Efeito do tratamento lipossomal com antimoniato de meglumina em
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Universidade Federal de Ouro Preto Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação em Ciências biológicas Efeito do tratamento lipossomal com antimoniato de meglumina em camundongos infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi: análise das vias de administração e da resposta ao fármaco em modelo de desnutrição Letícia De Nadai Marcon Ouro Preto - MG Setembro - 2011 UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO Reitor João Luiz Martins Vice‐Reitor Antenor Barbosa Junior Pró‐Reitor de Pesquisa e Pós‐Graduação André Barros Cota NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Coordenador Prof. Dr. André Talvani PROGRAMA DE PÓS‐GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Coordenador Prof. Dr. Renata Nascimento de Freitas Universidade Federal de Ouro Preto Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação em Ciências biológicas Efeito do tratamento lipossomal com antimoniato de meglumina em camundongos infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi: análise das vias de administração e da resposta ao fármaco em modelo de desnutrição Letícia De Nadai Marcon Orientadora Colaboradores Dra. Simone Aparecida Rezende Dr. Frédéric Frézard Laboratório de Imunoparasitologia Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Universidade Federal de Ouro Preto Laboratório de Biofísica Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal de Minas Gerais Dr. Marcelo Eustáquio Silva Co-orientadora Laboratório de Nutrição Experimental Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Universidade Federal de Ouro Preto Dra. Sandra Aparecida Lima de Moura Laboratório de Imunopatologia Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Universidade Federal de Ouro Preto Dra. Maria Lúcia Pedrosa Laboratório de Bioquímica Metabólica Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Universidade Federal de Ouro Preto Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de mestre em Ciências Biológicas, área de concentração: Imunobiologia de Protozoários. Ouro Preto Setembro de 2011 II M321e Marcon, Letícia De Nadai. Efeito do tratamento lipossomal com antimoniato de meglumina em camundongos infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi [manuscrito]: análise das vias de administração e da resposta ao fármaco em modelo de desnutrição / Letícia De Nadai Marcon. - 2011. xvii, 97f.: il., color; graf., tabs. Orientadora: Profª. Drª. Simone Aparecida Rezende. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Área de concentração: Imunobiologia de Protozoários. 1. Leishmaniose visceral - Teses. 2. Lipossomas - Teses. 3. Desnutriçãoprotéico-calórica - Teses. 4. Camundongo como animal de laboratório - BALB/c - Teses. 5. Histopatologia - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título. CDU: 616.993.161:616.39 Catalogação: [email protected] MARCON, L. D. III MARCON, L. D. Dedicatória Dedico este trabalho aos meus queridos pais José Luiz e Regina Céli. Obrigada pelo amor e dedicação, por acreditarem mim... por me fazerem tentar ir mais longe... sempre... IV MARCON, L. D. “De tanto tentar conseguiu romper os rochedos... ...mas ele ainda precisava existir na sua infinita potencialidade... Assim como tantos quantos grão de areia formasse, sabia que não era apenas isso que o fazia existir. O mar havia de formar oceanos... e constituir o ciclo da vida em sua simples e perfeita harmonia... mesmo não quebrando mais pedras.” V MARCON, L. D. Agradecimentos A Deus, pela vida, por guiar meus passos, iluminar minhas decisões, meus caminhos... por fortalecer a minha fé e me dar forças pra acreditar em mim mesma e a continuar a seguir em frente. À Santa Rita de Cássia, pelo auxílio nos momentos difíceis... Aos meus pais José Luiz Marcon e Regina Céli De Nadai Marcon, por todo amor, paciência, dedicação, força e apoio durante essa difícil etapa. Pelas palavras de carinho, mesmo distantes... Por acreditarem sempre em mim e possibilitarem a realização de mais um conquista... Aos meus queridos irmãos Brunella e Marcelo, pelo apoio, conversas, amor e carinho. A distância só reforça nossos laços. Obrigada Bru por me fazer titia e trazer essa benção que é a Ana Júlia. Aos meus avós José Marcon e Dirce Marcon e Vitória Fornazier e Constantino De Nadai (in memorian) exemplos de vida! Obrigada pelo amor e carinho. Ao Fernando, pelo amor, paciência, dedicação... Por me dar forças, me ouvir... por me dar razões pra acreditar em mim mesma, por me ajudar a ver o outro lado da vida, o lado bom, alegre, otimista, que por vezes se perde com o cansaço e o fracasso de tentar. Obrigada por existir na minha vida. Você faz parte desta conquista. À Glaucy (Tico), amiga querida, sempre ao meu lado durante todos esses anos de Ouro Preto. Obrigada pelo carinho, conversas, pelas risadas... por compartilhar comigo as alegrias e as tristezas. Valeu pela força! À minha orientadora professora Simone Aparecida Rezende, pela oportunidade de trabalhar com a pesquisa e abrir as portas para o conhecimento da Imunologia. Obrigada pelo apoio e incentivo. À minha co-orientadora professora Sandra Aparecida Lima de Moura, pela grande ajuda ao fortalecimento deste trabalho, pelo entusiasmo, disponibilidade e aprendizado da Patologia. Ao professor Frédéric Frézard pela colaboração que possibilitou os testes com o antimoniato de meglumina e os lipossomas, e ao doutorando Erly Guilherme Azevedo, pela contribuição nas técnicas e preparo dos lipossomas. VI MARCON, L. D. À Lorena, companheira de mestrado, pela ajuda nos experimentos que conduziram este trabalho, pelo incentivo, e por compartilhar os bons e maus momentos dessa saga... Obrigada pelo apoio e pelas boas risadas. Ao professor Luiz Carlos Crocco Afonso, por abrir as portas do Laboratório de Imunoparasitologia (LIP), pela grande colaboração científica para o direcionamento deste trabalho e pelo exemplo de profissional. Ao professor Marcelo Eustáquio Silva e à professora Maria Lúcia Pedrosa, pela colaboração que possibilitou o preparo das dietas experimentais para os trabalhos utilizando o modelo de desnutrição. Aos mestrandos Juliana, Maurício e Renata, pelo companheirismo e amizade, por compartilhar os momentos difíceis da vida acadêmica e por tornarem os dias de trabalho mais agradáveis. Boas risadas! Sentirei saudades. Aos colegas do Laboratório de Imunoparasitologia em especial Marcorélio, Leandro, Ricardo, Denise, Bjay, Juliana, Maurício, Renata, Ana Clara e Jaime e a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para o aprendizado na pesquisa e na realização deste projeto. À minha querida república Feijão com Arroz, essenciais obrigada pelo companheirismo e força, às vezes mesmo na distância... Aos animais que fizeram parte deste estudo, pela contribuição ao conhecimento e desenvolvimento da ciência. VII MARCON, L. D. Lista Figuras Figura 1. Desenho esquemático da constituição de um granuloma ........................................ 5 Figura 2. Mecanismos envolvidos na ativação das células estreladas hepáticas (células de ITO) e na patogênese da fibrose hepática ............................................................................... 7 Figura 3. Delineamento experimental da etapa I ................................................................... 21 Figura 4. Delineamento experimental da etapa II ................................................................. 23 Figura 5. Processo de encapsulação do antimoniato de meglumina ..................................... 27 Figura 6. Análise morfométrica da área dos granulomas hepáticos ...................................... 29 Figura 7. Peso úmido do fígado e do baço de camundongos BALB/c, infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos ..................................................................... 33 Figura 8. Carga parasitária do fígado e do baço de camundongos BALB/c infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos ..................................................................... 34 Figura 9. Fotomicrografias dos cortes histológicos (5 μm, HE) representativos do número de granulomas no fígado dos animais infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos utilizando as vias endovenosa e intraperitoneal ................................................ 35 Figura 10. Fotomicrografias de cortes histológicos (5 μm, HE) representativos do fígado dos animais infectados com L. chagasi, não tratados ou tratados com Lipossoma vazio. Destaques para caracterização do processo inflamatório e dos granulomas ......................... 36 Figura 11. Fotomicrografia de corte histológico (5 μm, HE) representativos do fígado dos animais infectados com L. chagasi não tratados: destaque para infiltrado inflamatório ...... 37 Figura 12. Número e área dos granulomas encontrados no fígado de camundongos BALB/c infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos ........................................ 38 Figura 13. Fotomicrografias dos cortes histológicos (5 μm, Picrossírius Red) representativos da deposição de fibras colágenas do tipo I (amarelo-avermelhada) e tipo III (verde) no fígado dos animais infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos utilizando as vias endovenosa e intraperitoneal ......................................................................................... 40 Figura 14. Análise densitométrica da deposição de fibras colágenas do tipo I e III no fígado de camundongos BALB/c infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos ................................................................................................................................................ 41 Figura 15. Relação percentual das fibras colágenas do tipo I e III no fígado de camundongos BALB/c infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos ......................... 42 VIII MARCON, L. D. Figura 16. Peso corporal de camundongos BALB/c, alimentados com dieta controle ou hipoprotéica, infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos .................. 43 Figura 17. Peso úmido do fígado e do baço de camundongos BALB/c alimentados com dieta controle ou hipoprotéica, infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos .... ................................................................................................................................................ 44 Figura 18. Carga parasitária do fígado e do baço de camundongos BALB/c, alimentados com dieta controle ou hipoprotéica, infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos ............................................................................................................................ 46 Figura 19. Fotomicrografias dos cortes histológicos (5 μm, HE) representativos do número de granulomas no fígado dos animais controle e desnutridos, infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos ..................................................................................... 48 Figura 20. Fotomicrografias dos cortes histológicos (5 μm, HE) representativos do fígado dos animais controle e desnutridos infectados com L. chagasi ............................................. 49 Figura 21. Número e área dos granulomas presentes no fígado de camundongos BALB/c, controle e desnutridos, infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos .. 50 Figura 22. Fotomicrografias dos cortes histológicos (5 μm, Picrosírius Red) representativos da deposição de fibras colágenas do tipo I (amarelo-avermelhada) e tipo III (verde) no fígado dos animais controle e desnutridos infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos ............................................................................................................................ 52 Figura 23. Análise densitométrica da deposição de fibras colágenas do tipo I e III no fígado de camundongos BALB/c controle e desnutridos, infectados L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos ........................................................................................................... 53 Figura 24. Relação percentual das fibras colágenas do tipo I e III no fígado de camundongos BALB/c, controle e desnutridos, infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos ............................................................................................................................ 54 IX MARCON, L. D. Lista de quadros Quadro 1. Esquema terapêutico ............................................................................................ 24 Quadro 2. Composição e quantidade dos componentes das dietas controle e hipoprotéica .... ................................................................................................................................................ 26 X MARCON, L. D. Lista de siglas e Abreviaturas AM – Antimoniato de Meglumina AM + L – Antimoniato de Meglumina + Lipossoma ATP – Trifosfato de adenosina BALB/c – Camundongo susceptível a Leishmania major CCL2 – Quimiocina; sinonímia: MCP-1 CCL4 – Quimiocina; sinonímia: MIP-1b DMEM – Meio Esssencial Mínimo Dulbecco DPC – Desnutrição protéico‐calórica EROs – Espécies reativas de oxigênio ELISA – Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (Ensaio imunoenzimático) FAO – Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura FUNASA – Fundação Nacional de Saúde HSC – Hepatic Stellate Cells IL – Interleucina IFN‐γ – Interferon-gama iNOS – Enzima óxido nítrico sintase induzível LC – Leishmaniose cutânea LV – Leishmaniose visceral LV (em legendas de gráficos) – Lipossoma vazio MCP-1 – Proteína quimioatrativa de monócitos 1 MEC- Matriz extracelular MIP-1 – Proteína inflamatória de macrófagos 1 NKT – Células T Natural Killer NO – Óxido nítrico XI MARCON, L. D. OMS – Organização Mundial da Saúde ONU – Organização das Nações Unidas PBS – Solução salina tamponada com fosfato PCR – Reação em cadeia da polimerase PDGF – Fator de crescimento derivado de plaquetas RIFI – Reação de imunoflourescência indireta Sb – Antimônio III Sb – Antimônio trivalente V Sb – Antimônio pentavalente SFB – Soro fetal bovino TCD4+ – Linfócito T auxiliar TCD8+ – Linfócito T citotóxico TIMP-1 – Inibidor tecidual de metaloproteinase-1 TGF- – Fator de crescimento transformante beta TNF- – Fator de necrose tumoral alfa XII MARCON, L. D. Resumo A leishmaniose visceral (LV) é considerada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) uma das seis doenças endêmicas de maior relevância no mundo. Um dos principais fatores de risco para o estabelecimento e o agravamento da LV é a desnutrição protéico calórica (DPC). O espectro de drogas disponíveis para o tratamento da LV é restrito e apresenta diversas limitações em termos de toxicidade, eficácia, preço e esquemas terapêuticos. Neste trabalho, o antimoniato de meglumina (AM), umas das principais drogas utilizadas para o tratamento da leishmaniose, foi submetida ao processo de encapsulação em lipossomas. Devido a sua tendência natural de serem capturados pelas células do sistema fagocitário mononuclear, os lipossomas direcionam o fármaco para os órgãos alvo da infecção: fígado, baço e medula óssea, melhorando o aproveitamento da droga encapsulada. Diante disso, este estudo objetivou a avaliação da eficácia do fármaco leishmanicida antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas administrado por duas vias, intraperitoneal e endovenosa, para o tratamento de camundongos BALB/c infectados com L. chagasi. Os efeitos histopatológicos da infecção e do tratamento também foram avaliados em face ao quadro de desnutrição por meio da administração de uma dieta hipoprotéica contendo 4,5% de caseína. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento utilizando dose única do AM encapsulado em lipossomas administrado na segunda semana de infecção foi eficaz em reduzir significativamente a carga parasitária do fígado, eliminar os parasitos do baço, e auxiliar indiretamente na redução do número e da área dos granulomas hepáticos, bem como no reestabelecimento dos padrões de normalidade das fibras colágenas do tipo I e III do fígado dos camundongos após três semanas do tratamento. A administração intraperitoneal do fármaco apresentou melhor viabilidade e eficácia em relação à via endovenosa. Devido a DPC observou-se uma elevada carga parasitária do fígado e do baço nos animais desnutridos em relação aos controles, contudo o tratamento dos animais desnutridos com AM lipossomal foi capaz de reduzir a carga parasitária hepática e eliminar o parasito no baço com a mesma eficácia que a encontrada nos animais controle submetidos ao mesmo tratamento. A formação granulomatosa e a deposição das fibras colágenas também foram afetadas pelo processo de desnutrição, onde o número e área dos granulomas hepáticos e a densidade das fibras do tipo III e do tipo I encontraram-se reduzidos, além da presença de maiores proporções de fibras do tipo I nestes grupos. O tratamento dos animais desnutridos com AM encapsulado em lipossomas não alterou a formação dos granulomas e não foi capaz de auxiliar no reestabelecimento do padrão das fibras colágenas ao padrão observado nos animais desnutridos não infectados. Palavras chaves: leishmaniose visceral, tratamento, antimoniato de meglumina, lipossomas, desnutrição protéico calórica, BALB/c, histopatologia. XIII MARCON, L. D. Abstract Visceral leishmaniasis (VL) is recognized as one of the six endemic diseases of major relevance in the world by the World Health Organization (WHO). Of the several risk factors, Protein Energy Malnutrition (PEM) is considered as one of the most important factors to determine the establishment and severity of the disease. Very few drugs are available for the treatment of VL and are known to have several limitations in terms of their toxicity, efficacy, price and drug regimens. In this work, meglumine antimoniate (MA), one of the main drugs used as therapy to leishmaniasis, was encapsulated in liposomes. Due to its natural tendency to be captured by the mononuclear phagocytic system cells, liposomes trigger the drug to the target organs of infection: liver, spleen and bone marrow, optimizing the utilization of the drug encapsulated. Therefore, this study aimed to evaluate the effectiveness of the leishmanicidal drug meglumine antimoniate encapsulated in liposomes, administered by two routes, intraperitoneally and intravenously for the treatment of BALB/c mice infected with L. chagasi. The histopathological effects of infection and treatment were also assessed by a clinical picture of malnutrition through the administration