de dissertação em pdf - Pós

Universidade Federal da Bahia
Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia
Programa de Pós Graduação em Ciência Animal nos Trópicos
VALIDAÇÃO DE UM PROGRAMA DE PRODUÇÃO IN
VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS COM TRANSPORTE
DE OÓCITOS E DE EMBRIÕES POR LONGAS
DISTÂNCIAS
Marcus Vinícius Galvão Loiola
Salvador-Bahia
2013
i
Sistema de Bibliotecas - UFBA
Loiola, Marcus Vinícius Galvão.
Validação de um programa de produção in vitro de embriões bovinos com transporte de
oócitos e de embriões por longas distâncias / Marcus Vinícius Galvão Loiola. - 2013.
60 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Salvador, 2013.
1. Nelore (Zebu) - Reprodução. 2. Nelore (Zebu) - Transferência de embriões. 3. Ovulação Indução. 4. Sêmen. 5. Inseminação artificial. I. Ribeiro Filho, Antonio de Lisboa.
II. Universidade Federal da Bahia. Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia. III. Título.
CDD - 636.20824
CDU - 636.2.082.453.58
ii
MARCUS VINÍCIUS GALVÃO LOIOLA
VALIDAÇÃO DE UM PROGRAMA DE PRODUÇÃO IN VITRO DE
EMBRIÕES BOVINOS COM TRANSPORTE DE OÓCITOS E DE
EMBRIÕES POR LONGAS DISTÂNCIAS
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos,
da Universidade Federal da Bahia, como
requisito parcial para obtenção do título de
Mestre em Ciência Animal nos Trópicos.
Área de concentração: Reprodução Animal
Orientador: Prof. Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho
SALVADOR – BA
iii
FEVEREIRO – 2013
BIBLIOGRAFIA DO AUTOR
MARCUS VINÍCIUS GALVÃO LOIOLA - filho de Jaime Gonçalves Loiola
Sobrinho e Anita Dourado Galvão Loiola, nasceu em 26 de julho de 1986, na cidade de
Irecê, estado da Bahia. Iniciou o curso de graduação em Medicina Veterinária em
fevereiro de 2005 na Universidade Federal da Bahia e em agosto de 2010 concluiu a
graduação. Em 01 de março de 2011, ingressou no programa de Pós-graduação em
Ciência Animal nos Trópicos, pela Universidade Federal da Bahia, sob orientação do
professor Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho, defendendo a dissertação de mestrado
em 25 de fevereiro de 2013.
iv
Dedico este trabalho ao meu pai, Jaime
Gonçalves Loiola Sobrinho, por ser o maior
incentivador na construção de minha carreira
profissional e pelo exemplo de seriedade e
dignidade, pelo carinho e dedicação a sua
família, por todos os ensinamentos,
conselhos e pela contribuição na formação do
meu caráter.
Dedico-o também a meu filho Emerson, que
apesar de sua pouca idade, é o responsável
pelos melhores momentos da minha vida.
Nenhum problema ou preocupação consegue
persistir diante do seu sorriso ou abraço.
v
AGRADECIMENTOS
A Deus por todas as oportunidades concedidas, pela força e coragem para
enfrentar todos os obstáculos nesta nova trajetória.
Ao meu pai, Jaime Gonçalves Loiola Sobrinho, pelos ensinamentos, carinho e
exemplo de ser humano e por contribuir de forma direta nos momentos mais difíceis
desta caminhada e a minha mãe, Anita Dourado Galvão Loiola (in memorian) que
acompanha todos os meus passos e neste momento se orgulha com esta realização.
A minha esposa Tamira pelo apoio, palavras de incentivo diante das dificuldades
da distância, pelos cuidados e ensinamentos ao nosso filho nos momentos em que tive
de está ausente, pelo carinho e dedicação, por acreditar e ajudar a tornar este sonho em
realidade. Você é muito especial para mim.
A todos os meus familiares, em especial, Jardel, Denise, Ana, Fernando,
Ricardo, Son (in memorian), Tia Dene, Tio Dadá e minhas queridas sobrinhas, que
mesmo distantes, sempre me apoiaram e torceram pelo meu sucesso.
Ao meu orientador, Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho, pela confiança
depositada em todos esses anos, pelos ensinamentos, conselhos, amizade, brincadeiras e
acima de tudo lealdade e respeito. Sou-lhe eternamente grato pelas oportunidades que
tem me oferecido.
Ao professor amigo, Marcos Chalhoub Coelho Lima, pela grande contribuição
para minha carreira profissional, pelas orientações e ensinamentos, tanto acadêmico,
como prático, pela acessibilidade sempre que necessário, pela oportunidade a me
concedida de vivenciar a realidade do profissional de campo e por contribuir com
sugestões relevantes para este trabalho.
Aos grandes amigos de profissão, Sidnei, Endrigo, Alexandra, Priscila, Carlos
Henrique, Bruno, Alana, Edivânia e Mariana, pela amizade, convivência e enorme
participação neste trabalho, a ajuda de todos vocês foi crucial para execução deste
trabalho e mostra o quanto somos fortes quando estamos unidos como uma verdadeira
equipe.
A todos os colegas, funcionários e professores do Laboratório de Fisiopatologia
da Reprodução Animal e da Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia da UFBA pela
ajuda no desenvolvimento desta pesquisa.
vi
A Coordenação Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
concessão da bolsa de estudos de suma importância para desenvolvimento deste
trabalho.
Enfim, a todos que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização
deste trabalho. MUITO OBRIGADO!!!!
vii
LISTA DE FIGURAS
Validação de um programa de produção in vitro de embriões bovinos com
transporte de oócitos e de embriões por longas distâncias
Página
Figura 1.
Produção de embriões bovinos no Brasil de acordo com a
técnica utilizada, durante o período de 1995-2010
10
viii
LISTA DE TABELAS
Validação de um programa de produção in vitro de embriões bovinos com
transporte de oócitos e de embriões por longas distâncias
Página
Tabela 1.
Tabela 2.
Tabela 3.
Tabela 4.
Participação do Brasil no total de embriões bovinos
produzidos in vivo e in vitro no mundo, durante o período
2000-2008
Taxas de oócitos viáveis recuperados (OOVI), embriões
produzidos (EMB) e de gestação (GES). Médias e desvio
padrão de oócitos totais recuperados (OOTO), OOVI,
EMB e número de prenhezes por sessão de OPU em um
programa de PIVE na raça Nelore com transporte de
oócitos e de embriões por longas distâncias
Comparação da taxa de clivagem (TXCLIV), da taxa de
embriões produzidos (TXEMB) e da taxa de gestação
(TXGES) em um programa de PIVE utilizando sêmen
convencional (CONV), ou sêmen sexado (SEX) com
transporte de oócitos e de embriões por longas distâncias
Comparação entre as taxas de gestação de receptoras que
tiveram os embriões transportados por longas distâncias e
inovulados no turno da manhã (TE-M), no turno da tarde
(TE-T) e no turno da noite (TE-N)
10
30
33
34
ix
LISTA DE SIGLAS
%: Por cento
χ2: Qui-quadrado
µg: Microgramas
µL: Microlitro
BRL: Buffalo rat liver
BSA: Albumina Sérica Bovina
CIV: Cultivo in vitro
CL: Corpo lúteo
CO2: Dióxido de carbono
CONV: Sêmen convencional
CR1aa: Charles Rosenkrans 1 - aminoácidos
CR2aa: Charles Rosenkrans 2 - aminoácidos
D0: Dia 0
D10: Dia 10
D11: Dia 11
D17: Dia 17
D8: Dia 8
DNA: Ácido desoxirribonucleico
eCG: Gonadotrofina coriônica equina
EMB: Embriões produzidos
Fert-talp: Tyrode albumina lactato piruvato
FIV: Fertilização in vitro
FSH: Hormônio folículo estimulante
GDF9: Fator de crescimento e iniciação-9
GES: Gestações
h: Horas
IA: Inseminação artificial
IATF: Inseminação artificial em tempo fixo
IEC: Índice de escore corporal
IGF: Fator de crescimento semelhante à insulina
IGF-I: Fator de crescimento semelhante à insulina I
im: Intramuscular
KSOM: Namely potassium simplex optimization medium
LH: Hormônio luteinizante
mg: Miligramas
Mhz: Megahertz
MIV: Maturação in vitro
mL: Mililitro
mm: Milímetros
mmHg: Milímetro de mercúrio
MOET: Múltiplas ovulações e transferência de embriões
N2: Gâs nitrogênio
O2: Gâs oxigênio
ºC: Graus Celsius
OOTO: Oócitos totais recuperados
x
OOVI: Oócitos viáveis
OPU: Aspiração folicular guiada por ultrassonografia (Ovum pick up)
P4: Progesterona
PGF2α: Prostaglandina F2α
PHE: Epinefrina
PIVE:Produção in vitro de embriões
S: Desvio-padrão
SBTE: Sociedade Brasileira de Tecnologias em embriões
SEX: Sêmen sexado
SFB: Soro fetal bovino
SOF: Synthetic oviductal fluid
SPSS: Statistical Package for Social Science
SVE: Soro de vaca em estro
TCM: Tissue Culture Medium
TE-M: Transferência de embrião no turno da manhã
TE-N: Transferência de embrião no turno da noite
TE-T: Transferência de embrião no turno da tarde
TETF: Transferência de embriões em tempo fixo
TXCLI: Taxa de clivagem
TXEMB: Taxa de embriões produzidos
TXGES: Taxa de gestação
U.I.: Unidades internacionais
VERO: Linhagens de células estabelecidas para cultivo
xi
SUMÁRIO
Validação de um programa de produção in vitro de embriões
bovinos com transporte de oócitos e de embriões por longas
distâncias
Resumo
Página
1
Abstract
3
Introdução
5
Objetivos
6
Hipóteses
7
Revisão de Literatura
7
Histórico da produção in vitro de embriões bovinos
7
Produção in vitro de embriões bovinos no Brasil e no mundo
9
Etapas da produção in vitro de embriões
11
Utilização de sêmen sexado na produção in vitro de embriões bovinos
19
Transporte de oócitos por longas distâncias
21
Transporte de embriões por longas distâncias
22
Sincronia receptora-embrião
24
Material e Métodos
25
Animais e local do experimento
25
Aspiração folicular
25
Transporte dos oócitos e dos embriões
26
Produção in vitro dos embriões
27
Transferência de embriões
28
Diagnóstico de gestação
29
Análise estatística
29
Resultados e Discussão
30
Conclusões
35
Referências
37
1
Validação de um programa de produção in vitro de embriões bovinos com
transporte de oócitos e de embriões por longas distâncias
RESUMO
Objetivou-se avaliar a viabilidade de um programa de produção in vitro de embriões
(PIVE) bovinos da raça Nelore cuja maturação oocitária e cultivo embrionário
ocorreram parcialmente durante o transporte, determinar o efeito da fertilização com
sêmen sexado sobre a taxa de clivagem, a produção de embriões e a taxa de gestação,
assim como, a influência de diferentes sincronias receptora-embrião sobre a taxa de
gestação em um programa de PIVE com transporte de oócitos e embriões por longas
distâncias. Para tanto, 123 fêmeas Nelore foram submetidas a 274 procedimentos de
aspiração folicular (OPU). Os oócitos foram aspirados em fazendas no estado da Bahia,
classificados e apenas os considerados viáveis eram acondicionados em criotubos e
transportados em incubadora portátil em condições de maturação in vitro para o
laboratório no estado de São Paulo. No laboratório, prosseguiram-se as etapas de
produção in vitro, sendo que a fertilização era realizada com espermatozoides oriundos
de sêmen convencional (grupo CONV) ou sexado para fêmea (grupo SEX). No dia seis
do cultivo embrionário, os embriões produzidos eram submetidos às mesmas condições
de transporte que os oócitos, em meios de cultivo e remetidos para as fazendas no
estado da Bahia onde eram transferidos às receptoras. O tempo gasto com o transporte
variou de 18 a 24 horas, sendo que todos os embriões foram transferidos no dia sete,
entretanto em diferentes turnos, perfazendo três grupos experimentais: TE-M, embriões
inovulados durante a manhã (06:00 à 11:59), TE-T, inovulações à tarde (12:00 à 17:59)
e TE-N, inovulações à noite (18:00 à 24:00). O diagnóstico de gestação foi realizado por
ultrassonografia transretal. As fêmeas tiveram média de 46,18±32,7 oócitos recuperados
e 30,74±24,3 oócitos viáveis por OPU. A taxa de embriões produzidos foi de 32,85%
(10,09±6,2 embriões/OPU) e a taxa de gestação foi de 33,12% (2,71±1,2 prenhez/OPU).
