BIR 11111111111131111 *1

(21)
PI 0615313-5 A2
República Federati,a de Brasil
du C .11,..r
Instituto Nactenal ra P
.
B
IR 1111111 1 1 13111 *1
(22) Data de Depósito: 04/09/2006
(51) Inta:
(43) Data da Publicação: 04/12/2012
CO7K 16/18
A61 K 39/395
A61 K 39/00
A61 P 9/10
A61K 31/33
GO1N 33/68
GO1N 33/53
(RPI 2187)
■ ••1.r....•21
(54) Título: USO DE IMUNOTERAPIA CONTRA
USO DE IMUNOTERAPIA CONTRA
(57) Resumo:
LIPOPROTEINA DE DENSIDADE BAIXA OXIDADA, MÉTODO PARA
LIPOPROTEÍNA DE DENSIDADE BAIXA OXIDADA,
MÉTODO PARA INDUZIR REGRESSÃO DE PLACAS INDUZIR REGRESSÃO DE PLACAS ATEROSCLERÓTICAS EM UM
M
INEDNIVOÍDS UOtim USEOpÍTD0
E pP
oELO
OXM
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ODOOU P AER
LO
A
ATEROSCLERÓTICAS EM UM INDIVÍDUO, USO DE
PELO MENOS UM ANTICORPO OU PELO MENOS UM COMBATER UMA DOENÇA CARDIOVASCULAR ASSOCIADA COM
ATEROSCLEROSE, USOS DE PELO MENOS UMA MOLÉCULA DE
EPÍTOPO OXIDADO DE LDL, MÉTODO PARA
ANTICORPO OU PELO MENOS UM EPÍTOPO OXIDADO DE LDL E
COMBATER UMA DOENÇA CARDIOVASCULAR
DE UMA ESTATINA, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, KIT DE
ASSOCIADA COM ATEROSCLEROSE, USOS DE PARTES, MÉTODOS PARA IDENTIFICAR UM ANTICORPO QUE
PELO MENOS UMA MOLÉCULA DE ANTICORPO OU INDUZ REGRESSÃO DE PLACAS ATEROSCLERÓTICAS EM UM
PELO MENOS UM EPÍTOPO OXIDADO DE LDL E DE INDIVÍDUO E PARA IDENTIFICAR UM AGENTE QUE INDUZ
UMA ESTATINA, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, KIT REGRESSÃO DE PLACAS ATEROSCLERÓTICAS EM UM
INDIVÍDUO, ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO
DE PARTES, MÉTODOS PARA IDENTIFICAR UM
DE ANTICORPO. O uso de imunoterapia contra LDL oxidada para
ANTICORPO QUE INDUZ REGRESSÃO DE PLACAS
induzir regressão de lesões ateroscleróticas preexistentes em um
indivíduo. A imunoterapia pode ser imunoterapia passiva utilizando
ATEROSCLERÓTICAS EM UM INDIVÍDUO E PARA
IDENTIFICAR UM AGENTE QUE INDUZ REGRESSÃO anticorpos que se ligam em epítopos presentes em LDL oxidada, ou
imunoterapia ativa utilizando uma composição de vacina para indução
DE PLACAS ATEROSCLERÓTICAS EM UM
de uma resposta imune contra epítopos presentes em LDL oxidada.
INDIVÍDUO, ANTICORPO, COMPOSIÇÃO
Regressão de placa
FARMACÊUTICA, E, USO DE ANTICORPO
14
(30) Prioridade Unionista: 02/09/2005 GB 0517878.5
12 -
(73) Titular(es): BIOINVENT INTERNATIONAL AB
10
(72) Inventor(es): JAN NILSSON, ROLAND CARLSSON
E
(74) Procurador(es): Momsen, Leonardos & CIA.
(86) Pedido Internacional: PCT EP2006008594 de
04/09/2006
o
I
2
o
LDD-D4
(87) Publicação Internacional: WO 2007/025781 de
08/03/2007
lEI-E3
K1T-138 Linha base 25w
,IO
•":4
1
"USO DE IMUNOTERAPIA CONTRA LIPOPROTEÍNA DE DENSIDADE
BAIXA OXIDADA, MÉTODO PARA INDUZIR REGRESSÃO DE
PLACAS ATEROSCLERÓTICAS EM UM INDIVÍDUO, USO DE PELO
MENOS UM ANTICORPO OU PELO MENOS UM EPÍTOPO OXIDADO
5 DE LDL, MÉTODO PARA COMBATER UMA DOENÇA
CARDIOVASCULAR ASSOCIADA COM ATEROSCLEROSE, USOS DE
PELO MENOS UMA MOLÉCULA DE ANTICORPO OU PELO MENOS
UM EPÍTOPO OXIDADO DE LDL E DE UMA ESTATINA,
FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, KIT DE PARTES, MÉTODOS PARA
10 IDENTIFICAR UM ANTICORPO QUE INDUZ REGRESSÃO DE
PLACAS ATEROSCLERÓTICAS EM UM INDIVÍDUO E PARA
IDENTIFICAR UM AGENTE QUE INDUZ REGRESSÃO DE PLACAS
ATEROSCLERÓTICAS EM UM INDIVÍDUO, ANTICORPO,
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DE ANTICORPO"
15 A presente invenção refere-se aos métodos imunoterapêuticos
para tratamento de doença cardiovascular.
Aterosclerose é uma doença multifatorial desenvolvendo
preferivelmente em indivíduos apresentando fatores de risco bioquímico
incluindo fumo, hipertensão, diabetes mellitus, hipercolesterolemia,
20 triglicerídeos e lipoproteína de densidade baixa (LDL) de plasma elevados,
hiperfibrinogenemia e hiperglicemia, dentre outros. Aterosclerose é uma
doença crônica que causa espessamento da camada mais interna (a íntima) de
artérias de tamanhos médio e grande.Diminui o fluxo sanguíneo e pode causar
isquemia e destruição de tecido em órgãos alimentados pelo vaso afetado.
25 Lesos ateroscleróticas desenvolvem-se durante numerosas décadas,
acarretando complicações tais como isquemia coronariana e cerebral e
doenças tromboembólicas e infarto miocardial e cerebral.
Aterosclerose é a causa maior de doença cardiovascular
incluindo infarto miocardial, derrame cerebral e doença de artéria periférica.
Doença cardiovascular é a causa líder de morbidez e de mortalidade em países
industrializados e progride constantemente em países emergentes, com
aterosclerose coronariana sendo a patologia subjacente principal. Terapia
corrente de aterosclerose não é completamente efetiva na prevenção
5
desenvolvimento e complicação de doença.
A doença é iniciada pelo acúmulo de lipoproteínas,
primariamente LDL, na matriz extracelular do vaso. Estas partículas de LDL
agregam-se e sofrem modificação oxidativa. LDL oxidada é tóxica e causa
lesão vascular. Aterosclerose apresenta, em muitos países, uma resposta a este
10
lesão incluindo inflamação e fibrose.
Níveis plásmicos altos de colesterol, e em partículas níveis
altos de LDL são geralmente reconhecidos como forças motrizes para o
desenvolvimento de aterosclerose enquanto que níveis altos de lipoproteína de
densidade alta (HDL) contra-atacam o desenvolvimento de aterosclerose.
15 HDL tem sido conseqüentemente chamada de colesterol bom enquanto que
LDL tem sido chamada de colesterol mau Simplificado, LDL transporta
colesterol para tecido enquanto que HDL absorve colesterol de tecido e o
transporta para o figado onde ele se torna degradado. Estratégias terapêuticas
para reduzir LDL e aumentar HDL estão sob desenvolvimento para o
20 tratamento de aterosclerose. Uma estratégia particularmente interessante e
promissora envolve uma variante mutada de HDL a denominada ApoAl milario. Esta variante de HDL é muito eficiente no transporte de colesterol dos
experimentos em animal e tecido (Shah et al., 1998) e resultados de testes
clínicos (Nissen et al., 2003) têm demonstrado que pode causar redução
25
significativa de carga de placa aterosclerótica.
Como sumariando no fundamento de WO 02/080954, Palinski
et al. (1989) identificaram autoanticorpos circulantes contra LDL oxidada em
humanos. Esta observação sugeriu que aterosclerose pode ser uma doença
autoimune causada por reações imunes contra lipoproteínas oxidadas. Neste
3
momento, vários laboratórios começaram a pesquisar associações entre títulos
de anticorpo contra LDL oxidada e doença cardiovascular.
Foi verificado que anticorpos contra LDL estão presentes em
pacientes com doença cardiovascular bem como em controles saudáveis. Isto
5 levou os pesquisadores a investigarem se reações autoimunes contra LDL
oxidada na parece vascular desempenhou um papel no desenvolvimento de
aterosclerose por imunização de animais contra sua própria LDL oxidada. A
idéia por trás desta abordagem foi que se reações autoimunes contra LDL
oxidada são reforçadas usando técnicas de imunização clássicas isto resultaria
10 em inflamação vascular aumentada e progressão aterosclerose. Para testas esta
hipótese coelhos foram imunizados com LDL oxidada homóloga e então
aterosclerose foi induzida pela alimentação dos animais com uma dieta alta
em colesterol por 16 semanas (Ameli et al., 1996; Freigang et ai., 1998).
Contudo, em contraste com a hipótese original, imunização com LDL oxidada
15 teve um efeito protetor reduzindo o desenvolvimento de aterosclerose com
cerca de 50%. Resultados similares também foram obtidos em um estudo
subseqüente no qual a dieta rica em colesterol foi combinada com lesão de
balão vascular para produzir um desenvolvimento de placa mais agressivo.
(Nilsson et al., 1997). Tomados juntos os dados sugerem que há reações
20 imunes que protegem contra o desenvolvimento de aterosclerose e que estas
envolvem autoimunidade contra LDL oxidada.
Estas observações sugeriram a possibilidade de
desenvolvimento de uma terapia imune ou "vacina" para tratamento de
doença vascular baseada em aterosclerose em homem. Uma abordagem para
25 fazer isto seria imunizar um indivíduo com sua própria LDL após ter sido
oxidada, por exemplo pela exposição ao cobre.
Palinski et al. (1995) e George et aL, (1998) têm mostrado
,
que imunização contra LDL oxidada reduz o desenvolvimento de
aterosclerose. Similarmente Zhou et ai., (2001) demonstraram que anticorpos
4
reativos com epítopos encontrados em formas oxidadas de LDL protegeram
contra o desenvolvimento de aterosclerose em modelos animais
WO 02/080954 relata que vacinação de animais propensos ao
desenvolvimento de aterosclerose com formas oxidadas de certos peptídeos
5 derivados de apolipoproteína B-100 (ApoB-100) protege-os do
desenvolvimento de aterosclerose. Experimentos prévios têm demonstrado
que anticorpos que se ligam em epítopos oxidados presentes em partículas de
LDL (Schipou et ai, 2004) protegem do desenvolvimento de placas
ateroscleróticas em modelos animais. Além disso, formas radiomarcadas de
10 anticorpos que se ligam em LDL oxidada também podem ser usadas para
radioimunodetecção de lesões ateroscleróticas em animais experimentais
(Tsimikas et ai, 2000). Um anticorpo marcado com 125Iodo anti-epítopo de
lisina-MDA foi usado para detectar placa em camundongos e coelhos, e foi
verificado que o anticorpo injetado está localizado em placas na aorta. Isto
15 indica que as reações imunes contra LDL oxidada podem possuir um efeito
protetor.
Também, foi mostrado que anticorpos recombinantes de
humano produzidos contra peptídeos modificados com MDA de ApoB-100 de
humano inibem significativamente a formação de placa em modelos animais
20 apropriados (Schiopu et ai, (2004); WO 2004/030607). Os mecanismos
subjacentes a este efeito sobre o desenvolvimento de placa não são
conhecidos, mas um efeito sobre ativação de macrófago e inflamação foi
sugerido (Schiopu et ai, 2004). É sabido que LDL oxidada ativa macrófagos
acarretando um processo inflamatório acelerado que por sua vez conduz à
25 aterosclerose (Smith et ai, 1995). Contudo, não houve expectativa, nem
qualquer evidência experimental, para sugerir que uma resposta imune contra
LDL oxidada, ou administração de anticorpos pré-preparados reativos contra
LDL oxidada, poderia resultar na regressão de lesões ateroscleróticas préexistentes.
5
Trabalho prévio também tem demonstrado que anticorpos
contra peptídeos oxidados derivados de ApoB-100 bem como anticorpos
contra outros epítopos de LDL oxidada incluindo fosfatidil-colina podem
prevenir o desenvolvimento de placas ateroscleróticas em modelos animais.
5 (2004/030607; US 6.716.410). Injeção de imunoglobulinas de humano
contendo anticorpos naturais anti-oxLDL reduziu a aterosclerose em
camundongos deficientes em ApoE (Nicoletti et ai., 1998).
