Adila Liliane Barros Dias

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS DA HEPATITE B (VHB) EM
PORTADORES DE ÁREA ENDÊMICA NA AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA
ÁDILA LILIANE BARROS DIAS
MANAUS
2009
i
ÁDILA LILIANE BARROS DIAS
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS DA HEPATITE B (VHB) EM
PORTADORES DE ÁREA ENDÊMICA NA AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Medicina Tropical da
Universidade do Estado do Amazonas em
Convênio com a Fundação de Medicina
Tropical do Amazonas, para obtenção do grau
de Mestre em Doenças Tropicais e
Infecciosas.
Orientador: Prof. Dr Wornei Silva Miranda Braga
Co-Orientadora: Profa. Dra. Cintia Mara Costa de Oliveira
MANAUS
2009
FICHA CATALOGRÁFICA
Dias, Ádila Liliane Barros Dias
Caracterização molecular do vírus da Hepatite B (VHB) em portadores de área
endêmica na Amazônia Ocidental Brasileira. Ádila Liliane Barros Dias. Manaus, 2009.
ix, 53f.
Dissertação de Mestrado – Universidade do Estado do Amazonas. Fundação de
Medicina Tropical.
Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical.
Título em inglês: Characterization of the hepatitis B Virus in patients from an
endemic area of the West Brazilian Amazon.
1. VHB. 2. Genótipos. 3. Epidemiologia. 4. Amazônia. 5. Brasil.
ii
FOLHA DE JULGAMENTO
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VHB EM AMOSTRAS DE
PORTADORES DO MUNICÍPIO DE LÁBREA
ÁDILA LILIANE BARROS DIAS
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre
em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do
Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical
do Amazonas”.
Banca Julgadora:
_______________________________
Prof. Wornei Silva Miranda Braga, Dr
Presidente
________________________________
Profª. Maria Paula Gomes Mourão, Dra
Membro
_____________________________
Prof. Cristóvão Alves da Costa, Dr
Membro
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me dado forças para conseguir chegar até o final.
Ao meu esposo, Vanderson Sampaio, pelo apoio incondicional, pela
compreensão e pelo companheirismo. Ao meu filho, Gabriel Sampaio, que mesmo
pequeno e sem ter conhecimento me motivou e me vivificou com cada sorriso.
Aos meus pais, Lacy Dias e José Antônio Dias que puderam me proporcionar
uma base educacional, necessária para ter chegado aqui.
As minhas irmãs, Luanna Dias e Letícia Dias, pelo incentivo mesmo a
distância.
Ao meu orientador, Dr. Wornei Braga, pela oportunidade e confiança dada a
minha pessoa me proporcionando a chance de poder realizar este trabalho.
A Márcia Castilho e a Dra. Cintia Mara, por terem me ensinado e me ajudado
com as técnicas de Biologia Molecular, pela amizade e pelo apoio.
Ao Dr. Henrique que me auxiliou nos momentos de dúvidas e desesperos.
Aos colegas de laboratório pela ajuda, amizade e pelos momentos de
descontração.
Aos meus amigos de mestrado, em especial, Belisa Magalhães, Gisely
Cardoso, Laylah Magalhães, Suzane Prestes e Marly Marques, pela amizade,
carinho, companheirismo e pelo apoio.
Aos professores e a equipe da coordenação do Curso de Mestrado em
Doenças Tropicais e Infecciosas, da Universidade do Estado do Amazonas e
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, uma pós-graduação que a cada ano
vem se aprimorando.
As instituições de fomento, CNPq e FAPEAM, as quais proporcionaram a
realização deste trabalho.
iv
RESUMO
A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) é um importante problema de saúde
pública no mundo. O VHB é classificado em oito genótipos diferentes, A-H, com
distinta distribuição geográfica. No Brasil os genótipos mais freqüentes são o A, D e
F. Objetivo deste estudo foi caracterizar os genótipos do VHB em região endêmica
de infecção pelos vírus das hepatites B e Delta na Amazônia Ocidental Brasileira.
Foram analisadas 86 amostras soro reativas para o HBsAg de indivíduos indígenas
e não-indígenas, obtidas de inquéritos sorológicos realizados no município de
Lábrea, Estado do Amazonas. Das 86 amostras soro reativas 39 foram VHB-DNA
positivas pela semi-“nested” PCR. Os genótipos foram estabelecidos pelo
seqüenciamento da região do gene S amplificado. Foram obtidas 20 seqüências,
classificada em três genótipos A, D e F. Sendo o genótipo A o mais freqüente (60%),
seguido do D (35%) e F(5%). O perfil de distribuição dos genótipos encontrados
reflete o padrão de ocupação histórica da região.
Palavra-chave: VHB, genótipos, epidemiologia, Amazônia, Brasil.
v
ABSTRACT
Hepatitis B virus (HBV) infection is an important public health problem in the
world. HBV is classified into eight genotypes, varying from A to H, with distinct
geographical distribution. In Brazil, the most frequent genotypes are A, D and F. The
purpose of this study, was to characterize the genotypes of HBV in a hepatitis B and
Delta endemic area in the Western Brazilian Amazon. We analyzed 86 serum
samples reactive for HBsAg of indigenous and non-indigenous, obtained from
serological surveys conducted in the Lábrea municipality, Western State of
Amazonas. From the 86 reactive serum samples, 39 were HBV-DNA positive by
semi-nested PCR. Genotypes were established by sequencing the S gene region
amplified. We obtained 20 sequences, classified into three genotypes A, D and F.
The genotype A was the most frequent (60%), followed by D (35%) and F (5%). The
distribution profile of the genotypes found reflect the pattern of historical occupation
of the region.
Keyword: HBV genotypes, epidemiology, Amazon, Brazil.
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Prevalência da VHB no mundo......................................................... 2
Figura 2: Mapa mostrando a distribuição da hepatite B no Brasil.................... 2
Figura 3: Partículas virais do VHB...................................................................
5
Figura 4: Desenho esquemático do genoma do VHB...................................... 6
Figura 5: Esquema da replicação do vírus da hepatite nos hepatócitos......... 9
Figura 6: Esquema da replicação do vírus da hepatite nos hepatócitos......... 10
Figura 7: Figura 5: Mapa do município de Lábrea...........................................
13
Figura 1: Mapa da área de estudo...................................................................
23
Figura 2: Árvore filogenética............................................................................
26
vii
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA
µl – Micro litros
AgAu – Antígeno Austrália
AgHBe – Antígeno e
AgHBs - Antígeno de superfície da hepatite B
Anti- HAV – Anticorpos totais contra vírus da hepatite A
Anti- HD – Anticorpos totais contra vírus da hepatite D
Anti-HBc – Anticorpo contra antígeno do core do vírus
Anti-HBe – Anticorpo contra antígeno e
Anti-HBs – Anticorpo contra o antígeno de superfície da hepatite B
Anti-HCV – Anticorpo contra o vírus da hepatite C
cccDNA – Ácido desoxirribonucléico circular covalente fechado
DNA - Ácido desoxirribonucléico
dNTP – Desoxirribonucléico Trifosfato
ELISA – Enzyme Linked Immunosorbente Assay
FMTAM – Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
HBx – Proteína X
IgG – Imuniglobulina G
IgM – Imuniglobulina M
mM – Mil imolar
Nm - Nanômetro
Nt - Nucleotídeos
ºC – Graus Celsius
OMS - Organização mundial de saúde
pb – Pares de base
PCR – Reação em cadeia de polimerase
Pmol – pico moles
Primer F – Iniciador senso
Primer R – Iniciador anti-senso
RNA – Ácido ribonucléico
Rpm – Rotações por minuto
TBE – Tampão Tris HCL, EDTA, e ácido bórico
UI/μl – unidade internacional por micro litros
UV – Raios ultra violeta
VHB - Vírus da hepatite B
VHC – Vírus da hepatite C
VHD – Vírus da hepatite Delta
viii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................
1
1.1 Considerações gerais..........................................................................................
1.2 Hepatite B na Amazonia .....................................................................................
1.3 Vírus da Hepatite B (VHB)...................................................................................
1.3.1 Replicação do VHB...........................................................................................
1.3.2 Marcadores sorológicos...................................................................................
1.3.3 Subtipos do VHB...............................................................................................
1.3.4 Genótipos do VHB............................................................................................
1
3
4
7
7
8
9
2 OBJETIVO..............................................................................................................
12
2.1 Objetivo Geral......................................................................................................
2.2 Objetivo Especifico..............................................................................................
12
12
3 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................
13
3.1 Modelo de estudo................................................................................................
3.2 Local de estudo....................................................................................................
3.4 Amostras..............................................................................................................
