Vacinas de nova geração para Rotavirus

Vacinas de nova
geração para
Rotavirus
Paula Alves
Laboratório de Tecnologia de Células Animais
Ciência em Portugal – Ciência 2007
A5 – Biologia, Biotecnologia, Bioquímica
Lisboa, 13/Abril/2007
Rotavirus
¾ Causa de ~ 40% das hospitalizações devidas a Gastroenterites agudas
¾ Aprox. 600.000 mortes/ano em 111 millhões de episódios de diarreia aguda em
crianças com idades inferiores a 5 anos)
Vacinas para ROTAVIRUS
(no mercado desde 2006)
Reoviridae Family
VP1
VP2
VP4
RotaTeqTM (aprovada pela FDA)
RotarixTM
VP6
(aprovada pela EMEA)
VP7
VP3
Virus atenuados em cultura
98 nm
VACINAS DE NOVA GERAÇÃO
VLP (Virus Like Particles) – Partículas Semelhantes a Vírus
VLP’s (Virus Like Particles) – Partículas Semelhantes a Vírus
i. Eficazes - mimetizam particulas virais nativas
(conformação e apresentação dos antigénios ao sistema imunitário)
ii. Seguras (não contêm material genético – ADN e ARN)
iii. Custos reduzidos (após optimização dos processos de produção)
VLP’s já no mercado:
¾ Hepatite B (desde 1986)
¾ 2006 - Virus do Papiloma Humano (HPV) :
Gardasil® e Cervarix®
Primeira vacina no mercado contra o cancro cervical
VLP’s com
UMA única
proteína viral
@ Lab
TCA
¾
VLP para PPV (irá ser comercializada pela Ingenasa
(Espanha)
¾
VLP candidata para HIV (utilizada em testes de diagnostico
pela Innogenetics (Bélgica)
Rotavirus-Like Particles
~ 75 nm
~ 64
nm
VLP para ROTAVÍRUS
OBJECTIVO
“Re-desenhar” o
genoma do
Baculovirus
(a nível dos
promotores dos genes
das proteinas
recombinantes)
Monomeros das
proteínas virais nas
proporções e nos
tempos ideais
(Estequiometria e
termodinâmica)
Desenvolvimento
de Bioprocessos
para produção de
Rota
VLPs
Expressão
das proteínas
“Re-desenhar”
estratégias de
infecção
(MOI and TOI)
Particulas duplas 2/6 VLP
Monomeros de VP7
Infecção com 3 Baculovirus Recombinantes
(transportam genes que codificam as
proteínas vp2, vp6 e vp7)
vp2 gene
vp6 gene
Trimeros de VP6
Monomers of VP7
1
Partículas 2/6/7 VLP (triplas)
7
vp7 gene
2
6
VP6
H+
H+
H+
H+
VP7
H+ H+ H+
H+ H+
H+
H+
VP2
4
H+
5
vDNA
3
Membrana Celular
Membrana Nuclear
mRNA
Infecção
Expressão dos genes
Montagem VLPs
Purificação
™Caracterização das
cinéticas de infecção
dos baculovirus
™Tráfego viral na
célula hospedeira
™Replicação do
transADN (vp2, vp6
and vp7)
™Transcrição - mARN
(vp2, vp6 and vp7)
™Produção das
proteínas recombinantes
(VP2, VP6 and VP7)
™Montagem em
partículas formadas
correctamente (três
camadas)
™Estratégias de
assembly/disasembl
y/reasembly
™VLPs Purificação
Técnicas
analíticas
™Q-PCR
™RT-Q-PCR
™Western blot, HPLC,
Proteína total
™Western blot, HPLC,
Proteína total
™ELISA
™Espect. de massa
™Microscopia
™Gradientes de
CsCl (ultracentrif.)