Até onde sabemos, nenhum dos autores de qualquer uma
destas publicações reconheceram que anticorpos contra epítopos de LDL
10 oxidada podem causar regressão de placas ateroscleróticas, nem sugeriram
que tais anticorpos podem ser usados em pacientes humanos para redução da
carga de placa aterosclerótica.
Surpreendente e inesperadamente, agora temos verificado que
não apenas os anticorpos contra epítopos de LDL oxidada interferem com a
15 formação de placa, mas também induzem regressão de placas ateroscleróticas
já formadas. Tais anticorpos possuem um potencial para serem usados para
terapia de aterosclerose avançada para ativamente reverterem a progressão da
doença resultando em uma carga de placa reduzida.
Similarmente, visto que títulos de anticorpo específico em
20 mamíferos podem ser alcançados por imunização quer passiva quer ativa,
regressão de placas pré-existentes pode ser obtida por qualquer uma das duas
abordagens.
A presente invenção assim refere-se ao uso de imunoterapia
contra LDL oxidada para induzir regressão de placas ateroscleróticas pré25 existentes em um indivíduo.
A imunoterapia pode ser quer imunização ativa pela
administração de epítopos oxidados de LDL, ou imunização passiva pela
administração de anticorpos produzidos contra epítopos oxidados de LDL
Por "regressão de placas ateroscleróticas" incluímos o
)5
6
significado de redução do tamanho e/ou da quantidade e/ou da extensão de
placas ateroscleróticas. Tipicamente, regressão de placas ateroscleróticas
acarreta uma redução na área da superfície arterial interna coberta pelas
placas. Assim por "regressão de placas ateroscleróticas" incluímos redução de
5 carga de placa total no indivíduo, bem como redução do tamanho de algumas,
ou de todas, as placas ateroscleróticas individuais. Regressão de placas
ateroscleróticas também acarreta um aumento no lúmen vascular contribuindo
para fluxo sanguíneo aumentado.
Métodos para medir o tamanho e/ou a quantidade e/ou a
10 extensão de placas ateroscleróticas em um indivíduo são bem conhecidos pela
pessoa experiente na técnica e incluem angiografia, ultra-som vascular,
tomografia computadorizada e imagem de ressonância magnética.
Por "redução do tamanho e/ou da quantidade e/ou da
extensão" incluímos uma redução de cerca de 1-25%, tal como uma redução
15 de cerca de 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5%, ou uma redução maior do que cerca de 6
ou 7 ou 8 ou 9 ou 10%, ou uma redução de 10-25%. Mais preferida é uma
redução maior de 25-50%, ou 50-75%, ou maior.
Por redução da área arterial interna coberta por placas
ateroscleróticas incluímos uma redução de cerca de 1-25%, tal como uma
20 redução de cerca de 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5%, ou uma redução maior de cerca
de 6 ou 7 ou 8 ou 9 ou 10%, ou uma redução de 10-25%. Mais preferida é
uma redução maior de 25-50%, ou 50-75%, ou maior.
Por um aumento na seção transversal efetiva do vaso arterial
incluímos o significado de um aumento de 1-25%, tal como um aumento de
25 cerca de 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5%, ou um aumento maior de cerca de 6 ou 7 ou
8 ou 9 ou 10%, ou um aumento de 10- 25% Mais preferido é um aumento
maior de 25-50%, ou 50-75%, ou 75-100%. Mais preferivelmente, a seção
transversal efetiva do vaso arterial é aumentado 2- ou 3- ou 4- ou 5- ou 10vezes, ou mais. Claramente, a extensão do aumento de seção transversal do
%)-1
7
vaso arterial é dependente do nível de obstrução arterial causada pelas lesões
ateroscleróticas antes do tratamento.
As placas ateroscleróticas a serem regredidas são tipicamente
aquelas na aorta do indivíduo, mas também podem ser encontradas em outros
5
sítios arteriais no paciente como as artérias femoral, carótida e coronária.
Preferivelmente, a imunoterapia é direcionada contra epítopos
presentes em LDL oxidada mas não em LDL nativa. Tais epítopos podem ser
determinados usando métodos conhecidos por uma pessoa experiente na
técnica e descritos em WO 02/080954.
10
Ainda mais preferivelmente, a imunoterapia é direcionada
contra epítopos oxidados presentes em ApoB-100 em LDL oxidada.
LDL oxidada contém vários epítopos diferentes que podem ser
reconhecidos por anticorpos. LDL pode sofrer mudanças oxidativas e
degradantes através de uma ampla variedade de reações químicas diferentes.
15 Estas incluem reações causadas por tipos diferentes de modificações causadas
pela atividade de oxigênio, enzimas (e.g. mieloperoxidase), íons de metal (e.g.
Fe2+ e Cu2+), radicais livres e outros tipos de estresse químico
Alguns dos epítopos oxidados são encontrados na parte de
proteína da LDL (Yang et al.,.5001) mas outros são modificações de lipídeos
20 presentes na partícula de LDL. Muitos fosfolipídeos oxidativamente
modificados e biologicamente ativos podem ser formados (Heery et aL, 1995;
Friedman et al., 2002; Watson et ai., 1999). Ácidos graxos poliinsaturados
são convertidos em hidroperóxidos de ácido graxo, que rapidamente formam
produtos elevadamente reativos tais como malondialdeído e 4-hidróxi25 nonenal (Smiley et ai., 1991). Estes tipos de produtos intermediários podem
formar produtos tipo Michael e base de Schiff covalentes com a lisina em
proteína ApoB-100 de LDL. Aldeídos reativos também podem ser
encontrados em ácidos graxos ligados via ligações éster no grupo fosfatidilcolina (Witztum & Berliner, 1998). Freqüentemente encontrado é fosfolipídeo
8
1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosforil-colina (PAPC), um produto
de oxidação quase terminal que dá um aldeído em um carbono do ácido
araquinóide sn-2-oxidado, resultando em POVPC (1-palmitoil-2-(5-oxo)valeroil-sn- glicero-3-fosforil-colina). POVPC pode reagir com lisina e
5 também com fosfolipídeos contendo amina tais como fosfatidil-etanol-amina
e fosfatidil-serina. O resultado final é uma variedade de lipídeo-proteína
oxidada e adutos de lipídeo-lipídeo oxidados. Algumas destas oxidações são
conduzidas por enzimas tais como fosfolipase secretária (Leitinger et aL,
1999). Outras mudanças formadas por enzima tais como nitração e adição de
10 HOCL são realizadas por mieloperoxidase (Carr et al., 2000). Todos os neoepítopos são para serem considerados como imunogênicos e biologicamente
ativos (Mclntyre et ai., 1999; Esterbauer et aL, 1991). Também epítopos
críticos que são um resultado de uma modificação oxidada da partícula de
LDL mas em si mesmos não estão oxidados, como fosforil-colina e
15 fragmentos de proteínas, são marcas de partículas de LDL oxidada e tais
epítopos são selecionáveis por imunoterapia.
Recentemente os presentes inventores desenvolveram
anticorpos de humano de uma biblioteca de fragmento de anticorpo
recombinante chamado n-CoDeR® que foram direcionados contra peptídeos
20 oxidados derivados de ApoB-100 de humano (WO 02/080954). Estes
epítopos de peptídeo de ApoB-100, tomados da Tabela 1 de WO 02/080954,
são listados em Tabela 1, abaixo. Os anticorpos desenvolvidos protegeram
contra o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas em modelos animais
(Schiopu et aL, 2004; WO 2004/030607). As seqüências de anticorpos anti25 ApoB-100 oxidada descritas em WO 2004/030607, especialmente 1E1- A8,
IEI-D8, IEI-E3, IEI-G8, KTT-B8 e KTT-D6, são aqui incorporadas como
referência. Para a evitação de dúvida, cada um dos anticorpos descritos em
WO 2004/030607 e em Schiopu et aL, (2004) são exemplos de anticorpos que
podem ser usados no contexto da presente invenção.
9
Tabela 1
DO SEQÜÊNCIA DO PEPTÍDEO
NOME
PEPTÍDEO
Categoria A. alto em IgG, MDA-diferença
FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG
P 11.
P 25.
PQCSTHILQWLKRVHANPLL
P 74.
VISIPRLQAEARSEILAHWS
Categoria B. alto em IgM, sem MDA-diferença
P 40.
KLVKEALKESQLPTVMDFRK
LKEVTQAEGAKQTEATMTEK
P 68.
DGSLRHKELDSNIKESHVEK
P 94.
P 99.
KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE
RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
P 100.
SLTSTSDLQSGIIKNTASLK
P 102.
TASLKYENYELTLKSDTNGK
P 103.
P 105.
DMTFSKQNALLRSEYQADYE
MKVKIIRTIDQMQNSELQWP
P 177.
Categoria C. alto em IgG, sem MDA-diferença
P 143.
IALDDAICINFNEICLSQLQTY
KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH
P 210.
Categoria D. NHS/AHP, IgG-ak > 2, MDA-diferença
P1.
EEEMLENVSLVCPKDATRFK
P 129.
GSTSHHLVSRKSISAALEHK
IENIDFNKSGSSTASWIQNV
P 148.
P 162.
IREVTQRLNGEIQALELPQK
EVDVLTKYSQPEDSLIPFFE
P 252.
Categoria E. NHS/AHP, IgM-ak > 2, MDA-diferença
HTFLIYITELLKKLQSTTVM
P 301.
P 30.
LLDIANYLMEQIQDDCTGDE
CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ
P 31.
P 32.
GNMGQTMEQLTPELKSSILK
SSILKCVQSTKPSLMIQKAA
P 33.
P 34.
IQKAAIQALRKMEPKDKDQE
P 100.
RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
P 107.
SLNSHGLELNADILGTDICIN
P 149.
WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQ
TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ
P 169.
EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ
P 236.
Categoria F NHVAIIP, IgG-ak < 0.5, sem MDA-diferença.,
ALLVPPETEEAKQVLFLDTV
P 10.
IEIGLEGKGFEPTLEALFGK
P 45.
P 111.
SGASMKLTTNGRFREHNAKF
P 154.
NLIGDFEVAEKINAFRAKVH
GHSVLTAKGMALFGEGKAEF
P 199.
P 222.
FKSSVITLNTNAELFNQSDI
P 240.
FPDLGQEVALNANTKNQKIR
Categoria G., Sem nível de anticorpos IgG ou de IgM.
ATRFKHLRKYTNYQAQSSS
P2
SEQ ID No:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
.25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
10
Como mostrado na Tabela 1 acima, os peptídeos poderiam ser
agrupados em seis categorias com características comuns:
Categoria A: Fragmentos que produzem níveis altos de
Anticorpos IgG para peptídeos MDA-modificados (n=3).
5
Categoria B: Fragmentos que produzem níveis altos de
anticorpos IgM, mas sem diferença entre peptídeos nativos e MDAmodificados (n=9).
Categoria C: Fragmentos que produzem níveis altos de
anticorpos IgG, mas sem diferença entre peptídeos nativos e MDA-
10 modificados (n=2).
Categoria D: Fragmentos que produzem níveis altos de
anticorpos IgG para peptídeos MDA-modificados e pelo menos duas vezes
mais anticorpos na coleção-NHP em comparação com a coleção-AHP (n=5).
Categoria E: Fragmentos que produzem níveis altos de
15 anticorpos IgM para peptídeos MDA-modificados e pelo menos duas vezes
mais anticorpos na coleção-NHP em comparação com a coleção-AHP (n=11).
Categoria F: Fragmentos que produzem níveis altos de
anticorpos IgG, mas sem diferença entre peptídeos intactos e peptídeos MDAmodificados mas pelo menos duas vezes mais anticorpos na coleção-NHP em
20 comparação com a coleção-AHP (n=7).
É reconhecido que os fragmentos de peptídeo de ApoB-100
podem ser preparados usando técnicas de química de proteína por exemplo
usando proteólise parcial (quer exolítica que endoliticamente), ou por síntese
de novo. Alternativamente, as variantes podem ser preparadas por tecnologia
25 de DNA recombinante. Técnicas adequadas para clonagem, manipulação,
modificação e expressão de ácidos nucleicos, e purificação de proteínas
expressadas, são bem conhecidas na técnica e são descritas por exemplo em
3 rd
Sambrook et al. (2001) "Molecular Cloning, a Laboratory Manual",
edition, Sambrook et aL (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
93/
11
Spring Harbor, NY, USA, aqui incorporada como referência.
