AMPLIFICAÇÃO CRUZADA DE MARCADORES

AMPLIFICAÇÃO CRUZADA
DE MARCADORES
MICROSSATÉLITES
DE ESPÉCIES DO GÊNERO
HYPSIBOAS*
YNGRID OLIVEIRA RODRIGUES, LÍLIAN DE SOUZA
TEODORO, FERNANDA RIBEIRO GODOY, HUGO
HENRIQUE DE PÁDUA OLIVEIRA, DANIELA DE MELO
E SILVA, ALEX SILVA DA CRUZ, LYSA BRENARDES
MINASI, CLAUDIO CARLOS DA SILVA, APARECIDO DIVINO
DA CRUZ
Resumo: o objetivo desta pesquisa foi de verificar a capacidade de amplificação de marcadores microssatélites da espécie Hypsiboas raniceps para
o Hypsiboas albopunctatus. Através deste tipo de teste, é permitido a utilização de marcadores antecipadamente desenvolvidos e caracterizados em
espécies filogeneticamente próximas. Este processo é denominado de transferibilidade.
estudos, Goiânia, v. 41, especial, p. 147-154, nov. 2014.
Palavras-chave: Hypsiboas. Transferibilidade de primers. Microssatélite.
Genética de conservação.
A ordem Anura compreende animais pertencentes à família Hylidae
que constitui-se em uma das mais numerosas dentro da ordem e que
ainda carecem de estudos evolutivos (FAIVOVICH et al., 2005).
Esta família é uma das que apresentam o maior número de espécies ameaçadas, conforme citado na análise da lista brasileira de anfíbios ameaçados de
extinção do Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade - ICMBio (2014).
Por demonstrarem resistência a ambientes antropizados e poderem ampliar
sua distribuição geográfica, tornam-se então, animais importantes para a genética de populações. Para tanto a conservação de espécies do grupo podem ser
reforçadas com o desenvolvimento de ferramentas moleculares que possibilitem
conhecer a estrutura genética que se constitui de um dos principais artifícios
na evolução das espécies (ROSA, 2009).
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estudos, Goiânia, v. 41, especial, p. 147-154, nov. 2014.
Dentro desta família foram desenvolvidos marcadores moleculares para apenas
uma espécie conhecidamente, por Arruda et al. (2010) para H. raniceps. E foram
posteriormente testados pelo teste de transferibilidade de espécies relacionadas
para H. albopunctatus por Oliveira (2012), que obteve sucesso na amplificação
com os primers Hraniμ1 e Hraniμ4, porém não contava com o grupo focal para
confirmação do teste.
Então, há capacidade de amplificação nos marcadores microssatélites desenvolvidos para identificação da espécie H. raniceps em outra espécie do mesmo gênero, o H.
albopunctatus?
Partindo desta questão, esperou-se que, os dois primers desenvolvidos para identificação da espécie H. raniceps tenham capacidade de amplificação em outra espécie
do mesmo gênero, o H. albopunctatus.
O objetivo geral desta pesquisa foi de verificar a capacidade de amplificação de
marcadores microssatélites desenvolvidos para identificação da espécie H. raniceps em
outra espécie do mesmo gênero, o H. albopunctatus.
Já os objetivos específicos consistem em propor regiões genômicas que poderão
ser utilizadas para a identificação de H. albopunctatus, auxiliar pesquisas futuras que
envolvam a identificação genômica através de marcadores microssatélites. E ainda
confrontar os resultados desta pesquisa com outros previamente descritos na literatura,
a fim de embasar estudos filogenéticos futuros.
A ordem Anura, constitui-se de anfíbios que encontram-se praticamente em todas
as regiões do globo terrestre, exceto na Antártica. Essa longa distribuição deu-se ao
longo da história evolutiva do grupo e um das características mais importantes para
tanto, foi a grande variedade de formas reprodutivas, além de um complexo arranjo
social (FAIVOVICH et al., 2005; HADDAD; PRADO, 2005).
