Mutações do Vírus Influenza A (H1N1)

Mutações do Vírus Influenza A (H1N1)
Laís Fernandes Rocha¹, Letícia Cechinel Lima¹, Talita Dewes¹; Adriana Helena Lau
1
2
Curso de Ciências Biológicas da Universidade Luterana do Brasil;
2
Departamento de Biologia, CNEC/Osório
RESUMO: No ano de 2009 surgiu a gripe com características pandêmicas causada
pelo vírus Influenza A (H1N1). Este vírus, capaz de infectar humanos de maneira
muito efetiva, se originou através de mutações e recombinação gênica de cepas
virais originárias de suínos, aves e humanos. A técnica de RT-PCR foi utilizada para
detecção desta nova linhagem viral que tem evoluído através de mutações ao acaso
que foram selecionadas positivamente. Não sabemos quais serão as pressões de
seleção geradas em novos episódios mutacionais.
Palavras-chave: vírus influenza A (H1N1), gripe suína, RT-PCR, mutações.
O VÍRUS INFLUENZA A (H1N1)
No ano de 2009, o surgimento de
vários casos semelhantes de uma
nova gripe em diversos países
desencadeou
uma
grande
preocupação, alertando as autoridades
sanitárias do mundo inteiro para o
risco de uma pandemia. A partir da
avaliação destes casos foi identificado
um novo subtipo viral, denominado
Influenza A (H1N1).
O vírus Influenza A (H1N1) pertence à
família Orthomyxoviridae e possui
RNA de cadeia simples segmentado
como material genético. Pode ser
classificado como do tipo A, B ou C,
baseado
no
antígeno
interno
nucleoprotéico. Externamente, o vírus
apresenta um envoltório de natureza
lipídica, no qual se insere antígenos de
superfície de natureza glicoprotéica
(PINHATI, 2009).
_______________________________
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O retrovírus Influenza tipo A pode
adquirir maior agressividade devido às
mutações derivadas da mistura de
genes de vírus de animais, em
especial aves e suínos (PINHATI,
2009). Mutações são erros que
ocorrem durante a replicação do
material genético (DNA ou RNA), ou
na sua reparação e se tornam
permanentes (NETTO E MENCK,
2001). As mutações classificadas
como espontâneas são eventos
naturais que ocorrem ao acaso na
replicação do material genético das
células; já as induzidas ocorrem pela
ação de fatores externos, ambientais
que podem produzir danos no material
genético (SADAVA e col. 2005). As
mutações
podem
gerar
efeitos
benéficos, deletérios, como também
ser neutras para os organismos,
dependendo da ação seletiva do
ambiente (BURNS E BOTTINO, 1991).
Novos genes podem ser introduzidos
em linhagens de vírus através do
contato com outras, mas sempre são
originados em uma espécie através de
mutações. As mutações, portanto,
podem ser consideradas como fonte
22
única
de
variabilidade
genética
(NETTO E MENCK, 2001; RIDLEY,
2006).
Mutações em vírus de RNA, ou
retrovírus,
ocorrem
mais
frequentemente, pois a transcriptase
reversa, que copia uma fita de DNA
complementar a partir do molde de
RNA, não possui atividade revisora de
erros e por isso não há mecanismos
capazes de promover reparação de
erros (OLIVEIRA E MENCK, 2001;
NETTO E MENCK, 2001; RIDLEY,
2006).
Através de suas mutações comumente
geradas, o vírus Influenza A tornou-se
um patógeno de inúmeras epidemias e
pandemias, afetando suínos ao causar
doenças respiratórias e sendo capaz
de infectar o homem por contato
próximo (GRECO e col. 2009).
De acordo com sua denominação, o
vírus Influenza A (H1N1) é composto
por oito genes, dos quais dois são
responsáveis pela codificação de
proteínas
virais
de
superfície
(hemaglutinina - HA e neuraminidase NA) que possibilitam a sua entrada na
célula e sua posterior disseminação
para outras, respectivamente. As
características antigênicas da HA e da
NA constituem a base para a divisão
do vírus da Influenza do tipo A em
subtipos e variantes. Existem 16
subtipos de hemaglutinina e nove de
neuraminidase, que resultam em 144
combinações possíveis das proteínas.
Dessas combinações apenas três,
H1N1, H2N2 e H3N2, são capazes de
infectar humanos (GRECO e col.
2009).