O tipo de sêmen não influenciou na taxa de clivagem dos oócitos (CONV=61,49% e
SEX=63,43%,
P=0,49),
assim
como,
nas
taxas
de
embriões
produzidos
(CONV=38,11% e SEX=47,76%, P=0,054) e nas taxas de gestação (CONV=33,37% e
SEX=31,93%, P=0,586). Em relação ao turno da inovulação (sincronia receptora-
2
embrião): As taxas de gestação entre os embriões transferidos pela manhã e à tarde não
diferiram (TE-M: 36,10% e TE-T: 40,99%, P=0,167), assim como, entre à tarde e à
noite (TE-T: 40,99% e TE-N: 50,00%, P=0,095), no entanto, houve diferença entre as
taxas de gestação no turno da manhã e da noite (TE-M: 36,10% e TE-N: 50,00%,
P=0,006). Os resultados encontrados demonstram que o transporte de oócitos e de
embriões foi eficiente em um programa de PIVE bovinos, mesmo quando utilizado o
sêmen sexado, entretanto, uma atenção especial deve ser dada a sincronia receptoraembrião, visto que, esta pode interferir nas taxas de gestação.
Palavras-chave: Bos indicus, Nelore, Sêmen sexado, Sincronia receptora-embrião,
Transferência de embriões
3
Validation of a program of in vitro production of bovine embryos with transport of
oocytes and embryos for long distances
ABSTRACT
This study aimed to assess the feasibility of a program of in vitro embryo production
(PIVE) Nellore cattle whose oocyte maturation and embryo development occurred
partly during transport, to determine the effect of fertilization with sexed semen on the
cleavage rate, production embryos and pregnancy rates, as well as the influence of
different synchronicities receptor-embryo on pregnancy rate in a program with PIVE
transport of oocytes and embryos for long distances. Therefore, 123 Nellore underwent
274 procedures follicular aspiration (OPU). The oocytes were aspirated on farms in the
state of Bahia, classified and only considered viable and were placed in vials and
transported in portable incubator under conditions of in vitro maturation to the
laboratory in the state of São Paulo. In the laboratory, they proceeded up the steps of
production in vitro, fertilization was performed with sperm from semen conventional
(group CONV) or to sexed female (group SEX). On day six of embryo development, the
embryos produced were subjected to the same conditions of carriage that oocytes, in
culture medium and sent to farms in the state of Bahia where they were transferred to
recipients. The time spent on transport ranged from 18 to 24 hours, and all embryos
were transferred on day seven, though in different shifts, totaling three experimental
groups: TE-M embryos transferred during the morning (06:00 to 11: 59), TE-T, transfer
afternoon (12:00 to 17:59) and TE-N, transfer evening (18:00 to 24:00). Pregnancy
diagnosis was performed by transrectal ultrasonography. Females had a mean of 46.18 ±
32.7 oocytes retrieved and 30.74 ± 24.3 viable oocytes by OPU. The rate of embryos
produced was 32.85% (10.09 ± 6.2 embryos / OPU) and the pregnancy rate was 33.12%
(2.71 ± 1.2 pregnancy / OPU). The type of semen did not influence the cleavage rate of
oocytes (CONV = 61.49% and 63.43% SEX =, P = 0.49), as well as the rates of
embryos produced (CONV = 38.11% and SEX = 47.76%, P = 0.054) and in pregnancy
rates (CONV = 33.37% and SEX = 31.93%, P = 0.586). Regarding the shift of embryo
transfer (embryo-recipient synchrony): Pregnancy rates between embryos transferred in
the morning and in the afternoon did not differ (TE-M: 36.10% and TE-T: 40.99%, P =
4
0.167 ) and between afternoon and evening (TE-T: 40.99% and TE-N: 50.00%, P =
0.095), however, there were differences in the pregnancy rates during the morning and
night (TE-M: 36.10% and TE-N: 50.00%, P = 0.006). The results show that the
transport of oocytes and embryos was efficient in a program PIVE cattle, even when
used sexed semen, however, special attention should be given to embryo-recipient
synchrony, since is can interfere in rates of gestation.
Keywords: Bos indicus, Nelore, Sexed semen, embryo-recipient Synchrony, Transfer
of embryos
5
INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, as fêmeas bovinas têm sido alvo de numerosas pesquisas
visando um melhor aproveitamento de seus gametas, principalmente aquelas
consideradas geneticamente superiores (SENEDA et al., 2002). Segundo Gordon
(2003), bezerras ao nascimento possuem mais de 100 mil oócitos em seus ovários, que
pelas vias naturais podem dar origem a 0,01% de produtos viáveis, algo próximo de dez
descendentes em toda sua vida reprodutiva. Uma forma de melhorar a exploração desses
gametas é através das biotecnologias da reprodução, como a indução de múltipla
ovulação e transferência de embriões (MOET) e a produção in vitro de embriões (PIVE)
(MERTON et al., 2003).
O Brasil passou por um crescimento significativo no segmento das
biotecnologias na última década. Após um amplo e consolidado conhecimento na
obtenção de embriões in vivo, o país passou a dominar a aspiração folicular ou ovum
pick up (OPU) e a PIVE, ocupando uma posição importante no mercado de embriões
bovinos, sobretudo, por possuir o maior rebanho comercial do mundo e ser o principal
exportador de carne bovina (IBGE, 2011; SENEDA et al., 2002).
Atualmente, o método in vitro superou a MOET e tornou-se a técnica de escolha
na produção de embriões (VIANA et al., 2012), especialmente, por ser mais utilizada
em raças zebuínas, as quais fisiologicamente possuem uma maior população folicular,
maior recuperação de oócitos por aspiração e consequentemente maior produção
embrionária (PONTES et al., 2010).
A PIVE é considerada uma ferramenta eficiente para a produção de animais de
maior mérito genético, sendo um instrumento importante para exploração maximizada
do potencial reprodutivo dos rebanhos, diminuindo o intervalo entre as gerações e
acelerando o melhoramento genético animal (VARAGO et al., 2008). Vários fatores
podem influenciar nos seus resultados: diferentes metodologias de maturação, cultivo,
capacitação espermática, sêmen, individualidade da doadora e do touro, entre outros
(CAMARGO et al., 2006).
O crescimento desta biotecnologia no Brasil permitiu sua aplicação em larga
escala e a exportação deste modelo para vários países latino-americanos e de outros
continentes (BOLS et al., 2012; MEIRELLES et al., 2008). Entretanto, a grande
6
extensão territorial e a distância entre as propriedades onde ficam os animais e os
laboratórios de PIVE, muitas vezes têm limitado a expansão da produção in vitro
comercial, principalmente pelas condições e pelo tempo gasto com o transporte dos
oócitos e dos embriões (ALVES et al., 2003; MARINHO et al., 2012; TESSMANN et
al., 2004).
Diversas alternativas de transporte têm sido relatadas, um exemplo é o uso de
incubadoras portáteis capazes de simular o ambiente do laboratório, permitindo assim,
tanto a maturação dos oócitos, quanto o cultivo dos embriões enquanto estes são
transportados, o que possibilita a execução de todo o processo de produção in vitro sem
nenhuma interrupção até o momento de transferência para as receptoras (MAX et al.,
2012).
Entretanto, são poucos os estudos envolvendo essas temáticas e os resultados
apresentados na literatura ainda são controversos (ALVES et al., 2003; ARRUDA et al.,
2012). Sendo assim, o estudo de estratégias de transporte de oócitos e de embriões por
longas distâncias e o impacto que a utilização de doses de sêmen sexado, assim como, a
inovulação do embrião transportado por longas distâncias em diferentes sincronias
receptora-embrião sobre os resultados destes procedimentos, possibilitará um melhor
entendimento e elementos auxiliares ao emprego desta tecnologia por técnicos e
criadores.
OBJETIVOS
Considerando os questionamentos apresentados acima, os objetivos desta
pesquisa foram:
•
Avaliar a viabilidade de um programa de produção in vitro de embriões
bovinos da raça Nelore cuja maturação oocitária e cultivo embrionário
ocorreram parcialmente durante o transporte por longas distâncias.
•
Determinar o efeito da fertilização com sêmen sexado para fêmea na taxa de
clivagem, produção de embriões e taxa de gestação em um programa de
produção in vitro de embriões com transporte de oócitos e embriões por longas
distâncias.
7
•
Estudar a influência de diferentes sincronias receptora-embrião sobre a taxa
de gestação em um programa de produção in vitro de embriões com transporte
de oócitos e embriões por longas distâncias.