3.5 Extração de DNA.................................................................................................
3.6 Amplificação do gene S por PCR........................................................................
3.7 Eletroforese dos produtos de PCR......................................................................
3.8 Purificação dos produtos de PCR........................................................................
3.8.1 Determinação do genótipo VHB.......................................................................
3.8.1.1 Reação de seqüenciamento..........................................................................
3.8.2 Analise dos questionários.................................................................................
3.8.3 Análise prévia das seqüências.........................................................................
3.8.4 Edição e alinhamento das amostras................................................................
3.8.5 Análise filogenética..........................................................................................
13
13
14
15
15
16
17
17
17
18
19
19
19
4 RESULTADOS.......................................................................................................
20
5 CONCLUSÃO.........................................................................................................
33
6 REFERÊNCIA BIBLIOGRAFICA...........................................................................
34
7 ANEXO...................................................................................................................
38
7.1 Certificado de Aprovação no Comitê de Ética e Pesquisa..................................
7.1.1 Hepatites virais no município de Lábrea: O impacto na saúde pública............
7.1.2 Febre Negra de Lábrea: O papel das populações indígenas na
epidemiologia da hepatite B e Delta..........................................................................
7.2 Termo de consentimento livre esclarecido..........................................................
7.3 Questionários......................................................................................................
7.3.1 Questionário de investigação epidemiológica de doença icterohemorrágica
em populações indígenas........................................................................................
38
38
39
40
41
41
ix
7.3.2 Questionário do projeto “Hepatites virais no município de Lábrea: “O impacto
na Saúde Pública”........................................................................................
43
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Considerações gerais
A hepatite viral aguda é uma doença antiga, porém acredita-se que o primeiro
surto de hepatite B tenha ocorrido a cerca de 100 anos, na Alemanha (Cruz et
al.,2000). É definida como uma infecção hepática causada por um grupo de vírus
hepatotrópicos que são denominados A, B, C, D e E (Cruz et al., 2000; Acosta,
2000).
A hepatite B representa uma das infecções mais presentes no mundo,
considerando que muitos indivíduos infectados são assintomáticos e que as
infecções sintomáticas são insuficientemente notificadas, a freqüência da hepatite B
é, certamente, ainda subestimada. Dados epidemiológicos da Organização Mundial
de Saúde (OMS) demonstram que cerca de dois bilhões de pessoas possuem
evidências sorológicas de infecção pelo vírus da hepatite B (VHB), apesar de já
existir uma vacina eficaz há cerca de vinte anos. Destes, cerca de 350 milhões são
portadores crônicos, que apresentam grande risco de morte por cirrose ou
hepatocarcinoma e constituem um reservatório de indivíduos infectados (Sharma et
al., 2005) por serem portadores do vírus em replicação (Ganem & Prince, 2004).
No mundo, o índice de prevalência de infecção pelo VHB divide as áreas
geográficas em três categorias distintas: alta endemicidade (> 8%); média
endemicidade (2 – 8%) e baixa endemicidade (< 2%) (Figura 1). Nas áreas que
correspondem à região de alta endemicidade o índice de portadores do VHB alcança
5% a 20%, e na maioria dessas áreas a aquisição da infecção ocorre, sobretudo na
fase precoce da vida, muitas vezes por transmissão vertical. Nas áreas de média
endemicidade o índice de portadores varia de 1% – 5% e nas áreas de baixa
endemicidade encontra-se abaixo de 0,1%. Nessas áreas a transmissão sexual
assume uma importância significativa (Silva, 2004).
No Brasil, o Ministério da Saúde estima que pelo menos 15% da população já
foi contaminada com VHB, sendo que os casos crônicos correspondem a cerca de
1% da população brasileira (Ministerio da Saude 2002). Alguns estudos do final da
2
década de 80 e início de 90 sugeriram uma tendência crescente do VHB em direção
à região Norte. Assim, considerava-se que ocorriam três padrões de distribuição da
hepatite B: alta endemicidade, com prevalência superior a 7%, presente na região
Amazônica, alguns locais do Espírito Santo e oeste de Santa Catarina;
endemicidade intermediária, com prevalência entre 2 e 7%, nas regiões Nordeste,
Centro-Oeste e Sudeste e baixa endemicidade, com prevalência abaixo de 2% na
região Sul do país (Ministério da Saúde, 2007; Souto et al., 1999) (Figura 2).
Figura 1: Prevalência do vírus da hepatite B no mundo. Fonte:
http://www.cdc.gov/search. do?q=hepatitis+b
Figura 2: Mapa mostrando a distribuição da hepatite B no Brasil (Souto et al.,
1999)
3
De modo geral, a taxa de letalidade dos pacientes hospitalizados é de 0,8 a
2%, podendo aumentar nos indivíduos com mais de 40 anos de idade e ser maior
nos casos associados ao vírus da hepatite D. No Brasil, a taxa de mortalidade por
hepatite B é de 0,6 por 100 000 habitantes (Dutra e Haas, 1999).
O VHB é o mais versátil dos vírus hepatotrópicos e pode causar:
hepatite aguda; hepatite crônica; cirrose hepática; hepatite fulminante com necrose
hepática e portadores assintomáticos. E ainda desempenha um papel importante no
desenvolvimento do carcinoma hepatocelular (Acosta, 2000). O risco de desenvolver
doença aguda ictérica aumenta com a idade do paciente, inversamente à
possibilidade de cronificação. Quando os recém-nascidos entram em contato com os
vírus B há 90% de chance de se tornarem cronicamente infectados; quando a
infecção ocorre aos cinco anos, a possibilidade cai para 30-50%, sendo a taxa
reduzida para 5-10% se a infecção ocorre em adultos (Gust e Crowe, 1986 ;CDC,
1991).
1.2 Hepatite B na Amazônia
A prevalência do VHB no Brasil varia principalmente de acordo com as
características demográficas e sócio-econômicas da população, sendo a região
Norte a que apresenta maior endemicidade. A Amazônia Ocidental brasileira é
considera uma região de alta prevalência para o VHB. Nessa região, os grupos de
risco para VHB serão definidos, fundamentalmente, pelo comportamento individual e
social: profissionais da área da saúde, homossexuais masculinos, usuários de
drogas intravenosas, prostitutas, pacientes em hemodiálise. Uma grande parte da
população é infectada ainda nos primeiros meses de vida ou durante a infância
(Ferreira e Silveira, 2004).
Estudo realizado no Brasil mostrou que 21,4% da população de uma
comunidade do Amazonas possui anticorpos anti-HBc, mostrando uma alta taxa de
prevalência do VHB nesta região (Clements et al., 2000). Braga e colaboradores
(2005) em estudo de soroprevelência da infeccção pelo VHB e pelo plasmódio em
Lábrea mostraram que 49,9% da população em estudo apresentou contado com
4
VHB (anti- HBc total isolado) e Aquino et. al., (2008) identificaram em seu estudo, no
Estado do Pará, uma prevalência de 37,7% para anti-HBc na amostra estudada .
Algumas comunidades indígenas do estado do Amazonas também apresentam
alta prevalência dos marcadores sorológicos do VHB, sendo que essa prevalência
geralmente varia de acordo com fatores que incluem condições econômicas e o
isolamento geográfico do grupo (Bensabath et al., 1987). Braga et.al.,(2001)
estudando o VHB em grupos indígenas encontraram um taxa de prevalência de
infecção passada, indivíduos anti-HBc total reativo, de 54,5%, variando entre os
grupos e aldeias visitadas, de 19,7% entre os Jamamadi a 78,6% entre os Kanamari.
A taxa de portadores do AgHBs encontrada (9,7%) confirma o caráter endêmico da
infecção pelo VHB na população estudada.
Um estudo realizado na Amazônia ocidental brasileira revelou uma significativa
correlação entre anti-HBc e o nível de atividade sexual (de Paula, 2001). Em outro
estudo, o uso medicação injetável foi identificado como o principal fator de exposição
prévia ao VHB (Cabezas et al., 1994). Contudo os principais mecanismos de
propagação da hepatite B na Amazônia ainda não foram totalmente identificados e
podem envolver fatores que são altamente específicos para a região (Leon et al.,
1999).
1.3 Vírus da Hepatite B (VHB)
A pedra fundamental para a história da hepatite B foi a descoberta acidental do
antígeno Austrália (AgAu) por Blumerg e colaboradores em 1965. A partir deste
achado novos estudos foram realizados a fim de elucidar tal partícula. No inicio
acreditava-se que AgAu tinha uma relação com a leucemia, mas em 1967, Blumerg
e colaboradores, sugeriram pela primeira vez que a alta freqüência do AgAu no soro
de pacientes com hepatite aguda poderia estar relacionada com um suposto “vírus”
introduzido entre humanos por transfusões de sangue (Fonseca, 2006).