Dentro da família Hylidae, existem quatro subfamílias, sendo elas Pelodryadinae, Phyllomedusinae, Hemiphractinae e por último a subfamília Hylinae na qual
encontram-se as pererecas do gênero Hypsiboas, caracterizadas por tamanho de porte
médio a grande e conhecidas como “rãs-gladiadoras” (FAIVOVICH et al., 2005).
Estas espécies H. albopunctatus e H. raniceps, são de grande interesse ecológico e
evolutivo no âmbito molecular e possuem grande representatividade dentro do cerrado
(141 espécies de anfíbios), que é o maior bioma brasileiro depois da Amazônia e da
Mata Atlântica (BASTOS, 2008).
Neste âmbito a espécie H. albopunctatus descrita por Spix em 1824, exibe
resistência às alterações ambientais, podendo conviver com ações antrópicas uma
generalista que encontra-se do Centro-oeste brasileiro ao Sul, no estado do Paraná
(SÁ, 2010).
Nunes e Fagundes (2008) afirmam que os anuros apresentam caracteres morfológicos
conservados, o que dificulta a utilização dos mesmos em estudos taxonômicos e filogenéticos. Número e morfologia cromossômica do grupo já são bem conhecidos. Mas como
citado anteriormente, pode-se verificar a estrutura genética por morfologia cromossômica,
porém variações no genoma não podem ser verificadas por estas ferramentas.
E com a utilização de ferramentas moleculares é possível verificar diretamente variações do genoma de um organismo, no caso, marcadores moleculares que apresentam
fenótipo molecular de regiões que podem estar presentes em regiões codantes e não
codantes do genoma (MÖLLER, 2009).
Pode-se então utilizar os marcadores Microssatélites, que são regiões genômicas altamente repetitivas e polimórficas, é amplamente utilizado em estudos
de diversidade genética, identificação de espécie e testes de paternidade (ROSA,
2009).
Dentro do gênero Hypsiboas, Arruda et al.,(2010) desenvolveu 16 pares de primers
para loci microssatélites de H. raniceps, e são, até o momento, os únicos marcadores
desenvolvidos especificamente para uma espécie do gênero Hypsiboas (OLIVEIRA et
al., 2012).
O desenvolvimento de marcadores microssatélites tem um custo alto e a transferibilidade de primers entre espécies relacionadas, ou seja, de mesma família pode ser
uma alternativa para redução destes custos (SILVA et al., 2013; OLIVEIRA et al., 2012;
MÖLLER, 2009).
Para tanto foi conduzido um teste com o controle ou grupo teste como descrito
em seu estudo, que trata-se de DNA de H. raniceps, espécie focal. Verificar a correta
amplificação dos loci microssatélite dos dois primers (Hraniμ1; Hraniμ4) que foram
descritos como amplificantes por Arruda et al., (2010) para H. raniceps.
E testar a amplificação em material genético de H. albopunctatus, também com os
dois primers (Hraniμ1; Hraniμ4), em que Oliveira et al., (2012) confirmou com o teste
de transferibilidade entre espécies relacionadas.
Para a discussão foi feita pesquisa bibliográfica em bancos de dados e revistas
científicas tais como Scielo, Bioone, em bancos de dados de Universidades e de eventos
de pesquisa.
estudos, Goiânia, v. 41, especial, p. 147-154, nov. 2014.
METODOLOGIA
A avaliação da transferibilidade foi realizada através de dois primers pré-selecionados
e capazes de amplificar diferentes regiões do genoma de H. raniceps por amplificação
para H. albopunctatus por teste de transferibilidade interespecífica.
Extração e Isolamento de DNA Genômico
O DNA para a amplificação dos locos microssatélites, foram extraídos a partir de
amostras de fígado da espécie H. albopunctatus e H. raniceps que estavam embebidos
em etanol absoluto e armazenados em freezer a -20ºC. Para o isolamento do DNA
utilizou-se o kit de extração Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega USA),
seguindo-se as instruções do fabricante.