HIPÓTESES
Ao realizar este trabalho hipotetisou-se que:
•
O transporte de oócitos e de embriões pode ser realizado por longas
distâncias, desde que em um ambiente que simule as mesmas condições de
atmosfera e de temperatura que são cultivados no laboratório.
•
O sêmen sexado para fêmea pode ser utilizado na PIVE bovinos cujos
oócitos foram transportados por longas distâncias, apresentando resultados
similares ao sêmen convencional em relação a taxa de clivagem, produção de
embriões e taxa de gestação.
•
O momento da inovulação influencia nos resultados da taxa de gestação das
receptoras devido à necessidade de uma sincronia entre a receptora e o embrião
transportado por longas distâncias.
REVISÃO DE LITERATURA
Histórico da produção in vitro de embriões bovinos
Os primeiros estudos sobre fertilização tiveram como referências trabalhos
realizados com estrela do mar a partir de 1940, pelo fato que, nestes invertebrados a
fertilização ocorre externamente ao sistema reprodutor da fêmea (GONÇALVES et al.,
2002). Posteriormente surgiram as pesquisas relacionadas com a produção de embriões
in vitro, que em mamíferos, tiveram como marco o nascimento do primeiro bebê de
proveta, Louise Brown, na Inglaterra no ano de 1978 (STEPTOE e EDWARDS, 1978
apud GONÇALVES et al., 2002).
8
O primeiro bezerro produzido por fertilização in vitro (FIV) nasceu em 1981 nos
Estados Unidos, provenientes de oócitos maturados in vivo (BRACKETT et al., 1982
apud SENEDA et al., 2002). No Brasil, vários laboratórios iniciaram suas pesquisas
com FIV no final da década de 1980 (WATANABE et al., 2002). Em 1994, uma equipe
de pesquisa obteve gestações de embriões zebuínos fertilizados in vitro (PEIXER et al.,
1994) e em 1996 pesquisadores da Universidade de São Paulo conseguiram o
nascimento de bezerros da raça Nelore mediante os processos de maturação, fecundação
e cultivo embrionário in vitro (AZAMBUJA et al., 1996).
Até o final da década de 90, a produção in vitro de embriões no Brasil foi
realizada, quase que exclusivamente, para fins de pesquisas e consequentemente não
teve impacto comercial (VIANA et al., 2012). Devido à sua complexidade e
características de altos custos era esperado um crescimento lento, apenas para atender as
demandas de mercados específicos (PONTES et al., 2010).
Posteriormente, estudos realizados por universidades e centros de pesquisas
contribuíram para a formação de uma base sólida de conhecimento na área, o
desenvolvimento de protocolos de maturação, fertilização e cultivo in vitro, a melhor
compreensão e controle da fisiologia reprodutiva em raças zebuínas e a otimização da
aspiração folicular guiada por ultrassonografia (OPU) foram pontos cruciais para tornar
esta biotecnologia pronta para o uso comercial (RUBIN, 2005).
O período entre 1999 e 2003 marcou a saída da PIVE do laboratório para o
campo (VIANA et al., 2012), entretanto, sendo utilizada em paralelo com a MOET e
compreendida ainda como uma alternativa complementar em casos específicos, como
doadoras inférteis ou de altíssimo valor financeiro (THIBIER, 2005).
A partir de 2004 houve uma estabilização e posteriormente um declínio na
utilização da MOET e a produção in vitro tornou-se a técnica de escolha para a
produção de embriões no Brasil (VIANA et al., 2010). O principal motivo para a
expansão da PIVE comercial foi a superação do maior limitador da superovulação: a
inconsistente resposta ovariana a estímulos exógenos de FSH em doadoras bovinas
(BARUSELLI et al., 2006).
Entre outros fatores que contribuíram para a hegemonia desta biotécnica estão
ainda: o maior número de folículos disponíveis para aspiração nos ovários de doadoras
zebuínas e a qualidade e o potencial dos oócitos recuperados nestes animais, uma vez
9
que, 97,3% dos embriões bovinos produzidos no Brasil são de doadoras Bos taurus
indicus (VIANA et al., 2012).
O contínuo e expressivo aumento da PIVE, sustentado principalmente pelas
raças zebuínas de corte, estabilizaram-se nos últimos anos, contudo, passou a ser
observado um avanço significativo da utilização desta técnica no setor leiteiro a partir
de 2005 até os dias atuais (VIANA et al., 2010). Do ponto de vista comercial, esta
ferramenta, associada a OPU, vem sendo cada vez mais acessível e eficiente, podendo
ser considerada uma técnica consolidada que provocou uma mudança significativa no
cenário nacional da indústria de embriões (SENEDA et al., 2002; 2006).
Produção in vitro de embriões bovinos no Brasil e no mundo
De acordo com relatórios fornecidos pela Sociedade Brasileira de Tecnologia de
Embriões
(SBTE), a
produção de embriões
bovinos
no Brasil
aumentou
significativamente na última década. Este aumento é diretamente relacionado com a
expansão da PIVE, que se tornou a técnica de escolha para aumentar o número de
descendentes de animais geneticamente superiores (VIANA et al., 2010).
A figura 1 mostra o crescimento da indústria de produção de embriões no país,
diferenciando o número de embriões produzidos pelas diferentes técnicas (MOET e
PIVE) entre o período de 1995-2010. Uma grande expansão no número total de
embriões produzidos pode ser notada a partir de 2000, sendo que em 2004 a produção
anual supera a marca de 200.000 embriões. Durante 2005-2010 a produção brasileira
total tende a se estabilizar com números em torno dos 300.000 embriões/ano (VIANA et
al., 2012).
Em relação à produção in vitro, o Brasil passa então a liderar o ranking mundial.
Em 2003 já são mais de 60.000 embriões gerados por este método (SENEDA et al.,
2006; THIBIER, 2004) e em 2008 foi responsável por mais da metade da produção in
vitro do mundo, ultrapassando a marca dos 220.000 embriões (Tabela 1) (MEIRELLES
et al., 2008).
Figura 1. Produção de embriões bovinos no Brasil de acordo com a técnica utilizada
durante o período de 1995-2010
10
Fonte: Adaptado de Viana et al. (2012)
Tabela 1. Participação do Brasil no total de embriões bovinos produzidos in vivo e in
vitro no mundo, durante o período 2000-2008
In vivo
In vitro
Total
Ano
Brasil
Mundo %
Brasil
2008
69,53
746,25
9,3
220,43 330,95
66,6 289,95 1.077,20 26,9
2007
57,37
763,47
7,5
212,44 434,58
48,9 269,81 1.198,05 22,5
2006
83,74
777,75
10,8 204,40 441,36
46,3 288,14 1.219,11 23,6
2005
122,21 789,97
15,5 137,04 330,65
41,4 259,25 1.120,62 23,1
2004
117,82 691,55
17,0 83,29
319.09
26,1 201,11 1.010,63 19,9
2003
117,83 693,79
17,0 63,16
330,85
19,1 180,99 1.024,64 17,7
2002
86,86
629,69
13,8 48,67
160,70
30,3 135,53 790,38
17,1
2001
46,30
580,08
8,0
10,20
109,21
9,3
56,50
689,28
8,2
2000
59,45
664,32
8,9
12,53
139,37
9,0
71,98
803,69
9,0
Fonte: Adaptado de Viana et al. (2010)
Mundo %
Brasil
Mundo
%
11
O cenário nacional da indústria de embriões passa então a refletir nos números
da produção mundial. A participação do país no panorama mundial aumenta até 2005,
estabilizando nos próximos anos, sendo responsável por 26,9% da produção total de
embriões em todo o mundo em 2008 (VIANA et al., 2010).
Enquanto no restante do mundo, na maioria das vezes, a técnica in vitro é
utilizada como última opção, em situações onde a recuperação de embriões pela
lavagem uterina é inviável, no Brasil a PIVE bovinos tem se tornado a primeira opção
na multiplicação de animais de interesse zootécnico (NONATO JR et al., 2003).
Certamente este fato correlaciona-se com o plantel nacional, pelo predomínio da
raça Nelore, tanto por produzir mais na PIVE, quanto pela valorização dos embriões
devido aos altos preços muitas vezes alcançados nesta raça. Com o maior domínio da
técnica e a grande quantidade de laboratórios também contribuiu para a sua
popularização (PONTES et al., 2011).
Etapas da produção in vitro de embriões
O termo PIVE é geralmente utilizado para se referir a uma série de
procedimentos realizados em laboratório, que incluem a maturação, a fertilização e o
cultivo in vitro, necessários para produzir embriões a partir de oócitos imaturos. Além
disso, a colheita dos oócitos realizada através da OPU também é considerada por alguns
autores como uma etapa da PIVE (VAGARO et al., 2008).
Colheita dos oócitos
A colheita de oócitos é considerada a base do programa de produção de
embriões in vitro (PIETERSE et al., 1988), podendo ser realizada tanto in vitro, por
meio de ovários de abatedouros, quanto in vivo, através de diversos procedimentos que
foram evoluindo ao longo das últimas décadas (GONÇALVES et al., 2008).
Quando realizada in vitro, através de ovários de abatedouros, é efetuada a
punção folicular com agulha acoplada a uma seringa ou bomba de vácuo
12
(GONÇALVES et al., 2002). Apesar de bastante utilizada com propósitos científicos e
viabilizar o nascimento de um número expressivo de descendentes de doadoras que
vieram a óbito, quando realizada de forma comercial, este procedimento apresenta
algumas dificuldades, como: problemas no transporte do abatedouro ao laboratório, o
desconhecimento acerca do estado de saúde e do padrão hormonal dos animais, assim
como a impossibilidade de repetição da técnica para um mesmo animal (SENEDA et
al., 2002).
Com os entraves da colheita em ovários de abatedouros, foram propostas novas
alternativas, buscando o aproveitamento de oócitos in vivo (BOLS et al., 1995; LEIVAS
et al., 2004). Primeiramente foi realizada de forma cirúrgica, através de diferentes
técnicas como a laparotomia, a laparoscopia transvaginal ou paralombar e a colpotomia,
sendo possível a recuperação de oócitos com êxito em vacas, novilhas e até mesmo
bezerras (HINRICHS et al., 1990; TESSMANN, 2004), entretanto, a dificuldade de
realização destas técnicas, a ocorrência de fibroses, aderências ovarianas e os riscos de
peritonites impediram sua expansão (LOONEY et al., 1994).