of a low-protein diet containing 4.5% casein. Our results showed that treatment using a single dose of MA encapsulated in liposomes, administered in the second week of infection, was effective in reducing the parasite load in liver significantly, and eliminating them from spleen. Further, the drug helped to reduce the number and area of hepatic granulomas, and in reestablishment the normal pattern of collagen fibers type I and III of the liver of BALB/c mice after three weeks of treatment. The intraperitoneal administration of the drug showed better viability and effectiveness compared to intravenously. Because of the PEM, a high parasite load of the liver and spleen in malnourished animals was found when compared to controls, however the treatment of malnourished animals with liposomal MA was able to reduce liver parasite burden and eliminate the parasite in the spleen with the same effectiveness as found in control animals underwent the same treatment. Granulomatous formation and deposition of collagen fibers were affected by the process of malnutrition that was characterized by smaller number and size of hepatic granulomas and smaller density of the fibers of type III and type I. Additionally, there was a larger presence of the type I fiber. The treatment of malnourished animals using MA encapsulated in liposomes don´t changed the granulomas formation and was not able to assist in the reestablishment of the pattern of collagen fibers to the pattern observed in uninfected malnourished animals. Keywords: visceral leishmaniasis, treatment, meglumine antimoniate, liposomes, protein energy malnutrition, BALB / c, histopathology. XIV MARCON, L. D. Sumário Dedicatória ........................................................................................................................... IV Agradecimentos ...................................................................................................................VI Lista Figuras ..................................................................................................................... VIII Lista de quadros .................................................................................................................... X Lista de siglas e Abreviaturas .............................................................................................. XI Resumo ............................................................................................................................. XIII Abstract ............................................................................................................................. XIV Sumário .............................................................................................................................. XV 1. Introdução .......................................................................................................................... 2 1.1. Leishmaniose visceral: classificação e epidemiologia ................................................ 2 1.2. Alterações histopatológicas hepáticas na leishmaniose visceral ................................. 3 1.3. A resposta granulomatosa ........................................................................................... 4 1.4. O processo fibroso hepático ........................................................................................ 6 1.5. Tratamento da leishmaniose visceral .......................................................................... 8 1.5.1. Mecanismo de ação dos antimoniais .................................................................... 9 1.6. Os lipossomas e a vetorização de fármacos .............................................................. 10 1.6.1. O antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas e a leishmaniose visceral .......................................................................................................................... 11 1.7. As vias de administração e sua interferência na aplicabilidade das formulações lipossomais ....................................................................................................................... 12 1.8. Desnutrição protéico calórica (DPC) ........................................................................ 13 1.8.1. A desnutrição protéico calórica e a leishmaniose visceral ................................. 14 1.8.2. A interferência da desnutrição na evolução terapêutica ..................................... 15 1.9. Justificativa ............................................................................................................... 16 2. Objetivos .......................................................................................................................... 18 2.1. Objetivo geral ............................................................................................................ 18 2.2. Objetivos específicos ................................................................................................ 18 3. Material e Métodos .......................................................................................................... 20 3.1. Animais ..................................................................................................................... 20 3.2. Delineamento Experimental ...................................................................................... 20 3.2.1. Etapa I ................................................................................................................. 20 XV MARCON, L. D. 3.2.2. Etapa II: .............................................................................................................. 22 3.3. Protocolo de desnutrição ........................................................................................... 22 3.4. Avaliação do peso corporal ....................................................................................... 24 3.5. Cultura de Leishmania .............................................................................................. 24 3.6. Infecção Experimental .............................................................................................. 24 3.7. Obtenção do antimoniato de meglumina (AM) ........................................................ 25 3.8. Preparo dos lipossomas ............................................................................................. 25 3.9. Encapsulação do antimoniato de meglumina ............................................................ 26 3.10. Quantificação de parasitos ...................................................................................... 27 3.11. Análises histológicas ............................................................................................... 28 3.11.1. Análises morfométricas e densitométricas ....................................................... 29 3.12. Análises estatísticas ................................................................................................. 30 4. Resultados ........................................................................................................................ 32 4.1. Primeira Etapa ........................................................................................................... 32 4.1.1. Peso do fígado e do baço .................................................................................... 32 4.1.2. Carga parasitária ................................................................................................. 33 4.1.3. Análise histopatológica do fígado ...................................................................... 34 4.1.4. Formação dos granulomas ................................................................................. 37 4.1.5. Deposição de fibras colágenas ............................................................................ 38 4.1.6. Seleção da via de administração do fármaco ...................................................... 42 4.2. Segunda Etapa: .......................................................................................................... 43 4.2.1. Média de peso dos animais ao longo do período experimental .......................... 43 4.2.2. Peso do fígado e do baço .................................................................................... 44 4.2.3. Carga parasitária ................................................................................................. 45 4.2.4. Análise histopatológica do fígado ...................................................................... 46 4.2.5. Formação dos granulomas .................................................................................. 50 4.2.6. Deposição de fibras colágenas ............................................................................ 51 4.3. Resumo dos resultados .............................................................................................. 55 5. Discussão ......................................................................................................................... 57 6. Conclusões ....................................................................................................................... 71 7. Referências bibliográficas................................................................................................ 73 8. Anexo ............................................................................................................................... 97 XVI Introdução Introdução MARCON, L. D. 1. Introdução 1.1. Leishmaniose visceral: classificação e epidemiologia A leishmaniose constitui um grupo de doenças causadas por aproximadamente 20 espécies de protozoários pertencentes ao gênero Leishmania (Herwaldt, 1999; Desjeux, 2004; Croft et al., 2006). A doença pode ser subdividida conforme suas principais formas clínicas: leishmaniose cutânea (LC), leishmaniose muco-cutânea (LMC; também conhecida como espúndia), leishmaniose cutâneo difusa (LCD), leishmaniose visceral (LV; também chamada de calazar) e leishmaniose dérmica pós calazar (LDPC) (Ashford, 2000; Dedet & Pratlong, 2003). A leishmaniose visceral (LV) é uma zoonose de ampla distribuição mundial com registro de casos em todos os continentes, à exceção da Oceania. A maioria dos casos de LV ocorre em Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia, Nepal e Sudão (Chappuis et al., 2007). Dos casos registrados na América Latina, 90% ocorrem no Brasil (Organização Mundial da Saúde, 2005). A LV humana é caracterizada por febre irregular e de longa duração, hepatoesplenomegalia, linfadenopatia, anemia, leucopenia, hipergamaglobulinemia, hipoalbuminemia, emagrecimento, edema, debilidade progressiva podendo evoluir para um quadro de caquexia ou mesmo morte caso não tratada adequadamente (Galvão‐Castro et al., 1984, Desjeux, 2004). A doença é causada por parasitos do complexo Leishmania donovani, dentre elas estão as espécies L. donovani, presente no leste da África e na Índia, a L. infantum presente na Europa e no norte da África, e a L. chagasi presente na América Latina (Laison & Shaw, 1987; Lukes et al., 2007). Devido semelhanças encontradas entre as espécies L. infantum e L. chagasi (Maurício et al.,1999) muitos autores as consideram sendo a mesma espécie. Apesar dos dilemas envolvendo a nomenclatura da L. chagasi (Dantas-Torres, 2006), o código internacional de nomenclatura zoológica (International Commission on Zoological Nomenclature, 1999) estabeleceu que a utilização do nome Leishmania (Leishmanina) infantum chagasi é absolutamente correto para se nomear a L. chagasi. Shaw (2006) declarou que mesmo havendo muitas questões não respondidas em torno da origem, identidade e epidemiologia dos parasitos causadores da leishmaniose visceral 2 MARCON, L. D. Introdução americana (LVA) esta é melhor forma de se referir à L. chagasi. No Brasil, esta espécie foi descrita primeiramente por Evandro Chagas em 1936 (Chagas, 1936). Devido à sua magnitude e alta letalidade, principalmente em indivíduos não tratados e crianças desnutridas, e ao fato de ser emergente em portadores de infecção por HIV, a LV é considerada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) uma das seis doenças endêmicas de maior relevância no mundo (Ministério da Saúde, 2010). Há uma estimativa de 500 mil novos casos de LV e mais de 50 mil mortes pela doença a cada ano, superada apenas pela malária entre as doenças parasitárias (Desjeux, 2004; World Health Organization, 2002). No Brasil, em 2008, a região nordeste apresentava o maior número de casos de LV, aproximadamente 45% do total, contudo a doença vem se expandindo gradativamente para as regiões Norte, Sudeste e Centro-Oeste. A letalidade da doença passou de 3,2% em 2000, para 5,6% em 2008 (Ministério da Saúde, 2010). A transmissão da LV no Brasil ocorre por meio da picada de fêmeas de flebotomíneos da espécie Lutzomyia longipalpis (Lainson & Shaw, 1987), as quais quando infectadas inoculam as formas promatigotas metacíclicas do parasito (Killick‐Kendrick, 1979). Dentro do hospedeiro, esses parasitos entram em contato com macrófagos e células dendríticas da derme e são internalizadas, se transformando em formas ovais não flageladas denominadas amastigotas. Por meio de uma complexa interação parasitohospedeiro, o parasito passa por adaptações bioquímicas e morfológicas, para garantir sua sobrevivência e multiplicação dentro do fagolisossoma destas células, o que permite a sua disseminação pelo organismo (Alexander & Russell, 1992; Alexander et al., 1999; Gossage et al., 2003; Rittig & Bogdan, 2000; Lodge et al., 2006). 1.2. Alterações histopatológicas hepáticas na leishmaniose visceral Os danos causados ao fígado durante a LV humana são decorrentes da resposta do hospedeiro à infecção. Neste órgão, as alterações morfológicas podem se manifestar principalmente como: padrão típico, onde a doença é sintomática e a resposta imune do hospedeiro reflete um padrão do tipo Th2; padrão nodular, onde há uma resposta imune para eliminação do parasito e reflete um perfil de resposta do tipo Th1; ou como manifestações intermediárias, refletindo uma resposta mista (Duarte, 2011). 3 MARCON, L. D. Introdução Na LV, os parasitos chegam rapidamente aos capilares sinusóides do fígado e do baço, onde são fagocitados por células do sistema fagocitário mononuclear. No fígado a principal célula a assegurar esta fagocitose é a célula de Kupffer, a qual também participa na formação dos granulomas hepáticos (Gutierrez et al., 1984; McElrath et al., 1988). Durante este processo há o recrutamento de um infiltrado celular composto por linfócitos T e numerosas células que expressam MHC de classe II, como as células de Kupffer e os macrófagos derivados de monócitos, infectados ou não (McElrath et al., 1988; Kaye et al., 1994). Além disso, outras alterações histopatológicas são observadas no fígado de indivíduos infectados, dentre elas a ocorrência de hipertrofia e hiperplasia das células de Kupffer, granulomas portais e intralobulares, deposição de bilirrubina e fibrose intralobular difusa (Andrade & Andrade 1966; Seitz, 1995; Guyot et al., 2006). A fibrose hepática é caracterizada pelo aumento da deposição de matriz extracelular bem como por alterações em sua composição, podendo acometer os tratos portais, regiões próximas às veias centrais, ou espaços perissinusoidais (Guyot et al., 2006). Mudanças hepáticas semelhantes às que ocorrem na hepatite crônica e estágios iniciais de cirrose, são observadas em pacientes com LV (Bogliolo, 1956; Rodrigues Da Silva, 1975; Rogers, 1980). 1.3. A resposta granulomatosa A resposta de resistência à leishmaniose visceral é bem caracterizada em modelo murino utilizando camundongos BALB/c e está associada ao direcionamento da resposta imune para o tipo Th1 (Kaye et al., 2004). Neste modelo, o controle do crescimento do parasito no fígado está relacionado à capacidade do hospedeiro em formar granulomas (Murray et al., 2000). A imunidade humoral, particularmente envolvendo anticorpos, pouco participa na resposta de resistência à Leishmania (Murray, 2001). Durante a infecção experimental, o início de uma resposta granulomatosa murina envolve a presença principalmente de linfócitos TCD4+ e TCD8+ (Stern et al., 1988); influxo de monócitos sanguíneos e expressão de moléculas de adesão intracelular-1 (ICAM-1) (Cervia et al., 1993); citocinas inflamatórias, primariamente as pertencentes à respostas celulares do tipo Th1 (Murray, 1999) e a indução dos mecanismos microbicidas dos monócitos e macrófagos (Murray & Nathan, 1999). Dentre as citocinas envolvidas neste processo estão a IL-12, IL-2, IFN-, TNF- e o fator estimulador de colônias de 4 MARCON, L. D. Introdução macrófagos e granulócitos (GM-CSF) (Murray et al., 1993; Tumang et al., 1994; Murray et al., 1995; Taylor & Murray 1997). Diversos trabalhos já mostraram o importante papel do IFN- na formação dos granulomas hepáticos durante a leishmaniose visceral, particularmente na ativação de macrófagos (Squires et al., 1989; Taylor & Murray, 1997; Wilson, 1996). O IFN- contribui diretamente na indução e produção dos principais mecanismos microbicidas dos macrófagos, os intermediários reativos de oxigênio e nitrogênio (Murray & Nathan, 1999; Shiloh & Nathan. 1999). Além disso, a produção do fator de necrose tumoral alfa (TNF-), citocina dominante da resposta granulomatosa, e de quimiocinas inflamatórias por macrófagos infectados, direcionam o recrutamento de células T natural killer (NKT), células TCD4+ e células TCD8+, as quais produzem quimiocinas e citocinas que amplificam o recrutamento celular e remodelam o sítio da infecção (Russell, 2007). Na leishmaniose visceral murina, os granulomas hepáticos são basicamente constituídos pela fusão de macrófagos residentes (células de Kupffer) parasitados e macrófagos transformados denominados células epitelióides, circundados por células T secretoras de citocinas e monócitos sanguíneos atraídos pela inflamação (Gutierrez et al., 1984; Murray, 2001) (Figura 1). A ativação contínua dos macrófagos provoca a adesão destas células entre si que por vezes se fundem para formar células gigantes multinucleadas (Fais et al., 1994; Kindt et al., 2008). A formação destas células é muito relatada em modelos de infecção com LV utilizando-se hamsters (Laurenti et al., 1990; Corrêa et al., 1992). Figura 1. Desenho esquemático da constituição de um granuloma (Kindt et al., 2008 com modificações). 