel et al. (2001) com os primers ORF2-s1 e ORF2-a1
que amplifica um segmento de 197 pb da região ORF2 do vírus.
Os produtos amplificados na RT-PCR foram analisados por eletroforese
em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio em tampão TBE (TrisBorato-EDTA) e visualizado sob luz UV.
Resultados e Discussão
No presente estudo a detecção do RNA viral foi possível em um dos 23 pools
(1/23) analisados. Das cinco amostras do pool a presença do HEV foi verificada
em duas (1,7%) amostras.
Um estudo realizado nos EUA também detectou o vírus em pacotes
comerciais de fígado de suíno comprados em supermercados e destinados
para o consumo humano (Feagins et al., 2007). Na Holanda o RNA viral foi
detectado em 6,5% dos fígados de suínos de abatedouros (Bouwknegt et al.,
2008). Este é o primeiro trabalho realizado com fígados de suínos de
abatedouros no Brasil. O resultado desta investigação revelou que o HEV pode
ser detectado em suínos abatidos na região estudada, e sugere que, suínos
saudáveis pode ser fonte de infecção para profissionais que trabalham na
indústria suína.
Conclusão
Este estudo fornece evidências de que trabalhadores em contato direto com
suínos, bem como os de abatedouros, podem estar expostos a estirpes suínas
de HEV que apresentam potencial zoonótico.
Bibliografia
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