Bioensaios celulares: Princípios e Aplicações
Propaganda
Bioensaios celulares: Princípios e Aplicações Letícia Veras Costa Lotufo Laboratório de Oncologia Experimental Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC [email protected] PROGRAMA: • 11/02 – aula 1 - Princípios básicos – Ensaios de citotoxicidade – aula 2 –Aplicações no estudo de novas drogas anticâncer • 12/02 – aula 3 – Aplicações no estudo de novas drogas anticâncer – aula 4 - Morte celular: apoptose versus necrose CITOESQUELETO Microtúbulos (Tubulina) Actina Proteínas motoras Aurora, Pólo quinases Quinesinas MICROTÚBULOS Segregação cromossômica Aurora papel central na orientação dos cromossomos Mayer et al., 1999, Science 286, 971. BIOENSAIOS: • Polimerização de tubulina in vitro • Ensaios de ligação (“binding”) – sítios: taxol, alcalóides da vinca e colchicina • Microscopia confocal Polimerização/despolimerização Tubulina Ensaio clássico – baseia-se na leitura de absorbância a 340 nm Atualmente pode ser realizado a partir da incorporação de um marcador fluorescentes na tubulina Ensaios de Ligação Ensaios de Ligação Ensaios de Ligação Ensaios de saturação Ligação Ensaios de competição Log [Ligante] M Imunofluorescência para citoesqueleto Microscopia confocal 24h Adição das drogas 24h PBS Fixadas e Permeabilizadas RNAse PI Zeiss LSM 510 α‐tubulina 24h Ac‐Cy5 3h Faloidina‐FICT VIAS DE MORTE CELULAR Apoptose vs. Necrose APOPTOSE Definição • Descrita em 1972 e denominada seguindo o termo grego “cair fora”. • Termo “ morte programada da célula ( PCD ) ” Apoptose Apoptose-like PCD Necrose-like PCD APOPTOSE Definição • “É uma forma de morte celular destinada a eliminar células indesejáveis, do hospedeiro, através da ativação de uma série coordenada e programada de eventos executados por um conjunto exclusivo de produtos gênicos”. ( Robbins, 2000). APOPTOSE 1. Durante o desenvolvimento 2. Mecanismo homeostático para manter as populações celulares nos tecidos 3. Mecanismo de defesa, como nas reações imunes 4. Quando as células são lesadas por uma doença ( corpúsculos de Councilman) ou agentes nocivos ( calor, radiação, hipóxica, drogas anti-câncer citotóxicas) 5. Envelhecimento MECANISMOS MOLECULARES Via Intrínseca: MECANISMOS MOLECULARES • Via extrínsica Ativação de pro-caspases pelo TNF-α e Fas ligante. Receptores da superfície celular associa-se com uma proteína adaptadora com domímio de morte. • Apoptose mediada por Fas-Fas ligante ( eliminação de linfócitos ativados de uma reação imune) MECANISMOS MOLECULARES Via extrínsica • Apoptose induzida por TNF TNF – R1 TRADD FADD Ativação do fator de transcrição nuclear ‐ κB ao estimular a degradação do seu inibidor ( I κB) MECANISMOS MOLECULARES • Apoptose estimulada por linfócitos T citotóxicos LTC – estimula a secreção de perfurina Serina‐protease granzima B – cliva proteínas com resíduos de aspartato e ativa caspases. • Apoptose após privação de fator de crescimento Bcl‐2 movem‐se para o citosol Aumento da permeabilidade da membrana • Apoptose mediada por lesão de DNA DNA lesado – acúmulo de p53 – interrompe o ciclo celular na fase G1. Falha do reparo apoptose. Vias não-apoptóticas de morte celular • Necrose • Morte celular autofágica • Morte celular independente de caspase Ativação de caspases Clivagem da bomba de cálcio Fragmentação de DNA por caspases Análise morfológica – Coloração Diferencial por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina Montar placa Incubar com droga BE LA Contagem 24h Célula viável Célula apoptótica Núcleo Célula necrótica MCGAHON et al., 1995 Citometria de fluxo Fluxo de Amostra Detectores Forward Angle Foward Light Scatter Light Angle Scatter Amostra Side Angle Side Light Scatter Tampão Filtros Ópticos Laser Lixo Sistema de Luzes Sistema Fluídico Light Angle Scatter Green Green fluorescence Flourescen FL1 ce (FL1 ) Red-Orange Orang -Red Flourescen efluorescence FL2 ce (FL2 ) Red Red fluorescence Flourescen FL3 ce (FL3 ) Sistema Óptico e Eletrônico Forward Angle Light Scatter Fluorescência Sistemas de Controle e Arquivo de Dados Visão dos Dados • HISTOGRAMA: – Intensidade de fluorescência x número de células FITC FITC FITC Number of Events FITC FITC FITC FITC FITC Counts FITC Positive cells FITC 100 101 102 FL-2 Intensidade de Fluorescência 103 104 INTEGRIDADE DA MEMBRANA CELULAR CITOMETRIA DE FLUXO Montar placa Incubar PBS com droga centrifuga 24h PI Fragmentação do DNA Citometria de fluxo Montar placa Incubar com droga 24h PI + tampão de lise centrifuga 30 mim DNA Ladder Potencial transmembrânico da mitocôndria - Citometria de fluxo Montar placa Rodamina Incubar com droga 24h centrifugar centrifugar 15 mim PBS Identificação de fosfotidilserina externalizada - Anexina V Ativação de CASPASES • Citometria de fluxo • Western Blot (Eletroforese) • Kits colorimétricos • Kits fluorimátricos