5 MARCON, L. D. Introdução Em camundongos BALB/c infectados com L. donovani, o início da formação dos granulomas pode ser detectado a partir da primeira semana de infecção, onde já se observam células de Kupffer parasitadas, alguma fusão celular e um recrutamento mínimo de células mononucleares. Na segunda semana granulomas iniciais constituídos por células de Kupffer parasitadas fundidas e um influxo inicial de linfócitos e monócitos para o local da reação granulomatosa pode ser observado. Na quarta semana há o estabelecimento de granulomas maduros funcionais onde se observa um manto de células mononucleares envolvendo um núcleo de células de Kupffer contendo poucas amastigotas. Na oitava semana há uma involução dos granulomas epitelióides desprovidos de amastigostas. Na décima segunda semana a inflamação tecidual está praticamente resolvida (Cervia et al., 1993; Murray, 1999; Murray, 2001). 1.4. O processo fibroso hepático A fibrose é caracterizada como uma resposta de cicatrização a uma variedade de estímulos agudos e/ou crônicos, dentre eles o etanol, as infecções virais, drogas e toxinas, colestases e doenças metabólicas (Anthony et al., 1978; Schuppan, 1990;). O desenvolvimento da fibrose hepática ocorre devido ao aumento da síntese e deposição de colágeno fibrilar com insuficiente remodelamento (Friedman, 2000; George et al., 2001). As células estreladas hepáticas (HSC - Hepatic Stellate Cells) ou células de ITO estão envolvidas na patogênese da fibrose hepática. Estas células residem no espaço de Disse entre os hepatócitos e as células endoteliais dos sinusóides (Friedman, 2008). Quando há algum tipo de dano hepático, mediadores gerados pela lesão como produtos da peroxidação lipídica, metabólitos intermediários de drogas, hepatotoxinas, acetaldeído e espécies reativas de oxigênio induzem a ativação das HSC (Mormone et al., 2011). O processo inflamatório decorrente da infecção por Leishmania, por sua vez, acarreta no aumento do número e ativação das células de Kupffer (Duarte et al., 2008; Beattie et al., 2010). A ativação das células de Kupffer resulta na liberação de espécies reativas de oxigênio (EROs) e citocinas, como o fator transformador de crescimento (TGF- e o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), os quais estimulam a ativação da HSCs promovendo a fibrogênese e a proliferação destas células (Tsukamoto, 1999; Nieto, 2006). 6 MARCON, L. D. Introdução Quando ativadas, as HSC quiescentes adquirem o fenótipo de miofibroblastos, proliferam, se tornam móveis, contráteis e exibem abundante retículo endoplasmático rugoso (Gressner, 1996). Além das HSC, os fibroblastos portais, pertencentes ao tecido conectivo portal, também participam do processo de fibrose portal (Tuchweber et al., 1996). Durante a fibrose hepática mudanças qualitativas e quantitativas ocorrem na composição da matriz extracelular (MEC) nos espaços portais e perisinusiodais (George & Chandrakasan, 1996; Zeisberg et al., 2006). Há uma elevada deposição de colágeno fibrilar do tipo I e III, de proteoglicanos, fibronectina e ácido hialurônico nas regiões de cicatriz (George et al., 2004). Essas alterações ocorrem particularmente nos espaços de Disse, onde a MEC de baixa densidade é reposta por outra rica em colágeno fibrilar e fibronectina. Essas alterações conduzem à perda das fenestrações das células endoteliais, prejudicando o exsudato de solutos entre as células vizinhas, alterando a função hepática e consequentemente danificando células não parenquimais (Hernandez-Gea & Friedman, 2011). O estresse oxidativo também participa deste processo fibrótico promovendo a necrose e/ou a apoptose dos hepatócitos, ou agindo diretamente sobre o comportamento das HSC e dos miofibroblastos (Nieto, 2006), por meio da regulação positiva da expressão de genes criticamente associados à fibrose como COL1A1, COL1A2, MCP-1 e TIMP-1 (Bataller & Brenner, 2005). Além disso, a redução das defesas antioxidantes como a glutationa (GSH), catalase, ou superóxido dismutase (SOD), juntamente com o aumento da peroxidação lipídica conduzem a uma resposta pró fibrogênica aumentando a expressão de proteínas colágenas do tipo I (George, 2003). Figura 2. Mecanismos envolvidos na ativação das células estreladas hepáticas (células de ITO) e na patogênese da fibrose hepática (Mormone et al., 2011, com modificações). 7 MARCON, L. D. Introdução Poucos trabalhos envolvendo a leishmaniose visceral e a infecção experimental em modelo murino abordaram a formação do processo fibroso hepático. Um estudo de Gutierrez et al. (1984), utilizando camundongos BALB/c, revelou um aumento da deposição de colágeno reticular na região dos granulomas ao longo da infecção por L. donovani, que foi observada a partir da segunda semana de infecção. Posteriormente, Leite e Croft (1996) avaliaram o desenvolvimento da matriz extracelular no fígado de camundongos BALB/c infectados com L. donovani. Estes autores observaram uma deposição de fibras colágenas do tipo III e proteoglicanos nos granulomas e nos espaços porta durante 4 a 20 semanas após a infecção, contudo não verificaram mudanças na distribuição dos componentes da MEC nos espaços de Disse, bem como não observaram fibrose sistêmica nos lóbulos hepáticos. Estes autores sugeriram que camundongos BALB/c parecem não ser um modelo apropriado para estudar o papel da MEC durante a LV crônica. Apesar disso, não foram encontrados na literatura trabalhos em modelo murino avaliando a interferência da infecção e do tratamento leishmanicida sobre a deposição de fibras colágenas hepáticas. 1.5. Tratamento da leishmaniose visceral O espectro de drogas disponíveis para o tratamento da LV ainda é limitado. Dentre elas estão incluídos os antimoniais pentavalentes (SbV), o deoxicolato de anfotericina B (AB), as formulações lipídicas de anfotericina B, a miltefosina (MF) e a paramomicina (PM). O antimonial pentavalente é a droga mais utilizada no mundo (Sundar, 2001). Atualmente existem dois tipos de SbV em uso, os complexos de SbV com N-metil-Dglucamina (antimoniato de meglumina (AM) ou glucantime®) e o gluconato de sódio (estibogluconato de sódio ou pentosan®) (Ministério da Saúde, 2009; Frézard et al., 2009). No Brasil, os medicamentos utilizados para o tratamento da LV são o antimoniato de meglumina e a anfotericina B. Contudo, o Ministério da Saúde recomenda o antimoniato de meglumina como fármaco de primeira escolha (Ministério da Saúde, 2009). Embora os antimoniais sejam drogas de primeira linha contra todas as formas de leishmaniose, seu uso clínico apresenta sérias limitações (Marsden, 1985; Berman, 1997), como a necessidade de administração parenteral, diariamente e por pelo menos três semanas (20 mg de Sb/kg/dia durante 20–30 dias); dor local durante as injeções; efeitos 8 MARCON, L. D. Introdução colaterais como náuseas, vômitos, fraqueza, mialgia, cólica abdominal, diarréia, erupções cutâneas, hepatotoxicidade e cardiotoxicidade (Guerin et al., 2002). A pentamidina e a anfotericina B, drogas de segunda linha, também apresentam limitações pelos severos efeitos colaterais e a necessidade de administração parenteral (Berman, 1997). Além disso, devido a problemas de resistência do parasito ao fármaco, o SbV é agora pouco utilizado na Índia, que sozinha soma 50% dos casos de LV no mundo (Sundar, 2001). A resistência é fruto de diversos fatores, dentre eles estão o alto custo da droga e a ausência de sistemas de saúde funcionais, os quais implicam em uma baixa adesão e tratamentos incompletos. Dessa forma, a OMS recomenda e auxilia pesquisas em novas drogas para o tratamento da leishmaniose (WHO, 2009). 1.5.1. Mecanismo de ação dos antimoniais Alguns trabalhos sugerem que o SbV atua como uma pró-droga, que in vivo, é reduzida a uma forma mais tóxica e ativa, o antimônio trivalente (SbIII) (Burguera et al., 1993; Shaked-Mishan, 2001). Essa redução pode ocorrer através da ação de tióis como, por exemplo, a glutationa (GSH) que é o principal tiol presente no citosol das células de mamíferos, a cisteína (Cys) e a cisteinil-glicina (Cys-Gly), tióis presentes dentro dos lisossomas (Mego, 1985; Gainey et al., 1996), e o conjugado glutationa-espermina, a tripanotiona (T(SH)2), que é um tipo de tiol presente dentro do parasito (Fairlamb & Cerami 1992). Dados obtidos por Ferreira et al. (2003), realçam a hipótese de que o SbV é convertido in vivo pela tripanotinona (T(SH)2), dentro da Leishmania, e pela cisteína (Cys) e cisteinil-glicina (Cys-Gly), dentro dos compartimentos acídicos das células de mamíferos, pois estes compostos foram capazes de reduzir o SbV à sua forma trivalente, à temperatura de 37°C em pH ácido. Essa redução pode então ocorrer de forma preferencial em amastigotas, que vivem sob condições de baixo pH e temperaturas levemente elevadas (Shaked-Mishan, 2001). Assim, o mecanismo leishmanicida do SbIII esta provavelmente relacionado à sua alta afinidade por biomoléculas contendo radicais sulfidrilas, como os tióis (Frézard et al., 2009). Uma vez que o SbIII encontra-se na célula, ele pode ser conjugado com a T(SH)2, e este complexo formado é sequestrado para dentro de um vacúolo ou expelido por proteínas transportadoras ABC (ATP-binding cassette) (Mukhopadhyay et al., 1996; Légaré et al., 9 MARCON, L. D. Introdução 2001). A tripanotiona redutase (TR), e as proteínas zinc-finger, são os principais alvos para o SbIII (Frézard et al., 2009). O sistema tripanotiona/TR, é responsável por manter a T(SH)2 em seu estado reduzido, protegendo os tripanossomatídeos dos danos oxidativos e metais pesados tóxicos e entregando equivalentes reduzidos para a síntese de DNA (Krauth-Siegel & Comini, 2008). Contudo, o SbIII pode interferir no metabolismo da T(SH)2 por inibir a TR, induzindo um rápido efluxo de T(SH)2 na Leishmania (Cunningham & Fairlamb, 1995, Wyllie et al., 2004). O SbIII também pode se ligar a peptídeos zinc-finger CCHC e promover a ejeção de ZnII (Demicheli et al., 2008), o que pode ser danoso à célula, já que estes peptídeos, estão envolvidos em interações proteínaácido nucléico, proteína-proteína, e funções imprescindíveis como, reconhecimento do DNA, empacotamento do RNA, enovelamento e montagem de proteínas, ligação de lipídeos, ativação trasncricional, diferenciação e crescimento celular e regulação da apoptose (Leon & Roth, 2000). Segundo outros autores, o SbV poderia apresentar uma atividade leishmanicida intrínseca, através da inibição da DNA topoisomerase I (Chakraborty & Majumder, 1988; Walker & Saravia, 2004), ou pela formação de complexos com ribonucleosídeos, neste ultimo caso haveria inibição do transporte de purinas na Leishmania com consequente interferência na via de salvação de purinas do parasito (Ferreira et al., 2006). Além disso, o antimoniato de meglumina também pode aumentar a capacidade fagocítica de monócitos e neutrófilos e aumentar a produção de ânion superóxido por fagócitos, que representam a primeira linha de defesa contra o parasito (Muniz-Junqueira & Paula-Coelho 2008). 1.6. Os lipossomas e a vetorização de fármacos Lipossomas são vesículas esféricas, constituídas por uma ou várias bicamadas concêntricas de lipídeos, que isolam um ou vários compartimentos aquosos internos do meio externo (Frézard, 1999), permitindo assim que substâncias farmacologicamente ativas possam ser incorporadas tanto em seu compartimento aquoso interno (substâncias hidrossolúveis), quanto em sua membrana (substâncias lipofílicas ou anfifílicas). Além disso, a encapsulação do fármaco protege o princípio ativo de uma degradação rápida in vivo ou mesmo de uma rápida eliminação pelo organismo (Demicheli et al., 2005). 10 MARCON, L. D. Introdução Os lipossomas possuem elevada biocompatibilidade, principalmente quando constituídos por lipídeos naturais, e são preparados, classicamente, a partir de glicerofosfolipídeos como a fosfatidilcolina (Frézard, 1999). Seu tamanho médio pode variar entre 20 a 5000nm de diâmetro (Demicheli et al., 2005). Outra propriedade que auxilia na sua eficácia é a sua capacidade de lenta liberação do fármaco, o que leva a redução da concentração do princípio ativo na forma livre e, portanto, prolonga a sua presença no organismo. Isso leva a uma melhora na ação biológica do fármaco utilizado, bem como na redução dos possíveis efeitos adversos (Demicheli et al., 2005). In vivo a liberação das substâncias encapsuladas em lipossomas é mediada por células endocíticas, e a presença da fosfatidilcolina ou de surfactantes não-iônicos e de colesterol, faz com que estes lipossomas sejam naturalmente capturados por macrófagos, quando administrados por via endovenosa. Os lipossomas também sofrem opsonização quando entram em contato com componentes do sangue, auxiliando na sua captura. Após a fagocitose os lipossomas são degradados pelas fosfolipases lisossomais e o fármaco contido dentro deles é liberado no fagolisossoma, podendo se difundir para o citossol ou ser excretado para o meio extracelular (Demicheli et al., 2005). 1.6.1. O antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas e a leishmaniose visceral O efeito leishmanicida do antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas pode ser atribuído à propriedade dos lipossomas de lenta liberação do princípio ativo contido e da sua captação pelas células do sistema fagocitário mononuclear, ricamente presentes no fígado, baço e medula óssea, órgãos alvo da infecção pela Leishmania (Demicheli et al., 2005). Assim, as formulações lipossomais podem melhorar o uso dos antimoniais, auxiliando na redução da dose da droga e na duração da quimioterapia (Storm & Crommelin, 1998). Sabe-se que durante a infecção por Leishmania os parasitos são fagocitados por macrófagos e no interior destas células se transformam em amastigostas, as quais conseguem evadir os diversos mecanismos de defesa do hospedeiro e se multiplicar livremente no compartimento ácido dos fagolisossomas (Olivier et al., 2005). Os lipossomas, assim como a Leishmania, também chegam ao fagolisossoma por meio da 11 MARCON, L. D. Introdução fagocitose, e o seu conteúdo pode então ser liberado, por meio da degradação de sua capsula lipídica, neste compartimento acídico. Dessa forma, o fármaco liberado pode agir diretamente sobre o parasito (Demicheli et al., 2005). Estudos de biodistribuição e farmacocinética do antimônio em camundongos e cães mostraram que as formulações lipossomais promovem níveis de antimônio muito mais elevados e prolongados no fígado e no baço dos animais quando comparados à forma livre (Collins et al., 1993; Schettini et al., 2003). A formulação lipossomal de anfotericina B (AmBisome), aprovada pela Food and Drug Administration (FDA) já é usada em alguns países como a Índia e possui diversas vantagens sobre a anfotericina B não encapsulada, como o aumento do seu índice terapêutico, prolongamento da ação do fármaco, redução do número de injeções, redução do tempo de terapia e diminuição dos efeitos colaterais (Davidson et al., 1996; Meyerhoff, 1999). Mesmo sabendo da necessidade de melhoramento da quimioterapia antimonial e que resultados obtidos em modelos experimentais de LV utilizando lipossomas serem extremamente promissores, nenhuma formulação farmacêutica utilizando lipossomas e antimoniais está disponível no mercado (Schettini et al., 2006). 1.7. As vias de administração e sua interferência na aplicabilidade das formulações lipossomais Praticamente todas as drogas utilizadas para o tratamento da LV são administradas por via endovenosa, exceto a miltefosina que é administrada oralmente (WHO, 2009). Um grande número de trabalhos mostra a aplicabilidade das formulações lipossomais também pela via endovenosa, contudo diversos efeitos colaterais foram associados ao uso deste tipo de via (Schettini et al., 2006; Ribeiro et al., 2008). Assim, pesquisas por vias alternativas de administração de fármacos lipossomais como as vias intramuscular, subcutânea, intradérmica, intralinfática, oral, e intraperitoneal estão sendo divulgadas (Hirano & Hunt, 1985; Santangelo et al., 2000; Bern et al., 2006; Mohanan et al., 2010). A aplicabilidade e a eficácia da administração de fármacos por via intraperitoneal é mostrada em diversos trabalhos (Bajaj & Yeo, 2010; Chaudhary et al., 2010). Sabe-se que drogas de baixo peso molecular são absorvidas pelos capilares peritoniais e chegam rapidamente à circulação sistêmica, passando primeiro pela circulação portal, fígado e 12 MARCON, L. D. Introdução posteriormente alcançando outros órgãos. (Lukas et al., 1971; Hirano & Hunt, 1985). Além disso, a terapia intraperitoneal pode relativamente fornecer altas concentrações do fármaco na região e permitir uma meia vida longa da droga na cavidade peritoneal (Bajaj & Yeo, 2010). Bhowmick et al. (2009) avaliaram a interferência das vias de administração de antígenos de membrana de Leishmania donovani livres ou encapsulados em lipossomas na formação do perfil de resposta imune gerada em camundongos BALB/c, e verificaram que a imunização intraperitoneal e endovenosa foi da mesma forma eficaz em gerar uma resposta imune protetora, o que não ocorreu com a imunização subcutânea e intramuscular. Assim, uma das propostas deste trabalho foi avaliar a eficácia de duas vias de administração medicamentosa, as vias endovenosa e intraperitoneal, para o tratamento da LV utilizando a formulação lipossomal de antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas. 1.8. Desnutrição protéico calórica (DPC) A desnutrição protéico-calórica (DPC) é definida pela OMS como uma gama de condições patológicas decorrentes da deficiência simultânea de proteínas e calorias, em variadas proporções, acometendo principalmente crianças de baixa faixa etária, sendo comumente associada a infecções. As deficiências calórica e protéica geralmente ocorrem juntas, porém, quando há predomínio da deficiência protéica, o quadro é denominado Kwashiorkor, e quando há predomínio da deficiência calórica é chamado marasmo. Assim, a DPC possui um amplo espectro de manifestações clínicas que variam desde a perda de peso ou retardo de crescimento até síndromes clínicas típicas, frequentemente associadas à deficiência de minerais e vitaminas (Waitzberg, 2004). Entre os anos de 2000 e 2002 foram estimados 852 milhões casos de DPC no mundo, acometendo principalmente países em desenvolvimento (FAO - Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2004). Em 2005, na África e países do sul da Ásia estimou-se que 130 milhões de crianças sofriam de DPC, o que representava aproximadamente 20% do número total de crianças nestas regiões. Direta ou indiretamente, a DPC foi responsável neste mesmo ano por 54% das 10,8 milhões de mortes de crianças com idade inferior a 5 anos (Blössner & Onis 2005). Em um recente estudo, Svedberg (2011) relatou que em torno de um quarto das crianças dos países em desenvolvimento menores de cinco anos de idade estavam abaixo 13 MARCON, L. D. Introdução do peso esperado e que na Índia, país com extensa população infantil, foi constatado um elevado número de crianças desnutridas, aproximadamente 60% do total. No Brasil, a DPC já foi reconhecida como um dos mais graves problemas de saúde pública (Lopes, 1998; Sigulem & Taddei, 1998). Atualmente, ainda há uma alta prevalência de DPC no país, principalmente nas regiões mais pobres (Coutinho et al., 2008). Dentre as causas da DPC, a deficiência de proteínas e calorias bem como de micronutrientes como ferro, cobre, zinco, fosfato e vitaminas, por exemplo, contribuem para os prejuízos na imunidade (Schaible & Kaufmann, 2007). Dessa forma, a DPC é considerada uma das mais frequentes causas de imunodeficiência secundária (Cunningham-Rundles et al., 2005), podendo comprometer importantes funções e estruturas relacionadas ao funcionamento do sistema imune, provocando a atrofia dos tecidos linfoides, redução da hipersensibilidade de tardia, redução do número de células T, redução da concentração e atividade de componentes do complemento, prejuízo na fagocitose, entre outros (Redmon et al., 1991; Chandra, 1992; Woodward et al., 1992; Borelli & Nardinelli, 2001; Xavier et al., 2007). 