O VHB é um vírus resistente, capaz de suportar extremos de temperatura e
umidade (Chisari, 2000) sobrevive até uma semana fora do corpo humano, no
plasma, a vida média do VHB varia de um a três dias, enquanto nos hepatócitos a
5
vida média varia de 10 a 100 dias (Fonseca, 2007). O sangue e os líquidos corporais
são os principais veículos de transmissão, podendo transmitir o vírus por transfusão
de sangue e hemoderivados, transplantes de órgãos e hemodiálise. O vírus também
pode ser disseminado pelo contato com secreções do corpo, como sêmen, saliva,
suor, lágrima e leite de mama (CDC, 2007).
O VHB pertence à família Hepadnaviridae, uma família de vírus de DNA que
causa hepatite em múltiplas espécies de animais, e ao gênero Orthohepadnavirus.
Os hepadnavirus infectam preferencialmente os hepatócitos. O VHB completo,
também chamado de partícula de Dane, é formado por uma partícula de DNA, é
envelopado e com 42 nm de diâmetro (Figura 3) (Moreno et al., 2004; Pinho, 1995).
Além da partícula Dane, existem dois outros tipos de partículas virais não
infecciosas, que podem ser encontradas na circulação. Umas esféricas de pequeno
diâmetro (20 nm) e outras de forma tubulares (22 nm de largura e 150 nm de
comprimento), ambas constituídas exclusivamente pelo antígeno de superfície
(Figura 3) (Carneiro de Moura, 1997).
Figura 3: Partículas virais do VHB. Fonte:http://pathmicro.med.sc.edu/virol/hepatitisvirus.htm
6
O genoma do VHB é uma cadeia circular incompleta de DNA de dupla hélice,
que possui 3.200 nucleotídeos (Figura 4). Apresenta quatro regiões abertas para
leitura: S, C, P e X. O gene S, incluindo a região pré-S1, pré-S2 e a região S,
codifica proteínas do antígeno de superfície encontradas no envelope viral. O Gene
C, constituído pela região pré-C, é responsável por codificar os polipeptídios que
constituem o nucleocapsídeo viral, antígeno core da hepatite B (AgHBc) e o
antígeno e (AgHBe). O Gene P codifica a polimerase viral e o gene X codifica a
proteína X (HBx), que é um potente ativador de transcrição (Moreno et al., 2004;
Silva, 2004).
A proteína X é imprescindível para replicação e disseminação in vivo do VHB,
ela atua como um transativador transcricional dos genes virais e uma variedade de
genes do hospedeiro. A modulação pela HBx de transcrição gênica afeta a
replicação viral e a função dos pontos de verificação do ciclo celular do hepatócito. A
HBx está relacionada com a patogenia do hepatocarcinoma em pacientes infectados
com VHB (Chisari, 2000).
Figura 4: Desenho esquemático do genoma do VHB. (Beck & Nassal, 2007)
7
1.3.1 Replicação do VHB
Embora não se conheça com exatidão os mecanismos deste processo, a
replicação começa com a união do vírus a membrana do hepatócito através da
proteína Pré-S1. O Envelope da partícula viral se funde com a membrana celular e é
liberado no citoplasma o nucleocapsídeo (core), que se dirige ao núcleo (Figura 5).
Dentro do núcleo da célula se completa a síntese da cadeia positiva (incompleta) do
DNA viral, de tal forma que o genoma do VHB se converte em uma cadeia fechada
de DNA com ligações covalentes superespiraladas (cccDNA). Este cccDNA servi
como base para transcrição do RNA viral (Ganem et al, 2001).
O RNA viral (pré-genômico), por sua vez, constitui o molde para a síntese de
uma das cadeias da molécula de DNA (cadeia -) pela atividade enzimática da
transcriptase reversa (polimerase do vírus), a qual ao mesmo tempo em que copia o
RNA em DNA, o vai removendo através da atividade RNAse H que também possui.
A digestão do RNA não é completa e o oligoribonucleótido terminal, que inclui a
seqüência repetida DR1 é translocado e emparelhado com a região DH2 perto do
terminal 5’ da mesma cadeia negativa (-) onde atua como iniciador da síntese da
cadeia positiva (+). Quando parte (50 a 70%) desta cadeia está sintetizada,
presume-se que uma alteração alostérica do complexo tenha lugar e que esta
determine a posição do invólucro do antígeno de superfície e a exportação da
partícula para o exterior da célula (Raney e Mclachlan,1991).
Posteriormente, as progênies virais adquirem o envoltório, a partir das
membranas intracelulares (retículo endoplasmático e o complexo de Golgi), quando
então os virions podem retornar ao núcleo celular para continuar o processo de
replicação genômica ou podem ser secretados (Huovila et al., 1992).
1.3.2 Marcadores sorológicos
Na investigação da hepatite B podem ser utilizados os seguintes marcadores :
8
•
O HBsAg aparece antes do início dos sintomas. Chega ao máximo
durante doença franca e a seguir declina para níveis indetectáveis em 3
a 6 meses;
•
O HBeAg, VHB-DNA e DNA polimerase aparecem no soro logo depois
do HBsAg, e todos significam replicação viral ativa;
•
A IgM anti-HBc torna-se detectável no soro um pouco antes do início dos
sintomas, concomitante ao início da elevação das aminotransferases
séricas. Ao correr dos meses, o anticorpo IgM é substituído por IgG antiHBc;
•
O anti-HBe é detectável logo depois do desaparecimento do HBeAg,
significando que a infecção aguda chegou ao máximo e a doença está
regredindo;
•
A IgG anti-HBs não se eleva até que a doença aguda tenha acabado e
em geral não é detectável durante algumas semanas a vários meses
depois do desaparecimento de HBsAg. O anti-HBS pode persistir por
toda vida, conferindo proteção (Veronesi, 2005).
1.3.3 Subtipos do VHB
Através de análises sorológicas, as cepas de VHB foram divididas em nove
subtipos baseados nos antígenos de superfície apresentados, (HBsAg) designados
da seguinte forma: ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4q-, adrq+ e adrq(Bancroft, 1972; Okamoto et al., 1988). As variações d/y e w/r, que garantem a
variabilidade entre os subtipos, apresentam sua base molecular em substituições do
tipo Lys/Arg nos resíduos 122 e 160 no gene S, respectivamente (Okamoto, 1987).
Atualmente, a classificação em subtipos tem caído em desuso, sendo utilizada a
classificação em genótipos (Kidd-Ljunggren, 2002).
9
Figura 5: Esquema da replicação do VHB nos hepatócitos.
https://www1.qiagen.com/Geneglobe/PathwayView.aspx? pathwayID=217
Fonte:
1.3.4 Genótipos do VHB
Tomando-se como base diferenças genéticas, o VHB foi classificado em oito
genótipos distintos que variam de A a H. Uma análise do genoma completo de um
grupo em relação a outro demonstra diferenças de até 8%. É notável ainda que os
oito grupos de genótipos demonstram um padrão de dispersão geográfica ao redor
do mundo (Norder et al, 1993 e 1994). O genótipo A encontra-se disperso pelo
mundo, sendo o predominante na Europa, América do Norte, África e Índia. Os
genótipos B e C predominam no Leste e Sudeste da Ásia e Austrália. O genótipo D é
principalmente encontrado no Oriente Médio e países do Mediterrâneo. O genótipo E
parece ser predominante no oeste africano, enquanto o genótipo G foi caracterizado
nos Estados Unidos, México e França e os genótipos F e H são encontrados
exclusivamente nas Américas Central e do Sul (Campos et al, 2005 e Weber, 2006).
10
Alguns genótipos foram subdivididos em subclasses: sub-genótipos com
origens geográficas diferentes. O genótipo A, por exemplo, é subdividido em três
grupos: Sub-genótipos A1, A2 e A3, com origens em África/Ásia, Europa/América do
Norte e Camarões, respectivamente (Bowyer et al, 1997 e Kurbanov et al, 2005).
No Brasil, já foi relatada a existência de variabilidade de prevalência em
diferentes regiões. Na região amazônica brasileira, representada pela região norte e
parte da região nordeste, por exemplo, nota-se uma taxa de infecção endêmica,
contrastando com a baixa prevalência encontrada na região sul (Figura 6). Tal
distribuição é diferente da encontrada nos demais países da América Latina, com
maior prevalência dos genótipos A, D e F entre os portadores (Gaspar et al, 1987;
Souto, 1999; Mello et al., 2007).
Figura 6: Mapa da distribuição dos genótipos no Brasil (Mello et al., 2007).
