Protocolo

DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE PLASMÁTICA
DE TRANSAMINASES (TGO/ TGP)
1. DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE DA TGO (AST)
Princípio:
O meio de reacção, para além dos substratos para a reacção da TGO (ácidos aspártico e
α-cetoglutárico), contém malato desidrogenase (MDH) e NADH, utilizados na segunda
reacção, estequiométrica com a primeira:
TGO
Ácido aspártico + Ácido α-cetoglutárico
↔
Ácido oxalacético + Ácido glutâmico
MDH
Ácido oxalacético + NADH + H+
↔
+ Ácido málico + NAD+
Deste modo, a concentração de NADH gasto é igual à de oxaloacetato formado, bastando,
portanto, medir a variação de absorvância a 340 nm (o NADH absorve fortemente neste
comprimento de onda).
Procedimento:
1. Regule o espectrofotómetro para 340nm.
2. Para acertar o "zero" do aparelho, prepare primeiro uma célula com as seguintes
quantidades, em mL (ou duas, se estiver a utilizar o espectrofotómetro Shimadzu):
"Branco"
Água destilada
Reagente TGO
(enzima/coenzima/substratos)
0.15 mL
1,5 mL
3. Homogenize, coloque a (ou as duas) célula(s) no espectrofotómetro, e acerte o "zero".
4. Agora prepare a célula "amostra", com o soro ou plasma:
"Amostra"
Soro ou plasma
Reagente TGO
(enzima/coenzima/substratos)
0.15 mL
1,5 mL
1
5. Homogenize, leia a absorvância inicial ao fim de 1 minuto, e leia novamente aos 2, 3 e 4
minutos. Registe os valores na tabela apresentada a seguir:
Actividade da TGO
Tempo (min)
Abs340 nm
1
2
3
4
6. Determine a variação de absorvância, ∆Abs340nm/min, tendo o cuidado de utilizar apenas os
valores da curva em que a variação seja linear.
7. Para calcular a actividade da TGO, use a fórmula seguinte:
U/L=1746 x ∆340nm/min
(valores normais no soro, a 25ºC: homens, até 18U/L; mulheres, até 15U/L).
2. DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE DA TGP (ALT)
Princípio:
De modo semelhante ao utilizado para a determinação anterior, o meio de reacção, para
além dos substratos para a reacção da TGP, contém lactato desidrogenase (LDH) e NADH,
utilizados na segunda reacção, estequiométrica com a primeira:
TGP
Alanina + ácido α-cetoglutárico
↔
ácido pirúvico + ácido glutâmico
LDH
Ácido pirúvico + NADH + H+
↔
+ Ácido láctico + NAD+
Assim, a concentração de NADH gasto é igual à de piruvato formado, medindo-se a variação
de absorvância a 340 nm.
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Procedimento:
1. Regule o espectrofotómetro para 340nm.
2. Para acertar o "zero" do aparelho, prepare primeiro uma célula com as seguintes
quantidades, em ml (ou duas, se estiver a utilizar o espectrofotómetro Shimadzu):
"Branco"
Água destilada
Reagente TGP
(enzima/coenzima/substratos)
0.15 ml
1.5 ml
3. Homogenize, coloque a (ou as duas) célula(s) no espectrofotómetro, e acerte o "zero".
4. Agora prepare a célula "amostra", com o soro ou plasma:
"Amostra"
Soro ou plasma
Reagente TGP
(enzima/coenzima/substratos)
0.15 ml
1.5 ml
5. Homogenize, leia a absorvância inicial ao fim de 1 minuto, e leia novamente aos 2, 3 e 4
minutos. Registe os valores na tabela apresentada a seguir:
Actividade da TGP
Tempo (min)
Abs340 nm
1
2
3
4
6. Determine a variação de absorvância, ∆Abs340nm/min, tendo o cuidado de utilizar apenas os
valores da curva em que a variação seja linear.
7. Para calcular a actividade da TGP, use a fórmula seguinte:
U/L=1746 x ∆340nm/min
(valores normais no soro, a 25ºC: homens, até 22 U/L, mulheres até 17 U/L).
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