Fosforilação oxidativa
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Aula de Bioquímica II – SQM04242015201 Bacharelado em Ciências Físicas e Biomoleculares Tema: Fosforilação Oxidativa Cadeia transportadora de elétrons Prof. Dr. Júlio César Borges Depto. de Química e Física Molecular – DQFM Instituto de Química de São Carlos – IQSC Universidade de São Paulo – USP E-mail: [email protected] Fosforilação oxidativa Fim das rotas metabólicas de produção de energia em organismos aeróbicos - Representa o estágio 3 do processo Acoplamento da oxidação de NADH e FADH2 e síntese de ATP - É o principal sítio de produção de ATP - Envolve o consumo de O2 e formação de H20 Teoria Quimiosmótica - Fluxo de elétrons por carreadores criam um gradiente de concentração de prótons na membrana mitocondrial - A quebra deste gradiente está acoplada com a síntese de ATP Fosforilação oxidativa LOCAL: MITOCÔNDRIA - Organela de eucariotos Possui duas membranas Membrana Mitocondrial externa - MME - Permeável a pequenas moléculas Membrana Mitocondrial interna - MMI - Impermeável a maioria das moléculas - Inclusive H+ - Necessidade de transportadores de membrana Espaço intermembranal -Cristas membranais Matriz mitocondrial - Local de oxidações - Ciclo de Krebs - β-oxidação de lipídeos - Oxidação de Aminoácidos Mitocôndria Os carreadores que transportam os elétrons do NADH e FADH2 até O2 estão na MMI A oxidação de NADH e FADH2 é promovida pela CTE Alguns desses centros redox são móveis ou proteínas integrais de membrana Fosforilação oxidativa LOCAL: MITOCÔNDRIA Fosforilação oxidativa MMI -~ 75% de proteínas: mais rica em proteínas do que a MME LOCAL: MITOCÔNDRIA A impermeabilidade da MMI para a maioria dos íons e metabólitos permite a formação de um gradiente de íons através dessa barreira Resulta na compartimentalização das funções metabólicas entre o citosol e a mitocôndria -É permeável a O2, CO2 e H2O - Contém proteínas de transporte que controlam a passagem de metabólitos, como ATP, ADP, o piruvato, o Ca2+ e o fosfato A MMI contém proteínas que acoplam processos: Fluxo de elétrons (favorável) com o fluxo de prótons (desfavorável); Fluxo de prótons (favorável) a fosforilação oxidativa (desfavorável). Os elétrons passam por uma série de carreadores Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA Os carreadores que transportam os elétrons do NADH e FADH2 até O2 estão na MMI - A oxidação de NADH e FADH2 é promovida pela cadeia de transporte de elétrons - Alguns desses centros redox são móveis ou proteínas integrais de membrana - Dependem dos grupos protéticos associados A sequência de carreadores de elétrons reflete seus potenciais de redução relativos O processo é exergônico Transporte de e’ 1) 1 e’ Fe3+ para Fe2+ 2) 1 e’ + 1 H+ 3) 2 e’ na forma de :H- Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA Potencial de transferência de elétrons E0 = potencial de redução = potencial redox = potencial de oxidorredução Par redox Forma oxidada (oxidante) → X Forma reduzida (redutor) → − X H+ : H2 Potencial de redução = E0 = 0 V Potencial de redução = E’0 = -0,414 V Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA Potencial de transferência de elétrons Potencial de redução ˂ 0 A forma oxidada tem menor afinidade por elétrons do que o H2 Potencial de redução ˃ 0 A forma oxidada tem maior afinidade por elétrons do que o H2 Um agente redutor forte (como o NADH) tem a tendência de doar elétrons (E’0 < 0); um agente oxidante forte (como o O2) está pronto para aceitar elétrons (E’0 > 0) A força impulsora da fosforilação oxidativa é o potencial de transferência de elétrons de NADH e FADH2 em relação ao do O2 Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS NADH + H+ + ½ O2 NAD+ + 1 H2O A ∆G da reação pode ser medida a partir da diferença de voltagem entre meias células + ⇋ + [ Ared ][ Boxn+ ] ∆G = ∆G + RT ln n+ n [ Aox ][ Bred ] 0' - Se ∆G = − w' = − wel