O advento da ultrassonografia na reprodução animal marcou a evolução da
obtenção de oócitos bovinos in vivo (BONI, 2012). Os primeiros relatos ocorreram em
1987, em que os ovários eram manipulados por via transretal e posicionados dorsolateralmente na cavidade abdominal e um transdutor linear com frequência de 3,5 MHz
era posicionado externamente na pele, na região paralombar, de forma que fosse
possível a visualização dos folículos e sua punção por meio de agulhas específicas
(SENEDA et al., 2002).
Posteriormente, Pieterse et al. (1988), a partir de modificações da técnica usada
para humanos, descreveram a aspiração folicular via transvaginal por meio da
ultrassonografia, tornando viável o aproveitamento de oócitos de forma simples e
inócua, podendo ser repetida várias vezes em um mesmo animal, sem as limitações
descritas nos procedimentos anteriores.
Na OPU, um sistema de bomba a vácuo permite a recuperação de oócitos e
líquido folicular para um tubo coletor. Em seguida, é feita a procura e seleção dos
oócitos viáveis, em microscópio estereoscópico, de acordo com sua morfologia, aqueles
selecionados são então, transportados até o laboratório onde se inicia as etapas de
produção in vitro (GARCIA et al., 2004).
13
A associação da OPU com a PIVE tornou-se uma alternativa interessante para a
produção de embriões principalmente por poder ser aplicada independente do estado
reprodutivo da doadora, ou seja, fêmeas gestantes, acíclicas, além daqueles animais com
alterações patológicas do aparelho reprodutor localizadas na tuba ou útero, e ainda
naquelas que não respondem a superovulação (BONI, 2012).
Desde sua consolidação, esta técnica vem passando por diversas modificações
em busca de melhorias na quantidade e qualidade de oócitos recuperados (SENEDA et
al., 2002). O tipo de agulha e a pressão do vácuo durante a aspiração são pontos cruciais
na busca por uma melhor eficiência (SENEDA et al., 2006).
Diferentes diâmetros e comprimentos de agulhas foram testados, associados ou
não, a pressão do vácuo. Uma maior quantidade de oócitos pode ser recuperada de
acordo com o aumento na pressão durante a aspiração, entretanto, a proporção de
camadas de células do cumulus, assim como a produção de blastocisto tende a diminuir
(BOLS et al., 1997). Dessa forma, é interessante um equilíbrio entre a eficiência da
aspiração e a qualidade dos oócitos aspirados (BONI, 2012).
Atualmente, a OPU encontra-se relativamente estabilizada quanto ao uso de
equipamentos e aparato técnico, com poucas expectativas de mudanças. Relatos de
campo mostram que uma dupla bem treinada consegue realizar a aspiração e seleção de
oócitos de 20 vacas por dia, apresentando resultados bastante satisfatório e capaz de
promover demanda suficiente para as etapas posteriores da produção de embriões
(SENEDA et al., 2006).
Maturação in vitro (MIV)
Durante a maturação, primeira etapa laboratorial da produção in vitro, os oócitos
colhidos passam por uma série de transformações do núcleo e do citoplasma, maturação
nuclear e citoplasmática tornando-os aptos a serem fertilizados (GORDON, 2003).
A maturação nuclear, in vivo, inicia após o pico pré-ovulatório de LH, enquanto
que in vitro, esse processo é iniciado logo após a remoção do oócito do ambiente
folicular, quando é retomada a meiose. Esta compreende a quebra da vesícula
germinativa, seguida por condensação da cromatina, desaparecimento do nucléolo e
14
desintegração do núcleo. Durante este processo acontece a progressão do estádio
diplóteno da primeira prófase meiótica até a metáfase II (GONÇALVES et al., 2008).
A maturação citoplasmática consiste na reorganização das organelas
intracelulares, incluindo a migração das mitocôndrias para a posição perinuclear,
deposição dos grânulos corticais abaixo da membrana vitelina e às alterações dos
padrões de síntese proteica, sendo que a transcrição de genes só voltará a ocorrer após a
transição materno-zigótica (GARCIA et al., 2004).
Células somáticas (da granulosa e do cumulus oophorus) têm um papel
importante durante a aquisição da competência oocitária na maturação in vitro
(VARAGO et al., 2008). Elas interagem com os oócitos através das junções ‘gap’,
facilitando a passagem de nutrientes e proteínas reguladoras que participam do
crescimento e da maturação destes (MIYANO, 2003).
Para que todos os eventos de maturação oocitária ocorram in vitro é necessário
que os meios utilizados durante este período mimetizem as condições encontradas
durante o processo de maturação in vivo (GARCIA et al., 2004).
A grande maioria dos laboratórios tem utilizado o Tissue Culture Medium
(TCM) como meio de maturação (GORDON, 2003). Este meio base é modificado de
acordo com a rotina de cada laboratório, sendo, geralmente, adicionado de piruvato,
lactato, aminoácidos, bicarbonato de sódio, vitaminas, penicilina, estreptomicina, entre
outros (GONÇALVES et al., 2008). Pode ainda ser suplementado com fontes proteicas
de origem animal como Soro Fetal Bovino (SFB) e a Albumina Sérica Bovina (BSA)
(VARAGO et al., 2008), ou ainda Soro de Vaca em Estro (SVE) (GONÇALVES et al.,
2002).
A adição de alguns hormônios ao meio, com LH, FSH, ou ainda a associação de
ambas as gonadotrofinas com hormônios esteroides, tem sido implementada em função
da especificidade da ação que cada hormônio deve exercer tanto para maximizar a
porcentagem de oócitos que completam a meiose quanto para aumentar a capacidade de
fecundação e desenvolvimento até o estádio de blastocistos (ALVES et al., 2001;
SAEKI et al., 1991).
Um dos principais motivos de redução na produção in vitro de embriões é a falta
de competência dos oócitos antes da maturação (ALVES et al., 2003). Alguns estudos
tem demonstrado que a qualidade do oócito está relacionada com o ambiente folicular,
15
havendo uma relação entre o tamanho do folículo e a competência oocitária, onde a
competência aumenta com o aumento do folículo (KRUIP et al., 2000; LONERGAN et
al., 1994).
Com poucas exceções, a maturação de oócitos bovinos in vitro é realizada a
39°C por 22 a 24h em atmosfera de 5% de CO2 em ar e umidade saturada
(GONÇALVES et al., 2002).
Somente após a conclusão dos processos de maturação nuclear e citoplasmática
é que o oócito torna-se competente para a fertilização e o desenvolvimento embrionário
inicial (VARAGO et al., 2008).
Fertilização in vitro (FIV)
A fertilização é caracterizada pela fusão do espermatozoide com o oócito, após
ocorre a exocitose dos grânulos corticais e a retomada da meiose com extrusão do
segundo corpúsculo polar e formação do pronúcleo feminino. O núcleo espermático se
descondensa transformando-se no pronúcleo masculino (HAFEZ e HAFEZ, 2004). Os
pronúcleos masculino e feminino migram para o centro do oócito, o envelope nuclear se
desintegra e ocorre a associação dos cromossomos para a primeira divisão mitótica, a
clivagem, iniciando o desenvolvimento embrionário (GONÇALVES et al., 2002).
In vivo, para que ocorra a fertilização é necessário que o espermatozoide
percorra um longo trajeto pelo trato genital da fêmea até chegar ao sítio de fertilização
no oviduto. Durante este percurso, glicosaminoglicanos presentes no interior do trato
reprodutivo feminino induzem sua capacitação (HAFEZ e HAFEZ, 2004). Para
fertilização in vitro, a capacitação espermática é geralmente promovida pela heparina,
um glicosaminoglicano presente em altas concentrações no trato reprodutivo de fêmeas
bovinas, principalmente durante o estro (BLONDIN et al., 2009).
In vitro, antes da capacitação, após o descongelamento da palheta de sêmen, os
espermatozoides viáveis precisam ser separados do plasma seminal, dos crioprotetores,
dos extensores e das células mortas (GONÇALVES et al., 2008). Para bovinos, os
métodos de separação espermática mais utilizados são o gradiente de percoll e o swimup (GALLI e LAZZARI, 1996).
16
Testes com diferentes concentrações inseminantes deveriam ser realizados
buscando a concentração de espermatozoides ideal para cada touro, maximizando a
capacidade fecundante da amostra de sêmen. Como estes testes não tem aplicabilidade
na prática de laboratórios comercias, geralmente é utilizada a concentração de 1 x 106 a
2 x 106 espermatozoides/mL, calculada de acordo com a motilidade e a população viva
de espermatozoides obtida após o processo de separação (GONÇALVES et al., 2002).
O co-cultivo de espermatozoides e oócitos, é realizado por um período de 6 a 9h
ou 18 a 22h, a depender da rotina do laboratório, a 39°C e 5% de CO2 em ar e umidade
saturada. O meio base mais utilizado é o Tyrode-albumina-lactato-piruvato (FERTTALP) (VARAGO et al., 2008).
O sistema de fertilização in vitro tenta mimetizar as condições in vivo. Porém,
resultados variados são obtidos com espermatozoides oriundos de touros ou partidas
diferentes. Uma média de 40% ou mais dos oócitos maturados e fecundados in vitro
podem se desenvolver até o estádio de blastocisto (BAVISTER, 2002).
Cultivo in vitro (CIV)
O cultivo embrionário in vitro, corresponde ao desenvolvimento do oócito
fertilizado até o estádio de blastocisto. É durante este período que ocorrem eventos
como: ativação do genoma embrionário (transcrição materno-zigótica), divisão celular
(clivagem), compactação dos blastômeros no estádio de mórula, início da diferenciação
embrionária (células do trofoblasto, que darão origem à placenta e anexos fetais, e
células da massa celular interna, que formarão o feto propriamente dito) com a
formação da blastocele (GARCIA et al., 2004).
Esses fenômenos podem ser afetados por uma variedade de fatores intrínsecos e
extrínsecos, como íons inorgânicos, tampões, composição da atmosfera gasosa,
aminoácidos, pH, fatores de crescimento, luminosidade, vitaminas e macromoléculas
(CAMARGO et al., 2006).
Muitos estudos têm demonstrado diferenças envolvendo aspectos morfológicos e
moleculares entre embriões produzidos in vivo e in vitro, os quais interferem nas taxas
de gestação. Embriões produzidos in vitro apresentam coloração mais escura, menor
17
compactação da massa celular, formação prematura da blastocele, alteração na
proporção da massa celular interna e células trofoblásticas, alterações na expressão
genética e metabolismo celular (GONÇALVES et al., 2002).