Primers para a Amplificação dos Loci Microssatélites
Inicialmente desenvolvidos para a espécie H. raniceps, 2 pares de primers para
loci microssatélites foram testados em amostras de H. albopunctatus com a intenção
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Tabela 1: Sequencia dos Primers utilizados neste estudo.
de verificar sua transferibilidade em espécies relacionadas geneticamente. Os Primers
utilizados neste estudo estão presentes na tabela 1.
Loci
Sequência (5’ → 3’)
Hraniμ1
Amplicons
N0 de alelos
esperado
261-271
3
194-214
8
F: GCA CTC ATG CAG ACA CAA CT
R: CTG CTG CAG GAT ACT AAA GGA C
Hraniμ4
F: GAG CAC ACC ATT ATC ACA CAG AC
R: CAG CTT GTC AGC ATA GAG ATT GTC
Protocolo de amplificação dos locos microssatélites
As amplificações por PCR foram otimizadas para o volume final de 25µl
com 70ng de DNA alvo. A concentração final para a otimização da reação foi
realizada com tampão de PCR 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,3mM de cada DNTP
(Invitrogen, USA), 2,5 pmol de cada primer, 1U Taq DNA polimerase (Invitrogen,
USA). Após a realização destes ajustes nas condições de amplificação por PCR,
obteve-se uma amplificação satisfatória com o protocolo de termociclagem
apresentado na Tabela 2.
Para a observação da amplificação dos loci STRs, após as reações de PCR, as amostras submetidas à eletroforese em gel de agarose a 2% em tampão TBE 1X durante 50
minutos a 10 V/cm.
Etapas
Temperatura (ºC)
Tempo (segundos)
Ciclos
Desnaturação inicial
94
300
1
Desnaturação
94
30
Anelamento
X
60
Extensão
72
60
Extensão final
72
300
Armazenamento
4
∞
30
∞
X: temperatura de anelamento específica para cada primer.
RESULTADO E DISCUSSÃO
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Neste estudo as amplificações do conjunto de primers Hraniµ1 esteve de acordo
com o tamanho esperado, entre 260 e 280 pares de bases (Figura 1 - 1). Entretanto, com
o conjunto de primers Hraniµ4 (Figura 1 - 2) os alelos amplificados ficaram acima do
tamanho esperado, aproximadamente entre 300 a 400 pb.
estudos, Goiânia, v. 41, especial, p. 147-154, nov. 2014.
Tabela 2: Protocolo de termociclagem de marcadores microssatélites, otimizados para
a espécie Hypsiboas albopunctatus.
estudos, Goiânia, v. 41, especial, p. 147-154, nov. 2014.
Figura 1: Gel de agarose a 1,5% indicando a amplificação dos loci 1= Hraniµ1 e 2= Hraniµ 4 transferido
para espécie Hypsiboas albopunctatus.
O aumento nos números de repetições de alelos microssatélites pode ser atribuído
a uma possível inserção de íntrons a qual está sujeito o genoma dos organismos. Para a
confirmação desta hipótese, a amostra deverá ser sequenciada. Embora a diminuição da
temperatura de anelamento no processo de PCR possa, teoricamente, resultar em maior
sucesso de amplificação, temperaturas abaixo de 60 ºC se mostraram insatisfatórias por
não ser útil para a identificação de locos polimórficos.
Estudos demonstram que a amplificação cruzada de marcadores microssatélites declinam à medida que a distância genética entre os táxons aumenta. Portanto as relações
filogenéticas entre o grupo focal e o grupo teste são de extrema importância para o sucesso
da transferência dos marcadores (PRIMER; MERILA, 2002 apud OLIVEIRA, 2012).
Tendo em vista a relação genética do H. raniceps e o H. albopunctatus, apenas a distância
genética entre os táxons não seriam suficientes para explicar a baixa taxa de amplificação,
já que há grande similaridade genômica de grupos tão filogeneticamente relacionados.