referente ao trabalho elétrico realizado a pressão e volume constante -Se o wel = nf∆E onde f é a constante de Faraday (96.485 Cmol-1) e - n é o número de e’/mol, portanto: ∆G = − nf∆E Reorganizando n+ [ A ][ B RT 0' red ox ] ∆E = ∆E − ln n+ n nf [ Aox ][ Bred ] Equação de Nernst - O ∆E0‘ representa o potencial de redução padrão nas condições padrões para bioquímica - Um Valor positivo para o ∆E (potencial de redução ou força eletromotiva) sugere espontaneidade da reação - um valor positivo para o ∆E representa um valor negativo para o ∆G Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS Acetaldeído + NADH + H+ Acetaldeído + 2H+ + 2e’ Fluxo de e’ NAD+ + 2H+ + 2e’ NAD+ + 1 Etanol 1 Etanol NADH + H+ E’0 = -0,197 V E’0 = -0,320 V ∆E 0' = E 0' aceptor − E 0' doador ∆E 0' = −0,197 − ( −0,320) = 0,123 V ∆G = − nf∆E '0 '0 ∆G '0 = −2(96,5kJ / V .mol )(0,123V ) ∆G '0 = −23,7 kJ / mol Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA Os carreadores de e´ NAD(P)H São carreadores de elétrons solúveis em água, que se associam reversivelmente a desidrogenases Substrato reduzido + NAD(P)+ ↔ **Desidrogenases Substrato oxidado + NAD(P)H + H+ remoção de 2 átomos de H do substrato :H- → NAD+ H+ → Liberado do meio NADH → carreador de elétrons das vias catabólicas até a entrada na CTE NADPH → geralmente supre elétrons para reações anabólicas [NADH] [NAD+ ] Nas células NADH Razão baixa carreador de e- no catabolismo [NADPH] [NADP+ ] Razão alta NADPH Poder redutor a reações anabólicas Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA Os carreadores de e´ Flavoproteínas Contêm um nucleotídeo de flavina (FMN ou FAD) → parte do sítio ativo da flavoproteína Pode aceitar 1 elétron → semiquinona ou 2 elétrons → FADH2 FMNH2 A forma oxidada (FMN) reage com um próton e um elétron, convertendo-se na forma semiquinona (FMNH●); a incorporação de mais um próton e um elétron resulta na forma totalmente reduzida (FMNH2). Flavoproteínas podem participar da transferência de 1 ou 2 e- → intermediários entre reações onde 2e- são doados (desidrogenações) e onde 1 e- é doado (redução de uma quinona a hidroquinona). Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA Os carreadores de e´ Carreadores não podem atravessar a MMI, MAS os equivalentes redutores podem ser lançados através da membrana indiretamente Equivalentes redutores termo geral para um elétron ou equivalente de elétron na forma de um átomo de hidrogênio ou de um íon hidreto. Ocorrem 3 tipos de transferência de elétrons na CTE ① Transferência direta como na redução de Fe3+ a Fe2+ ② Transferência na forma de um átomo de hidrogênio (H+ + e-) ③ Transferência como íon hidreto (:H+) que tem 2 elétrons + 3 tipos de moléculas carreadoras de elétrons atuam na CTE: ① Ubiquinona (quinona hidrofóbica) ② Citocromos ③ Proteínas ferro- enxofre Proteínas (diferentes) que contêm ferro Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS Os carreadores de elétrons na mitocôndria COENZIMA UBIQUINONA (Q) - Pequena e Lipossolúvel Quinona → composto benzênico com duas funções cetona Aceita 1 elétron Constituída de unidades isoprenóides (cada uma com 5C) A coenzima Q10 é a mais comum em mamíferos (10 unidades de isopreno) Fácil de desprotonar, formando um radical aniônico de semiquinona Aceita 2 elétrons Forma que fixa mais firmemente seus prótons Lipossolúvel → se difunde livremente no espaço intermembranas → Capaz de fazer a junção entre o doador de 2e- e um aceptor de 1e- (como as flavoproteínas) → Carrega tanto elétrons como prótons ** acopla fluxo de e- com o movimento de prótons Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS Os carreadores de elétrons na mitocôndria PROTEÍNAS COM CENTROS DE FERRO-ENXOFRE - Estrutura variável simples a complexas - O íon Fe sofre reações de óxido-redução Os átomos de ferro estão ligados a átomos de enxofre inorgânico ou com átomos de enxofre em resíduos de cisteína ou com ambos