A definição do novo vírus foi feita
pouco tempo depois do surgimento da
doença. Com o desenvolvimento
rápido da técnica de RT-PCR (Reverse
Transcription PCR - Reação em
Cadeia da Polimerase com
Transcrição
Reversa)
para
identificação da nova cepa, foi possível
confirmar a infecção em pessoas com
manifestações clínicas como tosse,
febre, irritação na orofaringe, náusea e
diarréia (GRECO e col. 2009).
Este trabalho tem como objetivo
explicar como os artigos científicos
recentemente publicados descrevem a
ocorrência
das
mutações
que
permitiram a disseminação deste
agente patogênico em humanos e
descrição da técnica de PCR com
transcriptase reversa (RT-PCR) que
possibilita um diagnóstico preciso da
doença.
MUTAÇÕES DO VÍRUS
INFLUENZA A
Em geral, doenças virais são
endêmicas, ocorrendo com frequência
em locais que são propícios e
atacando um número variável de
indivíduos.
Possuem
variações
periódicas de intensidade em resposta
a eventos ecológicos e à dinâmica das
populações. Por exemplo, o vírus
Influenza A atua preferencialmente sob
baixas temperaturas, tornando-se um
risco à população humana no inverno
(DESSEN, 2006).
Atualmente, o vírus influenza é
classificado em três categorias: A, B e
C – e todos causam doenças
respiratórias. O vírus Influenza A é
aquele que causa a doença do modo
mais severo, do ponto de vista clínico.
Ele pode causar epidemias e incluive
pandemias (surtos que se espalham
mundialmente) e tem capacidade de
infectar o mesmo hospedeiro mais de
uma vez. Considera-se também que
as mutações acumuladas nos genes
virais, ao longo do tempo, podem
tornar este vírus ainda mais infeccioso
(DESSEN, 2006).
23
Para haver a formação de novos
subtipos virais de Influenza A ocorre
recombinação, que corresponde à
mistura de, por exemplo, genes de um
vírus que infecta seres humanos com
genes de vírus que infectam outros
animais, como aves. Para ocorrer a
mistura, os vírus têm que infectar ao
mesmo tempo um mesmo animal,
sendo comumente o porco, pois é um
hospedeiro
com
células
cujas
moléculas receptoras de superfície
permitem a entrada de ambos os tipos
virais (tantos os provenientes do
homem quanto os de aves). Por
exemplo, um porco pode ser infectado
pelo vírus Influenza A humano de um
homem gripado e, ao mesmo tempo,
pelo vírus de uma ave com gripe. As
moléculas de RNA dos dois tipos de
vírus podem então ser reestruturadas
criando um híbrido novo que, se tiver a
capacidade de infectar humanos, não
será reconhecido pelo sistema imune
do hospedeiro, visto que é a primeira
vez que o organismo tomará contato
com este tipo viral. Desta forma, o
híbrido tem a possibilidade de ser mais
virulento dependendo das condições
do hospedeiro (DESSEN, 2006). A
recombinação gênica aberrante e a
recombinação ilegítima são estratégias
comuns em vírus de RNA, onde a
colisão aleatória de fitas simples de
RNA pode ocorrer (PASSAGLIA, 2003;
MICHEREFF, 2008), aumentando a
probabilidade de gerar, ao acaso,
novas mutações, benéficas para o
organismo que as sofreu e deletérias
para o hospedeiro.
Mecanismos
estratégicos
de
recombinação
que
permitem
a
evolução dos vírus (PASSAGLIA,
2003), portanto, explicam a atual
pandemia de origem suína. Um novo
subtipo
de
vírus
surgiu
por
combinação dos genes de vírus
humanos, que vinham causando
gripes leves em anos anteriores, com
genes de aves e dos próprios suínos.
Posteriormente o vírus foi transmitido
de modo direto e indireto do suíno
para o ser humano, através da
inalação das secreções respiratórias
ou pelo contato com a mão e objeto
contaminados pelo vírus, o que
possibilitou os surtos no ano de 2009
(SENNA e col., 2009).
A
variação
antigênica
nas
glicoproteínas de superfície resultante
de recombinação do segmento do
gene que codifica a HA ou quando
ambos os genes que codificam a HA e
a
NA
estão
envolvidos
nos
mecanismos de recombinação, leva a
formação de um novo vírus. As
características antigênicas diferentes
das linhagens até então circulantes,
como foi o caso do vírus Influenza A
(H1N1) determinam a sua grande
transmissibilidade
entre
seres
humanos (GRECO e col. 2009).