Por "peptídeo" incluímos não apenas moléculas nas quais os
resíduos de aminoácido são unidos por ligações peptídicas (-CO-NH-) mas
também moléculas nas quais a ligação peptídica está invertida. Tais
5 peptidomiméticos retro-inversos podem ser preparados usando métodos
conhecidos na técnica, por exemplo tais como aqueles descritos em Meziere
et ai, 1997. Esta abordagem envolve a preparação de pseudopeptídeos
contendo mudanças envolvendo a estrutura principal, e não a orientação de
cadeias laterais. Pelo menos para as respostas de célula auxiliar T de MEC de
10 classe II, foi mostrado que estes pseudopeptídeos são úteis. Peptídeos retroinversos, que contém ligações NH-CO em vez de ligações peptídicas CO-NH,
são muito mais resistentes à proteólise. Similarmente, a ligação peptídica
pode ser dispensada com tudo desde que seja usado um grupo ligante
apropriado que retém o espaçamento entre os átomos Ca dos resíduos de
15 aminoácido; é particularmente preferido se o grupo ligante possua
substancialmente a mesma distribuição de carga e substancialmente a mesma
planaridade de uma ligação peptídica Também é reconhecido que o peptídeo
pode ser convenientemente bloqueado em sua terminação N ou C de modo a
ajudar a reduzir a suscetibilidade à digestão exoproteolítica.
20
A invenção assim inclui o uso de epítopos de peptídeo
oxidados de ApoB-100 listados em Tabela 1, ou de um fragmento ativo de um
ou mais destes peptídeos, para imunoterapia contra LDL oxidada para induzir
regressão de placas ateroscleróticas pré-existentes, seja por imunização ativa
seja por imunização passiva i.e. administração de anticorpos produzidos
25
contra estes epítopos oxidados.
É reconhecido que para propósitos de vacinação, peptídeos
ApoB-100 podem ser administrados em qualquer forma oxidada ou não
oxidada. Isto é porque parece que se tomam oxidados quando administrados
in vivo. Assim por "administração de um epítopo oxidado de LDL" incluímos
12
administração de um epítopo não oxidado que se torna oxidado in vivo.
Para evitação de dúvida, no contexto desta invenção, todos os
anticorpos para imunização passiva se ligam em LDL oxidada.
Por um "fragmento" de um epítopo de peptídeo de ApoB-100
5 listado em Tabela 1 damos por significado pelo menos seus aminoácidos
consecutivos da seqüência dada. Assim um fragmento pode incluir 6 ou 7 ou
8 ou 9 ou 10 ou 11 ou 12 ou 13 ou 14 ou 15 ou 16 ou 17 ou 18 ou 19
aminoácidos consecutivos da seqüência dada Um fragmento "ativo" é um
que, quando oxidado, pode ser usado para produzir anticorpos que induzem
10 regressão de placas ateroscleróticas em um indivíduo por imunoterapia quer
ativa quer passiva. Métodos para determinar se qualquer fragmento particular
de epítopos de peptídeo listados em Tabela 1 são fragmentos ativos como
definidos são proporcionados nos Exemplos.
Em um aspecto da invenção, a imunoterapia compreende
15
administrar ao indivíduo pelo menos um anticorpo que seletivamente se liga
em um epítopo oxidado de LDL
A invenção assim inclui um método de induzir regressão de
placas ateroscleróticas em um indivíduo em necessidade da mesma, o método
compreendendo administrar ao indivíduo pelo menos um anticorpo que
20 seletivamente se liga em um epítopo oxidado de LDL.
A invenção também inclui o uso de pelo menos um anticorpo
que seletivamente se liga em um epítopo oxidado de LDL na preparação de
um medicamento que induz regressão de placas ateroscleróticas em um
indivíduo.
25
Em uma modalidade, administração de um anticorpo que
seletivamente se liga em um epítopo oxidado de LDL compreende administrar
ao indivíduo um polinucleotídeo codificador de citada molécula de anticorpo.
Método de liberar polinucleotídeos a um paciente são bem
conhecidos por uma pessoa experiente na técnica e incluem o uso de
13
imunolipossomos, vetores virais (incluindo vacínia, vacínia modificada, e
adenovírus), e por liberação direta de DNA, eg usando uma pistola de genes e
eletroporação. Por exemplo, Svensson et ai., 1999, descrevem a liberação de
genes recombinantes em cardiomiócitos por injeção intramiocardial ou
5 infusão intracoronariana de vetores cardiotrópicos, tais como vetores de vírus
adeno-associado recombinantes, resultando em expressão transgênica em
cardiomiócitos murinos in vivo. Melo et al. (2004) revisam terapias genéticas
e baseadas em célula para doença cardíaca. Uma rota de administração
preferida alternativa é via um cateter ou stent. Stents representam uma
10 alternativa atrativa para liberação de gene localizada, porque proporcionam
uma plataforma para eluição de gene e transdução eficiente de paredes
arteriais opostas. A estratégia de liberação de gene possui o potencial para
diminuir a disseminação sistêmica de vetores virais e conseqüentemente uma
resposta imune de hospedeiro reduzida. Ambos os revestimentos de stent
15 sintéticos e naturalmente ocorrentes têm mostrado potencial para permitir
eluição de gene prolongada sem reação adversa significativa. (Sharif et al.,
2004).
Preferivelmente, o polinucleotídeo codificador da molécula de
anticorpo é operativamente ligado nas seqüências alvo e/ou regulatórias que
20 dirigem a expressão do anticorpo para as artérias, e preferivelmente as
paredes arteriais. Assim o polinucleotídeo permite a geração de anticorpos
específicos dentro do indivíduo afetado. As seqüências alvo e regulatórias
adequadas são conhecidas pela pessoa experiente.
Pode ser desejável ser capaz de temporariamente regular a
25 expressão do polinucleotídeo na célula. Assim pode ser desejável que
expressão do polinucleotídeo esteja direta ou indiretamente (veja abaixo) sob
o controle de um promotor que pode ser regulado, por exemplo pela
concentração de uma molécula pequena que pode ser administrada ao
paciente quando é desejado ativar ou, mais provavelmente, reprimir
14
(dependendo de se a molécula pequena efetua ativação ou repressão do citado
promotor) expressão do anticorpo do polinucleotídeo. Isto pode ser de
beneficio particular se construto de expressão é estável, i.e. capaz de
expressar o anticorpo (na presença de quaisquer moléculas regulatórias
5 necessárias), na célula por um período de pelo menos uma semana, um, dois,
três, quatro, cinco, seis, oito meses ou um ou mais anos. Assim o
polinucleotídeo pode ser operativamente ligado em um promotor regulável.
Exemplos de promotores reguláves incluem aqueles referidos nos seguintes
documentos: Rivera et ai. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(15), 8657-62
10 (controle por rapamicina, uma droga oralmente biodisponível, usando dois
vetores de adenovírus e de vírus adeno-associado (AAV) separados, um
codificando um gene alvo de hormônio de crescimento de humano (hGH)
induzível, e o outro um fator de transcrição regulado por rapamicina
bipartite); Magari et aL (1997) J Clin Invest 100(11), 2865-72 (controle por
15 rapamicina); Bueler (1999) Biol Chem 380(6), 613-22 (revisão de vetores
virais adeno-associados); Bohl et al. (1998) Blood 92(5), 1512-7 (controle por
doxiciclina em vetor adeno-associado); Abruzzese et ai. (1996) JMoI Med
74(7), 379-92 (revisão de fatores de indução, eg. hormônios, fatores de
crescimento, citocinas, citostáticos, irradiação, choque térmico e elementos
20
responsivos associado).
Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo é um
anticorpo produzido contra um epítopo oxidado de LDL, tais como aqueles
listados em Tabela 1 e descritos em WO 02/080954. Como descrito em WO
02/080954, peptídeos podem ser oxidados pela exposição a uma variedade de
25 agentes tais como feno, oxigênio, cobre, mieloperoxidase, fosfolipase, ácido
hipocloroso, ou por modificação de manone-dialdeído (MDA), para imitar as
modificações diferentes dos aminoácidos que podem ocorrer durante a
oxidação de LDL. Alternativamente, outros métodos conhecidos na técnica
podem ser empregados para oxidar os epítopos de LDL.
15
Geração de anticorpos de humano reativos com peptídeos
derivados de ApoB-100 MDA-modificados tem sido descrita em WO
02/090854 e em Schiopu et al. (2004). Como discutido em detalhe abaixo,
anticorpos de humano, ou humano-semelhantes também podem ser gerados
5 usando outras tecnologias bem conhecidas na técnica, incluindo imunização
de camundongos transgênicos em locus de imunoglobulina de humano, ou por
humanização de e.g. anticorpos morenos com a especificidade desejada
Um anticorpo que "seletivamente se liga em um epítopo
oxidado de LDL" significa para nós que a molécula de anticorpo se liga no
10 epítopo oxidado de LDL com uma afinidade maior do que em uma LDL não
oxidada. Preferivelmente, o anticorpo se liga no epítopo oxidado de LDL com
afinidade pelo menos 1,5, ou pelo menos 2, ou pelo menos 5, ou pelo menos
10 ou pelo menos 50 vezes maior do que em LDL não oxidada. Mais
preferivelmente, a molécula de anticorpo se liga em epítopo oxidado de LDL
15 com afinidade de pelo menos 100, ou pelo menos 1.000, ou pelo menos
10.000 vezes maior do que em LDL não oxidada. Tal ligação pode ser
determinada por métodos bem conhecidos na técnica, tal como um dos
sistemas Biacore®. Preferivelmente, a molécula de anticorpo seletivamente se
liga em um epítopo oxidado de LDL e não se liga em LDL não oxidada.
20 É preferido que os anticorpos possuam uma afinidade pelo
epítopo alvo de pelo menos 104 M, embora anticorpos com afinidades mais
altas possam ser ainda mais preferidos.
É sabido que os efeitos protetores de imunidade humoral são
mediados por uma família de moléculas estruturalmente relacionadas
25 chamadas de anticorpos. Anticorpos iniciam sua atividade biológica pela
ligação em antígenos. Ligação de anticorpo em antígenos é geralmente
específica para um antígeno e a ligação é normalmente de afinidade alta.
Anticorpos são produzidos por linfócitos-B. Sangue contém muitos anticorpos
diferentes, cada um derivado de um clone de células-B e cada um possuindo
16
uma estrutura e uma especificidade distintas para o antígeno. Anticorpos estão
presentes sobre a superfície dos linfócitos-B, no plasma, em fluido intersticial
dos tecidos e em fluidos secretórios tais como saliva, mucos sobre superfícies
mucosais. Todos os anticorpos naturalmente ocorrentes são similares em sua
. 5 estrutura total, respondendo por certas similaridades em características físicoquímicas tais como carga e solubilidade. Todos os anticorpos possuem uma
estrutura central comum de duas cadeias leves idênticas, cada uma de cerca de
24 quilodaltons, e duas cadeias pesadas idênticas cada uma de cerca de 55-70
quilodaltons. Uma cadeia leve é ligada em cada cadeia pesada, e as duas
10 cadeias pesadas são ligadas uma na outra. Ambas as cadeias leves e pesadas
contêm uma série de unidades homólogas repetidas, cada uma de cerca de 110
resíduos de aminoácido em comprimento que se dobram independentemente
em um motivo globular comum, chamado de domínio de imunoglobulina (Ig).
A região de um anticorpo formada pela associação de duas cadeias pesadas é
15 hidrofóbica. É sabido que anticorpos, e especialmente anticorpos
monoclonais, clivam no sítio onde a cadeia leve se liga na cadeia pesada
quando são submetidos às condições físicas ou químicas adversas. Devido ao
fato de anticorpos conterem numerosos resíduos de cisteína, possuem muitas
ligações de dissulfeto de cisteína-cisteína. Todos os domínios de Ig contêm
20
duas camadas de folhas beta-dobradas com três ou quatro fitas de cadeias de
polinucleotídeo anti-paralelas.
A despeito de sua similaridade total, as moléculas de anticorpo
podem ser divididas em um número pequeno de subclasses e classes distintas
baseadas em características fisico-químicas tais como tamanho, carga e
25 solubilidade, e sobre seu comportamento em ligação em antígenos. Em
humanos, as classes de moléculas de anticorpo são: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM,
e é dito que os membros de cada classe são de mesmo isótipo. Isótipos IgA e
IgG são adicionalmente subdivididos em subtipos chamados IgA2, IgA2 e
IgGl IgG2, IgG3 e IgG4. As cadeias pesadas de todos os anticorpos em um
17
isótipo compartilham regiões extensivas de identidade de seqüência de
aminoácidos, as diferem dos anticorpos pertencentes aos outros isótipos ou
subtipos. IgG, IgE e IgD circulam como monômeros, enquanto que formas
secretadas de IgA e IgM são dímeros ou pentâmeros, respectivamente,
5 estabilizadas pela cadeia J. Algumas moléculas de IgA existem como
monômeros ou trímeros.