Podem ter de 1 a 4 átomos de ferro *** Proteínas ferro-enxofre de Rieske 1 Fe está associado com dois resíduos de His ao invés de Cys Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS Os carreadores de elétrons na mitocôndria Citocromos a, b e c Seus grupos prostéticos – grupos Heme Citocromo c solúvel no espaço intermembrana Podem interagir com a MMI Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS O fluxo de elétrons pelos carreadores vai daquele com menor potencial para o maior potencial NADH Q Cit b Cit c1 Cit c Cit a Cit a3 O2 Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS Os carreadores de elétrons na MMI: 4 complexos Complexo I é do NADH para formar Ubiquinol NADH:Ubiquinona-oxidoreductase ou NADH-desidrogenase Complexo II é do FADH2 para formar Ubiquinol Succinato-desidrogenase Complexo III é do Ubiquinol para o Citocromo c Ubiquinona:Citocromo c-oxidoreductase Complexo IV é do Citocromo c para o O2 Citocromo c-oxidase Fosforilação oxidativa COMPLEXO I: NADH:UBIQUINONA-OXIDOREDUTASE OU NADH-DESIDOGENASE Grupos prostéticos: FMN e Fe-S Porta de entrada dos e’ do NADH produzidos dentro da mitocôndria -O Complexo catalisa 2 processos simultâneos e acoplados 1) NADH + H+ + Q NAD+ + QH2 Exergônico 2) Transferência de 4 H+ para o espaço intermembrana Endergônica Fosforilação oxidativa COMPLEXO II: SUCCINATO-DESIDOGENASE Porta de entrada dos e’ do FADH2 produzidos no ciclo do ácido cítrico Porta de entrada dos e’ do NADH produzidos no citoplasma - Canaliza diretamente os e’ do succinato para a cadeia transportadora de e’ FADH2 + Q FAD + QH2 Exergônico Sem transferência de H+ para o espaço intermembrana Porta de entrada de e’ de outras vias oxidativas - β-oxidação de ácidos graxos Fosforilação oxidativa COMPLEXO I E COMPLEXO II 4) Vias de entrada de e’ para a ubiquinona: 1) NADH mitocondrial, 2) Succinato do ciclo do ácido cítrico, 2) 3) e’ da β-oxidação de ácidos graxos via Acil-CoA- 3) 1) desidrogenase e do glicerol dos triacilglicerois 4) NADH citosólico via glicerol 3-fosfato A ubiquinona é o ponto de convergência dos e- (Fontes 1 a 4) O ubiquinol de todas essas reações (pool de QH2) é oxidado no Complexo III Fosforilação oxidativa COMPLEXO III: UBIQUINONA:CITOCROMO C-OXIDOREDUTASE Canaliza os 2 e’ do Ubiquinol (QH2) para o Citocromo C com a transferência de H+ da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana - possui duas unidades de Citocromo b enterrados em 1 fenda na membrana QH2 + 2 Citc1 (Oxi) + 2 H+N Q + 2 Citc1 (Red) + 4 H+P Fosforilação oxidativa COMPLEXO III: UBIQUINONA:CITOCROMO C-OXIDOREDUTASE 2 e’ do Ubiquinol são afunilados no Citc carreador de 1 e’ 2 ciclos de redução do Citc com a formação da Semiquinona (.Q-) 1º Ciclo -1 e’ do QH2 é passado para o Citc no primeiro ciclo e o outro e’ (via citocromo b) para a Q formando Semiquinona - 2 H+ transportados para o espaço intermembrana 2º Ciclo -1 e’ do QH2 é passado para o Citc e o outro e’ (via citocromo b) para a Semiquinona formando outra QH2 + - 2 H transportados para o espaço intermembrana - 2 outros H+ são retirados da matriz 1º Ciclo 2º Ciclo Fosforilação oxidativa COMPLEXO IV: CITOCROMO OXIDASE Os e’ do Citocromo c são entregues ao O2 4 Citc (Red) + 8 H+N + O2 4 Citc (Oxi) + 4 H+P + 2 H2O Os e- do citocromo c são entregues ao O2 (reduzindo-o a H2O) Composto por 13 subunidades aparentemente 3 são essenciais Sub. II: 2 Cu ligados a resíduos de Cys (centro binuclear CuA) Sub. I: 2 grupos heme (a e a3) e outro íon Cu (CuB) Heme a3 e CuB forma outro centro binuclear Fosforilação oxidativa COMPLEXO IV: CITOCROMO OXIDASE Os e’ do Citocromo c são entregues ao O2 4 Citc (Red) + 8 H+N + O2 Envolve a participação de: Ion CuA Citocromo a Citocromo a3-CuB (Centro Fe-Cu) O2 4 ciclos são necessários para reduzir 1 O2 a 2 H2O 4 H+ transportados para o E.I. 4 outros H+ são retirados da matriz para formar as 2 H2O 2 H+ por par de e- 4 Citc (Oxi) + 4 H+P + 