O bloqueio no desenvolvimento embrionário no momento da ativação do seu
genoma (estádio de 8 a 16 células nos bovinos), causado pelos efeitos adversos ou
carências dos meios utilizados foi o responsável pela grande dificuldade na obtenção in
vitro de embriões bovinos nas décadas de 60 e 70, levando ao desenvolvimento de
cultivos in vivo, onde embriões de duas e quatro células produzidos in vitro
desenvolviam em ovidutos até o estádio de blastocisto (VARAGO et al., 2008).
Posteriormente começaram os cultivos de embriões com co-cultivos de células
somáticas em estufas com atmosfera sem o controle de O2, como células do oviduto, da
granulosa, células VERO (linhagens celulares estabelecidas para cultivo), células BRL
(buffalo rat liver), entre outras (GONÇALVES et al., 2002). Depois estes foram
substituídos por sistemas com meios e atmosfera de 5% de CO2 (GONÇALVES et al.,
2008).
Há mais de trinta anos diferentes sistemas de cultivo vêm sendo estudados e
testados, porém, algumas respostas em relação aos efeitos destes no desenvolvimento
embrionário ainda estão em aberto (CAMARGO et al., 2006). Os diversos nutrientes
utilizados não conseguem suprir totalmente as necessidades embrionárias, ainda sendo
observadas alterações moleculares e fenotípicas nos embriões e neonatos (FARIN et al.,
2006).
Atualmente existe uma grande variedade de meios de cultivo para o
desenvolvimento embrionário, sendo, as condições de cultivo in vitro de fundamental
importância para obtenção de bons índices de produção (GARCIA et al., 2004). De
acordo com sua formulação, os meios podem ser classificados em: indefinido, semidefinido ou definido (CAMARGO et al., 2006).
No sistema de cultivo indefinido, o soro é o principal componente e possui uma
série de fatores benéficos ao embrião, como: aminoácidos, fatores de crescimento,
vitaminas e substratos energéticos. Além disso, co-cultivo de células somáticas também
pode ser inserido neste meio, contribuindo para o desenvolvimento embrionário pela
remoção de substâncias nocivas como metais pesados e pela secreção de substâncias
embriotróficas (BAVISTER, 1995).
18
Entretanto, traz como desvantagem a produção de fatores tóxicos aos embriões,
alteração na produção, em decorrência da variação nos componentes do meio, alterações
durante a gestação e fenotípicas nos neonatos, aumento na proporção de machos e
distúrbios na expressão genética (BAVISTER, 1995; GUITIÉRREZ-ADAN et al.,
2001; WALDROP et al., 2004)
No meio semi-definido o soro é substituído pela albumina, uma proteína que está
presente no trato reprodutivo dos mamíferos e é relacionada com a nutrição do embrião
no período após a compactação. O uso da BSA busca eliminar os efeitos nocivos do
soro, contudo, por ser um componente biológico também pode contaminar o cultivo e
prejudicar o desenvolvimento embrionário (TOMPSON, 2000).
Os sistemas definidos permite um maior controle das condições de cultivo por
eliminar as variações nutricionais e os efeitos deletérios das substâncias biológicas, uma
vez que, são substituídas por macromoléculas como álcool polivinílico e
polivinilpirrolidona. Entretanto, por não ter ação protetora, como o soro e a BSA, os
resultados são inconsistentes e mais baixos quando comparado aos sistemas citados
anteriormente, limitando seu uso comercial (KURAN et al., 2001).
Entre os principais meios de cultivo embrionário disponíveis no mercado, estão
o SOF (Fluido Sintético do Oviduto), o KSOM, o CR1aa e o CR2aa. O uso de meios
sequenciais também vem sendo utilizado, devido às variações nas exigências
nutricionais dos embriões durante o seu crescimento. Estes são modificados durante o
cultivo, de forma a simular as condições encontradas nos diferentes locais do trato
reprodutivo durante o período de pre-implantação embrionária (CAMARGO et al.,
2006).
O cultivo embrionário in vitro varia de 7 a 9 dias a 39°C, atmosfera controlada
(5% de O2, 5% de CO2 e 90% de N2) e umidade saturada. A taxa de blastocisto
geralmente é avaliada no 7° dia após a fecundação, quando são transferidos, sendo que
os blastocistos podem permanecer na estufa até o 9° dia para avaliar a taxa de eclosão in
vitro (GONÇALVES et al., 2008).
19
Utilização de sêmen sexado na produção in vitro de embriões bovinos
Cada gameta (célula haplóide) possui apenas um cromossomo sexual, o
feminino (oócito) é portador do cromossomo sexual X e o masculino (espermatozoide)
possui o cromossomo sexual X ou Y. Dessa forma, o sexo genético é determinado pelo
cromossomo sexual presente no espermatozoide (X ou Y), no momento da fertilização
(HAFEZ e HAFEZ, 2004).
Após a determinação do sexo genético no embrião, a diferenciação sexual cursa
com o desenvolvimento gonadal que desencadeará o desenvolvimento do sexo
fenotípico. Sendo assim, células somáticas diploides de fêmeas possuem dois
cromossomos sexuais similares (X e X), enquanto as células somáticas dos machos
apresentam cromossomos sexuais diferentes (um cromossomo X e um menor, o
cromossomo Y) (GARNER e SEIDEL, 2008).
De forma natural na reprodução, para as espécies mamíferas, a proporção do
sexo esperada é em torno de 50:50 (XU et al., 2009). A busca por métodos capazes de
selecionar o sexo dos animais sempre foi um desafio para a humanidade e objeto de
estudos ao longo dos anos (ARRUDA et al., 2012; WHEELER et al., 2006). Depois de
diversas técnicas experimentadas, atualmente, a sexagem de espermatozoides através da
citometria de fluxo é largamente aceita com grande avanço entre as tecnologias da
reprodução (BLONDIN et al., 2009).
Baseada na diferença entre o conteúdo do DNA do espermatozoide X e Y
(aproximadamente 4% em bovinos), esta técnica, que foi desenvolvida em 1989 por
Larry A Johnson, é considerada o principal método validado para seleção do sexo antes
do nascimento, sendo que na espécie bovina avançou suficientemente para permitir o
uso de forma comercial (BLONDIN et al., 2009; SEIDEL et al., 1999).
A precisão da sexagem está em torno de 85-95% e a velocidade de separação das
células espermáticas, que no início da técnica era de 300.000 células/hora aumentou
atualmente para 15-20 milhões/hora atualmente. Entretanto, esta velocidade de
separação continua a ser um gargalo para a ampliação do uso de sêmen sexado em larga
escala (XU et al., 2009).
Outra grande preocupação com a implantação desta tecnologia está relacionada
com a menor fertilidade do sêmen sexado quando comparado com o sêmen
20
convencional, a qual pode ser atribuída a dois fatores: danos sofridos às células
espermáticas durante a técnica de citometria de fluxo e a menor quantidade de
espermatozoides por palhetas por consequência da velocidade de sexagem (SEIDEL et
al., 1999).
Ao analisar os parâmetros seminais em diferentes touros, Blondin et al. (2009)
observaram menor motilidade dos espermatozoides que foram submetidos ao processo
de sexagem, quando comparado com o convencional, demonstrando comprometimento
na qualidade do sêmen quando submetido a este procedimento.
Os altos preços das doses de sêmen sexado aliado aos resultados inconsistentes
quando utilizado na inseminação artificial (IA) tem limitado sua expansão (SEIDEL e
SCHENK, 2008). No entanto, os resultados são animadores quando associado à
produção in vitro (PONTES et al., 2010). Na IA em média 2 x 106 espermatozoides são
necessários para fertilizar um oócito, já na FIV pode ser usado em média apenas 1.000
espermatozoides por oócito, maximizando o aproveitamento da dose inseminante
(YANG et al., 1993).
Ao longo dos últimos anos diversos estudos relataram a utilização de sêmen
sexado na produção de embriões bovinos in vitro (XU et al., 2009). Contudo, uma série
de questões parece influenciar seus resultados, com grande variabilidade nas taxas de
obtenção de blastocistos (ARRUDA et al., 2012).
Apesar das limitações encontradas, a produção de embriões in vitro tem
contribuído para uma maior difusão do uso de sêmen sexado (PONTES et al., 2010).
Existem controvérsias quanto aos resultados da PIVE com sêmen sexado, enquanto
alguns estudos mostram taxas de clivagem e produção de blastocistos semelhantes às
encontradas com sêmen convencional (BLONDIN et al., 2009; CARVALHO et al.,
2010; LU e SEIDEL, 2004), outros mostram resultados inferiores com o sêmen sexado
(MERTON et al., 1997; PALMA et al., 2008; STINSTROFF et al., 2012).
No entanto, a técnica ainda está em desenvolvimento e é inegável o grande
avanço proporcionado pelo seu uso na indústria de embriões bovinos in vitro, as
perspectivas são altamente favoráveis especialmente com o aumento da PIVE no
segmento da pecuária leiteira (ARRUDA et al., 2012).
21
Transporte de oócitos por longas distâncias
No Brasil, em função da grande extensão territorial, as condições de transporte
de oócitos até os laboratórios de PIVE são consideradas como fator limitante na
produção comercial de embriões bovinos, em muitos casos, o tempo transcorrido nestes
transportes pode interferir diretamente na viabilidade dos oócitos e nas posteriores
etapas da produção in vitro (LEIVAS et al.,2004; TESSMANN et al., 2004).
Apesar de diversos avanços na recuperação de oócitos, poucos são os estudos
envolvendo o transporte destes do local das OPUs até as centrais produtoras de
embriões (FRY et al., 2000; WOLF et al., 1998). Alguns aspectos como, o meio
utilizado, recipientes onde são acondicionados, a duração do transporte e a temperatura
entre a coleta e a chegada ao laboratório podem influenciar no desenvolvimento
embrionário in vitro (TESSMANN et al., 2004; WARD et al., 2000).
Quando o transporte é realizado por um período curto, o uso do próprio líquido
folicular pode ser uma alternativa, pois substâncias presentes neste líquido
proporcionam graus variáveis de bloqueio da meiose, possibilitando maior sincronia
entre a maturação nuclear e citoplasmática, sendo adequado para a manutenção dos
oócitos por pouco tempo, entretanto, por períodos prolongados este bloqueio pode
provocar redução nas taxas de embriões produzidos. (LEHMKUHL et al., 2000;
VIZCARRA et al., 2000).
O uso de meio de maturação no transporte de oócitos se faz interessante, uma
vez que, proporciona condições adequadas de maturação já durante o transporte,
melhorando os resultados da PIVE quando comparado ao transporte em meios de
manutenção (GARCIA et al., 1998).