1.8.1. A desnutrição protéico calórica e a leishmaniose visceral Sabe-se que a imunidade ou a susceptibilidade a diversas doenças infecto‐ parasitárias está diretamente ligada ao estado nutricional do hospedeiro (França et al., 2009). Nesse sentido, a DPC pode auxiliar a compor um quadro de imunodeficiência e consequentemente favorecer a progressão bem como o agravamento da leishmaniose visceral (Cerf et al., 1987). Gomes et al. (2007) verificaram que o estado nutricional durante a infecção por Leishmania ssp. tem um papel significativo na evolução clínica da LV, principalmente em crianças menores de 5 anos de idade. Badaró et al. (1986) encontraram 45% de prevalência de desnutrição moderada ou grave em crianças com leishmaniose visceral, e associou a desnutrição como um fator de risco para o desenvolvimento da doença. Maciel et al. (2008) também verificaram, no Rio Grande do Norte, em crianças com leishmaniose visceral, que modificações nos aspectos nutricionais estão associadas diretamente com o curso da infecção. 14 MARCON, L. D. Introdução González-Martínez et al. (2008) avaliaram as possíveis alterações no balanço das respostas tipo Th1/Th2 decorrentes do estado nutricional. Eles verificaram que crianças desnutridas apresentaram maiores níveis de TNF-, IL-4 e IL-10, em contraste com baixos níveis de IL-2, IFN- e IL-6, indicando que na desnutrição há um direcionamento da resposta imune para o tipo Th2, que por sua vez tem um efeito supressor sobre a resposta à Leishmania. Além disso, alguns estudos envolvendo modelos experimentais relacionaram a DPC com prejuízos significativos nas funções microbicidas dos macrófagos (Redmond et al., 1995; Anstead et al., 2001), o que favorece a manutenção e crescimento da Leishmania no hospedeiro. 1.8.2. A interferência da desnutrição na evolução terapêutica Nos últimos 20 anos, várias publicações científicas em todo o mundo apontaram a desnutrição como a responsável direta por maiores índices de mortalidade e de morbidade (lenta cicatrização de feridas; maior taxa de infecção hospitalar; maior tempo de internação e elevados índices de reinternação) (Waitzberg et al., 2004). Evidências mostraram que pacientes hospitalizados frequentemente pioram o seu quadro nutricional (McWhirter et al., 1994; Singh et al., 2006), contribuindo para o aumento do risco de agravamento de doenças. (Naber et al., 1997; Braunschweig et al., 2000). Assim, a DPC pode afetar tanto o estado geral do paciente quanto a resposta adequada ao tratamento em questão (Waitzberg et al., 2004). Diante disso, a segunda proposta deste trabalho foi avaliar por meio de parâmetros parasitológicos e histopatológicos a capacidade de camundongos BALB/c desnutridos e infectados com L. chagasi responderem ao tratamento quimioterápico para leishmaniose visceral, utilizando a formulação lipossomal de antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas. 15 MARCON, L. D. Introdução 1.9. Justificativa Devido à gravidade da leishmaniose visceral e à necessidade de se obter medicamentos mais eficazes com menos efeitos colaterais foi avaliada a eficácia de uma formulação lipossomal de antimoniato de meglumina administrada por diferentes vias. Além disso, sabendo que a desnutrição prejudica a resposta imune ocasionando o agravamento do quadro clínico da LV, torna-se importante avaliar o efeito do estado nutricional na resposta ao tratamento. 16 Objetivos MARCON, L. D. Objetivos 2. Objetivos 2.1. Objetivo geral Avaliar a eficácia de duas vias de administração do antimoniato de meglumina (AM) lipossomal, e a eficácia deste medicamento em camundongos BALB/c desnutridos infectados com Leishmania chagasi. 2.2. Objetivos específicos Etapa I: Nesta etapa foi avaliada a eficácia das vias de administração endovenosa e intraperitoneal do AM lipossomal em camundongos BALB/c infectados com L. chagasi. Para cumprir com tal etapa foram propostos os seguintes objetivos específicos: - Avaliar o peso do fígado e do baço - Quantificar o número de parasitos no fígado e baço - Caracterizar histologicamente as alterações ocorridas no fígado - Quantificar morfometricamente o número e a área dos granulomas hepáticos - Avaliar histologicamente e densitometricamente a deposição das fibras colágenas do tipo I e III. - Selecionar a via de administração do AM lipossomal de melhor eficácia para ser utilizada na etapa II. Etapa II: Nesta etapa foi avaliada a eficácia do AM encapsulado em Lipossomas em animais desnutridos e infectados com L. chagasi. Para cumprir com tal etapa foram propostos os seguintes objetivos específicos: - Avaliar o peso corporal ao longo do período experimental - Avaliar o peso do fígado e do baço - Quantificar o número de parasitos no fígado e baço - Caracterizar histologicamente as alterações ocorridas no fígado - Quantificar morfometricamente o número e a área dos granulomas hepáticos -Avaliar histologicamenete e densitometricamente a deposição das fibras colágenas do tipo I e III. 18 Material e Métodos MARCON, L. D. Material e Métodos 3. Material e Métodos 3.1. Animais Neste trabalho, foram utilizados aproximadamente 180 camundongos fêmeas da linhagem BALB/c (n = 3 a 5 animais / grupo) com idades entre 8 a 10 semanas, obtidos no Centro de Ciência Animal (CCA) da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP). Os animais foram mantidos em gaiolas de plástico com ração padrão e água ad libitum. Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) (protocolo número 2010/19) da Universidade Federal de Ouro Preto (documento em anexo). 3.2. Delineamento Experimental Este trabalho foi dividido em duas etapas objetivando a padronização e aplicação de um modelo experimental. Os resultados finais foram obtidos a partir de dois experimentos independentes em cada etapa. 3.2.1. Etapa I Esta etapa consistiu na avaliação da eficácia de duas vias de administração, endovenosa e intraperitoneal, do fármaco leishmanicida antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas em modelo de infecção causada pela Leishmania chagasi. Os animais foram divididos em nove grupos: Grupo não infectado (NI) Grupo infectado não tratado inoculados com PBS pela via endovenosa ou intraperitoneal (I) Grupo infectado tratado com lipossoma vazio pela via endovenosa ou intraperitoneal (LV) Grupo infectado tratado com antimoniato de meglumina na forma livre pela via endovenosa ou intraperitoneal (AM) 20 Material e Métodos MARCON, L. D. Grupo infectado tratado com antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas pela via endovenosa ou intraperitoneal (AM+L) (Figura 3). Figura 3. Delineamento experimental da etapa I. Foram testados dois protocolos de tratamento: um utilizando a via de administração intraperitoneal e outro a via de administração endovenosa. O tratamento em dose única foi realizado após duas semanas da infecção experimental. Com base no estudo de Frézard et al. 2000, a concentração de antimônio (Sb) administrada foi de 30 mg de Sb/Kg, tanto para o medicamento encapsulado quanto para o fármaco livre. Três semanas após a administração do medicamento, os animais foram eutanasiados (Quadro 1). Dia do Dose Via tratamento Número de Eutanásia doses 14 dias 30 mg de de infecção Sb/kg (200µl) 14 dias 30 mg de de infecção Sb/kg (200µl) endovenosa 1 5 semanas de infecção intraperitoneal 1 5 semanas de infecção Quadro 1. Esquema terapêutico 21 MARCON, L. D. Material e Métodos 3.2.2. Etapa II: A segunda etapa baseou-se na avaliação da resposta de camundongos BALB/c desnutridos infectados com L. chagasi ao tratamento com antimoniato de meglumina lipossomal. O medicamento foi administrado pela via que segundo resultados obtidos na etapa I obteve os melhores resultados. 3.3. Protocolo de desnutrição Após o período de desmame (3 semanas de idade), os animais foram alimentados com uma ração padrão, específica para roedores (Labina - Nestlé Purina PetCare Company). Seguido um período de aproximadamente 20 dias, quando os animais passam a ter massas corporais semelhantes, os grupos foram divididos de maneira homogênea visando à obtenção de médias de pesos semelhantes. Para iniciar o processo de desnutrição dos animais, uma dieta especial para estabelecimento da desnutrição (hipoprotéica, 4,5% de caseína) foi oferecida aos animais dos grupos “desnutridos” e outra dieta contendo percentuais de caseína adequados à nutrição de camundongos (14% de caseína) foi oferecida aos animais dos grupos “controle”. A composição destas dietas constituiu-se por ingredientes semipurificados para roedores de laboratório seguindo os padrões da AIN-93M (Reeves et al., 1993), e baseando-se no trabalho de Anstead et al. (2001) para formulação da dieta hipoprotéica. As dietas especiais foram preparadas no Laboratório de Nutrição Experimental na Escola de Nutrição da UFOP. Ambas continham a mesma composição em nutrientes, contudo na dieta hipoprotéica a quantidade de caseína encontrava-se reduzida (4,5%) sendo substituída por amido de milho para manter a mesma quantidade de calorias que a controle (≈3,6 Kcal/g de dieta) (Quadro 2). Para o preparo, seus componentes foram adicionados em ordem crescente de quantidade e misturados simultaneamente. Em seguida, adicionou‐se água até obter uma mistura com uma consistência de “massa de bolo”, a qual foi colocada em forma de aço inoxidável e posteriormente em estufa à temperatura de 60°C por aproximadamente 48h, ou até sua completa secagem. As dietas foram mantidas a -20°C e oferecida aos animais em pedaços. Alimento e água foram fornecidos aos animais ad libitum. 22 Material e Métodos MARCON, L. D. DIETAS (g/Kg) Composição Controle Hipoprotéica Caseína (1) 140 45 Óleo de milho 40 40 Sacarose 100 100 Celulose 50 50 Mistura de vitaminas (2) 10 10 Mistura de sais (3) 35 35 Amido de milho 625 720 Quadro 2. Composição e quantidade dos componentes das dietas controle e hipoprotéica. (1) Teor de proteína da caseína usada: 80%. (2) Mistura de Vitaminas (expressa em mg/kg de mistura): acetato de retinila: 690; colecalciferol: 5; ácido p-aminobenzóico: 10,000; inositol: 10,000; niacina: 4000; pantotenato de cálcio: 4000; riboflavina: 800; tiamina. HC1: 500; piridoxina: 500: ácido fólico: 200; biotina: 40; cianocobalamina: 3; dl- -tocoferol: 6700; sacarose: q.s.p. l kg.(3) Mistura de Sais (expressa em g/kg de mistura): NaCl: 139,3; KI: 0,79; MgSO4·7H2O: 57,3; CaCO3: 381,4; MnSO4·H2O: 4,01; FeSO4·7H2O: 27,0; ZnSO4·7H2O: 0,548; CuSO4·5H2O: 0,477; CoCl2 · 6H2O: 0,023; KH2PO4: 389,0. Os animais foram divididos em dez grupos, sendo cinco grupos de animais controle e cinco de animais desnutridos, os quais foram submetidos aos mesmos tratamentos da etapa I (Figura 4). Figura 4. Delineamento experimental da etapa II. 23 MARCON, L. D. Material e Métodos 3.4. Avaliação do peso corporal Com o objetivo de avaliar o estado nutricional dos animais e verificar a eficácia da dieta hipoprotéica quanto ao seu potencial para estabelecer um quadro de desnutrição, foi realizada, após a introdução das dietas experimentais, a pesagem semanal dos animais dos grupos “desnutridos” e “controle”, com o auxílio de uma balança eletrônica (Bell equipamentos LTDA). Foi construída uma curva de peso corporal para avaliar as diferenças estatísticas entre os grupos estudados. Só então, após um período de estabilização do peso (aproximadamente 60 dias), foi realizado o inóculo com L. chagasi para a infecção dos animais. 3.5. Cultura de Leishmania Foram utilizadas para a infecção experimental formas promastigotas de Leishmania infantum (cepa M2682 – MHOM/BR/74/PP75). Os parasitos foram cultivados em estufa BOD a 25°C em Grace´s Insect Medium suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) (previamente inativado a 56°C/30 min), 2 mM L‐glutamina, 100 unidades/mL de penicilina G potássica, pH = 6.5. 3.6. Infecção Experimental Para o inóculo das formas promastigotas, a cultura foi previamente repicada iniciando-se com 1x105 parasitos/ml. No quinto dia de cultura, onde o parasito encontravase em início de fase estacionária, e pode-se obter um maior número de formas metacíclicas (infectantes), foi realizado o preparo do parasito para a inoculação experimental. A cultura foi centrifugada a 1540 x g, a 4°C por 10 minutos, lavada duas vezes com solução salina tamponada (PBS estéril, pH=7,2). O pellet final foi ressuspendido em meio RPMI, pH=7,2. A quantificação do número de parasitos na amostra foi feita em câmara de Newbauer. A preparação final teve seu volume reajustado para 200μL/dose, onde cada dose continha 1x107 parasitos. Os parasitos foram inoculados por via endovenosa na veia da cauda dos animais. 24 MARCON, L. D. Material e Métodos 3.7. Obtenção do antimoniato de meglumina (AM) O antimoniato de meglumina liofilizado foi gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Fréderic Frézárd do Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade Federal de Minas Gerais, onde foram realizados os processos de síntese do medicamento, como descrito por Demicheli et al. (2003). Neste procedimento, o AM foi sintetizado a partir de quantidades equimolares de N-metil-D-glucamina e de oxihidrato de antimônio pentavalente. O produto resultante continha aproxidamadamente 30% de antimônio por peso, determinado por espectroscopia de emissão de plasma (ICP-OES) com o auxílio de um espectrômetro de emissão de plasma PerKin-Elmer Optima 3000. O AM liofilizado foi reidratado em água deionizada de forma a se obter uma solução com concentração de 300mg de AM/ml de solução final (equivalente a 85g/L de Sb). Em seguida, a solução foi aquecida a 40°C sob pressão reduzida, com auxílio de um rotavapor, para remoção dos solventes na solução. O volume obtido foi reajustado para o de início e a solução foi filtrada em membrana 0,22 µm. 3.8. Preparo dos lipossomas Os lipossomas, na forma liofilizada, foram fornecidos pelo Prof. Dr. Fréderic Frézárd do Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade Federal de Minas Gerais. A preparação do liofilizado foi feita através do método descrito por Schettini et al. (2006) no qual vesículas unilamelares pequenas (SUVs) foram obtidas por ultrasonificação de uma suspensão de vesículas multilamelares em água deionizada, constituída de Diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), colesterol (CHOL), dicetilfosfato (DCP) (razão molar de 5:4:1) a uma concentração final de lipídeos de 55 g/l. A suspensão foi filtrada em membrana estéril 0,22 µm, e posteriormente misturada com água (preparação 1) ou com uma solução de sacarose (preparação 2) a uma razão de massa açúcar/lipídeo de 3:1 e a uma concentração final de açúcar de 0,3 M. A mistura resultante foi imediatamente congelada em nitrogênio líquido e em seguida liofilizada (Labconco freeze-dryer, 4.5 l). 25 MARCON, L. D. Material e Métodos 3.9. Encapsulação do antimoniato de meglumina O processo de reidratação dos lipossomas liofilizados foi realizado, segundo Schettini et al. (2006). A solução de antimoniato de meglumina (85 g de Sb/L) foi adicionada a um tubo contendo o liofilizado, na proporção de 1:2 (AM:lipossoma), para se obter o medicamento, ou seja, o antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas. O mesmo volume de solução tampão salina fosfatada (PBS, pH 7,2) foi adicionado à outro tubo contendo o liofilizado, obtendo-se assim o controle do tratamento, os lipossomas vazios. A mistura foi vortexada e incubada a 60°C em banho maria por 45 minutos. Após o tempo decorrido, o mesmo volume de PBS foi adicionado e a mistura foi vortexada e incubada a 60°C em banho maria por mais 15 minutos. As amostras foram centrifugadas a 15.000g durante 40 minutos, utilizando uma ultra-centrífuga refrigerada (Beckman L7-65-rotor 55,2T) para que os lipossomas contendo a droga fossem separadas da droga não encapsulada. Neste processo consegue-se obter 35% de encapsulação do AM. O pellet foi então ressuspendido em PBS, de forma a se obter uma concentração final de antimônio de 14g de Sb / L, o que corresponde a uma administração de aproximadamente 30mg de Sb / Kg do peso do animal. Ambos os tratamentos com AM encapsulado em lipossomas e lipossoma vazio foram administrados em um volume de 250µl/animal (Figura 5). O diâmetro hidrodinâmico médio das vesículas na suspensão foi previamente estabelecido pela técnica de fotocorrelação de fótons, obtendo-se vesículas de 400nm de diâmetro. 26 MARCON, L. D. Material e Métodos Figura 5. Processo de encapsulação do antimoniato de meglumina. 