Algumas alterações na estrutura genética dos genótipos do VHB podem
resultar em diferentes níveis de patogenicidade, sendo relacionadas com maior ou
11
menor risco de desenvolvimento de hepatocarcinoma ou cirrose no fígado. Além das
diferenças citadas, a heterogeneidade dos genótipos da hepatite B parece estar
relacionada com diferenças na evolução clínica da infecção e na resposta ao
tratamento antiviral (Roncato et al, 2008).
12
2 OBJETIVO
2.1 Geral
Seqüenciar e analisar o gene S do vírus da hepatite B (VHB) e identificar os
diferentes genótipos obtidos de indivíduos procedentes do município de Lábrea do
Estado do Amazonas.
2.2 Especifico
• Obter a seqüência parcial do gene S, que expressa o antígeno de
superfície, de diferentes amostras de indivíduos infectados pelo VHB;
• Caracterizar os genótipos do VHB obtidos;
• Identificar o genótipo predominante em indivíduos indígenas e não
indígenas;
13
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Modelo de estudo
Estudo descritivo com caracterização da biologia molecular do VHB em
indivíduos positivos para o antígeno HBsAg da região Amazônica Ocidental
Brasileira.
3.2 Local de estudo
O município de Lábrea (Figura 7) está localizado na região sudoeste do Estado
do Amazonas, no vale do Rio Purus é uma área hiper endêmica do VHB e VHD. É
uma região ainda quase que despovoada sendo sua densidade demográfica de 0,4
habitantes por quilômetro quadrado.
Figura 7: Mapa do Estado do Amazonas em destaque o município de Lábrea
Fonte: http://www.manausonline.com/ municípios_detalha. asp?id_mun=35)
3.3 Obtenção de amostras
O presente projeto está associado a dois projetos de maior amplitude
designados: “Hepatites virais no município de Lábrea: O impacto na saúde pública”,
(aprovado pelo comitê de ética da FMTAM – processo Nº 2957/2003-FMTAM)
(Anexo 6.4.1), que tem como objetivo geral, determinar a prevalência de marcadores
sorológicos de infecção presente e passada do vírus da hepatite B (VHB), vírus da
hepatite C (VHC), vírus da hepatite Delta (VHD) e vírus da hepatite A, na zona rural
do município de Lábrea (rio Purus), quatorze anos após a introdução da vacina
14
contra hepatite B na região; “Febre Negra de Lábrea: O papel das populações
indígenas na epidemiologia da hepatite B e Delta” (aprovado pelo comitê de ética da
FMTAM – processo Nº 2090/2005-FMTAM) (Anexo 6.4.2), que tem como objetivo
geral estudar a biologia molecular dos vírus das hepatites B e Delta, em populações
indígenas do município de Lábrea, Amazônia ocidental brasileira.
As pessoas, ao serem visitadas, foram convidadas a participar do estudo em
questão. Ao concordarem participar do estudo, foram lhes esclarecidos os objetivos
do trabalho, riscos associados ao estudo, benefícios e confidencialidade dos
registros. Em seguida o participante assinou o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (Anexo 6.2), e com ajuda do pesquisador responsável, foi preenchido
um questionário individual (Anexo 6.3).
De cada paciente foi colhido, à vácuo, dois frascos de sangue total com EDTA
(2 x 5 ml - Vacutainer BD / Becton Dickinson UK Ltda.) e posteriormente
centrifugados a 2.000 rpm. O plasma foi separado e as amostras foram identificadas
com o número de registro , e imediatamente armazenadas a temperatura de -20ºC.
O transporte para Manaus foi realizado por via aérea, em containeres
acondicionados em recipiente térmicos, mantidos a baixa temperatura.
3.4 Amostras
As amostras selecionadas para realização deste trabalho foram coletadas
durante a realização de inquéritos sorológicos realizado no município de Lábrea/AM
entre fevereiro 2006 e julho 2008.
Tais amostras foram submetidas testadas
marcadores sorológicos de infecção pelo VHB (HBsAg, anti-HBc total, anti- HBc IgM,
HBeAg, anti-HBe), anticorpos contra o vírus da hepatite A (anti-HAV total), da
hepatite C (anti-HCV), da hepatite Delta (anti-HD total). Tais experimentos foram
feitos
utilizando-se
testes
imunoenzimáticos
em
fase
sólida
(ELISA)
(BIOMÉRIEUX/ORGANO TÉCNICA DIASORIN PROCESSO AUTOMATIZADO
ETMAX 33), de acordo com o manual do fabricante. De 1500 amostras obtidas nos
inquéritos e submetidas à análise citada, 86, foram positivas para o marcador HBsAg
e são objeto de análise do presente estudo. Desta amostra (86), 31 pertencem a
indígenas e 55 a não indígenas.
15
3.5 Extração de DNA
Foram utilizadas algumas estratégias de extração, a fim de se obter o melhor
resultado da técnica. Primeiramente o DNA viral foi extraído a partir das amostras de
soro utilizando o Qiamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen Sciences, Maryland, USA), de
acordo com os procedimentos recomendados pelo fabricante.
Utilizando-se o mesmo Kit, Qiamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen Sciences,
Maryland, USA), foi realizado um gradiente de extração. Utilizou-se duas amostras,
as quais foram colocadas em proteínase K e tampão AL por 30 minutos, 1 hora e 1
hora e 30 minutos, a fim de se verificar o melhor tempo de digestão. As amostras de
DNA extraídas foram mantidas a temperatura de -70ºC até o momento de sua
utilização.
3.6 Amplificação do gene S por PCR
Para a amplificação do gene S do VHB, utilizou-se a técnica semi-“nested”
PCR, utilizando na primeira reação os primers 783 e 2821 (Oliveira, 2007) (Tabela
1), que originou um produto de 1200pb. Nesta primeira reação foi utilizado um mix
de PCR de volume de 50 µl descritos a seguir:
- 5,0 µl de tampão 10x PCR
- 1,0 µl de amostra, 2,0 µl de mix dNTP (10mM)
- 2,0 µl de MgCl 2 (50mM)
- 2,0 µl de iniciador senso (783) (10pmol)
- 2,0 µl de iniciador anti-senso (2821) (10pmol)
- 0,4 µl de Platinum taq DNA polimerase (5U/µl)
- 36 µl de água MiliQ
Na reação de semi-“nested” foi utilizado os primers 783 e P1 (Oliveira et al.,
2008), originando um produto de 680 pb. O volume final da reação de semi-“nested”
também foi de 50 µl, nesta reação foi utilizado 1,0 µl do produto amplificado na
primeira reação e o volume do restante dos reagentes foi similar ao da primeira.
16
Tabela 1. Seqüência dos primers utilizados nas reações de PCR
Nome
Seqüência
Quantidade
2821
783
P1
5’-GGG TCA CCA TAT TCT TGG GAA CA-3’
5’-CTC ACG ATG CTG TAC AGA CTT-3’
5’-GC CTC TCA CAT CTC GTC AAT-3’
23nt
21nt
20nt
Posição no
genoma do
VHB
2821-2150
783-762
104-123
Em todas as reações foram utilizadas uma amostra controle positivo de DNA
VHB (plasma humano com carga viral a 1.000.000.000 UI/μl de VHB) e uma de
controle negativo, na qual havia todos os reagentes com água MiliQ no lugar da
amostra.
As amplificações foram realizadas em termociclador Eppendorfe Mastercycler
Gradiente. Para ambas as amplificações foi utilizado 35 ciclos com a seguinte
programação.
94°C--------------------por 5 minutos
94°C--------------------por 30 segundos
35 ciclos
52,6°C-----------------por 2 minutos
72°C--------------------por 30 segundos
72°C--------------------por 7 minutos
4°C---------------------∞
3.7 Eletroforese dos produtos de PCR
Os produtos da amplificação da segunda reação foram visualizados em gel de
agarose a 1,5% corados em brometo de etídeo (1,0 µl/ml). Foram aplicados no gel
5,0 µl de produto de PCR misturados com 3,0 µl de tampão de amostra TBE 5X.
Como padrão de peso molecular utilizou-se o padrão Ladder de 100pb (Fermentas
Life Sciences). Para migração das amostras em gel, na cuba de eletroforese, foi
aplicada uma voltagem de 80 volts por 40 a 50 minutos. Após a migração
eletroforética as amostras foram analisadas em transiluminador UV 302 nm Bio
Agency e fotografadas utilizando o equipamento Canon Powershot S315.
17
3.8 Purificação dos produtos de PCR
Após a revelação do gel as amostras que apresentaram a quantidade de pares
de bases esperados na reação de semi -“nested” (680 pb), foram purificadas para
serem seqüenciadas.
