Sequenciamento de aminoácidos

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Determinação da seqüência de
aminoácidos de cadeias polipeptídicas
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Determinação da seqüência de aminoácidos de cadeias polipeptídicas
1ª Etapa: Determinação da composição em aminoácidos
Hidrólise de todas as ligações peptídicas do polipeptídeo puro. A mistura obtida é analisada
por cromatografia de troca iônica, para determinação dos aminoácidos presentes e das
suas proporções relativas.
2ª Etapa: Identificação dos resíduos amino-terminal e carboxila-terminal.
Resíduo Amino-terminal (utilizando 1-fluor-2,4-dinitrobenzeno ou cloreto de dansil)
1-fluor-2,4-dinitrobenzeno + peptídeo → 2,4-dinitrofenil-peptídeo
HCl
2,4-dinitrofenil-aminoácido
(resíduo N-terminal)
+ aminoácidos livres
NO2
2
F
NO2
2
1-fluor-2,4-dinitrobenzeno
O resíduo de aminoácido N-terminal ligado ao 2,4-dinitrofenil é
identificado por comparação cromatográfica com padrões de
derivados dinitrofenilados dos diferentes aminoácidos.
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Cloreto de dansil + peptídeo → dansil-peptídeo
dansil-aminoácido
H 3C
(resíduo N-terminal)
HCl
+ aminoácidos livres
CH3
N
O dansil-aminoácido é fortemente fluorescente. Pode ser detectado e
dosado em concentrações muito menor que os dinitrofenil-aminoácidos.
O
S
O
Cl
Cloreto de Dansil
Resíduo Carboxila-terminal
Utilizando a enzima carboxipeptidase que hidrolisa a ligação peptídica a partir da ponta
carboxila-terminal da cadeia.
Determinando qual aminoácido é liberado em primeiro lugar pela ação da carboxipeptidase,
identifica-se o resíduo C-terminal no polipeptídeo.
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3ª Etapa: Fragmentação da cadeia polipeptídica (hidrólise seletiva)
Tripsina - hidrolisa as ligações peptídicas das quais participa a carboxila de resíduos de
arginina ou lisina.
Um polipeptídeo com cinco resíduos de arginina e/ou lisina deverá produzir seis peptídeos
menores. Com exceção de um, todos terão arginina ou lisina na posição C-terminal.
Quimotripsina - hidrolisa as ligações peptídicas cujo grupo carboxila pertence a resíduos de
fenilalanina, triptofano e tirosina.
Mapa peptídico - Separação dos fragmentos
produzidos por cromatografia de troca iônica
em coluna, por eletroforese em papel ou por
cromatografia em duas dimensões
2ª cromatografia ↑
origem
1ª eletroforese
→
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4ª Etapa: Determinação da seqüência dos fragmentos peptídicos
O método de degradação de Edman marca e remove apenas o resíduo N-terminal de
peptídeos, deixando intacta todas as outras ligações peptídicas.
Após a remoção e identificação do resíduo N-terminal, o novo resíduo N-terminal exposto
pode ser marcado e removido pela repetição da mesma reação.
Desta maneira, resíduo a resíduo, a degradação de Edman pode elucidar a seqüência inteira
de aminoácidos de um peptídeo.
Fenilisotiocianato + peptídeo
feniltiohidantoína
OH
(derivado do resíduo N-terminal)
feniltiocarbamoil-peptídeo
HCl
+ peptídeo original (sem o resíduo N-terminal)
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O resíduo de aminoácido
N-terminal na
feniltiohidantoína é
identificado por
cromatografia.
Seqüências contendo até
20 aminoácidos podem ser
facilmente identificadas.
Permanece,
Permanece, entretanto,
entretanto, oo problema
problema de
de determinar
determinar como
como esses
esses fragmentos
fragmentos são
são
arranjados
arranjados na
na cadeia
cadeia polipeptídica
polipeptídica original.
original.
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5ª Etapa: Fragmentação da cadeia polipeptídica por um segundo método
Brometo de Cianogênio - quebra apenas as ligações peptídicas nas quais o grupo carboxila
pertence ao resíduo metionina.
Assim, se o polipeptídeo contem 8 resíduos de metionina, a quebra com o brometo de cianogênio
deverá produzir nove fragmentos peptídicos. Os fragmentos são separados por eletroforese ou
cromatografia
Temos agora dois grupos de fragmentos peptídicos, um obtido pela ação da tripsina e outro
pela quebra química com o brometo de cianogênio.
6ª Etapa: Ordenação dos fragmentos peptídicos através da determinação de superposições
A superposição de porções dos peptídeos obtidos na 2ª fragmentação indica a ordem
correta dos peptídeos obtidos na 1ª fragmentação.
Às vezes a 2ª quebra falha em estabelecer superposições para dois ou mais peptídeos da 1ª
quebra. Neste caso, uma terceira ou mesmo quarta quebra por métodos diferentes deve ser
utilizada.
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Arranjo dos peptídeos em sua ordem correta, pelas sobreposições
Exemplo: Resultados obtidos utilizando hidrólises seletivas com tripsina e quimotripsina.
Resíduos terminais: N-terminal = Ser
C-terminal = Gli
Fragmentos da 1ª quebra
Ser-Asn-Tre-Trp-Arg
Tyr-Cys-Arg
Phe-Asp-Gli
Leu-Ile-Lys
Val-Lys
(c/ tripsina):
Fragmentos da 2ª quebra
Ser-Asn-Tre-Trp
Cys-Arg-Leu-Ile-Lys-Phe
Asp-Gli
Arg-Val-Lys-Tyr
(c/quimotripsina):
1º grupo de fragmentos
Ser-Asn-Tre-Trp-Arg
Val-Lys
Tyr-Cys-Arg
Leu-Ile-Lys
2º grupo de fragmentos
Phe-Asp-Gli
Ser-Asn-Tre-Trp
Arg-Val-Lys-Tyr
Cys-Arg-Leu-Ile-Lys-Phe
Asp-Gli
Seqüência deduzida
Ser-Asn-Tre-Trp-Arg-Val-Lys-Tyr-Cys-Arg-Leu-Ile-Lys-Phe-Asp-Gli
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Especificidade de alguns métodos importantes de fragmentação seletiva de
cadeias polipeptídicas
Tratamento
Ponto de quebra
Tripsina
Lisina, Arginina (extremidade C-terminal)
Quimotripsina
Fenilalanina, Triptofano, Tirosina (extremidade C-terminal)
Pepsina
Fenilalanina, Triptofano, Tirosina e outros
(extremidade N-terminal)
Termolisina
Leucina, isoleucina, valina (extremidade N-terminal)
Broneto de
Cianogênio
Metionina (extremidade C-terminal)