Por "anticorpo" ou "molécula de anticorpo" incluímos não
apenas as moléculas inteiras de imunoglobulina como descritas acima mas
também os seus fragmentos tais como Fab, F(abt)2, Fv e outros seus
10 fragmentos que retêm o sítio de ligação de antígeno. Similarmente o termo
anticorpo inclui derivados geneticamente engenhados de anticorpos tais como
moléculas Fv de cadeia única (scFv) e anticorpos de domínio (dAbs). O termo
também inclui moléculas semelhantes a anticorpo que podem ser produzidas
usando técnicas de exibição de fago ou outras técnica de seleção aleatória
15 para moléculas que se ligam em LDL oxidada ou em regiões especificadas
dela. Assim, o termo anticorpo inclui todas as moléculas que contêm uma
estrutura, preferivelmente uma estrutura de peptídeo, que é parte do sítio de
reconhecimento (i.e. parte do anticorpo que se liga em ou se combina com o
epítopo ou antígeno) de um anticorpo estrutural.
20
Domínios pesados variáveis (V H) e leves variáveis (V I) do
anticorpo estão envolvidos em reconhecimento de antígeno, um fato primeiro
reconhecido pelos primeiros experimentos de digestão com protease.
Confirmação adicional foi verificada por "humanização" de anticorpos de
roedor. Domínios variáveis de origem de roedor podem ser fusionados em
25 domínios constantes de origem humana de tal modo que o anticorpo
resultante retenha a especificidade antigênica de anticorpo parental de roedor
(Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA Z1, 6851-6855). Que
especificidade antigênica é conferida pelos domínios variáveis e é
independente dos domínios constantes é sabido dos experimentos envolvendo
18
a expressão bacteriana de fragmentos de anticorpo, todos contendo um ou
mais domínios variáveis. Estas moléculas incluem as moléculas Fabsemelhantes (Better et aL (1988) Science 240, 1041); moléculas Fv (Skerra et
ai. (1988) Science 240, 1038); moléculas de Fv de cadeia única (ScFv) onde
•
5 os domínios parceiros VH e VL são ligados via um oligopeptídeo flexível
(Bird et aL (1988) Science 242, 423; Huston et aL (1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85, 5879) e anticorpos de domínio único (dAbs) compreendendo
domínios V isolados (Ward et ai. (1989) Nature 341, 544). Uma revisão geral
de outras técnicas envolveu a síntese de fragmentos de anticorpo que retêm
10
seus sítios de ligação específica é encontrada em Winter & Milstein (1991)
Nature 349, 293-299.
"Moléculas ScFv " significam para nós moléculas nas quais os
domínios parceiros VH e V L são ligados via um oligopeptídeo flexível.
Anticorpos engenhados, tais como anticorpos ScFv, podem ser preparados
15 usando as técnicas e as abordagens descritas J. Huston et al., (1988) "Protein
engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an antidigoxin single chain Fv analogue produced in E. coli", Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 85, pp.5879-5883, e en A. Pluckthun, (1991) "Antibody engineering,
Advances from use of E. coli expression systems", Bio/technology 9(6): 54520
51, aqui incorporadas como referências.
As vantagens do uso de fragmentos de anticorpo, em vez de
anticorpos inteiros, são muito maiores. O tamanho menor dos fragmentos
pode acarretar propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como
penetração melhor no alvo. Funções efetoras de anticorpos inteiros, tal como
25 ligação de complemento, são removidas. Todos os fragmentos de anticorpo
Fab, Fv, ScFv e dAb podem ser expressados em e secretados de E. coli,
permitindo assim a produção de quantidades grandes de fragmentos.
Anticorpos inteiros, e fragmentos F(ab') 2 são "bivalentes".
"Bivalente" significa para nós que os anticorpos e os fragmentos F(ab')2
19
possuem dois sítios de combinação de antígeno. Em contraste, fragmentos
Fab, Fv, ScFv e dAb são monovalentes, possuindo apenas um sítio de
combinação de antígeno.
É preferido que o anticorpo seja um anticorpo monoclonal Em
5 algumas circunstâncias, particularmente se o anticorpo for para ser
administrado repetidamente em um paciente humano, é preferido que o
anticorpo monoclonal seja um anticorpo monoclonal de humano ou um
anticorpo monoclonal humanizado.
Anticorpos monoclonais adequados que são reativos como
10 aqui descrito podem ser preparados por técnicas conhecidas, por exemplo
aquelas descritas em "Monoclonal Antibodies; A manual of techniques", H
Zola (CRC Press, 1988) e em "Monoclonal Hybridoma Antibodies:
Techniques and Application", SGR Hurrell (CRC Press, 1982).
Os anticorpos podem receber propriedades desejadas em
15 relação a, e.g. especificidade e reatividade cruzada, isótipo, afinidade e meiavida em plasma. A possibilidade de desenvolver anticorpos com propriedades
predeterminadas se torna evidente já com o advento da tecnologia de
anticorpo monoclonal (Milstein e Kõhler, 1975 Nature, 256: 495-7). Esta
tecnologia usou células de hibridoma de murino produtoras de quantidades
20 grandes de anticorpos idênticos, mas de murino. De fato, um grande número
de testes pré-clínicos, e também clínicos foram iniciados usando anticorpos
monoclonais morenos para tratamento de e.g. cânceres. Contudo, devido ao
fato de que os anticorpos foram de origem não-humana o sistema imune dos
pacientes reconheceu-os como estranhos e desenvolveu anticorpos para eles.
25 Como uma conseqüência a eficácia e as meia-vidas de placa dos anticorpos
morenos foram diminuídas, e muitas vezes efeitos colaterais de reações
alérgicas, causados pelo anticorpo estranho, preveniram o tratamento bem
sucedido.
Para solucionar estes problemas foram tomadas várias
20
abordagens para reduzir o componente murino do anticorpo específico e
potencialmente terapêutico. A primeira abordagem compreendeu tecnologia
para preparar os anticorpos denominados quiméricos onde os domínios
variáveis murinos do anticorpos foram transferidos para regiões constantes de
5 humano resultando em um anticorpo que foi principalmente de humano
(Neuberger et al., 1985, Nature 314: 268-70; Neuberger et al., 1998, 8th
InteraiolBchgySmposiuPart2,79-).
Um refinamento adicional desta abordagem foi o
desenvolvimento de anticorpos humanizados onde as regiões do anticorpo
10 murino que contataram o antígeno, as Regiões Determinantes de
Complementaridade (CDRs) foram transferidas para uma estrutura de
anticorpo de humano. Tais anticorpos já são completamente humanos e
raramente causarão quaisquer respostas de anticorpo nocivas quando
administrados aos pacientes. Vários anticorpos quiméricos ou humanizados
15 têm sido registrados como drogas terapêuticas e são agora amplamente usados
em várias indicações (Borrebaeck & Carlsson, 2001, Curr. Opin. Pharmacol.
1: 404-408).
É preferido que o anticorpo seja um anticorpo humanizado.
Anticorpos de não-humano adequadamente preparados podem ser
20 "humanizados" em modos conhecidos, por exemplo pela inserção das regiões
CDR de anticorpos de camundongo na estrutura de anticorpos de humano.
Anticorpos humanizados podem ser preparados usando as técnicas e as
abordagens descritas em Verhoeyen et al. (1988) Science, 239, 1534-1536, e
em Kettleborough et al., (1991) Protein Engineering, 14(7), 773-783.
25 Anticorpos completamente de humano podem ser produzidos
usando tecnologias recombinantes. Tipicamente são usadas bibliotecas
grandes compreendendo bilhões de anticorpos diferentes. Em contraste às
tecnologias prévias empregando quimerização ou humanização de e.g.
anticorpos murinos esta tecnologia não se baseia em imunização de animais
21
para gerar o anticorpo específico. Em vez disso as bibliotecas recombinantes
compreendem um número enorme de variantes de anticorpo pré-preparado
nas quais é provável que a biblioteca possuirá pelo menos um anticorpo
específico para qualquer antígeno. Assim, usando tais bibliotecas, um
5 anticorpo existente possuindo as características de ligação desejadas pode ser
identificado. Com o objetivo de encontrar o ligante bom em uma biblioteca
em uma maneira eficiente, têm sido planejados vários sistemas onde fenótipo
i.e. o anticorpo ou fragmento de anticorpo é ligado em seu genótipo i.e. o
gene codificador O tal sistema mais comumente usado é o denominado
10 sistema de exibição de fago onde fragmentos de anticorpo são expressados,
exibidos, como fusões com proteínas de capa de fago sobre a superfície de
partículas de fago filamentoso, enquanto simultaneamente trazendo a
informação genética codificadora de molécula exibida (McCafferty et al.,
1990, Nature 348: 552-554). Fragmentos de anticorpo de exibição de fago
15 específicos para um antígeno particular podem ser selecionados através de
ligação no antígeno em questão. Fago isolado pode ser então amplificado e o
gene codificação de domínios variáveis de anticorpo selecionado pode ser
opcionalmente transferido para outros formatos de anticorpo, tal como e.g.
imunoglobulina de comprimento total, e expressado em quantidades altas
20
usando vetores e células hospedeiras apropriados conhecidos na técnica.
O formato de especificidades de anticorpo exibido sobra
partículas de fago pode diferir. Os formatos mais comumente usados são Fab
(Griffiths et al., 1994. EMBO J. 13: 3245- 3260) e cadeia única (scFv)
(Hoogenboom et al., 1992, J Mo/ Biol. 227: 381- 388) ambos compreendendo
25 os domínios de ligação de antígeno variável de anticorpos. O formato de
cadeia única é composto de um domínio pesado variável (V H) ligado em um
domínio leve variável (V I) via um ligante flexível (US 4,946,778). Antes do
uso como um agente terapêutico, o anticorpo pode ser transferido para um
formato solúvel e.g. Fab ou scFv e analisado como tal. Nas últimas etapas o
22
fragmento de anticorpo identificado para possuir características desejáveis
pode ser transferido ainda para outros formatos tais como anticorpos de
comprimento total.
Recentemente uma tecnologia nova para geração de
5 variabilidade em bibliotecas de anticorpo foi apresentada (WO 98/32845;
Soderlind et al. (2000) Nature BioTechnol. 18:852-856). Todos os fragmentos
de anticorpo derivados desta biblioteca possuem as mesmas regiões de
estrutura e apenas diferem em suas CDRs. Visto que as regiões de estrutura
são de seqüência de linhagem germinativa é esperado que a imunogenicidade
10 de anticorpos derivados da biblioteca, ou de bibliotecas similares produzidas
usando a mesma tecnologia, seja particularmente baixa (Soderlind et al.,
2000). Esta propriedade é de grande valor para anticorpos terapêuticos,
reduzindo o risco de que o paciente forme anticorpos para o anticorpo
administrado, reduzindo deste modo os riscos de reações alérgicas, a
15 ocorrência de anticorpos bloqueadores, e permitindo uma meia-vida plásmica
longa do anticorpo.
Assim, quando se desenvolvem anticorpos terapêuticos a
serem usados em humanos, tecnologia de biblioteca recombinante moderna
(Soderlind et al., 2001, Comb. Chem. & High Throughput Screen. 4: 40920
416) é agora usada em preferência à tecnologia de hibridoma inicial.
É reconhecido que os peptídeos identificados em WO
02/080954 listados em Tabela 1 podem ser usados como antígenos para
geração de anticorpos totalmente de humano com propriedades
predeterminadas, que podem ser particularmente relevantes como anticorpos
25 terapêuticos para induzir regressão de placas ateroscleróticas. Não é esperado
que os anticorpos totalmente de humano resultantes gerem qualquer reação
imunológica indesejada quando administrados em pacientes.
Certos anticorpos preferidos incluem aqueles que se ligam em
epítopos de ApoB-100 P45 (resíduos de aminoácido 661-680) e/ou P143
9
23
(resíduos de aminoácido 2131-2150). Anticorpos possuindo esta
especificidade de ligação incluem 1E1-13 (Schiopu et al. 2004) e 2D03
(descrito em Exemplo 2).
a
Tem sido previamente mostrado que anticorpo IEI-E3 inibe
5 significativamente o desenvolvimento de placa em um modelo animal
(Schiopu et aL, 2004). Agora temos mostrado (veja Exemplos) que ele pode
induzir regressão de placas ateroscleróticas. Também temos demonstrado que
todos os anticorpos anti-LDL oxidada com uma especificidade diferente i.e.
2D03, LDO-D4 e KTT-B8, mas não o anticorpo de controle FITC-8,
10 poderiam significativamente reduzir o nível de placa em aorta em comparação
com a área de placa vista nos animais antes do início do tratamento. As
seqüências de CDR dos anticorpos são listadas em Tabela 2. As seqüências
VII e VL de anticorpos IEI-E3, 2D03 e KTT-B8 são dadas em Figura 3 de WO
2004/030607, e são aqui incorporadas como referências.