Para purificação das amostras utilizou-se o Kit Wizard SV Gel and PCR CleanUp System (Promega), conforme as instruções do fabricante para purificação de
produto de PCR. Foi utilizado 40 µl de produto de PCR que foram eluídos 25 µl de
água MiliQ.
Após a purificação misturou-se 2,0 µl de produto de PCR purificado com 2,0 µl
de tampão de amostra TBE 5X e 2,0 µl de mass ladder com 2,0 µl de tampão TBE
5X. Dessa mistura aplicou-se 2,0 µl em gel de agarose 1,5%.
3.8.1 Determinação do genótipo VHB
3.8.1.1 Reação de seqüenciamento
As reações de seqüenciamento foram realizadas em placas de 96 poços. Foi
realizado seqüenciamento apenas das amostras que amplificaram na reação de
semi-“nested”. O Kit utilizado para o seqüenciamento foi o “Big Dye Terminator 3.1
Cycle Sequencing Kit” .
Foram realizadas duas reações de seqüenciamento para cada amostra, uma
para o primer forward e outra para o reverse. Na reação de seqüenciamento foi
utilizado um mix de volume de 20 µl, para cada primer, descritos a seguir:
- 5,0 µl Mix de Big Dye
- 2,5 µl de primer F ou R (5pmol/µl)
- 0,5 a 3,0 µl de produto de PCR purificado
- Água miliQ para completar o volume da reação
18
A reação de seqüenciamento foi processada em 30 ciclos nas condições a
seguir:
96°C--------------------por 1 minuto
96°C--------------------por 20 segundos
55°C--------------------por 20 segundos
60°C--------------------por 3 minutos
4°C---------------------∞
3.8.1.2 Precipitação do produto da reação de sequenciamento
Foi adicionado aos 20 μl de produto da reação de seqüenciamento 80 μl de
Isopropanol 75%, a placa foi selada e incubada a temperatura ambiente por 15
minutos. Após a incubação a placa foi centrifugada por 45 minutos a 4000rpm,
descartou-se o sobrenadante e adicionou-se em cada amostra 200μl de etanol 70%,
a placa foi selada e centrifugada por 10 minutos a 4000rpm. O sobrenadante foi
descartado e adicionaram-se novamente 200μl de etanol 70%, a placa foi selada e
centrifugada por 10 minutos a 4000rpm. Deixou-se secar o pellet a temperatura
ambiente e protegido de luz. Adicionou-se em cada amostra 10 μl de Formamida HiDi, a placa foi selada e vortexada, posteriormente foi dado um pulso na centrifuga. A
placa foi aplicada no termociclador a 95°C por 3 minutos para desnaturação,
posteriormente a placa foi colocada em banho de gelo por 2 minutos e foi aplicado
na placa um pulso, para eliminação das bolhas. Por fim as amostras fora submetidas
a seqüenciamento, utilizado o seqüenciador automático 3130 XL Genetic Analyzer
Applied Biosystems.
3.8.2 Analise dos questionários
Os dados dos questionários foram consolidados e armazenados em um banco
de dados no programa Excel 2007 (Microsoft Office). Destes dados foram analisados
aspectos socioeconômicos e epidemiológicos da população estudada.
19
3.8.3 Análise prévia das seqüências
As seqüência obtidas neste trabalho foram submetidas a analise pela
ferramenta BLAST do GenBank, banco de dados internacional, para confirmação do
tipo viral.
3.8.4 Edição e alinhamento das amostras
Para confirmação do tipo viral, as seqüência obtidas foram submetidas a
análise pela ferramenta BLAST do GenBank. Posteriormente as seqüências foram
analisadas no programa BioEdit versão 7.0.9.0 (06/27/07) (Hall, 1999), aonde foram
alinhadas e editadas quando necessário. Para o alinhamento foram utilizadas 30
seqüências armazenadas no GenBank, que continham os oito genótipos.
3.8.5 Análise filogenética
Para identificação dos genótipos, foi realizada uma análise filogenética
comparando os diferentes genótipos do VHB obtidos com os já conhecidos e
depositados no GenBank. As análises filogenéticas e de evolução molecular foram
realizadas utilizando o programa MEGA versão 4.0.2 (Tamura, 2007).
Na construção das árvores filogenética aplicou-se o modelo de NeighborJoining (NJ). O nível de confiança foi obtido usando o método não paramétrico
bootstrap baseado em 1000 réplicas (uma réplica é igual a uma comparação). A
classificação genotípica foi realizada mediante análise de similaridade das
sequencias obtidas no estudo e sequencias correspondentes aos genótipos de A a
H
obtidas no GenBank. As sequencias externas estão classificasa com seus
respctivos números de acesso no banco de genes seguido da classificação
genotípica de cada um.
20
4 RESULTADOS
Os resultados serão apresentados na forma de artigo, que será enviado para
revista Acta Tropica.
Caracterização molecular do vírus da hepatite B em população autóctone e
população endógena do município de Lábrea, na Amazônia ocidental brasileira
Dias ALBa, Oliveira CMCb, Castilho MCb, Silva MSPc, Braga WSMb
a. Universidade do Estado do Amazonas
b. Gerência de Virologia, Fundação de Medicina Tropical do Amazonas.
Manaus, AM, Brasil
c. Secretaria Municipal da Saúde de Lábrea.
Resumo
A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) é um importante problema de saúde
pública no mundo. O VHB é classificado em oito genótipos diferentes, A-H, com
distinta distribuição geográfica. No Brasil os genótipos mais freqüentes são o A, D e
F. Objetivo deste estudo foi caracterizar os genótipos do VHB em região endêmica
de infecção pelos vírus das hepatites B e Delta na Amazônia Ocidental Brasileira.
Foram analisadas 86 amostras soro reativas para o HBsAg de indivíduos indígenas
e não-indígenas, obtidas de inquéritos sorológicos realizados no município de
Lábrea, Estado do Amazonas. Das 86 amostras soro reativas 39 foram VHB-DNA
positivas pela semi-“nested” PCR. Os genótipos foram estabelecidos pelo
seqüenciamento da região do gene S amplificado. Foram obtidas 20 seqüências,
classificada em três genótipos A, D e F. Sendo o genótipo A o mais freqüente (60%),
seguido do D (35%) e F(5%). O perfil de distribuição dos genótipos encontrados
reflete o padrão de ocupação histórica da região.
Palavras-chave: VHB, genótipos, epidemiologia, Amazônia, Brasil.
21
1 Introdução
A hepatite B representa uma das infecções virais mais prevalentes no mundo.
Estima-se que cerca de dois bilhões de pessoas possuem evidências sorológicas de
infecção pelo vírus da hepatite B (VHB). Destes, 350 milhões são portadores
crônicos, que apresentam risco elevado de morte por cirrose ou carcinoma
hepatocelular (Sharma et al. 2005).
O VHB pertence à família Hepadnaviridae, gênero Orthohepadnavirus, é
formado por uma partícula de DNA de dupla hélice circular, onde a fita de polaridade
negativa é completa e a de polaridade positiva é incompleta na extremidade 5’. É
envelopado, com 42 nm de diâmetro e 3.200 nucleotídeos (Okamoto et al, 1988,
Schaefer, 2005). Pode ser classificado quanto ao fenótipo em quatro diferentes
subtipos, que podem ser subdivididos mais tarde de acordo com o determinante
antigênico do antígeno de superfície (HBsAg) em adw (adw2 e adw4), ayw (ayw1-4),
adr (adrq+ e -) e ayr (Bancroft, 1972; Okamoto et al., 1988). E quanto ao genótipo
em oito cepas, que variam de A a H (Kidd-Ljunggren, 2002), suas diferenças
estruturais e funcionais estão associadas a gravidade clinica, falhas no tratamento e
possivelmente interferem na resposta vacinal contra o vírus. Estes genótipos podem
apresentar uma variação de até 8% no seu genoma completo (Norder et al, 2004).
Os diversos genótipos estão distribuídos de forma distinta, o genótipo A
apresenta dispersão universal, sendo o predominante na Europa, América do Norte,
África e Índia. Os genótipos B e C predominam no Leste e Sudeste da Ásia e
Austrália. O genótipo D é principalmente encontrado no Oriente Médio e países do
Mediterrâneo. O genótipo E parece ser predominante no oeste africano, enquanto o
genótipo G foi caracterizado nos Estados Unidos, México e França, o genótipos F é
encontrado principalmente nas Américas Central, do Sul e Alaska, já o genótipo H é
22
exclusivo das Américas Central e Estados Unidos (Norder et al., 2004; Campos et al,
2005 e Weber et al, 2006).