3.10. Quantificação de parasitos Para avaliar a carga parasitária dos animais infectados, foi realizada a quantificação de parasitos no fígado e baço através da técnica de diluição limitante proposta por Titus et al. (1985) e modificada por Marques-da-Silva et al. (2005). Os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical e o baço e um pequeno fragmento do fígado (aproximadamente 100mg), foram coletados em ambiente estéril, mantidos a 4°C, em tubos contendo 2 ml de meio de lavagem de células (Meio Essencial Mínimo Dulbecco (DMEM), suplementado com 1% de soro fetal bovino (SFB) (previamente inativado a 56°C/30 min), 2mM de L‐glutamina, 100 unidades / mL de penicilina G potássica e 4,9% de tampão Bicarbonato de Sódio, pH=7,2 ). Os órgãos foram então macerados separadamente, transferidos para tubos de fundo cônico e ressuspendidos em 10 ml do mesmo meio à temperatura de 4°C. Para o protocolo de quantificação de parasitos no baço foram utilizados 2 ml do macerado, sendo o mesmo ressuspendido em 10 ml de meio de lavagem de células. O material foi centrifugado a 42 x g, 4°C por 1 minuto, o sobrenadante foi coletado e posteriormente centrifugado a 1540 x g, 4°C por 10 minutos. O sedimento foi 27 Material e Métodos MARCON, L. D. ressuspendido em 500 μL de Grace´s Insect Medium, suplementado com 10% de SFB, e as amostras foram então adicionadas em placas de fundo chato com 96 poços da seguinte maneira: 200 μL da amostra de células foram colocadas em duplicata nos primeiros poços da placa, e, nos poços restantes, foram adicionados 160 μL de Grace´s Insect Medium. Em seguida, foi feita a diluição seriada de 1:5, transferindo-se 40 μL da amostra do primeiro poço para o segundo poço, e assim sucessivamente até o décimo segundo poço, desprezando 40 μL da ultima diluição. As placas foram incubadas em estufa BOD a 25°C durante 14 dias. A quantificação do número de parasitos foi feita através da observação do crescimento de parasitos nos poços da placa. Quanto maior a diluição em que se encontravam parasitos, maior seria a carga parasitária do órgão avaliado, seguindo uma regra onde: se houvesse apenas parasitos no primeiro poço a quantificação seria de apenas 3 parasitos, se encontrássemos no segundo poço corresponderia a uma quantificação de 15 parasitos, se no terceiro de 75, e assim por diante, multiplicando-se por 5. (Marques‐da‐ Silva, et al., 2005; Malafaia et al. 2009, Serafim et al. 2010; Coelho, 2011). 3.11. Análises histológicas Para realizar as avaliações histopatológicas, fígado e baço, foram coletados no momento da eutanásia e foram fixados em formol tamponado (10%), por no mínimo 48 horas para posterior processamento e inclusão em parafina. Fragmentos de aproximadamente 1 cm2 foram processados em concentrações crescentes de alcoóis (etanol 70%, 80%, 90% e 100%), diafanizados em dois banhos de xilol, embebidos em dois banhos de parafina (entre 60°C a <70°C), (por 1h em cada bateria), e incluídos em parafina. Após este procedimento os blocos de parafina foram cortados a 4 m de espessura. Para as avaliações histopatológicas cortes dos fragmentos do fígado e baço foram corados com Hematoxilina-Eosina (H&E). A coloração Picrossírius Red (Montes & Junqueira, 1991) foi utilizada para caracterização do tipo de colágeno presente nos tecidos e o material foi analisado em microscópio de luz com lentes de polarização. A luz polarizada possibilita distinguir três cores: a coloração verde característica das fibras colágenas finas, reticulares do tipo III; e o espectro de cor amarela até a cor vermelha, indicando fibras colágenas densas do tipo I. 28 MARCON, L. D. Material e Métodos 3.11.1. Análises morfométricas e densitométricas As imagens digitais dos tecidos foram obtidas com o auxílio do microscópio óptico de captura Leica® DM5000 através do software Leica Aplication Suíte (versão 2.4.1), e as análises morfométricas e densitométricas foram feitas através do software Leica Qwim plus (versão 3.0). Foram analisados o número e a área (µm2) dos granulomas hepáticos. A análise morfométrica dos granulomas foi feita a partir da marcação manual da área ocupada pelo granuloma em cada campo avaliado (Figura 6). A densidade de fibras colágenas do tipo I e III foi feita a partir da captura e binarização das imagens obtidas dos campos histológicos. Figura 6. Análise morfométrica da área dos granulomas hepáticos. A linha vermelha mostra a área manualmente selecionada (indicada pela seta preta). A área é automaticamente computada pelo programa de análise de imagens o qual fornece os dados de acordo com o aumento da foto. (Foto de fígado, aumento de 440X, área do granulama: 1556.19 µm2). Para definição do número mínimo de campos utilizados para as análises, foi realizado o estudo da variação da instabilidade dos valores médios em relação à amostra. Em uma lâmina representativa de cada grupo experimental foram obtidos 50 campos, os quais foram agrupados em números de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 e 50 campos, por meio de sorteio. A média e o desvio padrão foram calculados para cada agrupamento de 29 MARCON, L. D. Material e Métodos números. O número mínimo representativo de campos microscópicos por tratamento foi obtido quando o aumento no número de campos não resultou em considerável redução (≤ 5%) no respectivo valor do desvio padrão. Os resultados deste trabalho foram expressos em média ± e.p.m. do número e área de granulomas/25 campos, e densidade média de fibra/15 campos. 3.12. Análises estatísticas Inicialmente todas as amostras avaliadas foram submetidas aos testes de normalidade de Kolmogorov-Smirnov, D’Agostino e Pearson e Shapiro-Wilk. Após a constatação de que as amostras não seguiam distribuição normal, foram então submetidas ao teste não paramétrico de Mann-Whitney. Diferenças estatísticas foram consideradas quando o valor de P foi menor que 0,05. Os teste foram realizados com auxílio do software GraphPad Prism 5. 30 Resultados MARCON, L. D. Resultados 4. Resultados 4.1. Primeira Etapa: Avaliação da eficácia das vias de administração endovenosa e intraperitoneal do AM lipossomal em camundongos BALB/c infectados com L. chagasi. 4.1.1. Peso do fígado e do baço Um dos principais sinais clínicos que ocorrem durante o curso da leishmaniose visceral humana é a hepatoesplenomegalia. Nesse sentido, para avaliar possíveis alterações decorrentes da infecção ou do tratamento, foi analisado o peso do fígado e do baço dos animais deste estudo. Após cinco semanas de infecção, não foram observadas modificações no peso úmido do fígado e do baço dos animais infectados não tratados, indicando que a infecção não provocou o aumento destes órgãos (Figura 7, A e B). Além disso, o peso do fígado dos animais submetidos ao tratamento com lipossoma vazio, AM livre ou AM encapsulado em lipossomas por ambas as vias da administração, endovenosa e intraperitoneal, também não sofreu alteração quando comparado ao peso do fígado dos animais não infectados (Figura 7, A). Em contraste, o peso do baço foi significativamente maior nos animais tratados com lipossoma vazio ou AM encapsulado em lipossomas por ambas as vias de administração quando comparado aos animais não infectados (Figura 7, B). 32 Resultados MARCON, L. D. A B Figura 7. Peso úmido do fígado e do baço de camundongos BALB/c, infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos. (A) Peso úmido do fígado em gramas (B) Peso úmido do baço em gramas. (NI) não infectado; (I) infectado; (LV) lipossoma vazio; (AM) antimoniato de meglumina livre; (AM + L) antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas. O tratamento com lipossomas vazios ou lipossomas contendo AM provocou aumento do peso do baço dos animais infectados com L. chagasi. Os resultados estão representados como média ± d.p.m. dos dados de dois experimentos independentes (n= 3 a 4 animais/experimento). (*) Diferença estatística em relação ao grupo não infectado. Valores de P<0,05 foram considerados significativos. 4.1.2. Carga parasitária Ao se avaliar o efeito do AM encapsulado em lipossomas sobre a carga parasitária hepática nos animais infectados, observou-se uma significativa redução do número de parasitos/miligrama de tecido quando comparado aos animais infectados não tratados, efeito este observado em ambas as vias de administração do fármaco (Figura 8, A). De maneira interessante, em alguns animais tratados com AM encapsulado em lipossomas não foram detectados parasitos pela técnica de diluição limitante, com negativação da carga parasitária de 14,3% dos animais tratados pela via endovenosa e de 33,3% pela via intraperitoneal. De forma similar, a carga parasitária do baço destes animais sofreu significativa redução, tanto nos animais que foram tratados com AM encapsulado em lipossomas pela via endovenosa quanto naqueles tratados pela via intraperitoneal quando comparado ao grupo infectado não tratado (Figura 8, B). O tratamento com dose única de AM lipossomal foi capaz de negativar a carga parasitária esplênica em 100% dos animais tratados tanto pela via endovenosa quanto pela via intraperitoneal. Não foram observadas diferenças estatísticas nos animais tratados com lipossoma vazio ou AM livre em relação aos animais infectados não tratados. 33 Resultados MARCON, L. D. A B Figura 8. Carga parasitária do fígado e do baço de camundongos BALB/c infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos. (A) Carga parasitária/mg de tecido hepático; (B) Carga parasitária/mg de tecido esplênico. (I) infectado; (LV) lipossoma vazio; (AM) antimoniato de meglumina livre; (AM + L) antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas. O tratamento com AM encapsulado em lipossomas foi capaz de reduzir a carga parasitária do fígado e do baço nos animais infectados com L. chagasi. Os resultados estão representados como média ± e.p.m. dos dados de dois experimentos independentes (n= 3 a 4 animais/experimento). (*) Diferença estatística em relação ao grupo infectado. Valores de P<0,05 foram considerados significativos. 4.1.3. Análise histopatológica do fígado O fígado dos animais infectados não tratados e dos animais tratados com lipossoma vazio, por ambas as vias, exibiu de forma acentuada padrão inflamatório granulomatoso típico, com exsudato de células que se organizavam em forma de agregados circunscritos de macrófagos e de células epitelióides (Figuras 9 e 10, A-B). Além disso, foram observados focos de infiltrado linfoplasmocitário intralobular (Figura 10, C). Nos espaços sinusóides houve um aumento difuso das células de Kupffer que exibiam aspecto hipertrofiado (Figura 10, C). Alguns hepatócitos da região centrolobular apresentaram moderado grau de degeneração hidrópica. Também verificou-se uma perivasculite nos ramos da veia hepática que exibiram intensa hiperemia com moderado infiltrado mononucelar (Figura 11). Animais que receberam tratamento com AM livre, por ambas as vias, apresentaram processo inflamatório discreto com acúmulo focal perivascular de células mononucleares (Figura 9). Poucos granulomas foram observados. De forma interessante, nos animais que receberam AM encapsulado em lipossomas por via intraperitoneal não foram observadas as lesões acima descritas, diferentemente da via endovenosa, nos quais raros granulomas ainda foram observados. 34 MARCON, L. D. Via Intraperitoneal AM encapsulado AM Livre Lipossoma vazio Infectado Via Endovenosa Resultados Figura 9. Fotomicrografias dos cortes histológicos (5 μm, HE) representativos do número de granulomas no fígado dos animais infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos utilizando as vias endovenosa e intraperitoneal. Animais não tratados ou tratados com lipossoma vazio, pelas vias endovenosa ou intraperitoneal exibiram elevado número de granulomas. O tratamento com AM livre por ambas as vias reduziu o número de granulomas. Em contraste animais tratados com AM encapsulado em lipossomas exibiram raros granulomas ou nenhum. As setas pretas indicam granulomas. Barra = 50 µm. 35 Resultados MARCON, L. D. A B C K Figura 10. Fotomicrografias de cortes histológicos (5 μm, HE) representativos do fígado dos animais infectados com L. chagasi, não tratados ou tratados com Lipossoma vazio. Destaques para caracterização do processo inflamatório e dos granulomas. (A) A infecção pela leishmania provocou lesões de padrão nodular observadas em grande número. As setas pretas indicam os granulomas. Destaque em A para o granuloma. (B) As lesões foram caracterizadas por agregados circunscritos de células mononucleares, macrófagos, células epitelióides e linfócitos. A seta tracejada indica uma célula epitelióide. Destaque para as células. (C) Infiltrados focais de células mononucleares também foram observados nestes animais. “K” indica células de Kupffer. Destaque para acúmulo focal de células de Kupffer. Barra = 50 µm. 36 MARCON, L. D. Resultados Figura 11. Fotomicrografia de corte histológico (5 μm, HE) representativo do fígado dos animais infectados com L. chagasi não tratados: destaque para infiltrado inflamatório. A infecção por leishmania induziu a formação de agregados de células linfoplasmocitárias em torno das vênulas. Barra = 100 µm. 4.1.4. Formação dos granulomas O número e a área ocupada pelos granulomas formados durando a infecção experimental por L. chagasi reflete a amplitude do perfil de resposta imunológica de resistência, do tipo Th1, e determina o grau de lesão que está acometendo o órgão. Por meio de analises morfométricas foi possível determinar o número e a área ocupada por eles nos diferentes grupos. Nos animais tratados com AM lipossomal houve significativa redução do número de granulomas (Figura 12, A) e da área ocupada por estes (Figura 12, B) quando comparado aos animais do grupo infectado sem tratamento. Esse efeito foi observado utilizando-se tanto a via de administração intraperitoneal quanto a via endovenosa. É interessante ressaltar que 100% dos animais tratados com AM encapsulado em lipossomas pela via intraperitoneal não apresentaram granulomas, enquanto que pela via endovenosa 40% não apresentaram granulomas. O tratamento com lipossoma vazio não alterou a formação dos granulomas bem como não afetou a área ocupada por estes. 37 Resultados MARCON, L. D. A B Figura 12. Número e área dos granulomas encontrados no fígado de camundongos BALB/c infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos. (A) Número de granulomas/25 campos; (B) Área média de granulomas/25 campos. (I) infectado; (LV) lipossoma vazio; (AM) antimoniato de meglumina livre; (AM + L) antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas. Animais tratados com AM encapsulado em lipossomas, por ambas as vias, apresentaram significativa redução do número de granulomas e da área ocupada por campo. Os resultados estão representados como média ± e.p.m. dos dados de dois experimentos independentes (n= 3 a 4 animais/experimento). (*) Diferença estatística em relação ao grupo infectado. Valores de P<0,05 foram considerados significativos. 4.1.5. Deposição de fibras colágenas O padrão fibrogênico manifestado na leishmaniose visceral de longa duração caracteriza-se por fibrose intralobular difusa, resultante do desequilíbrio entre a produção de colagenase e outras enzimas de degradação da matriz e a fibrogênese aumentada estimulada pela presença de citocinas inflamatórias sobre as células Ito. Por meio da coloração especial com picrosirius-red pode-se determinar o padrão da deposição das fibras colágenas no estroma hepático. A luz polarizada possibilita distinguir três cores: a coloração verde característica das fibras colágenas finas, reticulares do tipo III; e o espectro de cor amarela até a cor vermelha indicando a presença de fibras colágenas densas do tipo I. A análise densitométrica da deposição das fibras verdes e amarelo-avermelhadas permitiu estabelecer uma correlação entre as vias, os tratamentos e o padrão fibrogênico da inflamação em cada grupo estudado. Os animais infectados não tratados mostraram redução das fibras colágenas do tipo III e um aumento das fibras do tipo I quando comparados aos animais não infectados. As 38 MARCON, L. D. Resultados fibras foram depositadas em todo espaço intralobular, porém, de forma mais acentuada, em torno das veias centrolobulares e do espaço periportal (Figuras 13 e 14, A e B). A deposição de fibras do tipo III nos animais infectados não tratados e nos animais tratados com AM livre pela via endovenosa foi menor do que o padrão constitutivo dos animais não infectados. De maneira oposta, animais tratados com AM encapsulado em lipossomas pela via endovenosa apresentaram níveis de densidade de fibra do tipo III semelhantes aos animais não infectados ao contrário dos animais que receberam AM encapsulado em lipossomas pela via intraperitoneal, nos quais a deposição das fibras reticulares foi menor do que a dos animais não infectados (Figura 13 e Figura 14, A). Os animais infectados não tratados, tratados com lipossoma vazio ou tratados com AM livre, tanto pela via endovenosa quanto pela via intraperitoneal, apresentaram aumento significativo na deposição das fibras densas do tipo I quando comparados ao grupo não infectado. Em contraste, nos animais tratados com AM encapsulado em lipossomas pela via intraperitoneal não houve diferença na deposição dessa fibra em relação aos animais não infectados, diferentemente do ocorrido na administração endovenosa, que foi maior em relação ao padrão não infectado (Figura 14, B). 39 Resultados MARCON, L. D. Lipossoma vazio AM Livre AM encapsulado Intraperitoneal Endovenosa Infectado Não Infectado Figura 13. Fotomicrografias dos cortes histológicos (5 μm, Picrossírius Red) representativos da deposição de fibras colágenas do tipo I (amarelo-avermelhada) e tipo III (verde) no fígado dos animais infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos utilizando as vias endovenosa e intraperitoneal. Animais infectados não tratados, tratados com lipossoma vazio ou tratados com AM livre, pelas vias endovenosa ou intraperitoneal exibiram elevada deposição de fibras colágenas do tipo I principalmente nos espaços porta e veias centrolobulares. As setas brancas indicam aumento na deposição de fibras do tipo I nos espaços porta. Animais tratados com AM encapsulado em lipossoma pela via intraperitoneal apresentaram reduzidos níveis de fibras do tipo III e semelhantes níveis das fibras do tipo I em relação ao padrão não infectado. As cabeças de seta branca indicam áreas de deposição de fibras reticulares. Barra = 100 µm. 40 Resultados MARCON, L. D. A B Figura 14. Análise densitométrica da deposição de fibras colágenas do tipo I e III no fígado de camundongos BALB/c infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos. (A) Densidade média de fibras do tipo III (µm2); (B) tipo I (µm2) por campo. (NI) não infectado; (I) infectado; (LV) lipossoma vazio; (AM) antimoniato de meglumina livre; (AM + L) antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas. Animais tratados com AM encapsulado em lipossomas pela via intraperitoneal apresentaram menor densidade de fibras colágenas do tipo III e níveis semelhantes de fibras do tipo I em relação aos não infectados. Os resultados estão representados como média ± e.p.m. dos dados de dois experimentos independentes (n= 3 a 4 animais/experimento). (*) Diferença estatística em relação ao grupo não infectado. (#) Diferença estatística entre as vias. Valores de P<0,05 foram considerados significativos. Os percentuais de fibras colágenas nos animais infectados mostram uma deposição de fibras do tipo I em torno de 75%, um aumento de 50% comparado ao grupo não infectado, indicando um padrão histopatológico fibrogênico. Em ambas as vias de administração testadas os percentuais de fibras do tipo I apresentaram a seguinte distribuição: lipossoma vazio > AM livre > AM encapsulado em lipossomas. De forma interessante, nos animais que receberam AM encapsulado em lipossomas pela via intraperitoneal o padrão de deposição das fibras foi semelhante ao grupo não infectado (Figura 15). 