A formação de novas linhagens
pandêmicas continuará desde que
haja uma fonte de genes virais (como
os de aves e suínos) que não tenha
tido o contato prévio com o hospedeiro
humano (SENNA e col., 2009).
PROCEDIMENTOS
DE
RT-PCR
UTILIZADA
PARA
A
IDENTIFICAÇÃO DO VÍRUS
INFLUENZA A (H1N1)
O teste laboratorial de RT-PCR é
recomendado
pela
Organização
Nacional de Saúde (OMS) para
detecção do vírus em pacientes com
suspeita de gripe A (H1N1). O mesmo
utiliza a técnica de coleta das
secreções respiratórias (nasofaríngeas
e orofaríngeas) para obter as amostras
a serem analisadas. As amostras
clínicas são retiradas com „swabs‟
através das secreções nasais e orais.
24
Pacientes intubados são submetidos à
coleta de aspirado nasotraqueal
(CARVALHO et al., 2009).
Primeiramente é feita a extração do
RNA das amostras e posteriormente,
os fragmentos específicos do vírus
Influenza A (a - proteína da matriz
universal), e de regiões dos genes de
Influenza A suína (b - nucleocapsídeo
e c - hemaglutinina H1) transformados
Figura 1 – RT-PCR. (Retirada de
Kendal e Riley, 2000, com
modificações).
O RNA molde deve ser isolado das
amostras
a
serem
testadas.
Portanto, os RNAs mensageiros
(mRNA) derivados das amostras
coletadas dos pacientes são
colocados juntamente com os
„primers
1
e
2‟,
os
dexoxirribonucleotídeos,
tampão,
transcriptase reversa, e DNA Taq
polimerase no termociclador. O
„primer‟ vai se anelar ou hibridizar com
os
mRNAs.
Assim,
a
enzima
transcriptase reversa pode continuar a
polimerização, adicionando
em DNAs complementares ou cópias
(cDNAs) pela ação da transcriptase
reversa, são amplificados através da
PCR num equipamento termociclador
(PROTOCOL ONLINE, 2009).
A figura 1, abaixo, ilustra as etapas da
RT-PCR (KENDALL E RILEY, 2000).
desoxirribonucleotídeos um a um,
por complementaridade de bases,
copiando as novas moléculas de
cDNA a partir das sequências molde
de
mRNAs
das
amostras,
produzindo
moléculas
híbridas
DNA/RNA. A enzima RNAase H,
degrada os mRNAs molde da
molécula híbrida, restando somente
os cDNAs. Estes cDNAs se anelam
com as moléculas do „primer 2‟
permitindo a ligação da Taq DNA
polimerase, que inicia os ciclos de
polimerização das moléculas de
cDNA, amplificando as amostras
através da técnica normal de PCR
(KENDALL E RILEY, 2000).
Os resultados são interpretados
através dos dados de fluorescência
25
emitidos pelas sondas (marcada
com fluoróforos), possíveis alvos,
com sinais coletados ao longo dos
45 ciclos da reação de PCR,
indicando a detecção dos genes em
questão. A interpretação ocorre da
seguinte forma: se somente o alvo
do gene da proteína da matriz
universal do vírus Influenza A “a”
brilhar e for detectado pela radiação
do fluoróforo, significa a presença
do vírus da Influenza A sazonal
(gripe comum); se ambos os alvos
“a” e “b” forem detectados, indica a
presença de um vírus da Influenza
A, de origem suína, porém não
pertencente ao tipo H1N1, e
finalmente se três alvos “a”, “b” e “c”
emitirem sinais e forem portanto
detectados, indica a presença do
vírus da Influenza A (H1N1),
pandêmico (CARVALHO et al.,
2009).
EVOLUÇÃO DA LINHAGEM H1N1
Um dos maiores mistérios da
evolução é prever o efeito de uma
mutação. De qualquer forma, sabese que quando atingem o nível de
indivíduo, podem atingir o nível de
população e influenciarão na vida
de
todos
os
organismos
relacionados no meio (DARWIN,
2007).
Sobre os efeitos da seleção natural,
presume-se que o vírus Influenza A
(H1N1), tendo um período cíclico de
mutações e de manifestação da
doença em humanos, dificilmente
pode ser previsível quanto aos
efeitos que poderá causar na
população humana cada vez que
houver uma nova mutação e esta se
disseminar (DUARTE, 2009).