2 H2O Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS Resumo do processo Equação Vetorial do transporte de Prótons pela cadeia NADH + 11 H+N + ½ O2 NAD+ + 10 H+P FADH2 + 6 H+N + ½ O2 FAD+ + 6 H+P + + 1 H2O 1 H2O Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS NADH + NADH/NAD+ O2/H2O H+ + NAD+ ½ O2 E0’ = + 0,320 V E0’ = +0,816 V TEÓRICO + 1 H2O ∆E0’= E0’Red + E0’oxi = + 1,14 V ∆G0' = −nf∆E 0' = −2(96,5kJ / V .mol )1,14V = −220kJ / mol(deNADH) Succinato + ½ O2 Fumarato + 1 H2O ∆G 0' = −nf∆E 0' = −2(96,5kJ / V .mol).0,785V = −150kJ / mol(deSuccinato) A razão da [NADH]/[NAD+] >1 o que sugere que a ∆G é mais negativa do que -220 kJ/mol! E energia liberada é usada para gerar um gradiente de prótons que é então utilizado para a síntese de ATP e para o transporte de metabólitos pela membrana mitocondrial Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS EFETIVO A energia da transferência de e’ é eficientemente conservada em um gradiente - Gradiente de prótons - Gradiente eletroquímico Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS FORÇA PROTON-MOTRIZ ENERGIA ELETROQUÍMICA A ∆G associada ao processo de criação dos 2 gradientes é: C2 ∆G = RT ln( ) + zf∆ψ C1 C2 = H+p C1 = H+n Lado positivo da MMI Lado negativo da MMI Espaço intermembrana Matriz mitocondrial Z = valor absoluta da carga elétrica 1 para 1 H+ ∆Ψ = Diferença do potencial transmembrana pH = − log[H + ] C2 ln = 2,3(log[H + ]p − log[H + ]n ) = 2,3( pHn − pHp ) = 2,3∆pH C1 Logo: ∆G = 2,3RT∆pH + zf∆ψ = (5,7kJ / mol ).∆pH + (95,6kJ / mol ).∆ψ Fosforilação oxidativa CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS A ∆pH da MMI é de 0,75 unidades de pH A ∆Ψ da MMI é de 0,15-0,20 V ∆G = (5,7kJ / mol ).0,75 + (95,6kJ / mol ).0,15 = 19kJ / mol A ∆G associada à oxidação de 1 mol de NADH é: Equação Vetorial do transporte de Prótons pela cadeia NADH + 11 H+N + ½ O2 NAD+ + 10 H+P Logo: ∆G = 19 kJ/mol*10 = ~190 kJ/mol ∆G0’ = 220 kJ/mol + 1 H2O Fosforilação oxidativa SISTEMAS DE TRANSPORTE MITOCONDRIAL Espaço intermembrana: entre a MME e MMI - equivalente ao citosol no que se refere às concentrações em metabólitos e íons A MMI é composta por cerca de 75% de proteínas mais rica em proteínas MME - A MMI é permeável a O2, CO2 e H2O - Contém proteínas de transporte que controlam a passagem de metabólitos, como ATP, ADP, o piruvato, o Ca2+ e o fosfato A impermeabilidade da MMI para a maioria dos íons e metabólitos permite a formação de um gradiente de íons através dessa barreira Resulta na compartimentalização das funções metabólicas entre o citosol e a mitocôndria Fosforilação oxidativa SISTEMAS DE TRANSPORTE MITOCONDRIAL Transporte seletivo de elétrons produzidos no citoplasma para a mitocôndria - O NADH produzido no citosol pela glicólise deve ter acesso à cadeia transportadora de elétrons para a oxidação aeróbica - Não há uma proteína transportadora de NADH na MMI - Somente os elétrons do NADH citosólico são transportados para a mitocôndria por um dos vários sistemas de transporte LANÇADEIRA DE MALATOASPARTATO Fosforilação oxidativa SISTEMAS DE TRANSPORTE MITOCONDRIAL LANÇADEIRA DE GLICEROL-3-P A glicerol-3-fosfato desidrogenase catalisa a oxidação do NADH citosólico pela DHAP para produzir NAD+, o qual retorna à glicólise Os elétrons do glicerol-3-fosfato são transferidos para a Flavoproteína-desidrogenase da MMI, formando FADH2, O FADH2 fornece elétrons diretamente para Cadeia Transportadora de Elétrons Fosforilação oxidativa SISTEMAS DE TRANSPORTE MITOCONDRIAL TRANSLOCADOR DE ATP/ADP-PI A maior parte do ATP gerado na matriz mitocondrial pela fosforilação oxidativa é utilizado no citosol A MMI contém um translocador de ADPATP (ou adenina-nucleotídeo translocase) - Transporta o ATP para fora da matriz mitocondrial acoplado à importação de ADP e Pi produzidos no citoplasma a partir de ATP - Sistema antiporte - Mantém balanço eletrolítico pelo gasto de energia quimiosmótica