De acordo com alguns autores, uma menor variação do pH dos meios de
transporte é de grande importância para melhorar os resultados na PIVE. No sistema de
tamponamento de meios através de bicarbonato/CO2 o controle do pH é efetuado pela
mudança da concentração de bicarbonato no meio, ou pelo conteúdo de CO2 na
atmosfera gasosa. Nos sistemas onde não se utiliza uma atmosfera controladora,
produzida por estufas de cultivo, o tamponamento dos meios pode ser realizado pelo uso
de um tampão orgânico denominado Hepes [N-(2-hidroxietil) piperazina-N-(2ácidoetanosulfônico)] (ALVES et al., 2003).
22
Entre os principais métodos de transporte adotados pelos laboratórios estão: o
uso de criotubos ou tubos de ensaio em estufas portáteis em que o pH do meio é
controlado pelo sistema bicarbonato/CO2 (KAISER et al., 1999), o uso de meios que
contenham tampão orgânico (Hepes), que não necessita de controle da atmosfera
(LEIVAS et al., 2004; SILVA et al., 2011), o uso de tubos de poliestireno em banhomaria (OLIVER et al., 1998) ou placas de cultivo acondicionadas em bolsas plásticas
seladas (PALMA et al., 1998).
Avaliando o transporte de oócitos bovinos em criotubos com meio de maturação
TCM associado ao tampão Hepes, a 38,5ºC, sem controle da atmosfera gasosa,
acondicionados em incubadora portátil (Minitub), Silva et al. (2011) não encontraram
diferença nas taxas de blastocistos quando o transporte foi simulado por até nove horas
em relação ao grupo controle, mostrando viabilidade desta técnica por este período.
Em um estudo semelhante, entretanto, com tubo de poliestireno em banho-maria,
a 39ºC, Leivas et al. (2004) não encontraram diferença no número e na qualidade de
blastocistos, quando os oócitos foram transportados por até 12 horas, contudo, uma
redução significativa ocorreu quando este transporte se prolongou por 18 horas.
Tessmann et al. (2004) mostraram a possibilidade de transporte-maturação de
complexos cumulus-oócitos de bovinos em palhetas de 0,25 mL em TCM-Hepes,
acondicionadas em garrafas térmicas a 38,5ºC, sem controle da atmosfera gasosa, por
até seis horas sem prejuízo ao desenvolvimento embrionário in vitro.
A busca por alternativas práticas e eficientes para o transporte de oócitos
bovinos aspirados no campo até os laboratórios tende a continuar dentro do contexto
nacional no qual está inserida a produção in vitro de embriões bovinos (SILVA et al.,
2011).
Transporte de embriões por longas distâncias
Em um programa de PIVE em larga escala existem algumas limitações. Uma
delas é a distância entre os laboratórios de produção in vitro e as propriedades rurais
onde são criadas as receptoras. Muitas vezes as fazendas com grandes rebanhos bovinos
em que os animais são utilizados como receptoras estão localizadas em áreas novas de
23
produção, como ao norte e nordeste do Brasil, enquanto que os grandes centros de
produção in vitro estão a milhares de quilômetros de distância nas regiões sul e sudeste
(MARINHO et al., 2012).
Vários estudos foram conduzidos buscando simular o transporte de embriões em
diferentes condições e por variados períodos (HASLER et al., 1997; MEZALLIRA et
al., 2004; YANG et al., 1991). De acordo com Ramos et al. (2006), a simulação de
transporte em palhetas de 0,25mL por até 12 horas, não interferiu na viabilidade
embrionária, quando analisada a taxa de eclosão dos embriões.
Também simulando o transporte em palhetas, Brum et al. (2002) não
encontraram diferença em relação a taxa de eclosão e números de células quando
comparado com o cultivo em placas, afirmando ser uma forma prática, na qual os
blastocistos bovinos podem continuar o seu desenvolvimento enquanto são
transportados por longas distâncias para serem transferidos.
Após o transporte por seis horas em meio TCM-Hepes + 10% de SVE em
temperatura ambiente (22-25ºC), blastocistos produzidos in vitro foram transferidos
para as receptoras, mantendo a taxa de gestação de 33,3%, resultados considerados
satisfatórios pelos autores (MEZZALIRA et al., 2004). Contudo, Yang et al. (1991)
mostraram que a taxa de gestação para embriões produzidos in vitro está inversamente
proporcional ao tempo de transporte.
O transporte de embriões se faz importante também devido às limitações da
criopreservação em embriões Bos taurus indicus produzidos in vitro, restringindo o
aproveitamento das receptoras no momento em que estes são produzidos (MARINHO et
al., 2012).
Uma alternativa para longas distâncias é o transporte de embriões no próprio
meio de cultivo, onde de acordo com a distância, os embriões são transportados em
diferentes estádios de desenvolvimento de forma que o fim do transporte coincida com
o fim do cultivo, ou seja, o dia sete do CIV (dia 0 = dia da FIV). Assim as últimas
etapas de desenvolvimento ocorrem durante o transporte, sendo este realizado em
incubadoras portáteis simulando as condições do laboratório (39º e 5% de CO2 em ar)
(PONTES et al., 2010).
24
Sincronia receptora-embrião
A variabilidade nos resultados das transferências de embriões produzidos in
vitro ainda é um dos entraves para a sua expansão, e a maioria dos problemas são
relacionados com as receptoras (MARINHO et al., 2012). Entre os fatores que afetam as
taxas de gestação, a sincronia entre o trato reprodutivo da receptora e o embrião no
momento da inovulação é de grande relevância (ANDRADE et al., 2012).
Maiores conhecimentos da função ovariana, por meio da ultrassonografia,
permitiram a elaboração de protocolos eficientes em controlar o status luteínico e
folicular em receptoras de embrião, possibilitando uma eficiente sincronização e
permitindo a transferência de embriões em tempo fixo (TETF) (BARUSELLI et al.,
2004; BÓ et al., 2004).
Entre os protocolos existentes no mercado, destacam-se os tratamentos com
dispositivos de progesterona/progestágenos e estrógenos, os quais têm apresentado altas
taxas de aproveitamento de receptoras (85-90%) e de gestação (40-50%), além de
eliminar a necessidade de detecção de estro, viabilizando programas de transferência de
embriões em tempo fixo em larga escala (BÓ et al., 2004; RODRIGUES et al., 2010).
A sincronia entre o ambiente uterino e o embrião é essencial para maximizar a
sobrevivência embrionária, diversas mudanças ocorrem no útero durante o
desenvolvimento embrionário, mediadas principalmente pela progesterona (REIS et al.,
2006).
Quando embriões são produzidos in vivo, a sincronia entre a receptora e o
embrião transferido é estimada pela comparação entre a data do cio das receptoras e da
doadora. Na PIVE esta sincronia é estimada pelo cio das receptoras e o dia da FIV.
Existem relatos que o desenvolvimento embrionário é retardado em embriões produzido
in vitro, no momento da ativação do genoma embrionário em comparação com
embriões produzidos in vivo (SAKAGUCHI et al., 2002).
Sakaguchi et al. (2002) encontraram variação nos resultados quando os embriões
foram inovulados em momentos diferentes, obtendo maior taxa de gestação em
receptoras que deram cio no dia da FIV. Dias et al. (2006) descreveram que a taxa de
gestação foi influenciada pela sincronia embrião-receptora e consideraram esta variável
25
como uma das mais importantes na seleção das receptoras em programas de produção
de embriões.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais e local do experimento
Foram utilizadas como doadoras de oócitos, 123 vacas Bos taurus indicus da
raça Nelore, selecionadas com base no mérito genético. Estes animais apresentavam
escore de condição corporal médio de 3,80±0,5 (escala de 1-5) (HOUGHTON et al.,
1990), idade média de 6,00±3,1 anos e tinham atividade ovariana regular (baseado em
exame de palpação retal e ultrassonografia). Foram realizadas 274 sessões de OPU, com
média de 2,23±1,1 procedimentos por animal, sendo que nenhum tratamento hormonal
foi realizado antes das sessões.
Novilhas e vacas mestiças (Bos taurus indicus x Bos taurus taurus) foram
utilizadas como receptoras. Esses animais foram avaliados por exames ginecológicos e
sanitários, receberam as vacinas obrigatórias e contra as principais doenças da esfera
reprodutiva sendo mantidas a pasto com água e sal mineral à vontade.
O experimento ocorreu entre os anos de 2011 e 2012. Todos os animais que
participaram (doadoras e receptoras) estavam em fazendas comerciais localizadas no
estado da Bahia e a produção in vitro dos embriões ocorreu em um laboratório
comercial no estado de São Paulo a uma distância aproximada de 2.000 quilômetros das
fazendas onde estavam os animais.
Aspiração folicular
O procedimento de aspiração folicular foi realizado utilizando-se equipamento
de ultrassonografia (ALOKA SSD 500, Aloka, Japão) com transdutor microconvexo de
5MHz conectado a uma guia de biópsia com agulha hipodérmica de 19G (Becton
Dickinson, Curitiba, Brasil) e linha de aspiração (Corning, Acton, MA, EUA) em tubo
26
de centrífuga de 50mL aquecido (37ºC). A pressão de vácuo foi obtida com uma bomba
de aspiração (BV004, WTA, Cravinhos, Brasil), ajustada entre 72 e 78mmHg.
Antes de cada procedimento era realizada limpeza e assepsia da região perianal
com água e álcool 70%. Para evitar movimentos peristálticos e desconforto ao animal
era feita anestesia epidural com 5mL de Lidocaína a 2% (Anestésico L, Pearson, São
Paulo, Brasil). Em seguida o transdutor era inserido até o fundo de saco vaginal e, com
o auxílio da manipulação retal, os ovários eram posicionados para obtenção de uma boa
visualização dos folículos na tela do ultrassom.
Os folículos visualizados eram posicionados no percurso da linha de punção e
então aspirados pela agulha conectada ao sistema com pressão negativa acionada pela
bomba de vácuo. O mesmo procedimento era repetido em todos os folículos
visualizados em ambos os ovários. O meio de colheita dos oócitos e de lavagem da
agulha e do sistema era composto de DPBS (Dulbecco Mod. PBS, Vitrocell, Campinas,
Brasil) acrescido de 5,0 UI/mL de heparina sódica (Liquemine, Roche, Rio de Janeiro,
Brasil).
O material aspirado era transferido para um filtro de colheita de embriões
(Vitrocell, Campinas, Brasil) e lavado com a mesma solução usada na aspiração. O
sedimento restante no filtro era transferido para placas de Petri 100x20mm (TPP,
Vitrocell, Campinas, Brasil) e observado em microscópio estereoscópio (SZM 1000,
Nikon, Melville, EUA), onde procedeu a busca e classificação dos oócitos de acordo
com a sua morfologia (número de camadas e o grau de expansão das células do cumulus
e o aspecto do citoplasma quanto à cor, homogeneidade e integridade) em grau I, II, III
e IV segundo Gonçalves et al. (2002).