Tabela 2. Seqüências de aminoácidos de CDRs encontradas em anticorpos anti-oxLDL
H1
9
Ll
L2
-
2D03
FSNAWMSWVRQAPG
(SEQ ID No: 39)
SSISVGGHRTYYADSVKGR
(SEQ ID No: 40)
ARIRVGPSGGAFDY
(SEQ ID No: 41)
CSGSNTNIGKNYVS
(SEQ ID No: 42)
ANSNRPS (SEQ ID No: 43)
CASWDASLNGWV
(SEQ ID No: 44)
LDO-D4
FSNAWMSWVRQAPG
(SEQ ID No: 45)
SSISTSSNYIYYADSVKGR
(SEQ ID No: 46)
ARVKKYSSGWYSNYAFDI
(SEQ ID No: 47)
CSGSSSSIGNNFVS
(SEQ ID No: 48)
DNNKRPS (SEQ ID No: 49)
CAAWDDSLNGWV
(SEQ ID No: 50)
IEI-E3
FSDYYMSWVRQAPG
(SEQ ID No: 51)
SGVSWNGSRTHYADSVKGR
(SEQ ID No: 52)
ARAARYSYYYYGMDV
(SEQ ID No: 53)
CSGSSSNIGNNAVN
(SEQ ID No: 54)
GNDRRPS (SEQ ID No: 55)
CQTWGTGRGV
(SEQ ID No: 56)
KTT-B8
FSSYAMSWVRQAPG (SEQ
ID No: 57)
SSISSSGRFIYYADSMKGR
(SEQ ID No: 58)
TRLRRGSYFWAFDI (SEQ ID
No: 59)
CSGSSSNIGGESVS (SEQ ID
No: 60)
SNNQRPS (SEQ ID No: 61)
CAAWDDSLNGWV (SEQ ID
No: 62)
IN)
25
Em outro aspecto da invenção, a imunoterapia compreende
administrar ao indivíduo pelo menos um epítopo oxidado de LDL. O pelo
menos um epítopo oxidado de LDL atua para induzir uma resposta imune
contra o epítopo oxidado de modo a induzir regressão de placas
5 ateroscleróticas em um indivíduo. Em outras palavras, o pelo menos um
.
epítopo oxidado de LDL atua como uma vacina para produzir uma resposta
imune que induz regressão de placas ateroscleróticas no indivíduo vacinado.
A invenção assim inclui um método de induzir regressão de
placas ateroscleróticas em um indivíduo em necessidade da mesma, o método
10 compreendendo administrar ao indivíduo pelo menos um epítopo oxidado de
LDL.
A invenção também inclui o uso de pelo menos um epítopo
oxidado de LDL na preparação de um medicamento para induzir regressão de
placas ateroscleróticas em um indivíduo.
15
Tipicamente, o indivíduo é um mamífero, tal como um cavalo,
uma vaca, uma ovelha, um porco, um camelo, um cão, ou um gato. Mais
preferivelmente, o indivíduo é um indivíduo humano.
O indivíduo humano é tipicamente um paciente que possui, ou
está sob risco de possuir, uma doença cardiovascular associada com
20 aterosclerose. O termo "doença cardiovascular associada com aterosclerose"
inclui referências às doenças que estão medicamente ligadas à aterosclerose
pelo fato de que são uma conseqüência de lesões ateroscleróticas. Doenças
cardiovasculares associadas com aterosclerose que podem ser mencionadas
incluem doença de artéria coronária, infarto miocardial e derrames cerebrais.
25 Se é ou não esperado que um paciente particular se beneficie
do tratamento pode ser determinado pelo médico.
É reconhecido que visto que os métodos e usos da invenção
acarretam regressão de placas ateroscleróticas pré-existentes, a invenção
inclui redução de risco de uma doença cardiovascular associada com
26
aterosclerose em um paciente que está sob risco de desenvolver as citadas
doenças cardiovasculares devido à presença das placas ateroscleróticas.
O paciente que está sob risco de uma doença cardiovascular
associada com aterosclerose pode ser um que possui níveis de colesterol do
5 sangue que são propensos a causarem ou exacerbarem a disfunção ou doença
cardiovascular.
O paciente pode ser um que está sob risco de desenvolver
doença cardíaca coronariana por causa de múltiplos fatores de risco (incluindo
obesidade, fumo, hipertensão, diabetes mellitus e história familiar de doença
10 cardíaca coronariana ). um com uma condição familiar caracterizada por
concentrações plásmicas muito altas de colesterol e/ou de triglicerídeos; um
com hiperlipidemia não secundárias às doenças subjacentes (tais como
hipotiroidismo, síndrome nefrótica, doença hepática ou alcoolismo); um com
LDL-colesterol elevado; ou um sob intervenção hipolipidêmica dietética
15
(tratamento complementar).
É adicionalmente reconhecido que visto que os métodos e usos
da invenção levam à redução no tamanho de placas ateroscleróticas préexistentes, a invenção é particularmente útil para tratar pacientes com
aterosclerose severa ou avançada, e formas severas ou avançadas da doença
20
cardiovascular associada com aterosclerose.
Em uma modalidade, a invenção pode compreender a etapa
prévia de determinar o tamanho e/ou a quantidade e/ou a extensão de placas
ateroscleróticas no indivíduo. Isto pode ser feito para avaliar se o indivíduo
está em necessidade de tratamento para reduzir sua carga de placa
25 aterosclerótica, ou para proporcionar uma medição de linha base para avaliar
a eficácia de tal tratamento, ou para ambos os propósitos.
Assim a invenção pode ser considerada como incluindo um
método de identificar um paciente com uma carga de placa aterosclerótica em
necessidade de redução, e subseqüentemente administrar ao indivíduo pelo
27
menos um anticorpo que seletivamente se liga em um epítopo oxidado de
LDL, ou pelo menos um epítopo oxidado de LDL.
É reconhecido que uma carga de placa aterosclerótica em
necessidade de redução pode ser devido ao tamanho e/ou à extensão da carga
5 de placa total. Adicional ou alternativamente, isto poderia ser devido à
natureza das placas, por exemplo, quanto instáveis elas são.
A invenção também pode ser considerada como incluindo o
uso de pelo menos um anticorpo que seletivamente se liga em um epítopo
oxidado de LDL, ou pelo menos um epítopo oxidado de LDL, na preparação
10 de um medicamento para induzir regressão de placas ateroscleróticas em um
indivíduo que tem sido avaliado como estando em necessidade de tal
tratamento pela medição do tamanho e/ou da quantidade e/ou da extensão de
placas ateroscleróticas no indivíduo.
Opcionalmente, e tipicamente, a invenção também pode
15 compreender a etapa subseqüente de determinar o tamanho e/ou a quantidade
e/ou a extensão de placas ateroscleróticas no paciente após a administração de
pelo menos um anticorpo que seletivamente se liga em um epítopo oxidado de
LDL, ou no pelo menos um epítopo oxidado de LDL, de modo a avaliar a
eficácia do tratamento em comparação com uma medição de linha base
20 tomada antes do tratamento.
A dose de pelo menos um anticorpo que seletivamente se liga
em um epítopo oxidado de LDL administrada ao paciente será tipicamente
determinada pelo médico baseado em considerações tais como a condição
aterosclerótica do paciente a ser tratado, outros agentes de tratamento a serem
25 administrados, a idade, o sexo e o tamanho do paciente, e assim por diante.
Tipicamente, contudo, a dose de pelo menos um epítopo oxidado de LDL
administrada ao paciente será determinada pelo médico baseado no peso
corporal do paciente a ser tratado.
Tem sido provado que estatinas (inibidores de 3-hidróxi-3-
28
metil-glutarol-coenzima A (HMG-CoA) redutase) são efetivas na prevenção
de eventos cardiovasculares agudos pela redução de conteúdo plásmico de
colesterol (e por mecanismos adicionais ainda a serem tornados claros).
Administração de uma estatina conjuntamente com a imunoterapia descrita
5 acima pode ser um meio útil de tratamento para suplementar a regressão de
placas ateroscleróticas. Preferivelmente os dois regimes de dosagem são
escolhidos para terem um efeito sinérgico.
Assim um outro aspecto da invenção proporciona um método
de combater uma doença cardiovascular associada com aterosclerose em um
10 indivíduo em necessidade da mesma, o método compreendendo: induzir a
regressão de placas ateroscleróticas em um indivíduo pela administração ao
indivíduo de: (a) pelo menos uma molécula de anticorpo que seletivamente se
liga em um epítopo oxidado de LDL, ou (b) pelo menos um epítopo oxidado
de LDL; e administrar uma estatina ao indivíduo.
Um outro aspecto da invenção proporciona o uso de: (a) pelo
15
menos uma molécula de anticorpo que seletivamente se liga em um epítopo
oxidado de LDL, ou (b) pelo menos um epítopo oxidado de LDL; na
preparação de um medicamento para combater uma doença cardiovascular
associada com aterosclerose pela indução de regressão de placas
20 ateroscleróticas, no qual o indivíduo é um ao qual uma estatina é
administrada.
Um aspecto relacionado da invenção proporciona o uso de
uma estatina na preparação de um medicamento para combater uma doença
cardiovascular associada com aterosclerose, no qual o indivíduo é um ao qual
25 é administrada(o): (a) pelo menos uma molécula de anticorpo que
seletivamente se liga em um epítopo oxidado de LDL, ou (b) pelo menos um
epítopo oxidado de LDL para induzir a regressão de placas ateroscleróticas.
Ainda um aspecto relacionado da invenção proporciona o uso
de: (a) pelo menos uma molécula de anticorpo que seletivamente se liga em
29
um epítopo oxidado de LDL, ou (b) pelo menos um epítopo oxidado de LDL,
e uma estatina, na preparação de um medicamento para combater uma doença
cardiovascular associada com aterosclerose pela indução de regressão de
placas ateroscleróticas.
5
É adicionalmente proporcionada uma formulação farmacêutica
compreendendo: (a) pelo menos uma molécula de anticorpo que
seletivamente se liga em um epítopo oxidado de LDL, ou (b) pelo menos um
epítopo oxidado de LDL, e uma estatina, misturada com um veículo, diluente
ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.
Ainda um outro aspecto da invenção proporciona A kit de
10
partes compreendendo componentes: (a) pelo menos uma molécula de
anticorpo que seletivamente se liga em um epítopo oxidado de LDL, ou (b)
pelo menos um epítopo oxidado de LDL; e uma estatina, no qual os
componentes são cada um proporcionados em uma forma que é adequada
15 para administrar conjuntamente com o outro.
Por "conjuntamente" nós incluímos o significado de que os
componentes podem ser adequados para administração simultânea ou
combinada ao paciente. Contudo, visto que pode ser necessário que os
componentes sejam administrados por rotas diferentes ou em velocidades
20 diferentes, por "conjuntamente" incluímos o significado de administração
consecutiva ou administração separada dentro do mesmo regime de
tratamento.
Estatinas adequadas incluem atorvastatina, cerivastatina,
fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pravastatina, rosuvastatina e
25 sinvastatina.
Em uma modalidade da invenção, o anticorpo pode ser
copulado em um agente antiinflamatório. Agentes antiinflamatórios
adequados incluem compostos esteroidais tais como dexametasona,
betametasona, prednisona, prednisolona, triancinolona, hidrocortisona,
30
alclometasona ancinonida, diflorasona, etc. bem como antiinflamatórios nãoesteroidais. Métodos para copular compostos, tais com os agentes
antiinflamatórios listados acima, em anticorpos são bem conhecidos na
técnica.
Um outro aspecto da invenção proporciona um método de
5
identificar um anticorpo que induz regressão de placas ateroscleróticas em um
indivíduo, o método compreendendo: proporcionar um anticorpo que
seletivamente se liga em um epítopo oxidado de LDL, e testá-lo em um ensaio
para regressão de placa aterosclerótica, no qual regressão de placas
10 ateroscleróticas no ensaio indica que o anticorpo é um que induz regressão de
placas ateroscleróticas.
O ensaio de regressão de placa aterosclerótica pode ser um
ensaio in vivo tal como os modelos animais descritos em Exemplo 2 ou 4.
Preferivelmente, o anticorpo testado tem sido isolado de uma
15
biblioteca de fragmento de anticorpo de humano como descrito acima.
Ainda preferivelmente, o anticorpo testado seletivamente se
liga em um peptídeo oxidado, em particular MDA-modificado, derivado de
ApoB-100.
Fragmentos de anticorpo identificados com características
20 desejadas de regressão de placa aterosclerótica podem ser então reconstruídos
em outras configurações de anticorpo, e.g. imunoglobulina de humano de
comprimento total, para serem usados para propósitos terapêuticos.