A região Amazônica é caracterizada como uma das regiões do mundo de maior
ocorrência da doença e suas seqüelas (Braga et al., 2001). No Estado do
Amazonas, as calhas dos rios Juruá, Purus e médio Solimões são consideradas as
regiões de maior endemicidade para os vírus das hepatites B (VHB) e Delta (VHD)
(Bensabath & Leão, 2003; Braga et al., 2005). Entre populações indígenas, da
Amazônia ocidental estudos soro epidemiológicos, relatam taxas superiores a 20%
de prevalência de portadores crônicos (Braga et al., 2001; Braga, 2004).
No Brasil, bem como na Amazônia brasileira o genótipo A tem se mostrado o
mais comumente encontrado seguido dos genótipos D e F (Mello et al., 2007). Já em
comunidades indígenas isoladas o genótipo F tem se mostrado o mais prevalente
(Blitz et al., 1998).
Este estudo teve como objetivo caracterizar por análise filogenética os
genótipos do VHB isolados de indivíduos HBsAg reativos de uma área endêmica da
Amazônia Ocidental brasileira. A analise foi obtida a partir de seqüências
nucleotidicas do gene S.
2- Material e métodos
Foi realizado um estudo de epidemiologia molecular com caracterização
genotípica do VHB em indivíduos positivos para o antígeno HBsAg da zona urbana,
rural e comunidades indígenas do município de Lábrea no Estado do Amazonas
(Figura 1).
23
As amostras selecionadas foram coletadas durante a realização de inquéritos
sorológicos para hepatites virais na zona urbana e rural, do município de Lábrea
entre fevereiro de 2006 e julho de 2008.
De 1510 amostras analisadas, 86 foram positivas para o marcador HBsAg e
são objeto de análise do presente estudo. Das 86 amostras, 31 pertencem a
indivíduos de comunidades indígenas e 55 a não-indígenas.
Estes estudos foram aprovados pelo comitê de ética da Fundação de Medicina
Tropical do Amazonas (FMTAM) processo Nº 2957/2003-FMTAM e 2090/2005FMTAM.
Figura 6: Mapa da área de estudo.
2.1 Extração de DNA
O DNA viral foi extraído a partir das amostras de soro utilizando o Qiamp DNA
Blood Mini Kit (Qiagen Sciences, Maryland, USA), de acordo com os procedimentos
recomendados pelo fabricante, porém o tempo de digestão com proteinase K e
tampão AL foi de 4 horas.
24
2.2 PCR
A região S do gene de superfície foi amplificada pela semi-“nested” PCR, na a
primeira reação utilizou-se os primers 783 (5’-CTC ACG ATG CTG TAC AGA CTT3’), nt 783-762, e 2821(5’-GGG TCA CCA TAT TCT TGG GAA CA-3’), nt 2821-2150
(Oliveira, 2007). Na segunda reação com os primers 783 e P1 (Oliveira et al., 2008),
originando um produto de 1200 e 680 pb respectivamente.
Para a amplificação do DNA foi adicionado 5,0 μl de amostra para primeira
reação e 1,0 μl de produto de PCR para a segunda reação a uma mistura contendo:
5,0 µl de tampão 10x PCR; 2,0 µl de mix dNTP (10mM); 2,0 µl de MgCl 2 (50mM); 2,0
µl de cada primer; 0,4 µl de Platinum taq DNA polimerase (5U/µl) (Invitrogen, San
Diego, CA); para um volume final de 50 µl. As condições do ciclo utilizado foram:
inicialmente 94°C por 5 minutos para desnaturação, seguidos de 35 ciclos de 94°C
por 30 segundos, 52,6°C por 2 minutos, 72°C por 30 segundos, e uma extensão final
de 72°C por 7 minutos, em termociclador Eppendorff Mastercycler Gradient.
2.3 Seqüenciamento
As amostras purificadas com Kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System
(Promega), seqüenciadas com os primers Foroward e reverse utilizando “Big Dye
Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit”, de acordo com o manual do fabricante. As
reações foram realizadas no Genetic Analyzer 3130 XL (Applied Biosystems).
2.3 Analise das seqüências
Para confirmação do tipo viral, as seqüência obtidas foram submetidas a
análise pela ferramenta BLAST do GenBank. Posteriormente as seqüências foram
editadas e alinhadas no programa BioEdit versão 7.0.9.0 (Hall, 1999). No
alinhamento foram utilizadas 30 seqüências obtidas do GenBank, correspondentes
aos que continham os oito genótipos do VHB.
25
2.4 Identificação dos genótipos
Foi realizada uma análise filogenética comparando os diferentes genótipos do
VHB obtidos com 8 seqüências do GenBank. As análises filogenéticas e de evolução
molecular foram realizadas utilizando o programa MEGA versão 4.0.2. (Tamura,
2007) Na construção das árvores filogenética aplicou-se o modelo de NeighborJoining (NJ). O nível de confiança foi obtido usando o método não paramétrico
bootstrap baseado em 1000 réplicas. A classificação genotípica foi realizada
mediante análise de similaridade das seqüências obtidas no estudo e seqüencias
correspondentes aos genótipos de A a H obtidas no GenBank. O grupo externo
utilizado foi o VHB de primatas não humano (número de acesso do GenBank
AF046996).
3 Resultados
O estudo incluiu amostras de 86 indivíduos, 54 (62,80%) do sexo masculino e
32 (37,20%) do sexo feminino, tendo estes uma idade média de 30 anos (1–87).
A análise qualitativa para o VHB-DNA, pela semi-nested PCR, foi positiva em
45,3% (39/86), e 37,5% (21/86) de amostras de portadores co-infectadas pelo VHD.
Durante o procedimento de purificação houve perda de produto de PCR de
17/39 amostras. Sendo 22 amostras submetidas ao seqüenciamento do gene S.
Destas, 20 seqüências foram de boa qualidade, as quais foram comparadas com 8
seqüências obtidas do GenBank.
O genótipo mais freqüentemente foi o genótipo A, encontrado em 60% (12/20)
das seqüências obtidas, seguido do genótipo D 35% (7/20), o genótipo F foi
encontrado em apenas uma amostra 5% (1/20) (Figura 2).
26
Entre as amostras de indígenas, 44,4% (4/9) apresentaram o genótipo A e
55,6% (5/9) o genótipo D. Enquanto que nas amostras de não-indígenas o genótipo
mais freqüente o A com 72,72% (8/11), seguido do genótipo D com 18,18% (2/11) e
genótipo F com 9,1% (1/11).
Figura 2: Arvore filogenética do tipo Neighbor-joining VHB-DNA (Gene S)
representando os genótipos encontrados. As seqüencias do estudo referentes
a indígenas estão marcadas com  e as de não indígenas com . As
seqüencias do genbank estão com seus respectivos números de acesso.
27
4 Discussão
Os resultados deste estudo contribuem com informações a respeito da
distribuição dos genótipos do VHB no estado do Amazonas, uma vez que estudos
de epidemiologia molecular do VHB na região ainda são raros. Como a distribuição
geográfica dos genótipos do VHB é muito diversificada (Norder et al, 2004), sua
caracterização molecular em uma determinada região pode revelar aspectos da
natureza da origem do vírus na população estudada.
As amostras avaliadas neste estudo revelam uma predominância do genótipo A
e D, enquanto o genótipo F foi encontrado em apenas uma amostra. Estudos sobre
a distribuição dos genótipos do VHB no Brasil e na Amazônia também mostram que
na região Norte do país o genótipo A é mais freqüente, seguido do D e F (Mello,
2007; Ferreira et al., 2006; Moraes et al., 1999; Carrilho et al., 2004). Entretanto,
outros estudos realizados na Amazônia brasileira, mostram o genótipo F como o
segundo mais freqüente (Viana et al., 2005; Victoria et al., 2008; Conde et al., 2004).
Acreditamos que essa diferença deva estar associada ao tipo de amostras
avaliadas que geralmente são oriundas de pacientes com doença crônica
estabelecida ou de pacientes com hepatite fulminante (Paraná et al, 2008; Victoria et
al., 2008), enquanto que as amostras por nós analisadas são de estudo de
prevalência de base populacional que avalia indivíduos assintomáticos.
O estudo de Viana e colaboradores (2005) embora também avaliem uma
amostra de base populacional, foi realizado em região do estado do Acre
sabidamente endêmica do VHB, onde a presença marcante do genótipo F também
está caracterizada como importante.
O genótipo F, na última década foi identificado com maior freqüência em
ameríndios (Blitz et al., 1998), Bertolini e colaboradores (2000) mostra que tal
28
genótipo é freqüente em tribos isoladas da Amazônia que não mantém contato com
brancos. Neste mesmo estudo foi mostrado que o contato de índios com não
indígenas favoreceu a introdução do genótipo A nestas comunidades.