41 Resultados MARCON, L. D. Via Endovenosa Via Intraperitoneal Figura 15. Relação percentual das fibras colágenas do tipo I e III no fígado de camundongos BALB/c infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos. (NI) não infectado; (I) infectado; (LV) lipossoma vazio; (AM) antimoniato de meglumina livre; (AM + L) antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas. Animais tratados com AM encapsulado em lipossomas pela via intraperitoneal apresentaram proporções de fibras colágenas semelhante aos animais não infectados. Os dados estão representados como percentuais dos valores de densidade média das fibras do tipo I e tipo III expressos na figura 14. 4.1.6. Seleção da via de administração do fármaco Por meio dos dados obtidos na primeira fase deste estudo, foi possível constatar diferenças entre as vias de administração testadas quanto à eficácia desejada do fármaco. Apesar de ambas as vias mostrarem o mesmo efeito sobre a carga parasitária, o tratamento com AM encapsulado em lipossomas pela via intraperitoneal apresentou maior redução da formação de granulomas e da área de deposição de colágeno do tipo I e tipo III no fígado quando comparado com a via endovenosa. Além disso, a via intraperitoneal é de fácil administração e causa menor sofrimento aos animais. Dessa forma, a administração por via intraperitoneal do AM encapsulado em lipossomas foi escolhida para ser utilizada na segunda etapa deste estudo. 42 MARCON, L. D. Resultados 4.2. Segunda Etapa: Avaliação da eficácia do AM lipossomal em camundongos BALB/c desnutridos e infectados com L. chagasi. 4.2.1. Média de peso dos animais ao longo do período experimental Um dos parâmetros utilizados para avaliar o estado nutricional é a determinação do peso corporal. Dessa maneira animais alimentados com diferentes dietas (controle: 14% de caseína e hipoprotéica: 4,5% de caseína) foram pesados semanalmente para verificação da eficácia da dieta em induzir a desnutrição, bem como avaliar o tempo de estabilização do peso para iniciar a infecção experimental. As dietas foram oferecidas aos animais após completarem aproximadamente 6 semanas de idade. A partir da primeira semana da introdução das dietas, foi observada uma redução significativa do peso corporal dos animais submetidos à dieta hipoprotéica, que se manteve ao longo de todo o experimento (Figura 16). Figura 16. Peso corporal de camundongos BALB/c, alimentados com dieta controle ou hipoprotéica, infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos. (□) Peso corporal médio dos animais controle; (●) Peso corporal médio dos animais desnutridos. (Seta aberta) indica o início da redução significativa de peso no grupo desnutrido; (Seta cinza) inóculo de 1x107 formas promastigostas de L. chagasi; (Seta tracejada) dia do tratamento; (Seta preta) dia da eutanásia. Os resultados estão representados como média ± e.p.m. dos dados de dois experimentos independentes (n= 4 a 5 animais/experimento). Valores de P<0,05 foram considerados significativos. 43 Resultados MARCON, L. D. 4.2.2. Peso do fígado e do baço Além de afetar o peso corporal, a desnutrição pode também interferir no peso dos órgãos viscerais. Dessa maneira, para verificar se a desnutrição associada ou não ao tratamento com a formulação lipossomal interferiam no peso do fígado e do baço de animais infectados com L. chagasi, o peso úmido destes órgãos foi avaliado. De maneira geral, os animais submetidos à dieta hipoprotéica, durante um período de três meses, apresentaram redução estatística do peso do fígado quando comparado aos animais alimentados com a dieta controle. Animais desnutridos infectados não tratados, tratados com lipossoma vazio ou tratados com AM encapsulado em lipossomas apresentaram significativa redução do peso úmido do fígado quando comparados aos animais controle submetidos aos mesmos tratamentos (Figura 17, A). O peso do baço sofreu redução significativa em todos os grupos de animais submetidos à dieta hipoprotéica quando comparado aos grupos controle (Figura 17, B). A B Figura 17. Peso úmido do fígado e do baço de camundongos BALB/c alimentados com dieta controle ou hipoprotéica, infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos. (A) Peso úmido do fígado em gramas. (B) Peso úmido do baço em gramas. (I) infectado; (LV) lipossoma vazio; (AM) antimoniato de meglumina livre; (AM + L) antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas. O tratamento com AM encapsulado em lipossomas não alterou o peso do fígado e do baço tanto nos animais controle quanto nos desnutridos. Os resultados estão representados como média ± d.p.m. dos dados de dois experimentos independentes (n= 4 a 5 animais/experimento). (#) Diferença estatística entre as dietas. Valores de P<0,05 foram considerados significativos. 44 MARCON, L. D. Resultados 4.2.3. Carga parasitária Sabe-se que a desnutrição pode favorecer a progressão da leishmaniose visceral reduzindo a capacidade do hospedeiro de montar uma resposta imune. Dessa forma o objetivo desta análise foi avaliar o potencial de ação da formulação lipossomal na redução da carga parasitária em hospedeiros desnutridos e infectados. Devido a problemas com o inóculo, não foi possível realizar as análises estatísticas dos dados da carga parasitária do fígado e baço dos animais desnutridos infectados não tratados. Contudo, os dados da primeira etapa deste estudo permitem utilizar com segurança o grupo tratado com lipossoma vazio como controle da infecção, já que este tratamento não altera a carga parasitária do fígado e baço quando comparado aos grupos infectados não tratados (Figura 18, A e B). Assim, o grupo tratado com lipossoma vazio foi utilizado como grupo controle da infecção. O tratamento com AM livre ou AM encapsulado em lipossomas foi capaz de reduzir significativamente a carga parasitária do fígado tanto nos animais controle quanto nos desnutridos, quando comparados aos seus respectivos grupos tratados com lipossoma vazio (Figura 18, A). De maneira interessante, a carga parasitária hepática dos animais desnutridos foi estatisticamente superior nos grupos infectados tratado com lipossoma vazio e tratado com AM livre, quando comparado aos controle submetidos ao mesmo tratamento, mas não diferiu nos animais tratados com a formulação lipossomal (Figura 18, A). Assim, apesar da elevada carga parasitária hepática encontrada nos animais desnutridos, o AM encapsulado em lipossomas foi capaz de reduzi-la a níveis semelhantes ao encontrado nos animais controle submetidos ao mesmo tratamento. Observou-se nos animais controle uma negativação da carga parasitária hepática de 66,7% nos animais tratados com AM livre e de 62,5% nos tratados com AM lipossomal. Ao passo que nos animais desnutridos a negativação foi mais baixa, sendo de 0% nos animais tratados com AM livre e de 40% nos tratados com AM lipossomal. Da mesma forma, a carga parasitária esplênica dos animais desnutridos tratados com lipossoma vazio foi estatisticamente superior em relação aos animais controle submetidos ao mesmo tratamento, ao contrário dos tratados com AM livre ou AM encapsulado em lipossomas, que não diferiram quanto ao estado nutricional (Figura 18, B). Assim como observado no fígado, a carga parasitária no baço foi reduzida significativamente nos animais tratados com AM lipossomal, de maneira semelhante tanto 45 Resultados MARCON, L. D. nos animais controle quanto nos desnutridos, quando comparado aos animais tratados com lipossoma vazio (Figura 18, B). Além disso, não se observou negativação da carga parasitária do baço tanto nos animais controle quanto desnutridos tratados com AM livre, ao passo que o tratamento com AM lipossomal ocasionou em uma negativação da carga parasitária de 77, 8 % que foi semelhante tanto nos controle quanto nos desnutridos. A B Figura 18. Carga parasitária do fígado e do baço de camundongos BALB/c, alimentados com dieta controle ou hipoprotéica, infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos. (A) Carga parasitária/mg de tecido hepático; (B) Carga parasitária/mg de tecido esplênico. (LV) lipossoma vazio; (AM) antimoniato de meglumina livre; (AM + L) antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas. O tratamento com AM encapsulado em lipossomas foi capaz de reduzir a carga parasitária do fígado e baço dos animais controle e desnutridos. Os resultados estão representados como média ± e.p.m. dos dados de dois experimentos independentes (n= 3 a 4 animais/experimento). (*) Diferença estatística em relação ao grupo lipossoma vazio. (#) Diferença estatística entre as dietas. Valores de P<0,05 foram considerados significativos. 4.2.4. Análise histopatológica do fígado A desnutrição protéico calorica (DPC) pode ser definida como uma ampla faixa de condições patológicas que provem da falta, em várias proporções, de proteínas e calorias podendo ocasionar disfunções metabólicas e degenerações celulares com comprometimento funcional do sistema imune e do fígado. Dessa forma, foi avaliada a 46 MARCON, L. D. Resultados interferência da desnutrição e do tratamento com a formulação lipossomal sobre parâmetros histopatológicos do fígado de camundongos BALB/c infectados com L. chagasi. O fígado dos animais controle infectados não tratados e dos animais tratados com lipossoma vazio, apresentou intenso processo inflamatório, com granulomas típicos, bem organizados, caracterizados por agregados circunscritos de células epitelióides e macrófagos (Figuras 19 e 20, A e B). Além disso, foram observados no parênquima hepático focos de infiltrado linfoplasmocitário. Nos espaços sinusóides houve um aumento difuso das células de Kupffer caracterizando um quadro de hiperplasia e hipertrofia destas células (Figura 20, insert de E). Um moderado grau de degeneração hidrópica foi detectado em alguns hepatócitos centrolobulares. Uma intensa hiperemia com moderado infiltrado mononucelar foi observada nas veias centrolobulares e nos ramos da veia hepática, caracterizando uma perivasculite (Figura 20, E). Animais controle tratados com AM livre ou AM encapsulado em lipossomas apresentaram discreta formação de granulomas, contudo um aumento difuso das células de Kupffer foi observado nestes grupos (Figura 19). Em contrapartida, os animais infectados e alimentados com a dieta hipoprotéica, não tratados, tratados com lipossoma vazio, tratados com AM livre ou com AM encapsulado em lipossomas apresentaram discreto infiltrado inflamatório de aspecto granulomatoso (Figura 19). Nestes grupos foi possível observar um alto grau de degeneração hidrópica dos hepatócitos centro e intralobulares com ocasional perda dos espaços sinusóides (Figura 20, C e D). De maneira interessante, animais desnutridos tratados com lipossoma vazio ou tratados com AM encapsulado em lipossomas apresentaram um aumento difuso das células de Kupffer em todo parênquima hepático (Figura 19). 47 Resultados MARCON, L. D. Lipossoma vazio AM Livre AM encapsulado Desnutrido Controle Infectado K K Desnutrido Não Infectado Controle A B Figura 19. Fotomicrografias dos cortes histológicos (5 μm, HE) representativos do número de granulomas no fígado dos animais controle e desnutridos, infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos. Animais desnutridos infectados, não tratados, tratados com lipossoma vazio, AM livre ou AM encapsulado em lipossomas apresentaram reduzido infiltrado celular de aspecto granulomatoso, diferente dos animais controle que apresentam maior número de granulomas com padrão característico. As setas indicam os granulomas. As setas tracejadas indicam os infiltrados focais. “K” indica células de Kupffer. Notar elevado grau de degeneração hidrópica nos hepatócitos dos animais desnutridos (B) em relação aos controles (A). Barra = 50 µm 48 Resultados MARCON, L. D. A B C D E Figura 20. Fotomicrografias dos cortes histológicos (5 μm, HE) representativos do fígado dos animais controle e desnutridos infectados com L. chagasi. Animais controle infectados não tratados ou tratados com lipossoma vazio apresentaram intenso infiltrado inflamatório com elevado número de granulomas típicos (A e B), perivasculite no espaço porta (E) e hiperplasia das células Kupffer (inserte de E). De forma diferente, os animais desnutridos infectados exibiram escassos agregados de células mononucleares e intensa degeneração hidrópica nos hepatócitos (C e D). As setas pretas indicam granulomas. Destaque de D mostra hepatócitos tumefeitos característicos de degeneração hidrópica. As cabeças de seta indicam células de Kupffer. Fotos A e C barra = 100 µm; Fotos B, D e E barra = 50 µm. 49 Resultados MARCON, L. D. 4.2.5. Formação dos granulomas A imunidade é afetada durante a desnutrição protéico calórica, prejudicando o desenvolvimento de uma resposta imune protetora durante a infecção por L. chagasi. Diante disso, foi avaliada a interferência da desnutrição associada à infecção e ao tratamento com a formulação lipossomal quanto à capacidade do hospedeiro em produzir um perfil de resistência. Animais alimentados com dieta controle tratados com AM livre ou AM encapsulado em lipossomas apresentaram uma redução significativa no número de granulomas (Figura 21, A) e da área ocupada por estes (Figura 21, B) quando comparado aos animais controle infectados não tratados. Diferentemente, animais desnutridos infectados não tratados ou tratados com lipossoma vazio foram incapazes de produzir uma adequada resposta protetora baseada na formação de granulomas, pois exibiram reduzido número e área de granulomas quando comparados aos respectivos grupos controle. O mesmo achado foi verificado nos animais desnutridos tratados com AM livre ou AM encapsulado em lipossomas (Figura 21, A e B). A B Figura 21. Número e área dos granulomas presentes no fígado de camundongos BALB/c, controle e desnutridos, infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos. (A) Número de granulomas/25 campos; (B) Área média de granulomas/25 campos. (I) infectado; (LV) lipossoma vazio; (AM) antimoniato de meglumina livre; (AM + L) antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas. Camundongos BALB/c desnutridos apresentaram menor número e área de granulomas hepáticos em relação aos animais controle. Os resultados estão representados como média ± e.p.m. dos dados de dois experimentos independentes (n= 3 a 4 animais/experimento). (*) Diferença estatística em relação ao grupo infectado. (#) Diferença estatística entre as dietas. Valores de P<0,05 foram considerados significativos. 50 MARCON, L. D. Resultados 4.2.6. Deposição de fibras colágenas A desnutrição reduz a síntese de proteínas, especialmente a síntese de colágeno, comprometendo a formação do tecido conjuntivo durante os processos de reparo tecidual. Assim, para determinar a influência da desnutrição associada à infecção por L. chagasi e ao efeito do tratamento com a formulação lipossomal sobre a de síntese de colágeno, a deposição hepática das fibras colágenas do tipo I e tipo III foi avaliada. Durante a infecção, animais controle não tratados, tratados com lipossoma vazio ou AM livre mantiveram os níveis de fibra do tipo III semelhantes aos animais do grupo não infectado. Estas fibras foram observadas em todo o espaço intralobular e em torno das vênulas. Adicionalmente, os níveis das fibras colágenas do tipo I aumentaram significativamente nestes mesmos grupos sendo depositadas predominantemente na região portal (Figuras 22 e 23). Em contraste, animais controle tratados com AM lipossomal apresentaram redução da densidade das fibras do tipo I e tipo III, quando comparado aos animais controle não infectados (Figuras 22 e 23). De forma interessante, animais alimentados com a dieta hipoprotéica infectados não tratados ou tratados com lipossoma vazio, AM livre ou AM encapsulado em lipossomas exibiram baixa deposição de fibras reticulares (tipo III) e de fibras densas (tipo I), tanto nos espaços intralobulares quanto nos espaços portais, observado pela fraca coloração verde e, apesar de um pouco mais destacada, da coloração amarelo-avermelhada, quando comparado aos animais desnutridos não infectados (Figuras 22 e 23). Adicionalmente, todos os grupos desnutridos exibiram menor deposição de fibras colágenas do tipo III (Figura 23, A) e do tipo I (Figura 23, B), quando comparado aos grupos controle. 51 Resultados MARCON, L. D. Lipossoma vazio AM Livre AM encapsulado Desnutrido Controle Infectado Não Infectado Controle Desnutrido Figura 22. Fotomicrografias dos cortes histológicos (5 μm, Picrosírius Red) representativos da deposição de fibras colágenas do tipo I (amarelo-avermelhada) e tipo III (verde) no fígado dos animais controle e desnutridos infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos. Animais desnutridos infectados não tratados, tratados com lipossoma vazio, AM livre ou AM encapsulado em lipossomas exibiram de maneira equivalente baixa deposição de fibras colágenas tipo I e tipo III em relação aos animais desnutridos não infectados. As setas brancas indicam aumento na deposição de fibras do tipo I no espaço portal. As cabeças de setas brancas indicam áreas de deposição de fibras reticulares. Barra = 100 µm. 52 Resultados MARCON, L. D. A B Figura 23. Análise densitométrica da deposição de fibras colágenas do tipo I e III no fígado de camundongos BALB/c controle e desnutridos, infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos. (A) Densidade média de fibras do tipo III (µm2); (B) tipo I (µm2) por campo em 15 campos/grupo. (NI) não infectado; (I) infectado; (LV) lipossoma vazio; (AM) antimoniato de meglumina livre; (AM + L) antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas. Animais desnutridos exibiram baixa deposição de fibras do tipo I e do tipo III quando comparado aos animais controle. Os resultados estão representados como média ± e.p.m. dos dados de dois experimentos independentes (n= 3 a 4 animais/experimento). (*) Diferença estatística em relação ao grupo não infectado. (#) Diferença estatística entre as dietas. Valores de P<0,05 foram considerados significativos. A proporção das fibras colágenas em animais controle revelou um aumento na deposição das fibras densas nos animais infectados não tratados, tratados com lipossoma vazio e tratados com AM livre em relação aos animais não infectados. O tratamento com AM encapsulado foi capaz de manter a proporção das fibras do tipo I e tipo III semelhantemente ao padrão de deposição dos animais não infectados. Contudo, animais desnutridos, de maneira geral, apresentaram maiores proporções de fibras do tipo I (>50%), em relação às fibras do tipo III, indicando a formação de um padrão fibrogênico nestes animais. O tratamento dos animais desnutridos com AM encapsulado em lipossomas, diferentemente dos controles, não foi capaz de manter o padrão das fibras colágenas encontrado nos desnutridos não infectados (Figura 24). 