Ainda um outro aspecto da invenção proporciona um método
de identificar um agente que induz regressão de placas ateroscleróticas em um
25 indivíduo, o método compreendendo: proporcionar um agente
compreendendo um epítopo oxidado de LDL, administrar o agente a um
indivíduo que possui placas ateroscleróticas, e determinar se o citado agente
induz regressão de placas ateroscleróticas, no qual regressão de placas
ateroscleróticas indica que o agente é um que induz regressão de placas
40
31
ateroscleróticas.
É reconhecido que o indivíduo pode ser um modelo animal de
aterosclerose, tal como descrito em Exemplo 2 ou 4. Alternativamente, o
método pode ser empregado no contexto de um teste clínico do agente, em
5 cujo caso o indivíduo pode ser um indivíduo humano que possui placas
ateroscleróticas.
Um aspecto final da invenção proporciona um anticorpo
compreendendo: pelo menos uma região determinante de complementaridade
(CDR) que possui a seqüência de aminoácidos da correspondente CDR de
10 anticorpo 2D03 como mostrado em Tabela 2, ou pelo menos uma CDR que
possui a seqüência da correspondente CDR de anticorpo LDO D4 como
mostrado em Tabela 2.
Mais preferivelmente, o anticorpo possui duas ou três ou
quatro ou cinco CDRs que possuem a seqüência de correspondentes CDRs de
15 anticorpo 2D03 ou de LDO D4.
Se o anticorpo tiver três ou quatro CDRs que possuem a
seqüência das correspondentes CDRs de anticorpo 2D03 ou de LDO D4, é
preferido que o anticorpo possuam todas as três CDRs de cadeia pesada ou
todas as CDRs de cadeia leve que possuem a seqüência das correspondentes
20 CDRs de anticorpo 2D03 ou de LDO D4.
Assim este aspecto da invenção inclui um anticorpo
compreendendo: três CDRs de cadeia leve que possuem a seqüência das
correspondentes três CDRs de cadeia leve de anticorpo 2D03, ou as três
CDRs de cadeia pesada que possuem a seqüência das correspondentes três
25 CDRs de cadeia pesada de anticorpo 2D03, ou três CDRs de cadeia leve que
possuem a seqüência das correspondentes três CDRs de cadeia leve de
anticorpo LDO D4, ou as três CDRs de cadeia pesada que possuem a
seqüência das correspondentes três CDRs de cadeia pesada de anticorpo LDO
D4.
32
Ainda mais preferivelmente, o anticorpo compreende três
CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada que possuem a seqüência
das correspondentes CDRs de anticorpo 2D03, ou três CDRs de cadeia leve e
três CDRs de cadeia pesada que possuem a seqüência das correspondentes
5 CDRs de anticorpo LDO D4.
Se o anticorpo não compreender todas as seis CDRs que
possuem a seqüência das correspondentes CDRs de anticorpo 2D03 ou LDO
D4, é preferido que algumas das ou todas as 1, 2, 3, 4 ou 5 CDRs "nãoidênticas" compreendam uma variante de seqüência das correspondentes
10 CDRs de anticorpo 2D03 ou LDO D4. Por "uma variante" incluímos o
significado de que a variante possui pelo menos 50% de identidade de
seqüência com a seqüência da correspondente CDR, mais preferivelmente
pelo menos 70%, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% ou pelo menos
90% ou pelo menos 95% Mais preferivelmente, a variante possui 96% ou
15 97% ou 98% ou 99% de identidade de seqüência com a seqüência da
correspondente CDR de anticorpo 2D03 ou LDO D4. Tipicamente a
seqüência de CDR "variante" possui 5 ou 4 ou 3 ou 2 ou apenas 1 resíduo de
aminoácido diferente da seqüência da correspondente CDR de anticorpo
2D03 ou LDO D4.
Este aspecto da invenção inclui anticorpo 2D03, e anticorpo
20
LDO D4.
A invenção também inclui um anticorpo que seletivamente se
liga em no epítopo oxidado de LDL que é seletivamente ligado pelo anticorpo
2D03 ou pelo anticorpo LDO D4. Métodos para determinar se qualquer
25 anticorpos dados seletivamente se liga no epítopo oxidado de LDL que é
seletivamente ligado pelo anticorpo 2D03 ou pelo anticorpo LDO D4 são bem
conhecidos pela pessoa experiente na técnica.
A invenção também inclui uma composição farmacêutica
compreendendo um anticorpo de acordo com este aspecto da invenção e um
33
veículo farmaceuticatnente aceitável; um anticorpo deste aspecto da invenção
para uso em medicina; e o uso de um anticorpo de acordo com este aspecto da
invenção na preparação de um medicamento para induzir regressão de placas
ateroscleróticas.
5
Todos os documentos aqui referidos são aqui incorporados, em
sua totalidade, como referências.
A listagem ou discussão de um documento anteriormente
publicado neste relatório descritivo não deve ser necessariamente considerado
como um reconhecimento de que o documento é parte da técnica ou é
10 conhecimento geral comum.
Esta invenção agora será descrita com mais detalhes com
referência aos seguintes Exemplos e Figuras.
Figura 1. ELISA de luminescência demonstrando a ligação de
anticorpos 2D03 e IEI-E3 em formas nativas e oxidadas de LDL e ApoB-100.
15 O prefixo MDA representa formas MDA-modificadas de LDL e ApoB-100
enquanto que Na representa as formas nativas destas entidade. Cu-LDL
representa LDL oxidada por cobre. Ligação foi detectada com IgG antihumano conjugada em peroxidase (RLU = unidades relativas de
luminescência).
20
Figura 2. Análise baseada em ELISA de ligação de anticorpos
2D03 e IEI-E3 em ApoB-100 de humano MDA-modificado. Controle
corresponde à ligação de anticorpo FITC-8 no mesmo antígeno. Afinidades
foram determinadas por análise Biacore.
Figura 3. Ligação de fragmento de cadeia única (scFv) of IEI-
25 E3 e 2D03 em números antígenos MDA-modificados diferentes. P2
(aminoácidos [aa] 16-31); P45 (aa 661-680); P129 (aa 1921-1940); P143 (aa
2131-2150); P210 (aa 3136-3155); e P301 (aa 4502-4521) são peptídeos
correspondendo à regiões especificadas de seqüência de ApoB-100 de
humano. O peptídeo de controle foi um peptídeo contendo lisina não-
34
relevante (MDA-modificado negro). Dados são plotados como sinal/10 5 .
Abreviações são como definidas no texto.
Figura 4. Coloração imuno-histoquímica de placas de humano
com 2D03, IEI-E3 e um anticorpo de controle FITC-8. Anticorpo ligado foi
5 detectado com um anti-anticorpo conjugado com peroxidase de rábano e
coloração de diamino-benzidina.
Figura 5. Área de placa na aorta descendente de camundongos
ApoBec ateroscleróticos tratados com anticorpo 2D03 e IEI-E3, LDO-D4 e
KTT B 8 que são específicos para LDL oxidada. O anticorpo FITC-8 isótipo
10 combinado foi usado como um controle. Área de placa foi avaliada por
coloração de Oil Red O. Os valores são expressados como percentagem de
área de placa total por área total da aorta descendente.
Figura 6. Tratamento de macrófagos derivados de monócito de
humano com IgG anti-ApoB-100 oxidada bloqueia liberação de MCP-1
15 release. Macrófagos derivados de monócito de humano, pré-cultivados por 10
dias na presença de soro de humano, foram tratados com 60 pg/mL de clones
de IgG anti-ApoB-100 oxidada, IgG de controle negativo, ou apenas solução
salina, como indicado, por 4 dias. Sobrenadantes foram isolados e analisados
para conteúdo de MCP-1 usando um ELISA comercialmente disponíveis.
20 Dados são médias de valores de triplicata obtidos de quatro doadores com
SEM.
Figura 7. O efeito de bloqueio de MCP-1 de IgG anti-ApoB100 oxidada sobre macrófagos ateroma-semelhantes é rápido e estável no
decorrer do tempo. Monócitos de humano e macrófagos derivados de
25 monócito de humano foram obtidos de dois doadores (círculos ou quadrados,
respectivamente). As células foram tratadas com 60 µg/ml de anticorpo 2D03
(símbolos fechados) ou com o anticorpo de controle (símbolos abertos) quer
imediatamente (conjunto esquerdo de gráficos) quer após a pré-cultura de
monócitos por 14 dias na presença de soro de humano (conjunto direito de
35
gráficos). Sobrenadantes foram isolados e analisados para conteúdo de
quimiocina MCP-1 CC usando um ELISA comercialmente disponível Dados
são médias de valores de triplicata com SEM.
Exemplo 1: Geração de anticorpos de humano com afinidade e
5
especificidade altas por epítopos presentes em LDL oxidada
Fragmentos de anticorpo de humano ligando com
especificidade para LDL oxidada foram selecionados da biblioteca n-CoDeR
essencialmente como descrito (Schiopu et al., 2004). Resumidamente; a
biblioteca foi expressada com exibição de fago e selecionada para ligação em
10 uma mistura de peptídeos oxidados biotinilados derivados de ApoB-100.
Fagos de ligação foram selecionados com glóbulos magnéticos revestidos
com avidina em 2-3 rodadas de seleção (Soderlind et al., (2000) Nature
BioTechnol. 18: 852-856) e finalmente triados para ligação em formas MDAe Cu-oxidadas de LDL e ApoB-100. Os anticorpos ligaram em formas MDA
15 e Cu oxidadas de LDL e ApoB-100 mas não em suas formas nativas, não
oxidadas (Figura 1). A ligação e a afinidade dos anticorpos são
exemplificadas em Figura 2 na qual a ligação de anticorpo 2D03 é comparada
com aquela de anticorpo LEI-E3. Uma comparação das especificidades de
ligação de 2D03 e IEI-E3 verificou que tiveram especificidades similares,
20 mas não idênticas para peptídeos derivados de ApoB-100 modificados com
MDA, e 2D03 deu um sinal maior no ensaio (Figura 3).
Como mostrado em Figura 4, os anticorpos também ligaram
com especificidade em placas ateroscleróticas de humano mas não em tecido
normal como avaliado por imuno-histoquímica.
25
Exemplo 2: Regressão de placas ateroscleróticas em modelo animal
usando imunoterapia baseada em imunização passiva
Métodos
Anticorpos
scFv selecionados com propriedades desejadas foram
5
36
transferidos para formato de anticorpo IgG de humano de comprimento total
usando métodos previamente descritos (Schiopu et ai., 2004)
Camundongos, imunização passiva e preparação de tecido
Camundongos machos LDL12. -/-ApoBec sobre findo C57BL/6
5 de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) foram usados no presente
estudo. A partir de 4 semanas de idade os camundongos foram alimentados
com uma dieta alta em colesterol (0,15% de colesterol, 21% de gordura,
Lactarnin AB, Kimstad, Suécia) proporcionada ad libitum. Uma semana antes
da primeira imunização a dieta foi mudada para ração normal. Com 25
10 semanas de idade um grupo de camundongos foi morto para servir como um
controle para o nível de formação de placa antes do início do experimento e
três grupos dos camundongos restantes foram injetados intraperitonealmente
com 1 mg/dose (0,5 mL) de anticorpos IgG de humano direcionados para
peptídeos de ApoB-100 modificados com MDA ou de anticorpo de controle
15 respectivamente. Anticorpos IgGl de humano não específicos direcionados
para fluoresceína-isotiocianato (FITC-8) foram usados como controle. As
injeções foram repetidas 2 vezes em intervalos de 1 semana.
Os camundongos foram humanamente mortos na idade de 29
semanas por exsanguinação através de uma punção cardíaca sob anestesia
20 com 300 1.1L de água destilada, fentanil/fluanisona e midazolam (2:1:1,
vol/vol/vol), administrados intraperitonealmente. Após perfusão de corpo
total com solução salina tamponada com fosfato (PBS) seguida por
Histochoice (Amresco, Solon, Ohio), o coração foi dissecado e armazenado
em Histochoice a 4°C até processamento. A aorta descendente foi dissecada
25 livre de gordura externa e tecido conjuntivo, cortada longitudinalmente, e
montada com lado de lúmen en face sobre lâminas revestidas com
-
ovalbumina (Sigma, St. Louis, Missouri) (chamada preparação plana) (Branen
et al., 2001). O Animal Care and Use Committee local aprovou o protocolo
experimental usado neste estudo.
37
Análise de área de placa
Coloração e quantificação de área placa em preparações planas
de aorta descendente foram realizadas como previamente descrito
(Fredriksson et al., 2003). A área de placa foi diretamente medida por
5 microscopia e morfometria auxiliada por computador (Image Pro Plus) e os
resultados são expressados como média de seção/área de placa.