A amplificação de 2 locos comuns entre H. raniceps e o H. albopunctatus, testados
demonstram que os dados estão condizentes com aqueles apresentados nas literaturas.
Primer e Merila (2002), obtiveram 27% de amplificações positivas em estudo de transferibilidade para o grupo Rana, contudo, este aumento no percentual de locos transferidos
podem ser relacionados a uma maior identidade genética entre as espécies do gênero.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Deve-se levar em consideração que há ainda uma quantidade de trabalhos relacionados a anuros utilizando microssatélites muito escasso, menos ainda com utilização
de transferibilidade entre espécies relacionadas.
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Existem muitos trabalhos na área vegetal e com animais de interesse zootécnico, mas
há necessidade também de se desenvolver esses estudos com os anfíbios, especialmente
os anuros, por sua enorme importância ecológica, e no caso do grupo aqui estudado, a
importância da resistência aos ambientes antropizados.
Deve-se considerar ainda, que o aumento verificado nos números de repetições de
alelos microssatélites demonstra que a amostra deverá ser sequenciada. Poderia se considerar abaixar a temperatura para a fase de anelamento na PCR, porém temperaturas
abaixo de 60ºC se mostraram insatisfatórias em outros estudos.
E deve-se levar em conta também que a amplificação de 2 locos comuns entre
H. raniceps e o H. albopunctatus, que apresenta um aumento no percentual de locos
transferidos podem ser relacionados a uma maior identidade genética entre as espécies
do gênero.
CROSS-AMPLIFICATION MICROSATELLITE MARKERS OF SPECIES OF THE
GENUS HYPSIBOAS
Abstract: the objective of this research, was to verify the ability to amplify microsatellite markers for species Hypsiboas raniceps to Hypsiboas albopunctatus. Through this
type of test, the use of tracers in early developed and characterized phylogenetically
related species is allowed. This process is called transferability.
Keywords: Hypsiboas. Transferability of primers. Microsatellite. Genetic conservation.
Referências
ARRUDA, M. P. et al. Development of eleven polymorphic microsatellite markers for
the Chaco Treefrog, Hypsiboas raniceps. Conservation Genetics Resources. Campinas, v. 2, n. 1, p. 93-96, 2010.
BLAUSTEIN, A. R. Chicken Little or Nero’s fiddle? A perspective on declining amphibian populations. Herpetologica, Baltimore, v. 50, n. 1, p. 85-97, 1994.
CONTE, M. Desenvolvimento de Microssatélites e Análise Populacional de Espécies
de Physalaemus do grupo ‘cuvieri’ (Anura, Leiuperidae). Tese (Doutorado em Biologia Celular e Estrutural) - Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2009.
FAIVOVICH, J. et al. Systematic Review of the Frog Family Hylidae, with Special
Reference to Hylinae: Phylogenetic Analysis and Taxonomic Revision. Bulletin of the
American Museum of Natural History, Nova Iorque, n. 294, 240p, 2005.
FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de Marcadores Moleculares em Análise Genética. EMBRAPA-CENARGEN, Brasília, 3. ed., 220p, 1998.
GUIMARÃES, L. D.; BASTOS, R. P. Vocalizações e Interações Acústicas em Hyla
raniceps (Anura, Hylidae) durante a Atividade Reprodutiva. Iheringia, Goiânia, v. 93,
n. 2, p. 149-158, 2003.
152
HADDAD, C. F. B.; PRADO, P. A. Reproductive modes in frogs and their unexpected diversity in the Atlantic Forest of Brazil. BioScience, São Paulo, v. 55, n. 3,
p. 207-217, 2005.
estudos, Goiânia, v. 41, especial, p. 147-154, nov. 2014.
BASTOS, P. B. Preservar Sapos e Rãs. Rev. UFG, Goiânia, ano X, n. 4, 2008.