Transporte dos oócitos e dos embriões
Os oócitos considerados viáveis (grau I, II e III) foram lavados em solução de
TCM 199 Hepes (Gibco Life Techonologies, Grand Island, EUA), suplementada com
10% de SFB, 50µg de gentamicina e 2,2µg de piruvato. Após esta etapa, os oócitos
eram acondicionados em criotubos (Uniscience, São Paulo, Brasil) com 400µL de meio
de maturação constituído de TCM-199 bicarbonato (Gibco Life Techonologies, Grand
27
Island, EUA); suplementado com 10% de SFB; 50UI de hCG/mL; 0,5µg/mL de FSH;
1µg/mL de estradiol; 2,2µg/mL de piruvato e 70µg/mL de amicacina. Este meio era
recoberto por 300µL de óleo mineral. Por fim, gaseificava-se o ambiente interno do
criotubo (Uniscience, São Paulo, Brasil) com uma mistura de 5% de CO2 e submetiamse os mesmos ao transporte em incubadora portátil (19180/0002, Minitube, Tiefenbach,
Alemanha, Brasil) a uma temperatura de 38,5ºC.
Os oócitos eram transportados de carro até o aeroporto mais próximo e então
remetidos de avião para o laboratório no estado de São Paulo. Chegando ao laboratório,
concluía-se a etapa de maturação e seguia a fertilização e o cultivo in vitro.
Posteriormente, os embriões produzidos eram transportados de volta à Bahia, fazendo o
mesmo percurso dos oócitos, para serem transferidos as receptoras. Em decorrência da
distância, os oócitos iniciavam a MIV e os embriões completavam o CIV enquanto eram
transportados.
O transporte dos embriões ocorria em condições semelhantes às dos oócitos,
entretanto, em meio de CIV. Devido à logística dos percursos eram feitos cálculos do
tempo gasto com o transporte (em média 18 a 24 horas) de forma que os embriões
retornavam no dia seis (D0 - dia da FIV) e eram sempre inovulados no dia sete. Ao fim
do transporte, os embriões eram novamente avaliados e envasados em palhetas de
0,25mL para serem transferidos.
Produção in vitro dos embriões
Chegando ao laboratório, os oócitos em maturação eram transferidos para placas
de Petri 100x20mm (TPP, Vitrocell, Campinas, Brasil), em microgotas de 100µL de
meio de maturação semelhante ao usado no transporte. Os oócitos permaneceram
incubados por 24 horas (levando em consideração o tempo gasto com o transporte) a
38,5ºC em atmosfera de 5% de CO2 em ar.
Percorrido o tempo de maturação, os oócitos eram lavados três vezes em meio
de fecundação TALP-FIV e transferidos para microgotas de 100µL de meio de
fecundação Tyrode modificado (TALP) suplementado com 10µg/mL de heparina e
160µL de solução de epinefrina (PHE). Foi utilizado sêmen criopreservado
28
comercializado de 12 touros diferentes da raça Nelore. A depender do acasalamento
sugerido pelos proprietários das doadoras, os oócitos maturados eram direcionados para
fertilização com espermatozoides provenientes de sêmen convencional (grupo 1 –
CONV) ou sêmen sexado para fêmea (grupo 2 – SEX). O sêmen era separado em
gradiente de Percoll 90 e 45%, submetido a uma força de centrifugação de 200g durante
30 minutos. O segmento recuperado era avaliado e ajustado de modo a obter a
concentração final de 100 X 103 espermatozoides viáveis por gota. Posteriormente,
foram incubados por 18 horas a 39ºC em atmosfera de 5% em ar, para a fecundação.
Após o tempo de fecundação, as estruturas foram lavadas por três vezes e
transferidas para microgotas de 100µL de meio de cultivo SOF modificado recobertas
com óleo mineral. O meio de cultivo foi renovado em cada microgota no terceiro e no
quinto dia (feeding), permanecendo nestas por um período de seis dias, até serem
submetidos ao transporte para as propriedades onde estavam as receptoras.
Transferência de embriões
Foi utilizado um protocolo de transferência de embrião em tempo fixo, onde no
dia 0, as receptoras receberam um dispositivo intravaginal de progesterona (DIB®, MSD
Saúde animal, São Paulo, Brasil) associado a 2mg de Benzoato de Estradiol i.m.
(Gonadiol®, MSD Saúde animal, São Paulo, Brasil). No dia 8, os dispositivos foram
retirados e foram aplicados 300UI de Gonadotrofina Coriônica Equina i.m. (eCG,
Novormon®, MSD Saúde animal, São Paulo, Brasil), 500µg de Cloprostenol
i.m.(Ciosin®, MSD Saúde animal, São Paulo, Brasil) e 1mg de Cipionato de Estradiol
i.m. (ECP®, Pfizer, Guarulhos, Brasil). O dia 10 foi considerado como o dia do estro e
os embriões foram transferidos no dia 17. Anteriormente a cada inovulação, os mesmo
procedimentos referentes a limpeza, assepsia e anestesia realizados nas doadoras, foram
conferidos às receptoras. Também foram realizados exames dos ovários por
ultrassonografia (ALOKA SSD 500, Aloka, Japão) para confirmar a presença e o
tamanho do corpo lúteo (CL), sendo que apenas receptoras com CL maior que 13mm
receberam embrião.
29
Devido à distância entre o laboratório e as fazendas onde se encontravam as
receptoras, foi avaliada também uma possível influência do momento da inovulação
(sincronia receptora-embrião) sobre taxa de gestação. Sendo assim, um percentual dos
embriões produzidos (n=893) foi inovulado em turnos diferentes no dia sete (D0 - dia
da FIV), sendo distribuídos em três grupos experimentais: TE-M (n=457), embriões
inovulados durante a manhã (06:00 à 11:59), TE-T (n=322), inovulações à tarde (12:00
à 17:59) e TE-N (n=114), inovulações à noite (18:00 à 24:00).
Diagnóstico de gestação
O diagnóstico de gestação foi realizado por ultrassonografia transretal, 30 dias
após a data da FIV e repetido com 60 dias, utilizando transdutor linear de 5,0MHz
(ALOKA SSD 500, Aloka, Japão). Foi considerado diagnóstico de gestação positivo a
presença de uma vesícula embrionária com viabilidade confirmada (batimento
cardíaco). A taxa de gestação foi calculada dividindo o total de receptoras gestantes pelo
total de vacas que receberam embrião.
Análise estatística
Os dados foram processados usando o Statistical Package for Social Science
(SPSS, versão 19). Para tanto, realizou-se a seguinte sequência de análises: 1- A média
e o desvio padrão das características de interesse ao estudo foram obtidas por meio da
análise descritiva; 2- As diferenças entre as taxas de clivagem e taxas de embriões
produzidos entre os grupos CONV e SEX foram comparadas utilizando o teste T de
Student. 3- As taxas de gestação entre os grupos CONV e SEX e entre os diferentes
turnos de inovulação foram comparadas empregando um estudo de dispersão de
frequências utilizando o teste de Qui-quadrado (χ2). Os testes foram realizados
considerando um nível de significância de 0,05.
30
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Um total de 12.653 oócitos foi recuperado em 274 sessões de aspiração. Em
média 46,18±32,7 oócitos foram obtidos por OPU e 8.423 (66,56%) foram considerados
viáveis, gerando uma média de 30,74±24,3 oócitos viáveis por procedimento (Tabela 2).
Estes resultados divergem dos obtidos por Viana et al. (2012) que analisaram os dados
de quatro consolidadas empresas brasileiras produtoras de embriões bovinos in vitro e
encontraram média de 19,90 oócitos por OPU, variando entre 15,20 e 24,40. Entretanto,
trabalhando apenas com animais da raça Nelore (Bos taurus indicus), Pontes et al.
(2011) analisaram o desempenho de 317 doadoras durante 656 sessões de aspiração
folicular em um centro comercial de produção in vitro de embriões e encontraram média
de 30,84±0,88 oócitos recuperados por aspiração, sendo 23,35±0,72 considerados
viáveis. Da mesma forma, Rubin et al. (2004) encontraram média de 25,14 oócitos
viáveis por OPU em fêmeas Nelore.
Tabela 2. Taxas de oócitos viáveis recuperados (OOVI), embriões produzidos (EMB) e
de gestação (GES). Médias e desvio padrão de oócitos totais recuperados
(OOTO), OOVI, EMB e número de prenhezes por sessão de OPU em um
programa de PIVE na raça Nelore com transporte de oócitos e de embriões
por longas distâncias
Variáveis
Taxa (%)
Média±(S)/Sessão OPU-PIVE
OOTO
-----
46,18±32,7
OOVI
66,56
(8.423/12.653)
30,74±24,3
EMB
GES
32,85
(2.767/8.423)
33,12
(745/2.249)
10,09±6,2
2,71±1,2
Fonte: Dados coletados no presente estudo
A disponibilidade de oócitos é considerada por vários autores uma das
características que mais influencia a produção de embriões in vitro. Esta característica
apresenta grande variabilidade individual e depende de diversas variáveis fisiológicas
ou patológicas, como idade, padrão nutricional, estação do ano, temperatura e fatores
genéticos (MEIRELLES et al., 2008). A forma como cada procedimento de aspiração
31
folicular é realizado pela equipe técnica também influencia na recuperação oocitária, a
quantidade de punções, o tipo de bomba de vácuo, a pressão utilizada, o tipo de agulha,
a eficiência do técnico e modificações na classificação dos oócitos, são fatores
extrínsecos que podem justificar as divergências entre a literatura e os resultados aqui
expostos (PONTES et al., 2009; SENEDA et al., 2006; RUBIN et al., 2004; VIANA e
BOLS, 2005).
A taxa de embriões produzidos, a partir de oócitos que foram submetidos a
maturação durante o transporte em incubadora portátil por até 24 horas foi de 32,85%
(Tabela 2), tendo uma média de 10,09±6,2 embriões produzidos por aspiração. Estes
resultados corroboram aos encontrados por Alves et al. (2003) os quais avaliaram a
influência do transporte de oócitos na produção in vitro de embriões bovinos e
conseguiram uma taxa de embriões produzidos de 33,6%, entretanto, neste estudo o
transporte foi simulado por seis horas e ocorreu em tubos de poliestireno de 5mL a
30ºC. Estes autores não encontraram influência do transporte de oócitos no
desenvolvimento embrionário in vitro, sugerindo-o como uma alternativa para melhorar
o emprego da OPU/PIVE.