Análise estatística
Dados são apresentados como média ± desvio padrão. Análise
dos dados foi realizada usando teste de Mann-Whitney bivariado
10
Significância estatística foi considerada no nível de < 0,05.
Resultados
Anticorpos recombinantes IgG de humano direcionados contra
LDL oxidada foram comparados no estudo. Temos previamente mostrado que
o anticorpo IEI-E3 efetivamente inibe o desenvolvimento inicial de
15 aterosclerose em camundongos ApoE -/- (Schiopu et aL, 2004). Um anticorpo
IgG1 de humano direcionado contra fluoresceina-isotiocianato, FITC-8, que
não se liga em LDL nativa ou oxidada, foi usado como controle de isótipo.
O efeito de anticorpos sobre o desenvolvimento de
aterosclerose foi testado em camundongos LDLR -/- ApoBec. Os camundongos
20 receberam 3 injeções intraperitoneais de 1 mg de anticorpo por dose a 25, 26
e 27 semanas de idade e foram mortos 2 semanas após a última injeção, a 29
semanas de idade. O estado de saúde geral dos camundongos não foi
influenciado pelo tratamento com anticorpo. Não houve diferenças
significativas dentre os grupos de teste e de controle em relação ao peso e aos
25 níveis plásmicos de colesterol e triacil-glicerol (dados não mostrados). Um
grupo de animais foi morto no início do experimento e serviu para o propósito
de determinar um nível de linha base de carga de placa.
A extensão de aterosclerose foi medida em preparações enface coradas com Oil Red O das aortas torácica e abdominal Como mostrado
38
em Figura 5, todos os anticorpos de teste induziram uma regressão
significativa de carga de placa nos animais tratados em comparação com o
anticorpo de controle e com o valor de linha base obtido de camundongos a
25 semanas de idade. O anticorpo 2D03 demonstrou o nível mais alto de
5 regressão com um efeito de 51% (p=0,0003) comparado com o anticorpo
FITC-8 e com 60% (p=0,003) comparado com o valor de linha base. Os
outros anticorpos também reduziram a carga de placa significativamente
(p<0,01) comparados com o grupo FITC-8 ou o valor de linha base.
Discussão
10
O presente estudo mostrou que o tratamento com anticorpos
IgGl recombinantes de humano contra epítopos em LDL oxidada
significativamente reduziu a carga de placas ateroscleróticas na aorta
descendente em um modelo animal. O ligante mais eficiente 2D03 pareceu ter
um efeito mais forte do que IEI-E3 ou os outros anticorpos, mas as diferenças
. 15 entre a área de placa nos grupos tratados com anticorpo não foram
significativas. Esta verificação demonstra pela primeira vez que os anticorpos
ligando em formas oxidadas de LDL possuem a capacidade para induzir
regressão de placas ateroscleróticas.
Anticorpos encontrados em plasma de indivíduos humanos e
20 direcionados contra LDL oxidada têm estados associados com extensão,
progressão e grau de atividade da doença em muitos estudos (Tsimikas et al.,
2001, Salonen et aL, 1992, Maggi et al., 1993). Níveis de tais anticorpos
podem no futuro se tornar úteis como marcadores para detectar a presença de
placas vulneráveis em pacientes cardiovasculares (Nilsson e Fredriksson,
25 2004, Nilsson e Kovanen, 2004).
Pacientes sob risco de infarto miocardial e derrame cerebral
necessitam de tratamento imediato, de ação rápida e efetivo. Estatinas
(inibidores HMG-CoA) são eficientes em prevenção de eventos
cardiovasculares agudos pela redução de conteúdo de colesterol de plasma e
ige
39
por mecanismos adicionais, ainda a serem tornados claros. Esforços contínuos
são feitos para desenvolver novos meios de tratamento, que, em vez de
substituir estatinas, aumentariam a sua eficácia pelo uso de mecanismos
complementares, diferentes.
Uma terapia de anticorpo direta, imediatamente efetiva poderia
5
ser portanto a resposta para os pacientes vulneráveis no crepúsculo de um
episódio cardíaco ou cerebrovascular ameaçador da vida. Temos mostrado no
presente estudo que pela transferência de camundongos da dieta de tipo
ocidental pra ração normal seguida pela tratamento com 3 doses de anticorpos
10 a extensão de aterosclerose diminuiu em 50% durante um período de 4
semanas. Como mencionado acima, o camundongo já tinha placas
ateroscleróticas complexas no momento do início do tratamento.
O tratamento com anticorpo pode ser ainda mais efetivo em
humanos do que em camundongos. Os anticorpos que usamos foram
. 15 anticorpos IgGl de humano gerados contra oxLDL ApoB-100 de humano. A
homologia entre ApoB-100 de humano e de camundongo não é perfeita,
prejudicando em uma certa extensão a ligação de anticorpo de humano em
oxLDL de camundongo. O sistema imune de camundongos reage à proteína
estranha gerando anticorpos IgGl de camundongo anti-humano que
20 correlacionam-se negativamente com a quantidade de anticorpos injetados
ainda presentes em plasma no momento da eutanásia, como temos
previamente mostrado (Schipou et ai., 2004). Estes anticorpos podem reduzir
a efetividade do tratamento com IgGl de humano em camundongos pelo
bloqueio de seus sítios de ligação ou pela indução de sua depuração da
25
circulação.
Exemplo 3: Modulação de atividade inflamatória de macrófago com
anticorpos contra epítopos oxidados em LDL
Mecanismos
moleculares
subjacentes
aos
efeitos
ateroprotetores de tratamento com anticorpo anti-ApoB-100 oxidado
40
(oxApoB-100) estão incompletamente caracterizados. Contudo, o papel de
macrófagos em desenvolvimento de placas e em hemóstase de placas (Li e
Glass, 2002), e a observação de que tratamento com anticorpo anti-oxApoB100 diminui o conteúdo de macrófago de placa in vivo (Schiopu et ai., 2004),
5 apontam para os mecanismos que regulam a função e o recrutamento de
macrófago. A rota MCP-1, constituída por MCP-1 e seu receptor CCR2, é o
diretor quimiotático mais importante de migração e infiltração de macrófago e
de monócito, e tem estado implicada no processo aterogênico em níveis
diferentes (Charo e Taubman, 2004). Conseqüentemente, examinamos a
10 possibilidade de que os efeitos ateroprotetores de IgG anti-oxApoB-100
incluem interferência com a rota de sinalização de MCP-1.
Foi verificado que tratamento de macrófagos derivados de
monócito de humano com IgG anti-oxApoB-100 diminui a liberação de MCP1 em até 60% comparado com células tratadas com IgG de controle (Figura
15 6). O efeito inibitório foi titulável com efeitos máximos sendo observados a
de 30 a 601.1g/ml. O efeito bloqueador de MCP-1 de anticorpos anti-oxApoB100 sobre macrófagos maduros foi rápido e estável no decorrer do tempo
(Figura 7).
Concentrações de MCP-1 de sobrenadantes isolados 24, 48, 72
20 ou 96 horas após a incubação com IgG anti-oxApoB-100 IgG permaneceram
constantes em níveis baixos Em contraste, o tratamento com IgG de controle
permitiu um aumento constante em concentrações de MCP-1 no decorrer do
tempo. O efeito bloqueador de MCP-1 foi ainda mais pronunciado quando
anticorpos foram incubados com monócitos recém-isolados (Figura7).
25 Tratamento de monócitos com IgG anti-oxApoB-100 por 48 horas resultou
em um decréscimo notável de 60 vezes em concentrações de MCP-1 em
comparação com as células tratadas com IgG de controle.
Também foi verificado que tratamento com IgG anti-oxApoB100 regula a síntese de MCP-1 em nível de transcrição. Monócitos recém-
41
isolados foram incubados com IgG anti-oxApoB-100 ou IgG de controle por
dois dias As células foram colhidas e o mRNA foi isolado e quantificado por
PCR em tempo real. Expressão de gene foi relacionada com 18S RNA.
Células de monócito incubadas com IgG anti-oxApoB-100 por dois dias
5 mostraram um decréscimo de 80% em níveis de MCP-1 mRNA comparadas
com células tratadas com IgG de controle (dados não mostrados).
O efeito bloqueador de MCP-1 de IgG anti-oxApoB-100 não
foi devido a um efeito citotóxico geral. Macrófagos colhidos após o
tratamento com IgG anti-oxApoB-100 foram totalmente viáveis conforme
10 determinado por coloração com azul tripano e análise subseqüente em um
microscópio de luz.
Nossas verificações sugerem que os efeitos ateroprotetores de
anticorpos anti-oxApoB-100 incluem efeitos inibitórios sobre liberação de
MCP-1 de macrófago e monócito. MCP-1 é pivotal para recrutamento e
15 migração de monócito e macrófago em saúde e doença. Especificamente,
deleção de quimiocina CC trópica MCP-1 de monócito / macrófago (Gu et ai,
1998) ou de seu receptor correspondente CCR2 (Boring et ai, 1998) protege
camundongos de aterosclerose in vivo. Foi mostrado que estimulação in vitro
de monócitos com MCP-1 promove migração transendotelial de monócito e
20 na presença de oxLDL foi mostrado que promove macrófago para formar
transformação de célula (Tangirala et ai, 1997). Sem o desejo de se ligar a
teoria especulamos que o tratamento com anticorpos anti-oxApoB-100 pode
proporcionar uma inibição seletiva de liberação de MCP-1 minimizando
assim os efeitos colaterais potenciais em sítios inflamatórios não relacionados
25
com a placa aterosclerótica.
Exemplo 4: Indução de regressão de placas ateroscleróticas em modelo
animal usando imunoterapia baseada em imunização ativa
Tem sido previamente mostrado que imunização com oxLDL
(Palinski et ai, 1995, Ameli et ai, 1996, Freigang et ai, 1998, Zhou et ai,
42
2001, Nilsson et al., 1997) ou com peptídeos ApoB-100 (Fredriksson et ai.,
2003) é efetiva em camundongos, e estudos para criar uma vacina contra
aterosclerose estão correntemente em andamento (Nilsson et aL, 2004;
Hansson 2002; Sherer & Shoenfeld 2002; Zhou & Hansson 2004).
5 Com o objetivo de estudar a capacidade de vacinação contra
peptídeos derivados de ApoB-100 oxidado para reduzir o tamanho de placas
ateroscleróticas, camundongos LDLIZ. 4- ApoBec são alimentados com uma
dieta alta em gordura por 21 semanas iniciando na semana 4 Quando os
camundongos são de 25 semanas de idade, um grupo de animais é morto e a
10 extensão de aterosclerose em suas aortas descendentes é determinada Este
grupo serve como um grupo de linha base, para o qual a extensão de
aterosclerose em outros grupos pode ser comparada. Animais de teste,
vacinados com peptídeo ou PBS apenas, são retirados de dieta alta em
gordura e recebem injeções por várias semanas, após as quais os animais são
15
mortos e o nível de aterosclerose é determinado.
Em Exemplo 2, acima, temos demonstrado que a extensão de
carga de placa é estável durante um período de 4 semanas da semanas 25 até a
semana 29 quando os animais são retirados da dieta rica em gordura. A
análise revelou que os animais de linha base tiveram 10% de sua área de aorta
20 descendente coberta por placa na idade de 25 semanas. É mostrado que
animais vacinados possuem uma carga de placa reduzida comparados com o
grupo de controle e o grupo de linha base. Isto demonstra que a imunização
contra epítopos verificados em formas oxidadas de LDL pode acarretar uma
redução na carga de placas pré-existentes e sugere que vacinação pode ser um
25
modo eficiente para diminuir a carga de placa em pacientes.
43
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1
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<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Phe Leu Asp Thr Val Tyr Gly Asn Cys Ser Thr His Phe Thr Val Lys
1
5
10
15
Thr Arg Lys Gly
20
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Pro Gln Cys Ser Thr His Ile Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val His Ala
1
5
10
15
Asn Pro Leu Leu
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Val Ile Ser Ile Pro Arg Leu Gln Ala Glu Ala Arg Ser Glu Ile Leu
1
5
10
15
Ala His Trp Ser
20
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Lys Leu Val Lys Glu Ala Leu Lys Glu Ser Gln Leu Pro Thr Val Met
1
5
10
15
1
REIVINDICAÇÕES
1. Uso de imunoterapia contra lipoproteína de densidade baixa
(LDL) oxidada, caracterizado pelo fato de ser para induzir regressão de placas
ateroscleróticas em um indivíduo.
5
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo
fato de que a imunoterapia é direcionada contra um epítopo presente em LDL
oxidada mas não presente em LDL nativa
3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado
pelo fato de que a imunoterapia é direcionada contra pelo menos um epítopo
10
ApoB-100 oxidado.