™Filtração Gel
™Chromatografia
™Ultrafiltração
1,6
6,0
1,0
0,8
4,5
0,6
3,0
j
7,5
1,2
V (Virus.ml -1)×106
Ni (Cell.ml-1)×106
Cinéticas de Infecção
do Baculovirus
e tráfego viral
MODELAÇÃO DA PRODUÇÃO
DE VLP’s PARA ROTAVIRUS
9,0
1,4
0,4
1,5
0,2
0
24
48
72
96
120
DNA6T (CopiesDNA.cell-1)× 104
0
0
144
Time (hpi)
Replicação ADN
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0
0
24
48
72
96
120
144
96
120
144
96
120
144
Time (hpi)
Expressão dos genes
RNA7 (CopiesDNA.cell-1)×103
12
Sintese do mARN
10
8
6
4
2
0
0
24
48
72
Time (hpi)
1,6
Produção
Protein de
Production
Proteinas
VP7 (AU.ml -1)×103
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
700
0
Montagem dasVLPs
VLP (μg.ml -1)
600
0
500
24
48
72
Time (hpi)
400
300
200
100
0
bVP2+bVP6+bVP7
bVP2/6/7
Colaboração com grupo Rui Oliveira
Monomeros das
proteínas virais nas
proporções e nos
tempos ideais
(Estequiometria e
termodinâmica)
Redesenhar o
genoma do
Baculovirus
Desenvolvimento de
Bioprocessos para
produção de Rota
VLPs
Expressão
das proteínas
“Redesenhar”
estratégias
de infecção
1. Antonis AF, Bruschke CJ, Rueda P, Maranga L, Casal JI, Vela C, Hilgers LA, Belt PB, Weerdmeester K, Carrondo MJ, Langeveld JP., 2006. A novel recombinant virus-like
particle vaccine for prevention of porcine parvovirus-induced reproductive failure. Vaccine, 24(26): 5481-90
2. Vieira, HLA, Estevão, C, Roldão, A, Peixoto, C, Sousa, M, Cruz, PE, Carrondo MJT, Alves, PM (2005) “Triple layered rotavirus VLP assembly: kinetics of vector replication,
mRNA stability and recombinant protein production”, Journal of Biotechnology, 120: 72-82
3. Vieira, HLA, Pereira, ACP, Carrondo, MJT, Alves, PM (2006) “Catalase effect on apoptosis for the improvement of recombinant protein production in baculovirus-insect cell
system”, Bioprocess Biosystems Engineering., 29, 409-414.
4. Peixoto, C, Sousa, MFQ, Silva, AC, Carrondo, MJT, Alves, PM (2007) “Downstream Processing of Triple-layered Rotavirus Like Particles”, Journal of Biotechnology, 127,
452-461
5. Roldão, A, Vieira HLA, Alves, PM, Oliveira, R, Carrondo, MJT (2007) Intracellular dynamics in Rotavirus-like particles production: Evaluation of multigene and monocistronic
infection strategies. Process Biochemistry, 41, 2188-2199.
6. Roldão, A, Vieira, HLA, Charpilienne, A, Poncet, D, Roy, P, Carrondo, MJT, Alves, PM, Oliveira, R (2007) Modeling Rotavirus-Like Particles production: infection kinetics,
baculovirus DNA replication, mRNA synthesis and protein production” J Biotechnology, 128(4): 875-894.
FCT-UNL (Portugal)
Rui Oliveira
LSHTM (UK)
Polly Roy
CNRS (France)
Jean Cohen
Didier Poncet
Annie Charpilienne
Karolinska (Sweden)
Lennart Svensson
Hopitaux de Paris (France)
Nathalie Parez
RVC (UK)
Janice Bridger
CIC Vaccinologie C Pasteur (France)
Odile Launay
Financiamento
European Commission (QLRT-2001-01249)
FCT (FCT/POCTI/BIO/55975/2004)
SFRH/BPD/14575/2003
SFRH/BD/21910/2005
Lab TCA (ITQB/IBET)
Equipa Rotavirus
Paula Alves
Helena Vieira
Cristina C. Peixoto
Marcos F.Q. Sousa
Rosário Clemente
Manuel J. T. Carrondo
António Roldão
Claudia Istrate
Catarina Estêvão
Candida Mellado