Os primeiros contatos das populações nativas da região do estudo com outros
povos do ocidente e oriente deram-se durante a chamada coleta das “drogas do
sertão” e no final do século 19 durante a exploração de seus extensos seringais
nativos (Ribeiro, 2009; Amazonas, 2009; Schröder, 2002; Schiel, 2005 ). O que pode
justificar a maior freqüência dos genótipos A e D na população indígena estudada.
Moraes e colaboradores (1999), analisando amostras caracterizadas anteriormente
pela técnica de anticorpos monoclonais com primers específicos para o genótipo F,
identificaram o genótipo A como mais freqüente seguidos do D e F, sugerindo que
em outros estudos houve uma super-estimativa do genótipo F, uma vez que usavam
anticorpos monoclonais para identificação de sorotipos.
. O Instituto Oswaldo Cruz (IOC), pioneiro em classificar os genótipos do VHB
que circulam no Brasil, identificou que cerca de 50% dos vírus encontrados no país
são do genótipo A, subtipo africano, possivelmente relacionado à introdução dos
africanos no Brasil pelo comércio escravo (Teles et al., 1999). Além da influência
afro-descendente, a influência da colonização européia e da presença de mascates
de origem libaneses na região Amazônica durante o período da exploração da
borracha (Bastani, 1949 apud Campos, 1987, p.67), justificam a presença marcante
dos genótipos A e D encontrados em nossas amostras.
Embora tenhamos encontrado uma positividade de 45,34% (39/86) do DNA
viral em nossa amostra diferentemente de outros estudos que mostram índices de
positividade superiores como de 76% em estudos realizados por Carrilho et al (2004)
e Chu et al (2003), nossos resultados possivelmente estejam relacionados a elevada
29
presença de indivíduos co-infectados com o VHD (65,11%), o que reprime
espontaneamente o VHB (Kiesslich et al., 2009; Rizzetto, 2009), como também
devido a baixa carga viral em indivíduos co-infectados (Kiesslich et al., 2009), que
compuseram a totalidade de nossa amostragem, bem como a problemas no
manuseio das amostras em trabalho de campo em situações precárias como na
zona rural do município de Lábrea.
É sabido que as formas clínicas da infecção pelo VHB tem estreita relação com
os genótipos. Em áreas endêmicas o genótipo A está associado com hepatite
aguda, o genótipo D está envolvido em sua grande maioria com desenvolvimento de
cirrose hepática e câncer (Thakur et.al., 2002) e o genótipo F nas hepatites
fulminantes (Nakano et al., 2001), podendo este estar também relacionado com
resistência a medicamentos utilizados no tratamento desta infecção. Por isso,
estudos como este são de grande importância para ajudar a estabelecer um perfil
genotípico do VHB na região, mostrando que mesmo em comunidades isoladas da
Amazônia refletem o mesmo padrão de cepas encontrados na Europa, África e
Oriente médio, por meio da ocupação histórica desta região.
Agradecimentos:
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM),
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pelo
suporte financeiro. A Fundação Nacional de Saúde, Distrito Sanitário Indígena do
Médio Purus, pelo apoio na investigação junto as populações indígenas e as
populações das comunidades da zona urbana e rural do Município de Lábrea pela
participação nesse estudo.
30
5 REFERÊNCIAS
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Biblioteca
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2009.
Disponivel
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33
5 CONCLUSÃO
Os resultados obtidos no presente estudo nos permitiram fazer as seguintes
conclusões:
•
A análise filogenética mostrou que 20∕86 das amostras analisadas
pertencem aos genótipos A, D e F;
•
O genótipo A foi o mais freqüente 60% seguido dos genótipos D 35% e F
5%;
•
Em indígenas o genótipo D foi o mais freqüente 55,6% seguido do
genótipo A 44,6%, não encontrados o genótipo F entre as amostras de
indígenas avaliadas;
•
O perfil de distribuição dos genótipos encontrados reflete o padrão de
ocupação histórica da região.
34
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38
7 ANEXOS
7.1 Certificado de Aprovação no Comitê de Ética e Pesquisa
7.1.1 Hepatites virais no município de Lábrea: O impacto na saúde pública
39
7.1.2 Febre Negra de Lábrea: O papel das populações indígenas na epidemiologia
da hepatite B e Delta
40
7.2 Termo de consentimento livre esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E INFORMADO
41
Instituição: Fundação de Medicina Tropical do Amazonas – FMTAM.
Orientadores Responsáveis/ Coordenadores: Prof. Dr. Wornei S. M. Braga
Investigadora responsável: Prof. Dr. Wornei S. M. Braga
Compromisso Assumido
O (A) Sr (a)_________________________________________________, aqui denominado(a),
participante de investigação da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas - FMTAM, está sendo
convidado e concorda livremente em participar como voluntário(a) em um estudo com o objetivo de
estudar os aspectos clínicos e a biologia do vírus da hepatite B e Delta em populações
indígenas do município de Lábrea – Amazonas. Podendo afastar-se do estudo a qualquer
momento, sem que este fato lhe venha causar problemas. Os exames e o atendimento médico para o
estudo serão gratuitos. O Sr (a) receberá todos os cuidados necessários durante o exame médico e
na coleta do sangue. O sangue será unicamente utilizado para este estudo e não será guardado nem
servirá para outros fins e/ou outros projetos de pesquisa.
O problema de saúde
A hepatite B é uma doença muito comum em muitas partes do mundo. A região amazônica é
conhecida como uma das regiões de maior ocorrência de hepatite B e Delta, e suas conseqüências,
no mundo. No Estado do Amazonas, a região do rio Purus é tida como uma das de maior ocorrência
dessa doença, inclusive com uma forma grave, descrita desde o final dos anos sessenta, conhecida
como Febre Negra de Lábrea. Como o Sr(a), está sendo convidado a participar deste projeto de
pesquisa, antes de assinar este TERMO, deve tirar todas as duvidas, informando-se adequadamente,
podendo realizar quaisquer perguntas para seu esclarecimento.
Objetivo da Investigação
Estudar os aspectos clínicos e a biologia do vírus da hepatite B e Delta em populações indígenas do
município de Lábrea – Amazonas, calha do rio Purus.
Benefícios
A participação é voluntária, e o Sr(a) está sendo convidado a colaborar, no entanto, estará, com
certeza contribuindo para o avanço da medicina e conhecimento da hepatite B e Delta, bem como
será beneficiado com tratamento clínico caso seja encontrado a presença de doença.
Riscos Potenciais
Os procedimentos do projeto não colocaram a pessoa que participar em nenhum risco, exceto o
desconforto da furada da agulha para a retirada do sangue. O procedimento será realizado com
sistema de coleta á vácuo, e a pessoa responsável seguirá todos os procedimentos padrões de
segurança evitando acidentes que coloquem em risco de contaminação o voluntário e o membro de
nossa equipe.
Sigilo dos Dados confidenciais
Foi informado do conteúdo deste TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E INFORMADO, e resolvi
participar voluntariamente, depois de ter formulado perguntas e de ter recebido respostas sobre elas.
Declaro dar meu consentimento que permanecerá guardado de uma forma confidencial, para proteger minha identidade.
Ressarcimento/Indenização: Ao Participar desse projeto, o Sr(a) será assistido, pela Instituição
patrocinadora caso ocorra algo referente aos procedimentos do projeto que estará participando.
________________________________
Assinatura do Voluntário ou responsável
_____________________________________
Assinatura do Investigador
7.3
Questionários
____________________________
Assinatura da Testemunha
Data: ____/____/____
42
7.3.1 QUESTIONÁRIO DE INVESTIGAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DE DOENÇA
ICTEROHEMORRÁGICA EM POPULAÇÕES INDÍGENAS.
Número de identificação_________________
______________________________________________________________
I- IDENTIFICAÇÃO
______________________________________________________________
1-Nome________________________________________________________
2-Sexo mas[ ] fem[ ]
3-Qual é a sua data de nascimento? ___/___/___ ou, se não souber, qual a sua idade aproximada?
____anos.
4-Etnia__________________
5 – Que língua você fala normalmente? ____________________________
6 -Tem mulher ou marido ? [ ]sim [ ] não
7 - Veio de outra aldeia ? [ ] sim [ ] não, se sim local______________
8 - Tempo que vive neste local__________________________________
9 - Razões para mudança__________________________________________
_______________________________________________________________
II-FATORES DE RISCO.
______________________________________________________________
1-Com que idade arrumou mulher ou marido pela 1ª vez ?____anos, quantas vezes_____
2-Presença de lesões de pele Sim [ ] Não [ ]
Se Sim Tipo de lesão ?