Contudo Leivas et al. (2004), ao trabalhar com transporte de oócitos bovinos em
meio de maturação associado a um tampão orgânico Hepes, sem controle de atmosfera
gasosa a 39ºC, verificaram uma redução significativa do desenvolvimento embrionário
quando a duração do transporte prolongou por até 18 horas. Esses resultados foram
atribuídos a uma possível incapacidade do tampão Hepes em manter o pH por até 18
horas, o que pode ter determinado prejuízos no desenvolvimento posterior dos
embriões.
O modelo de transporte de oócitos usado neste experimento foi eficiente mesmo
quando o transporte foi prolongado por mais de 18 horas, a produção de embriões
encontrada neste estudo apresenta-se em acordo com a média nacional relatada por
Brum et al. (2002) de 35% de blastocisto no dia sete de cultivo. Estes resultados podem
ser justificados pela menor variação do pH do meio através do controle da atmosfera
gasosa com a gaseificação prévia dos criotubos, mantendo 5% de CO2 em ar e o
controle eficiente da temperatura através da incubadora portátil, simulando as condições
encontradas no laboratório durante a MIV.
32
A quantidade de embriões produzidos, em alguns momentos, superou a
quantidade de receptoras disponíveis para transferência, dessa forma, em determinadas
situações ao longo do experimento parte dos embriões produzidos foram descartados.
Então, do total de 2.767 embriões, 2.249 foram transferidos (Tabela 2). A taxa de
gestação foi de 33,12%, correspondendo a uma média de 2,71±1,2 gestações por OPU.
Pontes et al. (2010) submeteram embriões bovinos produzidos in vitro ao transporte por
longas distâncias nas mesmas condições do presente estudo e encontraram taxas de
gestação total de 39%. Porém, a média de gestações por procedimento foi inferior a aqui
apresentada, provavelmente pelo menor número de oócitos recuperados por doadora.
As taxas de gestação encontrada neste estudo são similares as citadas por Viana
et al. (2010) a partir de comunicações pessoais de renomadas empresas de PIVE
bovinos do Brasil (38,5%, com média de 2,7 prenhez/OPU/doadora), demostrando que
as condições utilizadas no transporte de oócitos e de embriões foram eficientes e
possibilitam o uso desta biotecnologia em larga escala, viabilizando o envio de oócito e
embriões em fazendas distantes dos laboratórios que oferecem estes serviços.
A influência do sêmen sexado na produção de embriões bovinos in vitro também
foi estudada (Tabela 3). A taxa de clivagem dos oócitos não diferiu (P=0,49) quanto ao
uso de sêmen convencional (CONV=61,49%) ou sêmen sexado (SEX=63,43%). As
taxas de embriões produzidos com os diferentes tipos de sêmen (CONV=38,11% e
SEX=47,76%) também foram similares (P=0,054), assim como, a taxa de gestação
(CONV=33,37% e SEX=31,93%, P=0,586). Diferindo destes achados, Blondin et al.
(2009) encontraram maior taxa de clivagem e menor produção de blastocisto quando o
sêmen sexado foi utilizado na FIV em comparação ao sêmen convencional. Na mesma
pesquisa também foi observado um comprometimento da qualidade do sêmen devido ao
processo de sexagem, o que pode explicar a redução nas taxas de blastocisto.
Vários estudos têm mostrado que o processo de sexagem por citomeria de fluxo
envolve uma série de passos que podem causar alterações na funcionalidade da
membrana, características de motilidade e morfologia dos espermatozoides,
consequentemente, diminuição na fertilidade quando este é utilizado em relação ao
sêmen convencional (ARRUDA et al., 2012). Entretanto, neste estudo não houve
qualquer diferença significativa para os parâmetros estudados em relação ao tipo de
sêmen utilizado na FIV.
33
Tabela 3. Comparação da taxa de clivagem (TXCLIV), da taxa de embriões produzidos
(TXEMB) e da taxa de gestação (TXGES) em um programa de PIVE
utilizando sêmen convencional (CONV), ou sêmen sexado (SEX) com
transporte de oócitos e de embriões por longas distâncias
Tipo de sêmen usado (convencional ou sexado)
P-Valor
Variáveis
CONV
SEX
TXCLIV (%)
61,49
63,43
0,490
TXEMB (%)
38,11
47,76
0,054
TXGES (%)
33,37
31,93
0,586
Fonte: Dados coletados no presente estudo
Concordando com esses achados, Carvalho et al. (2010) não encontraram
diferença para a taxa de clivagem, fertilização e taxa de blastocisto no dia oito quando
utilizaram sêmen convencional, sexado para macho ou sexado para fêmea. Da mesma
forma, XU et al. (2006) observaram taxas de gestação com o uso de sêmen sexado na
PIVE bovinos semelhantes ao sêmen convencional.
Possivelmente, variações nos protocolos de separação dos espermatozoides antes
da FIV (tipos e volumes de gradientes, força e duração da centrifugação), bem como,
variações nas concentrações de heparina (utilizada para capacitação espermática in
vitro) e no tamanho da gota de fertilização, possam ser responsáveis pela divergência
em relação aos resultados encontrados referentes ao uso de sêmen sexado na produção
in vitro (BLONDIN et al., 2009; CARVALHO et al., 2010: WHEELER et al., 2006).
Além disso, o processo de sexagem torna mais evidente a variação individual
entre touros. Alguns animais apresentam maior comprometimento da qualidade seminal
após este processo e necessitam de concentrações diferentes de heparina na capacitação
para produzirem maiores quantidades de embriões (BLONDIN et al., 2009). Uma forma
de maximizar a eficiência do sêmen sexado na PIVE, seria o monitoramento por parte
das empresas comerciais, dos resultados individual de cada touro e a classificação dos
animais que apresentam maior fertilidade para espermatozoides sexados (CARVALHO
et al., 2010), porém, neste experimento foram utilizadas doses de sêmen comercial de
12 diferentes touros, não sendo comparados quanto aos parâmetros espermáticos e suas
possíveis variações.
34
Por consequência da distância entre os laboratórios e as fazendas de receptoras,
os embriões foram transportados em meios de cultivo no dia seis (D0 – dia da FIV) e
foram feitos ajustes no tempo gasto com o transporte para que todos os embriões fossem
inovulados no dia sete. Entretanto, essas inovulações ocorriam em turnos diferentes,
levando a variação na sincronia entre o trato reprodutivo da receptora e a idade do
embrião no momento da transferência.
Dessa forma, através das inovulações em diferentes turnos, foi avaliado o efeito
da sincronia entre as receptoras e os embriões nas taxas de gestação (Tabela 4). As taxas
de gestação entre os embriões transferidos pela manhã e à tarde não diferiram (TE-M:
36,10% vs. TE-T: 40,99%, P=0,167), assim como, entre à tarde e à noite (TE-T: 40,99%
vs. TE-N: 50,00%, P=0,095), no entanto, houve diferença entre as taxas de gestação no
turno da manhã e da noite (TE-M: 36,10% vs. TE-N: 50,00%, P=0,006).
Tabela 4. Comparação entre as taxas de gestação de receptoras que tiveram os embriões
transportados por longas distâncias e inovulados no turno da manhã (TE-M),
no turno da tarde (TE-T) e no turno da noite (TE-N)
Taxa de gestação
Variáveis
Embriões inovulados
(%)
TE-M
457
36,10a
(165/457)
TE-T
322
40,99ab
(132/322)
TE-N
114
50,00b
(57/114)
TOTAL
893
39,64
(354/893)
Valores seguidos de letras distintas na mesma coluna diferem entre si P<0,05
Fonte: Dados coletados no presente estudo
Todas as receptoras utilizadas no programa foram previamente sincronizadas por
um protocolo de TETF onde o cipionato de estradiol foi usado no D8 do protocolo
como indutor da ovulação. O D11 foi considerado como o dia da ovulação (70 horas
após a aplicação do hormônio) e no D17 ocorreram as transferências dos embriões.
Partindo deste princípio, as receptoras do grupo TE-M foram inovuladas seis dias após a
ovulação (sincronia -1), as do grupo TE-T receberam os embriões 6,5 dias após a
ovulação (sincronia -0,5) e aquelas do grupo TE-N foram inovuladas sete dias após a
35
ovulação (sincronia 0), ou seja, as maiores taxas de gestação foram obtidas das
receptoras que receberam o embrião com idade próxima ao período pós-ovulação (TEN).
Estes resultados estam em acordo aos de Andrade et al. (2012) que estudando os
fatores que interferem em programas de PIVE bovinos obsevaram efeito da sincronia
entre a receptora e o embrião nas taxas de gestação. Os melhores valores foram
alcançados com sincronia 0 (58,00%) em comparação a sincronia -1 e +1; 44,40 e
37,33%; respectivamente. Da mesma forma, Dias et al., (2006) analizaram dados de
3.021 transferência de embriões bovinos obtidos por fertilização in vitro, e também
encontraram influência (P<0,05) da sincronia receptora-embrião nas taxas de gestação.
Segundo estes autores este parâmetros é um dos mais importantes na seleção de
receptoras para programas de PIVE.
Em contrapartida, Spell et al. (2001) avaliaram um programa de transferência de
embriões convencional em larga escala onde os embriões eram transferidos às
receptoras entre os dias 6,5 e 8,5 após o estro e não observaram diferenças nas taxas de
gestação em relação ao momento da inovulação. Entretanto, houve uma tendência para
melhores resultados quando o cio das doadoras foi 12 a 24 horas antes do cio das
receptoras. Segundo os autores a variação no tamanho dos grupos experimentais foi
responsável por não encontrar diferenças nos resultados em relação a sincronia
receptora-embrião.
CONCLUSÕES
O transporte de oócitos e de embriões nas condições realizadas neste
experimento mostrou-se eficiente, obtendo resultados satisfatórios de produção de
embriões e taxas de gestação, viabilizando assim programas de PIVE em bovinos
quando doadoras e receptoras encontram-se distantes ao laboratório de produção de
embriões.
A utilização de sêmen sexado para fêmea não interferiu nos parâmetros
avaliados, quando comparado com o sêmen convencional, mostrando ser uma excelente
36
ferramenta associada a PIVE para a produção de animais de alto mérito genético com a
escolha do sexo, estando a disposição dos técnicos e criadores.
O turno da inovulação é um parâmetro importante em programas de PIVE
bovinos com transporte por longas distâncias, visto que, a sincronia entre o ambiente
uterino das receptoras e a idade do embrião interfere na sobrevivência embrionária e nos
resultados de taxas de gestação.
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