53 Resultados MARCON, L. D. Controle Desnutrido Figura 24. Relação percentual das fibras colágenas do tipo I e III no fígado de camundongos BALB/c, controle e desnutridos, infectados com L. chagasi e submetidos a diferentes tratamentos. (NI) não infectado; (I) infectado; (LV) lipossoma vazio; (AM) antimoniato de meglumina livre; (AM + L) antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas. Animais desnutridos exibiram maiores proporções de fibra do tipo I e mesmo após o tratamento com AM encapsulado em lipossomas não foram capazes de recuperar o padrão das fibras colágenas dos animais não infectados. Os dados estão representados como percentuais dos valores de densidade média das fibras do tipo I e tipo III expressos na figura 23. 54 MARCON, L. D. Resultados 4.3. Resumo dos resultados O AM encapsulado em lipossomas, administrado em dose única, foi eficaz no tratamento de camundongos BALB/c infectados com L. chagasi, por reduzir significativamente a carga parasitária do fígado e eliminar o parasito no baço, tanto pela via intraperitoneal quanto pela via endovenosa. O tratamento com AM lipossomal reduziu significativamente o número e a área ocupada pelos granulomas no fígado de forma mais eficaz pela via intraperitoneal. A administração do AM encapsulado em lipossomas pela via intraperitoneal favoreceu a manutenção do perfil de normalidade de deposição das fibras colágenas do tipo I e tipo III no fígado dos camundongos infectados. A dieta hipoprotéica reduziu o peso corporal dos animais bem como o peso do fígado e do baço em relação aos animais alimentados com a dieta controle. Os animais desnutridos infectados, mesmo apresentando maior carga parasitária que os animais controle, após o tratamento com AM lipossomal apresentaram significativa redução da carga parasitária no fígado e no baço, mantendo o padrão de eficácia observado nos animais alimentados com a dieta controle. O processo de desnutrição interferiu na formação dos granulomas hepáticos reduzindo o número e área dos granulomas nos animais infectados. Além disso, o tratamento com AM lipossomal não alterou o perfil de formação dos granulomas encontrado nos demais grupos desnutridos. A deposição das fibras colágenas foi afetada pela desnutrição reduzindo a densidade das fibras colágenas do tipo III e do tipo I, com maior proporção de fibras tipo I. O tratamento com AM encapsulado em lipossomas não foi capaz de reestabelecer o padrão das fibras colágenas ao observado nos animais desnutridos não infectados. 55 Discussão MARCON, L. D. Discussão 5. Discussão Este trabalho, em sua primeira etapa, teve como objetivo avaliar a eficácia do tratamento com o fármaco leishmanicida antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas em camundongos BALB/c infectados com Leishmania chagasi, usando duas vias de administração, intraperitoneal e endovenosa. Num segundo momento, foi avaliada a eficácia desta formulação lipossomal em camundongos desnutridos e infectados com Leishmania chagasi. A leishmaniose visceral já é bem caracterizada e apresenta dentre outros sinais a ocorrência de hepatoesplenomegalia (Galvão-Castro et al., 1984; Desjeux, 2004; Neves, 2004). Neste sentido, a avaliação das alterações do peso do fígado e do baço dos animais utilizados neste estudo pôde auxiliar na complementação da caracterização da infecção pela L. chagasi em modelo murino. Foi observado que a infecção por L. chagasi não alterou o peso do fígado e do baço de camundongos após cinco semanas de infecção. Resultados semelhantes foram encontrados por Serafim et al. (2010) e Coelho (2011), os quais utilizando camundongos BALB/c infectados com L. chagasi não observaram modificações do peso do fígado e do baço em animais infectados. O fato de camundongos BALB/c exibirem um padrão de resposta subclínica à infecção por L. chagasi (Wilson et al., 2005) pode auxiliar na compreensão destes achados. Contudo, outros fatores também podem estar relacionados, como a via de inoculação utilizada (endovenosa), a forma do parasito (promastigota), a virulência da cepa, dentre outros, contribuindo para ausência de alteração destes órgãos. Por outro lado, o peso do baço dos animais infectados e tratados com lipossoma vazio e dos animais tratados com AM encapsulado em lipossomas foi significativamente maior em relação aos animais não infectados. Nestes animais, as modificações do peso do baço podem não estar relacionadas à infecção e sim ao uso dos lipossomas como sistema de vetorização. Sabe-se que lipossomas convencionais quando administrados por via endovenosa são naturalmente capturados por macrófagos, ocasionando um aumento da concentração do fármaco carreado nos órgãos ricos em células do sistema mononuclear fagocitário: fígado, baço e medula óssea (Demicheli et al., 2005). Da mesma maneira, fármacos administrados por via intraperitoneal são absorvidos pelos capilares peritoneais e chegam à circulação portal atingindo o fígado e posteriormente outros órgãos (Lukas et al., 1971; Hirano & Hunt, 1985). Neste trabalho, a diferença de peso do baço foi observada 57 MARCON, L. D. Discussão quando se utilizou as duas vias de administração, endovenosa e intraperitoneal. Estes dados podem indicar um direcionamento deste sistema de vetorização para o baço com consequente ativação de macrófagos locais, independente das vias de administração. A ativação dos macrófagos pode promover o recrutamento e a proliferação destas e de outras células do sistema imune, o que influenciaria no aumento de peso do órgão. O potencial de ação da formulação lipossomal avaliada neste trabalho baseia-se na tendência natural dos lipossomas de serem capturados por células fagocitárias, dentre elas macrófagos, presentes principalmente no fígado, baço e medula óssea. Após a fagocitose pela célula infectada, o fármaco contido nos lipossomas entra em contado direto com o parasito no fagolisossomo, o que potencializa o seu mecanismo de ação (Demicheli et al., 2005). Dessa forma, para verificar a eficácia terapêutica do medicamento encapsulado, foi avaliada a carga parasitária do fígado e do baço dos animais infectados por L. chagasi. Observou-se uma significativa redução do número de parasitos/miligrama de tecido no fígado e no baço dos animais tratados com AM encapsulado em lipossomas quando comparado aos animais infectados não tratados. Este efeito foi encontrado em ambas as vias de administração testadas, contudo, um maior percentual de negativação carga parasitária foi observado nos animais tratados pela via intraperitoneal (33,3%) em relação aos animais tratados pela via endovenosa (14,3%). Ribeiro et al. (2008) avaliaram a eficácia do AM encapsulado em lipossomas porém em cães naturalmente infectados com L. chagasi. Estes autores observaram uma supressão da carga parasitária de mais de 95% no fígado, baço e linfonodo, em cães tratados com quatro doses de AM encapsulado (6,5mg Sb/kg/dose) pela via endovenosa 150 dias após o tratamento. Apesar de a dose utilizada no presente estudo (30mg Sb / Kg) ser maior que a utilizada por Ribeiro et al. (2008), com apenas uma única dose foi possível observar uma redução significativa da carga parasitária que foi mantida após três semanas do tratamento. Schettini et al. (2006), avaliando a farmacocinética de uma formulação lipossomal idêntica em composição e tamanho à utilizada neste trabalho, observaram que cães tratados com AM encapsulado em lipossomas apresentaram níveis mais elevados de antimônio no fígado e no baço quando comparado com cães tratados com a mesma dose de AM livre (63 e 68 vezes maior, respectivamente). Estes dados podem auxiliar na compreensão da baixa eficácia do AM livre, visto que, no presente estudo o AM livre não foi capaz de reduzir a 58 MARCON, L. D. Discussão carga parasitária de forma significativa no fígado e no baço quando comparado aos animais não tratados. O tratamento com lipossoma vazio não interferiu na carga parasitária do fígado e do baço dos camundongos infectados com L. chagasi, corroborando com os dados de Ribeiro et al. (2008), os quais também não observaram alteração da carga parasitária no fígado e no baço de cães tratados com lipossoma vazio. Os lipossomas convencionais, de carga neutra, como os utilizados neste trabalho e no trabalho de Ribeiro et al. (2008), parecem não interferir na carga parasitária do fígado e do baço de camundongos BALB/c infectados com L. chagasi, ao contrário dos lipossomas carregados positivamente, contendo estearilamina, que exercem efeito leishmanicida por meio da ativação de uma resposta imune inflamatória (Banerjee et al., 2011). Frezard et al. (2000) também avaliaram a eficácia do tratamento com AM encapsulado em lipossomas (60mg Sb/kg) por via intraperitoneal em hamsters infectados com L. chagasi. Semelhante aos achados do nosso estudo, estes autores demonstraram que o tratamento com a droga encapsulada provocou uma significativa redução da carga parasitária no fígado quando comparado aos animais controle tratados apenas com lipossoma vazio e que o tratamento com AM livre, administrado na mesma dose da formulação encapsulada, não foi significativo na redução da carga parasitária. No presente trabalho, observou-se que o potencial leishmanicida da droga encapsulada foi equivalentemente eficaz quando administrado pela via endovenosa ou pela via intraperitoneal. Chang et al. (2010) avaliaram em modelo murino o efeito das vias de administração da anfotericina B lipossomal sobre a concentração da droga em diversos tecidos. O grupo verificou que utilizando tanto a via intraperitoneal quanto a via endovenosa houve a mesma retenção da droga no baço e no fígado por até uma semana após o tratamento. Este dado sugere que as duas vias podem apresentar o mesmo efeito sobre a carga parasitária já que a droga apresenta semelhante concentração tecidual quando administrada por ambas as vias. De maneira interessante, verificou-se por meio da técnica empregada que o tratamento com a formulação lipossomal de antimoniato de meglumina, administrada em dose única, em alguns animais foi capaz de eliminar os parasitos no fígado e, em 100% deles foi capaz de eliminar os parasitos no baço. Semelhante a estes achados, Sundar et al. (2010), na Índia, avaliaram em pacientes com leishmaniose visceral a eficácia da anfotericina B lipossomal administrada em dose única, comparando com o tratamento 59 MARCON, L. D. Discussão convencional que utiliza anfotericina B deoxicolato na forma livre aplicado durante 29 dias. Estes autores verificaram que a dose única da formulação lipossomal foi tão eficaz na cura parasitária quanto ao fármaco aplicado na forma livre. O grupo concluiu que o tratamento com anfotericina B lipossomal foi mais viável em relação à terapia convencional por reduzir a dose da droga, o tempo de terapia, a toxicidade, os efeitos colaterais, o custo financeiro do fármaco e a manutenção do paciente. Alterações hepáticas são frequentes durante o curso da leishmanise visceral, dentre elas a reação granulomatosa se destaca pelo importante papel na resistência do hospedeiro ao parasito (Gutierrez et al., 1984; McElrath et al.,1988; Murray, 2001). Dessa forma, as lesões do fígado de camundongos BALB/c infectados e submetidos a diferentes tratamentos foram avaliadas por meio de analises histopatológicas e morfométricas. Dados de McElrath et al. (1988) indicaram que durante a LV experimental em modelo murino observa-se um rápido aumento do número e tamanho dos granulomas hepáticos durante as primeiras semanas de infecção, apresentando um pico na quarta semana. Assim, no presente trabalho, a avaliação da histopatologia dos granulomas durante a quinta semana de infecção representa um período adequado à observação destes parâmetros. A infecção por L. chagasi induziu no fígado dos animais não tratados e tratados com lipossoma vazio um padrão inflamatório granulomatoso típico da LV murina constituído por agregados mononucleares, com predomínio de macrófagos e células epitelióides em meio a poucas fibras colágenas. Além disso, houve um aumento no número das células de Kupffer no parênquima hepático e região perivascular. Murray (2001) associou a resistência à L .donovani em camundongos BALB/c a uma resposta celular dependente de células T, da geração de citocinas do tipo Th1 e da ativação de células fagocitárias mononucleares. Sabe-se que no fígado o controle e a resolução da infecção por L. donovani é assegurado por estruturas imunologicamente ativas chamadas granulomas, as quais são constituídas basicamente pela fusão de macrófagos (células de Kupffer) residentes parasitados, circundadas por células T secretoras de citocinas e por monócitos sanguíneos atraídos pela inflamação (Murray, 2001). Assim, com base em diversos trabalhos, dentre eles os de Murray (2001), Kaye et al. (2004), Malla & Mahajan (2006) e Duarte et al. (2008) pode-se inferir que o padrão de resistência à infecção pela L. chagasi em camundongos BALB/c está associado a presença de granulomas. 60 MARCON, L. D. Discussão McElrath et al. (1988), caracterizaram a dinâmica da formação de granulomas hepáticos em camundongos BALB/c infectados com L. donovani. Estes pesquisadores observaram que o desenvolvimento dos granulomas se inicia com acúmulo focal de células de Kupffer, as quais perdem a associação com os sinusóides e passam a ser envolvidas por células recém-migradas da circulação como granulócitos e monócitos. O tratamento com AM encapsulado em lipossomas resultou em significativa redução do número de granulomas e da área ocupada por estes quando comparado aos animais do grupo infectado sem tratamento. Sabe-se que a primeira evidência de formação de granulomas ocorre em torno do oitavo dia após a infecção (McElrath et al., 1988), dessa maneira, pode-se dizer que o tratamento com AM lipossomal, realizado na segunda semana de infecção, ocasionou a regressão do número e da área dos granulomas já formados, e impediu a formação de novos granulomas que poderiam surgir a partir de macrófagos parasitados. Da mesma forma que a carga parasitária não foi afetada pelo tratamento com lipossoma vazio, também não houve alteração na formação de granulomas neste grupo. Estes dados sugerem que lipossomas convencionais, isoladamente, não atuam na formação de granulomas hepáticos em camundongos BALB/c infectados com L. chagasi. A associação do número de granulomas à carga parasitária hepática revela a estreita relação entre granulomas e infecção, visto que após o tratamento com a formulação lipossomal de AM houve a eliminação dos parasitos concomitante a redução do recrutamento das células mononucleares e granulócitos para a formação dos granulomas. Trabalhos realizados por Ahsan et al. (2002) e Tempone et al., (2004) comprovaram a eficácia dos lipossomas na indução da atividade fagocitária dos macrófagos. Dessa forma, pode-se inferir que a formulação lipossomal atuou diretamente na ativação das células infectadas, auxiliando no recrutamento de células mononucleares e granulócitos para posterior eliminação do parasito. Além disso, o direcionamento do antimoniato de meglumina presente nos lipossomas fagocitados pelas células infectadas potencializou o efeito direto do fármaco sobre a Leishmania. O mecanismo leishmanicida dos antimoniais pentavalentes pode estar relacionado ao seu papel em induzir uma resposta imune formadora de granulomas, a qual está diretamente relacionada à produção de IFN-Murray & Delph-Etienne, 2000). O IFN- ativa os macrófagos a expressarem a enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS), conduzindo a produção de NO (Bacellar & Carvalho, 2005), um dos principais 61 MARCON, L. D. Discussão mecanismos microbicidas para eliminação da Leishmania (Liew et al., 1990). Além disso, o IFN- também participa da quimiotaxia de células mononucleares para o foco da infecção regulando a formação dos granulomas (Squires et al., 1989; Murray, 1999). Murray & Delph-Etienne (2000) observaram que camundongos deficientes no gene que codifica IFN- não foram responsivos ao tratamento com Sb e falharam em formar granulomas. Estes dados permitiram aos autores associar a formação dos granulomas à produção de IFN- e à eficácia do Sb. O potencial leishmanicida do antimoniato de meglumina também foi correlacionado à sua capacidade em induzir fagocitose, produção de ânion superóxido e TNF- (Muniz-Junqueira & Paula-Coelho, 2008). Pesquisas utilizando o estibogluconato de sódio como terapia leishmanicida associaram a importância dos linfócitos T e das citocinas à eficácia do tratamento, indicando a importância da resposta imune mediada por célula na quimioterapia com antimônio pentavalente (Murray et al., 1989; Alexander et al., 2000; Murray et al., 2000). Murray et al. (1989) mostraram que o sucesso na quimioterapia com estibogluconato de sódio requer a presença de linfócitos TCD4+ e TCD8+ juntamente com a produção de citocinas do tipo Th1 como a IL-12 e o IFN-. Contudo, Alexander et al. (2000), demonstraram em camundongos BALB/c infectados com L. donovani que a IL-4 possui um papel protetor por promover uma resposta imune do tipo Th1, favorecendo o sucesso na quimioterapia. Outro trabalho deste mesmo grupo demonstrou que a IL-13, assim como a IL-4, uma citocina do tipo Th2, tem um importante papel no controle na leishmaniose visceral hepática tanto durante a fase inicial da infecção quanto após a terapia com o estibogluconato de sódio, por promover uma resposta do tipo Th1 e auxiliar na maturação dos granulomas hepáticos (McFarlane et al., 2011). De maneira interessante, os resultados do número de granulomas revelaram diferenças quanto a via utilizada para a administração do AM encapsulado em lipossomas. Observou-se que 100% dos animais tratados com o fármaco encapsulado administrado pela via intraperitoneal não apresentaram granulomas, enquanto que 60% dos animais que receberam o fármaco pela via endovenosa apresentaram estas lesões no fígado. Porém, quando se correlacionam estes dados com os dados de carga parasitária hepática não se observa diferença entre vias. Talvez a presença dos granulomas nos animais tratados pela via endovenosa esteja relacionada ao padrão da resposta inflamatória presente nestes animais, sugerindo a presença de maiores níveis de citocinas do