As mutações que ocorreram no
vírus Influenza A, modificando seus
antígenos de superfície formando a
linhagem H1N1 geraram uma
pressão de seleção positiva. Tais
mutações foram benéficas para os
vírus ao possibilitar sua rápida
disseminação entre a população
humana que não apresentava
mecanismos de reconhecimento
pelo sistema imunológico ou
resistência a esta nova linhagem.
Para a população humana a
infecção pelo vírus Influenza A
(H1N1) atuou como agente de
seleção
natural,
atuando
negativamente, pois os indivíduos
infectados mais debilitados não
resistiram e foram a óbito, sendo
eliminados. Àqueles que foram
infectados
e
sobreviveram
apresentam agora resistência a este
subtipo viral. Isso mostra que
algumas características individuais
dos
organismos
humanos
influenciaram
nesta
seleção
(DARWIN, 2007; DESSEN, 2006;
DUARTE, 2009).
Porém, no momento em que os
humanos conseguiram identificar o
vírus e encontrar medicamentos para
combatê-lo, estes deixaram de ter
sucesso
reprodutivo,
não
conseguindo atingir os grupos de
risco nem os humanos mais „fracos‟
ou debilitados. Por outro lado, se os
humanos não obtivessem uma forma
de resistir à doença, todos poderiam
ser extintos, inclusive os mais „fortes‟
(DUARTE, 2009), muitos dos quais
compunham os grupos de risco que
incluem jovens saudáveis entre 18 e
39 anos. Isso mostra a gama de
possibilidades que as mutações ao
gerar pressão seletiva trazem aos
organismos. Se os organismos
conseguem de alguma forma adaptarse à situação a qual foram
submetidos,
sobreviverão
e
possivelmente
obterão
sucesso
seletivo. Se ao contrário, essa
adaptação não for
26
possível, só restam duas opções, ou
os organismos sofrem mutações ao
acaso e se adaptam a outros
ambientes, ou serão eliminados
(DARWIN, 2007; DESSEN, 2006;
DUARTE, 2009).
Os vírus mais resistentes são
aqueles que manifestam quadros
clínicos
menos
intensos
no
organismo humano, pois assim não
são eliminados e continuam a
persistir e voltar a infectar os
mesmos organismos (DESSEN,
2006). Não foi o caso do vírus
Influenza A (H1N1), pois devido a
sua alta virulência acabou sendo
restringido através da morte de
muitas vítimas e depois através de
medidas como a vacinação.
A cepa responsável pela pandemia
de Influenza A (H1N1) originária da
combinação de genes que incluem
suínos, aves e um gene de vírus
H3N2 humano, vem sofrendo
diversas modificações em suas
linhagens epidêmicas a cada um ou
dois anos devido à sua alta taxa de
mutação basal (DUARTE, 2009) e
recombinação
aberrante
e
inespecífica (PASSAGLIA, 2003;
MICHEREFF,
2008).
Como
possuem reservatório natural em
outros animais, como os já
mencionados exemplos de suínos e
aves, acabam por sofrer mutações
que podem transformá-los em
patógenos altamente virulentos,
capazes de contaminar o homem
com o qual mantêm contato
(DESSEN, 2006).
importância a compreensão de que
as mutações que ocorrem nos vírus
assim
como
nos
demais
organismos, podem influenciar a
vida humana.
Sendo a gripe suína uma doença
nova, originária da evolução da
linhagem viral Influenza A, os
médicos e cientistas desconheciam
os sintomas, o que impossibilitava o
correto diagnóstico e tratamento.
Uma vez identificado o vírus,
através de resultados obtidos pela
técnica de RT-PCR, pôde-se fazer o
monitoramento
das
possíveis
alterações do perfil viral em
circulação e posteriormente, a
aplicação da medicação correta
para evitar o agravamento do
quadro clínico dos casos de
Influenza A (H1N1).
Não se pode prever o grau de
severidade da gripe toda vez que
houver uma nova pandemia, pois
não poderá se presumir o quão
negativas à raça humana as
mutações do vírus Influenza A
podem se tornar. A sociedade deve
ter consciência da necessidade de
continuar a tomar medidas como: a
prevenção
diária
contra
a
contaminação viral através da
higienização;
a
atualização
constante da vacina através do
monitoramento
da
variação
antigênica, principalmente na HA; e
por fim, fazer uso adequado de
medicamentos somente depois de
um diagnóstico seguro.
BIBLIOGRAFIA
CONSIDERAÇÕES FINAIS
No ano de 2009 o mundo parou,
apreensivo, para assistir a uma
nova pandemia, que causou muitas
mortes por todo o globo. Portanto
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