4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo
fato de que o epítopo ApoB-100 é selecionado de peptídeos listados em
Tabela 1, ou um fragmento de pelo menos 6 resíduos de aminoácido
consecutivos de um peptídeo listado em Tabela 1.
15
5. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado
pelo fato de que a imunoterapia é direcionada contra pelo menos um epítopo
de lipídeo oxidado presente em LDL oxidada.
6. Método para induzir regressão de placas ateroscleróticas em
um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de
20
compreender administrar ao indivíduo:
(a) pelo menos um anticorpo que se liga seletivamente em um
epítopo oxidado de LDL, ou
(b) pelo menos um epítopo oxidado de LDL.
7. Uso de pelo menos um anticorpo ou pelo menos um epítopo
25 oxidado de LDL, sendo que o dito anticorpo seletivamente se liga em um
epítopo oxidado de LDL, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um
medicamento que induz regressão de placas ateroscleróticas em um indivíduo.
8. Método ou uso de acordo com a reivindicação 6 ou 7,
caracterizado pelo fato de que o epítopo oxidado de LDL compreende um
2
epítopo oxidado de ApoB-100.
9. Método ou uso de acordo com a reivindicação 8,
caracterizado pelo fato de que o epítopo de ApoB-100 é selecionado de
peptídeos listados em Tabela 1, ou é um fragmento compreendendo pelo
5 menos 6 resíduos de aminoácido consecutivos de um peptídeo listado em
Tabela 1.
10. Método ou uso de acordo com a reivindicação 6 ou 7,
caracterizado pelo fato de que o epítopo oxidado de LDL compreende um
epítopo de lipídeo oxidado de LDL.
11. Método ou uso de acordo com qualquer uma das
10
reivindicações 6-10, caracterizado pelo fato de que o epítopo oxidado de LDL
compreende um epítopo de LDL que tem sido oxidado pela exposição a cobre
ou por malone-dialdeído (MDA).
12. Método ou uso de acordo com qualquer uma das
15
reivindicações 6-11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo
humanizado.
13. Método ou uso de acordo com qualquer uma das
reivindicações 6-12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um
fragmento de anticorpo.
14. Método ou uso de acordo com a reivindicação 13,
20
caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um fragmento de
anticorpo de cadeia única (scFv).
15. Método ou uso de acordo com qualquer uma das
reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um
25 indivíduo humano.
16. Método ou uso de acordo com a reivindicação 15,
caracterizado pelo fato de que o indivíduo humano é um que possui, ou está
sob o risco de possuir, uma doença cardiovascular associada com
aterosclerose.
.5
3
17. Método ou uso de acordo com a reivindicação 16,
caracterizado pelo fato de que a doença cardiovascular associada com
aterosclerose é selecionada do grupo consistindo de doença de artéria
coronária, infarto miocardial e derrame cerebral.
5
18. Método ou uso de acordo com qualquer uma das
reivindicações 15-17, caracterizado pelo fato de que o indivíduo humano é um
com aterosclerose avançada ou severa, ou formas avançadas ou severas da
doença cardiovascular associada com aterosclerose.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6
10 e 8-18, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender a etapa
anterior de determinar o tamanho e/ou a quantidade e/ou a extensão de placas
ateroscleróticas no indivíduo.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6
e 8-19, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender a etapa
15 subseqüente de determinar a extensão de regressão de placa aterosclerótica no
indivíduo.
21. Método para combater uma doença cardiovascular
associada com aterosclerose, caracterizado pelo fato de compreender:
induzir a regressão de placas ateroscleróticas em um indivíduo
20 pela administração ao indivíduo de: (a) pelo menos uma molécula de
anticorpo que seletivamente se liga em um epítopo oxidado de LDL, ou (b)
pelo menos um epítopo oxidado de LDL; e
administrar uma estatina ao indivíduo.
22. Uso de pelo menos uma molécula de anticorpo ou pelo
25 menos um epítopo oxidado de LDL, sendo que a molécula de anticorpo
seletivamente se liga em um epítopo oxidado de LDL, caracterizado pelo fato
de ser na preparação de um medicamento para combater uma doença
cardiovascular associada com aterosclerose pela indução da regressão de
placas ateroscleróticas, no qual o indivíduo é um ao qual é administrado uma
4
estatina.
23. Uso de uma estatina, caracterizado pelo fato de ser na
preparação de um medicamento para combater uma doença cardiovascular
associada com aterosclerose, no qual o indivíduo é um ao qual: (a) pelo
5 menos uma molécula de anticorpo que seletivamente se liga em um epítopo
oxidado de LDL, ou (b) pelo menos um epítopo oxidado de LDL é
administrada para induzir a regressão de placas ateroscleróticas.
24. Uso de pelo menos uma molécula de anticorpo ou pelo
menos um epítopo oxidado de LDL, e uma estatina, sendo que a dita molécula
10 de anticorpo seletivamente se liga em um epítopo oxidado de LDL,
caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para
combater uma doença cardiovascular associada com aterosclerose pela
indução da regressão de placas ateroscleróticas.
25. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de
• 15 compreender: (a) pelo menos uma molécula de anticorpo que seletivamente se
liga em um epítopo oxidado de LDL, ou (b) pelo menos um epítopo oxidado
de LDL, e uma estatina, e um veículo, diluente ou adjuvante
farmaceuticamente aceitável.
26. Kit de partes, caracterizado pelo fato de compreender:
pelo menos um anticorpo que seletivamente se liga em um
20
epítopo oxidado de LDL, ou (b) pelo menos um epítopo oxidado de LDL; e
uma estatina,
no qual cada um dos componentes são proporcionados na
forma que é adequada para administração conjunta com o outro.
27. Método ou uso ou formulação farmacêutica ou kit de
25
partes de acordo com qualquer urna das reivindicações 21-26, caracterizado(a)
pelo fato de que a estatina é selecionada de atorvastatina, cerivastatina,
fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pravastatina, rosuvastatina e
sinvastatina.
5
28. Método para identificar um anticorpo que induz regressão
de placas ateroscleróticas em um indivíduo, caracterizado pelo fato de
compreender:
proporcionar um anticorpo que seletivamente se liga em um
5
epítopo oxidado de LDL, e
testar o anticorpo em um ensaio para regressão de placa
aterosclerótica,
no qual regressão de placa aterosclerótica no ensaio indica que
o anticorpo é um que induz regressão de placas ateroscleróticas.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado
10
pelo fato de que o ensaio para regressão de placa aterosclerótica é um ensaio
in vivo, usando um modelo animal de aterosclerose.
30. Método de acordo com a reivindicação 28 ou 29,
caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem sido isolado de uma biblioteca
15
de fragmento de anticorpo de humano.
31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações
28-30, caracterizado pelo fato de que o anticorpo seletivamente se liga em um
epítopo oxidado de ApoB-100.
32. Método para identificar um agente que induz regressão de
20
placas ateroscleróticas em um indivíduo, caracterizado pelo fato de
compreender:
proporcionar um agente compreendendo um epítopo oxidado
de LDL,
administrar o agente a um indivíduo que possui placas
25
ateroscleróticas, e
determinar se o agente induz regressão de placas
ateroscleróticas,
no qual regressãó de placas ateroscleróticas indica que o
agente é um que induz regressão de placas ateroscleróticas.
6
33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado
pelo fato de que determinar se o agente induz regressão de placas
ateroscleróticas, compreende um ensaio in vivo usando um modelo animal de
aterosclerose.
5
34. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado
pelo fato de que determinar se o agente induz regressão de placas
ateroscleróticas, compreende testar o agente em um indivíduo humano que
possui placas ateroscleróticas.
35. Método ou uso ou formulação farmacêutica ou kit de
10 partes de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes,
caracterizado(a) pelo fato de que a regressão de placas ateroscleróticas
compreende um decréscimo de pelo menos 5% na área de placas
ateroscleróticas na aorta do indivíduo.
36. Anticorpo, caracterizado pelo fato de compreender:
15 pelo menos uma região determinante de complementaridade
(CDR) que possui a seqüência de aminoácidos da CDR correspondente de
anticorpo 2D03 como mostrado em Tabela 2, ou
pelo menos uma CDR que possui a seqüência de CDR
correspondente de anticorpo LDO D4 como mostrado em Tabela 2.
20
37. Anticorpo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado
pelo fato de compreender:
três CDRs de cadeia leve que possuem a seqüência das
correspondentes três CDRs de cadeia leve de anticorpo 2D03, ou
três CDRs de cadeia pesada que possuem a seqüência das
25 correspondentes três CDRs de cadeia pesada de anticorpo 2D03, ou
três CDRs de cadeia leve que possuem a seqüência das
correspondentes três CDRs de cadeia leve de anticorpo LDO D4, ou
três CDRs de cadeia pesada que possuem a seqüência das
correspondentes três CDRs de cadeia pesada de anticorpo LDO D4.
7
38. Anticorpo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado
pelo fato de compreender:
três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada que
possuem a seqüência das correspondentes CDRs de anticorpo 2D03, ou
três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada que
5
possuem a seqüência das correspondentes CDRs de anticorpo LDO D4.
39. Anticorpo, caracterizado pelo fato de ser 2D03 ou LDO
D4.
40. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que seletivamente se
10
liga no epítopo de LDL oxidado que é seletivamente ligado pelo anticorpo
2D03 ou anticorpo LDO D4.
41. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de
compreender anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações
36-40 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
15
42. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações
36-40, caracterizado pelo fato de ser para uso em medicina.
43. Uso de anticorpo como definido em qualquer uma das
reivindicações 36-40, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um
medicamento para induzir regressão de placas ateroscleróticas.
1/4
Figura 1
1000
900
800
700
600
❑ 2D03
2
-$ 500
e
■
400
300
200
100
O
MDA-LDL
Na-LDL
MDA-ApoB
Na-ApoB
CU-LDL
IEI-E3
2/4
Figura 2
1000
21D03 (K D = 3x10 -8 )
800
o
600
IEI-E3 (K = 2x10 -8 )
400
re
200
Controle
,
200
600
400
IgG (ng/m 1)
800
Figura 3
• Peptideo de
controle-M DA
• Peptideo
de controle
120,0
100,0 -
rt
MDA-P2
80,0 -
o MDA-P45
60,0 -
■ MDA-129
MDA-P143
40,0 -
• MDA-210
20,0 -
MDA-301
0,0
2D03
S-E3
3/4
Figura 4
Figura 5
Regressão de placa
14
12 -
o
CO
o.
10 -
o
8-
E
o
c
2
6-
E
42
o
2D03
LDO-D4
lEI-E3
KTT-B8
Linha base 25w
4/4
Figura 6
=".1
18000 -
4
.16000
1
14000
/
▪ 12000
10000
o
E
8000 6000 4000 20 00 .
'0
T
etri IgG LIEI-G8IEI-E3 IEI-D8 1
anti-exApoB100 IgG
Figura 7
213000
121)
sown
10000
r.
o
tco
eu
4000
•
2000
o
o
5000
2000 1000
o
7
0+1 0+2 - 0+3
14+1 .14+2 14+3 14+4
Dias de cultura + dias de incubação de IgG
62
1
RESUMO
"USO DE IMUNOTERAPIA CONTRA LIPOPROTEÍNA DE DENSIDADE
BAIXA OXIDADA, MÉTODO PARA INDUZIR REGRESSÃO DE
PLACAS ATEROSCLERÓTICAS EM UM INDIVÍDUO, USO DE PELO
5 MENOS UM ANTICORPO OU PELO MENOS UM EPÍTOPO OXIDADO
DE LDL, MÉTODO PARA COMBATER UMA DOENÇA
CARDIOVASCULAR ASSOCIADA COM ATEROSCLEROSE, USOS DE
PELO MENOS UMA MOLÉCULA DE ANTICORPO OU PELO MENOS
UM EPÍTOPO OXIDADO DE LDL E DE UMA ESTATINA,
10 FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, KIT DE PARTES, MÉTODOS PARA
IDENTIFICAR UM ANTICORPO QUE INDUZ REGRESSÃO DE
PLACAS ATEROSCLERÓTICAS EM UM INDIVÍDUO E PARA
IDENTIFICAR UM AGENTE QUE INDUZ REGRESSÃO DE PLACAS
ATEROSCLERÓTICAS EM UM INDIVÍDUO, ANTICORPO,
- 15 COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DE ANTICORPO"
O uso de imunoterapia contra LDL oxidada para induzir
regressão de lesões ateroscleróticas preexistentes em um indivíduo. A
imunoterapia pode ser imunoterapia passiva utilizando anticorpos que se
ligam em epítopos presentes em LDL oxidada, ou imunoterapia ativa
20 utilizando uma composição de vacina para indução de uma resposta imune
contra epítopos presentes em LDL oxidada.