[ ] ferimento
[ ] ferimentos infectados
[ ] picada de inseto
[ ] escabiose
[ ] micose superficiais
[ ] outros, especificar________________________________________
___________________________________________________________
3-Tatuagem,escarificações Sim[ ] Não[ ]
Se Sim, que material utilizou____________________________
outras pessoas usaram o mesmo material Sim [ ] Não [ ]
4- Orelha furada Sim[ ] Não[ ]
Se Sim, que material utilizou___________________________
outras pessoas usara o mesmo material Sim [ ] Não [ ]
5-Alguém na sua família teve hepatite nos últimos 6 meses
Sim[ ] Não[ ].
Se sim, quem?
[ ]Mãe [ ] Pai [ ] Irmão/ã [ ] Companheiro/a
[ ] Filho/a
6-Dorme junto com outras pessoas Sim [ ] Não [ ]
[ ] Outros
43
7-Utiliza plantas quando está doente? Sim[ ] Não[ ]
Se sim, em que formas as usa mais frequentemente ?
[ ] Chá
[ ] Emplasto
[ ] Emulsão
[ ] outros, especifique_____________________________________
8-Passado de ictericia? Sim[ ] Não[ ]
9-Passado de urina escura? Sim[ ] Não[ ]
10-Teve hepatite? Sim[ ] Não[ ].
11 História de vacina contra hepatite B ? [ ] SIM [ ] NÃO
12- Número de doses:
[ ] UMA
Data da 1ª DOSE ____/_____/_____
[ ] DUAS
Data da 2ª DOSE ____/_____/_____
[ ] TRÊS
Data da 3ª DOSE _____/_____/_____
13- Teve Malária? ( ) SIM
( ) NÃO
Se sim, quantas vezes? ___________________
14 – Teve Tuberculose? ( ) SIM
( ) NÃO
15 – Já foi operado ou tomou sangue? ( ) SIM ( ) NÃO
Se sim, especificar ______________________________
Quando? ______________________________________
16 – Bebe? ( ) SIM ( ) NÃO
Se sim, que tipo de bebida? ________________________________
Qual quantidade e freqüência? ______________________________
17 – Fuma? ( ) SIM ( ) NÃO
Se sim, quantos cigarros por dia? ___________________________
18 – Usa algum outro tipo droga? ( ) ( )
Se sim, especificar ______________________________________
III – CRIANÇAS MENORES DE 5 ANOS.
1 – Nasceu de parto normal? ( ) SIM
( ) NÃO
2 – Nasceu no hospital ou na aldeia? ________________________________
3 – Quanto pesou? _________
Se não foi pesado, aparentava ser normal ou muito pequeno e magro? __________________
4 – Mamou no peito? ( ) SIM ( ) NÃO
Se sim, quanto tempo? ______________
5 – Falou com quantos anos? ____________
6 – Andou com quantos anos? ____________
Observação____________________________________________________
______________________________________________________________
44
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
DATA DA ENTREVISTA ___/___/___
7.3.2 Questionário do projeto “Hepatites virais no município de Lábrea: O
impacto na Saúde Pública”
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS
GERÊNCIA DE VIROLOGIA
Questionário Projeto: Hepatites virais no município de Lábrea: O impacto na Saúde Pública
Nº da Amostra: ____________
Família: ____________________
IDENTIFICAÇÃO
1 – Nome:_____________________________________________________________________
2 – Parentesco com o responsável pela família:
[ ]Esposa(o) [ ]Filho(a) [ ]Pai/Mãe [ ]Irmão(ã) [ ]Enteado(a) [ ]Sobrinho(a) [ ]Neto(a)
[ ]Agregado [ ] outro: ____________________
2 – Endereço: _______________________ Localidade: _________________________________
3 – Idade: __________________ anos
4 – Data do nascimento:______/_____ /______5
Sexo: [ ] Masculino [ ] Feminino
6 – Procedência:_________________________
7 – Tempo em que vive neste local:_____________________________________
8- Razões para mudança:_________________________________________________________
______________________________________________________________________________
ASPECTOS SOCIO-ECONÔMICOS
1 – Já freqüentou ou freqüenta escola? [ ] SIM [ ] NÃO Se sim, quantos anos? _____________
2 – Ocupação principal: _______________________
3 – No momento você está: [ ] Casado [ ] Junto [ ] Separado/divorciado [ ] Viúvo [ ] Solteiro
4– Com que idade você se casou pela primeira vez? ________ anos.
5- Quantas vezes? _________
6 – Renda familiar: R$ ________________________
7 – Quantos cômodos tem a sua casa? _______ cômodos.
8 - Quantos quartos? ____________quartos.
9 - Quantas pessoas vivem na casa?_______ pessoas.
10 - Qual o número de pessoas por quarto?________ pessoas.
______________________________________________________________________________
FATORES DE RISCO
ABASTECIMENTO DE ÁGUA
TRATAMENTO DA ÁGUA
–
45
[
[
[
[
[
] Rio
] Poço
] Chuva
] Serv. Público
] Outros____________
[ ] Filtrada
[ ] Fervida
[ ] Clorada
[ ] Não tratada
[ ] Outros____________
DESTINO DO LIXO
[ ] Coleta Pública
[ ] Queimado
[ ] Enterrado
[ ] Mata
[ ] Rio
[ ] Outros__________
DESTINO DOS DEJETOS
[ ] Fossa negra
[ ] Mata
[ ] Rio
[ ] Esgoto público
[ ] Outros____________
INSTALAÇÃO DO SANITÁRIO
[ ] Dentro da casa
[ ] Fora da casa
[ ] Outros____________
1-Fez cirurgia? [ ] SIM [ ] NÃO
Se sim, que tipo?____________________________
Onde?____________________ Por quê? _____________________Quando?_____/_____/_____
2- Recebeu transfusão de sangue? [ ]SIM [ ]NÃO
Se, sim, onde?___________________ Quando? _____/_____/_____
3-Compartilha escova de dente com outras pessoas? [ ] SIM [ ] NÃO
4- Compartilha lâmina de barbear? [ ] SIM [ ] NÃO
5-Tem tatuagem?
[ ] SIM [ ] NÃO Se sim, há quanto tempo ?__________ anos.
6-Tem orelha furada? [ ] SIM
[ ] NÃO Se sim, há quanto tempo ?__________ anos.
7-Quantos anos você tinha quando manteve a sua primeira relação sexual? ________ anos.
[ ]Criança [ ]Não quis responder
8- Você teve alguma doença abaixo:
[ ]Gonorréia [ ]Sífilis [ ]Verrugas genitais [ ]Corrimento genital [ ]Bolhas genitais
[ ]Câncro [ ]Outras, Especificar__________________________________________
9- Você trabalha em serviço de saúde? [ ] SIM [ ] NÃO
10- Bebe bebida alcoólica?
[ ] SIM [ ] NÃO
Se sim:
[ ] Todos os dias
[ ] Fins de semana
[ ]
Eventualmente
11- Você fuma?
[ ] SIM [ ] NÃO
Se, sim. Fuma, por dia:
[ ] de 1 a 10
[ ] de 11 a 20
[ ] mais de 20 cigarros
12- Uso de drogas injetáveis? [ ] SIM [ ] NÃO
13- Uso de drogas fumadas?
[ ] SIM [ ] NÃO
14- Uso de drogas cheiradas? [ ] SIM [ ] NÃO
15- Alguém na sua casa teve:
• Hepatite?
[ ] SIM [ ] NÃO
• Icterícia (olho amarelado)?
[ ] SIM [ ] NÃO
• Colúria (urina cor de guaraná)?
[ ] SIM [ ] NÃO
• Se sim, quem? [ ]Mãe [ ]Pai [ ]Irmão(ã) [ ]Companheiro(a) [ ]Filho(a)
[ ]Outros: _________________
• Passado de icterícia (olho amarelado)?
[ ] SIM
[ ] NÃO
16-Passado de colúria (urina cor de guaraná)? [ ] SIM
[ ] NÃO
17-Você já teve hepatite?
[ ] SIM [ ] NÃO
Se sim, quando? ____/_____/_____
18- História de vacina contra hepatite B ?
[ ] SIM [ ] NÃO
19-Número de doses:
[ ] UMA
Data da 1ª DOSE : ____/____/____
[ ] DUAS
Data da 2ª DOSE : ____/____/____
[ ] TRÊS
Data da 3ª DOSE : ____/____/____
20-Passado de malária?
[ ] SIM [ ] NÃO
DATA: ____/_____/_____
_____________________________
ENTREVISTADOR