tipo Th1, como IFN-, TNF- e IL-1 62 MARCON, L. D. Discussão favorecendo a manutenção dos granulomas. Outra possível explicação seria o fato de que a via intraperitoneal ofereceu maior vantagem na eliminação dos granulomas hepáticos devido a uma efetiva captação destes lipossomas por macrófagos peritoneais, os quais são rapidamente drenados pelos vasos linfáticos, posteriormente atingindo órgãos linfoides, dando início aos mecanismos de resposta imune nestes locais (Shimizu et al., 2007). Além das reações granulomatosas, outras alterações hepáticas foram observadas em animais infectados não tratados e tratados com lipossoma vazio, dentre elas áreas com moderado grau de degeneração hidrópica, hiperemia, hiperplasia/hipertrofia das células de Kupffer e perivasculites. Um padrão semelhante de lesões é descrito por Duarte (2011) durante a LV humana, onde a resposta sintomático no fígado caracteriza-se por focos de infiltrados linfoplasmocitário e de macrófagos infectados nos espaços intralobulares, hiperplasia e hipertrofia das células de Kupffer e elevado infiltrado mononuclear composto por linfócitos, plasmócitos e macrófagos em torno dos espaços porta. A hipertrofia e hiperplasia das células das Kupffer refletem o elevado parasitismo intracelular e o alto grau de ativação destas células o qual é decorrente do microambiente de citocinas produzidas como IFN- e TNF-, IL-12, IL-2 (Murray et al., 1993; Tumang et al., 1994; Taylor & Murray 1997). Esse aumento das células de Kupffer também causa distúrbios na produção de colagenase e em outras enzimas de degradação do colágeno, desequilibrando o balanço produção/degradação do colágeno. Nesse contexto há ainda a síntese elevada de fibronectina, a qual atua como fator estimulador da fibrogênese e liberação do fator de crescimento das células estreladas (células de Ito), favorecendo a ocorrência de fibroplasia (Duarte, 2011). A matriz extracelular (MEC) do fígado apresenta características distintas de acordo com a região. Nos espaços porta e em torno das veias centro lobulares predominam os colágenos dos tipos I e III, existindo ainda os colágenos dos tipos V e VI. Nos espaços de Disse há predomínio das fibras do tipo IV, com raras fibras do tipo I e III (Ushiki, 2002). Durante a conjuntivização hepática há o estabelecimento de um processo inflamatório com a liberação de citocinas e quimocinas como IL-1, TNF-, IL-6, PDGF, IL-4, IL-13, CCL2 e CCL4, que estimulam a proliferação, diferenciação e ativação dos miofibroblastos, consequentemente promovendo a formação excessiva da MEC (Schuppan & Rühl, 1994). A deposição de fibras inicia-se nas regiões em torno da veia centrolobular, avança para os espaços de Disse e acaba chegando à região portal (Pereira, 2006). Durante 63 MARCON, L. D. Discussão este processo há degradação das fibras do tipo III e reposição da matriz por fibras do tipo I, formadoras de cicatrizes (Viebahn & Yeoh, 2008). No presente trabalho, as análises de deposição de fibras colágenas revelaram uma conjuntivização hepática nos animais infectados com L. chagasi não tratados e tratados com lipossoma vazio, observado mesmo em um curto período de infecção (cinco semanas). Nesse sentido, verificou-se uma redução das fibras colágenas do tipo III e um aumento das fibras do tipo I nos animais infectados com L. chagasi não tratados e tratados com lipossoma vazio quando comparado aos animais não infectados. Adicionalmente, a deposição das fibras foi observada de forma mais acentuada em torno das veias centrolobulares e dos espaços portais nestes animais, o que se justifica pelo acúmulo de células inflamatórias predominantemente células de Kupffer na região, as quais alteram a composição da matriz extracelular nos espaços portais pela produção de citocinas inflamatórias tais como TGF- e PDGF, consideradas potentes estímulos pró-fibrogênicos e proliferativos para fibroblastos e células estreladas (Tsukamoto,1999). Estes dados corroboram com os achados de Melo et al. (2008), os quais avaliaram o padrão de deposição de fibras colágenas em cães naturalmente infectados por L. chagasi. Estes autores verificaram que animais infectados apresentaram maiores proporções de fibras colágenas do tipo I em relação ao colágeno reticular (tipo III). Apesar disso, os dados do presente trabalho não corroboram com os achados de Leite e Croft (1996), os quais ao avaliarem um modelo murino de infecção por L. donovani não verificaram mudanças na distribuição dos componentes da MEC nos espaços de Disse, bem como não observaram fibrose sistêmica nos lóbulos hepáticos. Estes autores inferiram que camundongos BALB/c parecem não ser um modelo apropriado para estudar o papel da MEC durante a LV crônica. Contudo, nos animais tratados com AM lipossomal pela via intraperitoneal a deposição de colágeno tipo III foi menor e a do tipo I foi semelhante aos animais não infectados. Já nos animais tratados pela via endovenosa não houve diferença na deposição das fibras do tipo III, mas houve um aumento das fibras do tipo I em relação aos animais não infectados. Pode-se dizer que o medicamento administrado pela via intraperitoneal apresentou melhor eficácia, pois foi capaz de interferir indiretamente no padrão da deposição das fibras por meio da redução da carga parasitária, reduzindo a inflamação e consequentemente diminuindo os estímulos para a deposição de colágeno no fígado. Além 64 MARCON, L. D. Discussão disso, a manutenção da densidade das fibras do tipo I a níveis semelhantes ao controle representa uma vantagem desta via, já que maiores densidades de fibra do tipo I refletem um perfil fibrogênico, o que pode culminar em hipertensão portal e insuficiência hepática. A administração de fármacos pela via intraperitoneal pode ser vantajosa como via alternativa para terapia com drogas convencionais, principalmente quando os tecidos alvos se localizam em cavidades peritoneais ou adjacentes (Chaudhary et al., 2010). Dessa maneira, em vista dos benefícios encontrados na primeira etapa deste estudo e da acessibilidade da via intraperitoneal, optou-se pela utilização dessa via para administração do AM encapsulado em lipossomas nos animais desnutridos e infectados com L. chagasi. O modelo de desnutrição protéico calórica, infecção e tratamento da LV, avaliado na segunda etapa deste trabalho, possibilitou estabelecer uma correlação entre o estado nutricional e os mecanismos de recuperação da infecção desenvolvidos pelo hospedeiro. Neste estudo, o estabelecimento da desnutrição nos animais alimentados com a dieta hipoprotéica foi monitorado por meio da avaliação do peso corporal, método também utilizado nos estudos de Malafaia et al. (2009), Serafim et al. (2010) e Coelho (2011). Nos animais alimentados com a dieta hipoprotéica (4,5% de caseína) foi observada uma significativa redução do peso corporal em relação aos animais alimentados com dieta controle (14% de caseína). Vários trabalhos mostram que a redução do peso corporal em animais submetidos à dieta hipoprotéica é um usual indicador da DPC (Abreu et al., 2006; Xavier et al., 2007; Borelli et al., 2007). Sabe-se que o consumo de uma dieta hipoprotéica por animais experimentais causa redução da sua ingesta (Vituri et al, 2008) e consequentemente a depleção dos estoques protéicos do organismo, o que resulta na perda de massa corporal magra (musculo esquelético) bem como na redução do peso corporal total (Ihemelandu, 1985; Alves et al., 2008). Nossos resultados revelaram que além da perda de peso corporal, houve uma significativa redução do peso úmido do fígado e do baço nos animais alimentados com a dieta hipoprotéica. Estes dados foram semelhantes aos achados de Serafim et al. (2010) e Coelho (2011) onde animais submetidos a uma dieta hipoprotéica apresentaram redução do peso destes mesmos órgãos. Sendo a DPC umas das mais frequentes causas de imunodeficiência (Schaible & Kaufmann, 2007), prejuízos na resposta imune mediada por células estão fortemente associados, envolvendo, por exemplo, a atividade fagocitária, o número e atividade das células T, os mecanismos de eliminação de patógenos intracelulares, entre outros. 65 MARCON, L. D. Discussão (Chandra, 1992; Chandra, 1997). Além disso, vários estudos já demonstraram que a DPC é considerada um fator de risco para a leishmaniose visceral, aumentando a visceralização do parasito, bem como a morbimortalidade associada ao quadro patológico (Desjeux, 2001; Anstead et al., 2001; Malafaia, 2009; Malafaia et al., 2009; Serafim et al., 2010). Diante disso, avaliou-se a capacidade de camundongos BALB/c desnutridos responderem ao tratamento com AM encapsulado em lipossomas, frente à impossibilidade de uma adequada montagem da resposta imune ao parasito. Observou-se que o tratamento com AM lipossomal nos animais desnutridos foi capaz de reduzir significativamente a carga parasitária no fígado e no baço quando comparado aos animais desnutridos tratados com lipossoma vazio. Essa redução da carga parasitária foi semelhante à observada nos animais controle submetidos ao mesmo tratamento. Adicionalmente, animais desnutridos tratados com lipossoma vazio apresentaram maior carga parasitária no fígado e no baço quando comparado aos animais controle tratados com lipossoma vazio, revelando o impacto da desnutrição no aumento da carga parasitária destes órgãos. Serafim et al. (2010) e Coelho (2011) também verificaram um aumento da carga parasitária nestes mesmos órgãos em animais desnutridos quando comparado aos animais controle. Também, Anstead et al. (2001) observaram uma maior taxa de visceralização da Leishmania no fígado e no baço de animais alimentados com dieta hipoprotéica quando comparado aos animais alimentados com dieta controle. Neste trabalho, o estado nutricional do hospedeiro não interferiu na resposta ao tratamento com AM encapsulado em lipossomas, já que não houve diferença entre desnutridos e controle com relação à sua eficácia em reduzir a carga parasitária. Contudo, os animais deste experimento foram avaliados somente três semanas após o tratamento e como alguns deles ainda apresentaram parasitos é possível que depois de cessado o efeito do tratamento, haja uma reagudização da doença naqueles alimentados com a dieta hipoprotéica, visto que a desnutrição prejudica a montagem de uma resposta imune competente ao parasito. A histopatologia do fígado dos camundongos controle e desnutridos foi avaliada para caracterização dos parâmetros relacionados à ativação da resposta inflamatória, com ênfase no principal mecanismo de resistência à infecção pela Leishmania: a formação de granulomas. Prejuízos na montagem de uma resposta de hipersensibilidade tardia, no número de células T, especialmente T auxiliar, concentração e atividade de proteínas do complemento 66 MARCON, L. D. Discussão e falhas na fagocitose podem ocorrer devido a DPC (Chandra,1992). Como visto, estes componentes são fundamentais para a formação de granulomas hepáticos (Stern et al., 1988; Cervia et al., 1993; Murray, 1999; Murray & Nathan 1999). De maneira geral, todos os grupos desnutridos apresentaram reduzida formação de granulomas. Observou-se que animais desnutridos infectados não tratados ou tratados com lipossoma vazio apresentaram significativa redução do número e da área dos granulomas em relação aos grupos controle. Estes dados revelam a interferência direta do estado nutricional na capacidade do hospedeiro em montar uma resposta de resistência à Leishmania, particularmente na sua capacidade em formar granulomas. Os animais desnutridos tratados com AM livre ou AM encapsulado em lipossomas não apresentaram alteração do número e área dos granulomas quando comparado aos desnutridos infectados não tratados. Contudo, provavelmente a redução do número de granulomas hepáticos no grupo tratado com AM encapsulado se deve a ação direta do fármaco sobre o parasito, uma vez que houve significativa redução da carga parasitária hepática nestes animais que ocorreu de forma similar ao grupo controle submetido ao mesmo tratamento. Outra lesão marcante encontrada nos animais desnutridos foi a degeneração hidrópica dos hepatócitos centro e intralobulares, achados estes que corroboram com os de Coelho (2011) que verificou este mesmo padrão histopatológico em camundongos BALB/c submetidos à dieta hipoprotéica. A degeneração hidrópica é uma lesão celular reversível provocada por transtornos no equilíbrio hidroeletrolítico que resultam no acúmulo de eletrólitos e água nas células. O mecanismo de transporte de eletrólitos das células depende do funcionamento das bombas eletrolíticas, capazes de transportar eletrólitos contra o seu gradiente de concentração. Algumas destas bombas necessitam de ATP para funcionarem, dessa forma se há alteração na produção ou consumo de ATP no organismo; modificações na integridade das membranas ou modificação das moléculas que compõem as bombas haverá prejuízos no transporte de eletrólitos das células. Esses danos acarretam a retenção de sódio, redução de potássio e aumento da pressão osmótica intracelular causando influxo de água no citoplasma e expansão isosmótica da célula (Pereira, 2006). Durante a DPC há diminuição do fornecimento de substratos energéticos para o organismo causando redução da disponibilidade de ATP e consequentemente alterando o funcionamento das bombas 67 MARCON, L. D. Discussão eletrolíticas (Waitzberg et al., 2004). Dessa forma, a DPC contribui fortemente para o desenvolvimento da degeneração hidrópica hepática. Além disso, trabalhos mostraram que a própria infecção por Leishmania também favorece a ocorrência de degeneração hidrópica em células hepáticas (El Hag et al., 1994; Melo et al., 2008), pela redução do aporte de ATP decorrente do processo inflamatório e pela atividade fagocitária das células recrutadas. Nossos resultados corroboram com os achados descritos pelos autores acima, já que os animais controle infectados não tratados apresentaram moderado grau de degeneração hidrópica em relação ao alto grau observado nos animais desnutridos. Sabe‐se que a síntese de proteínas hepáticas é dependente da disponibilidade de aminoácidos livres. Dessa forma, indivíduos desnutridos terão uma substancial redução no fornecimento de aminoácidos prejudicando a capacidade de síntese de proteínas hepáticas (Logan & Hildebrandt, 2003). Assim, a DPC também pode comprometer o equilíbrio entre a deposição e a degradação do colágeno. Neste trabalho, a avaliação do colágeno tecidual hepático mostrou que, de uma forma geral, animais desnutridos apresentaram significativa redução da densidade das fibras colágenas do tipo III e do tipo I, em relação aos animais controle. Este perfil de redução da densidade de fibras também ocorreu em todos os animais desnutridos infectados, tratados ou não, quando comparados aos animais desnutridos não infectados. Assim, pode-se inferir que além da desnutrição a infecção também participa dos mecanismos envolvidos na redução da produção de fibras colágenas nos animais desnutridos. Além disso, observou-se que, nos animais desnutridos não infectados os percentuais de fibra do tipo I foram maiores (>55%) em relação aos de fibras do tipo III (<45%) quando comparado aos percentuais dos animais controles (tipo I <39%; tipo III>61%). Adicionalmente, animais desnutridos e controle infectados apresentaram semelhantes proporções de fibras, com predomínio do colágeno tipo I (~60%) em detrimento ao colágeno tipo III (~40%). A deposição anormal de colágeno e de outros componentes da matriz extracelular pode ocorrer em doenças fibrosantes (Pereira, 2006), como é o caso da leishmaniose visceral. O estresse oxidativo, consequência do quadro debilitante provocado pela desnutrição, também participa do processo de conjuntivização, pois favorece a permeabilidade mitocondrial que pode promover a necrose e/ou a apoptose dos hepatócitos 68 MARCON, L. D. Discussão (Mormone et al., 2011). Concomitantemente, as espécies reativas de oxigênio (EROs) geradas também pode atuar diretamente sobre o comportamento das células estreladas hepáticas (HSC) e dos miofibroblastos (Nieto, 2006), regulando positivamente a expressão de genes criticamente associados à deposição de fibras colágenas como COL1A1, COL1A2, MCP-1 e TIMP-1 (Bataller & Brenner, 2005). O padrão de deposição das fibras colágenas nos animais controle tratados com AM encapsulado em lipossomas foi semelhante ao padrão encontrado nos animais controle não infectados. Contudo, animais desnutridos submetidos ao mesmo tratamento não foram capazes de manter o padrão das fibras semelhante aos desnutridos não infectados, tampouco aos controles não infectados. Esses achados revelam o comprometimento do balanço degradação/renovação das fibras colágenas provocado pela DPC. 69 Conclusões MARCON, L. D. Conclusões 6. Conclusões A partir da observação dos dados da primeira etapa deste estudo, pôde-se constatar a eficácia do AM lipossomal como agente leishmanicida. De maneira indireta, este medicamento contribuiu para a redução dos impactos causados pelo processo inflamatório, favorecendo a restauração do padrão de histológico hepático normal, apresentando melhor eficácia quando administrado pela via intraperitoneal. Por sua vez, os dados da segunda etapa revelaram a influência direta da desnutrição protéico calórica na resposta imune à L. chagasi, observada principalmente pela interferência na montagem da resposta imune celular, reduzindo a formação de granulomas, e consequentemente dificultando a eliminação dos parasitos. Contudo, o tratamento dos animais desnutridos com AM encapsulado em lipossomas conseguiu manter a eficácia leishmanicida como a observada nos animais controle. As lesões histopatológicas encontradas nos animais desnutridos como a degeneração hidrópica e as maiores proporções de deposição de colágeno do tipo I, refletem os danos na capacidade do organismo não só em garantir a sua defesa contra agentes externos como também em manter a sua integridade tecidual. 71 Referências Bibliográficas Referências Bibliográficas MARCON, L. D. 7. Referências bibliográficas Abreu, M. A. M. M., Weckx, L. L. M., Hirata, C. H. W. (2006). Histological and ultrastructural aspects of the tongue in undernourished rats. Rev. Bras. Otorrinolaringol. 72, 523‐7. Ashford R. W. (2000). The leishmaniasis as emerging and reemerging zoonoses. Int. J. Parasitol. 30, 1269-1281. Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., & Suárez A. I. T. (2002). Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers-liposomes and microspheres on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release 79, 29-40. Alexander, J. & Russell, D. G. (1992). 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