ICMBio, Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade. 2014. Uma Análise da Lista Brasileira de Anfíbios Ameaçados de Extinção. Disponível em: <http://
www.icmbio.gov.br/portal/images/stories/biodiversidade/faunabrasileira/livro-vermelho/volumeII/Anfibios.pdf>. Acesso em: 08 maio 2014.
MÖLLER, M. Comparações e novas abordagens no desenvolvimento de marcadores
microssatélites. Seminários em Genética e Melhoramento de Plantas. USP – ESALQ.
2009.
NUNES, R. R. A.; FAGUNDES, V. Cariótipos de oito espécies de anfíbios das subfamílias Hylinae e Phyllomedusinae (Anura, Hylidae) do Espírito Santo, Brasil. Bol.
Mus. Biol. Mello Leitão, Vitória, n. 23, p. 21-36, 2008.
OLIVEIRA, H. H. P. Diversidade Genética de Hilídeos do Brasil Central. Dissertação
(Mestrado em Biologia Celular e Molecular) - Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2012.
PRIMMER, C. R.; MERILA, J. A low cross-species amplification success in Ranid
frogs. Conserv. Genet. Durham, n. 3, p. 445-449, 2002.
ROSA, A. J. M. Marcadores Moleculares e suas Aplicações em Estudos Populacionais
de Espécies de Interesse Zootécnico. 1.ed. Planaltina – DF: Embrapa Cerrados, 2009.
SILVA, M. F. N. et al. Transferibilidade de Primers Microssatélites de Phaseolus vulgaris para Vigna unguiculata. Anais eletrônicos do III CONAC, Recife, PE. 5p. 2013.
estudos, Goiânia, v. 41, especial, p. 147-154, nov. 2014.
SÁ, F. P. História natural de Hypsiboas albopunctatus na região de Rio Claro, estado
de São Paulo. Rio Claro, 2010. Disponível em: <http://www.athena.biblioteca.unesp.
br/exlibris/bd/tcc/brc/3142/2010/sa_fp_tcc_rcla.pdf>. Acesso em: 16 ago. 2014.
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* Recebido em: 13.11.2014. Aprovado em: 26.11.2014.
YNGRID OLIVEIRA RODRIGUES
Graduanda de Biologia da Pontifícia Universidade Católica de Goiás (PUC Goiás). E-mail: [email protected]
LÍLIAN DE SOUZA TEODORO
Graduanda de Biologia da PUC Goiás. E-mail: [email protected].
FERNANDA RIBEIRO GODOY
Doutoranda de Biologia e Biodiversidade da Universidade Federal de Goiás (UFG).
E-mail: [email protected]
HUGO HENRIQUE DE PÁDUA OLIVEIRA
Mestre em Biologia Celular e Molecular pela UFG. E-mail: hugohenrique3000@yahoo.
com.br.
DANIELA DE MELO E SILVA
Professora do Instituto de Ciências Biológicas da UFG. E-mail: silvadanielamelo@
gmail.com
ALEX SILVA DA CRUZ
Doutorando em Biologia pela Universidade Federal de Goiás (UFG). Professor do
Departamento de Biologia da PUC Goiás. E-mail: [email protected]
LYSA BERNARDES MINASI
Núcleo de Pesquisa REPLICON, Pontifícia Universidade Católica de Goiás. E-mail:
[email protected].
CLAUDIO CARLOS DA SILVA
Núcleo de Pesquisa REPLICON da PUC Goiás. LaGene – Laboratório de Citogenética
Humana e Genética Molecular, SES GO. E-mail: [email protected]
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APARECIDO DIVINO DA CRUZ
Núcleo de Pesquisa REPLICON da PUC Goiás. LaGene – Laboratório de Citogenética
Humana e Genética Molecular, SES GO. E-mail: [email protected].
estudos, Goiânia, v. 41, especial, p. 147-154, nov. 2014.
APARECIDO DIVINO DA CRUZ
Professor do Departamento de Biologia da PUC Goiás. Coordenador do Núcleo de
Pesquisas Replicon da PUC Goiás. E-mail: [email protected].