SELEÇÃO DE ISOLADOS DE Trichoderma sp. PROVENIENTES DA
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1 Uni ANHANGUERA – CENTRO UNIVERSITÁRIO DE GOIÁS CURSO DE AGRONOMIA SELEÇÃO DE ISOLADOS DE Trichoderma sp. PROVENIENTES DA REGIÃO SUL DO BRASIL PARA O CONTROLE DE Sclerotinia Sclerotiorum LETICIA DIAS DE FREITAS GOIÂNIA Dezembro/2014 2 LETICIA DIAS DE FREITAS SELEÇÃO DE ISOLADOS DETrichoderma sp. PROVENIENTES DA REGIÃO SUL DO BRASILPARA O CONTROLE DE Sclerotinia sclerotiorum Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Curso de Agronomia do Centro Universitário de Goiás, UniANHANGUERA, sob orientação do Dr. Murillo Lobo Junior, como requisito parcial para obtenção do bacharelado em Agronomia. GOIÂNIA Dezembro/2014 3 TERMO DE APROVAÇÃO LETICIA DIAS DE FREITAS SELEÇÃO DE ISOLADOS DE Trichoderma sp. PROVENIENTES DA REGIÃO SUL DO BRASIL PARA O CONTROLE DE Sclerotinia sclerotiorum Trabalho de conclusão de curso apresentado à banca examinadora como requisito parcial para obtenção do Bacharelado em Agronomia do Centro Universitário de Goiás - UniANHANGUERA, defendido e aprovado em 24 de Novembro de 2014 pela banca examinadora constituída por: ______________________________________ Dr. Murillo Lobo Junior (Orientador) ______________________________________ Prof. MSc. Jardel Barbosa dos Santos (Membro) _____________________________________________ Prof.ª Dr.ª Luciana Domingues Bittencourt Ferreira (Membro) 4 Dedico primeiramente à Deus, razão de todas as coisas. À minha família, amigos, colegas de classe, professores e todos os que participaram de alguma forma desta conquista. 5 AGRADECIMENTOS Agradeço ao Centro Universitário de Goiás – UniANHANGUERA pela oportunidade em me tornar bacharel em Agronomia. Aos meus pais Edvaldo Parreira de Freitas e Maria Lúcia Dias de Freitas, pelos valores e princípios que me foram ensinados, pelo apoio constante, por serem minha referência em caráter e humildade e pelo amor incondicional que dedicaram à mim em todos esses anos. Às minhas irmãs Marina e Edlene, por serem minhas primeiras e eternas amigas e por me ensinarem que partilhar momentos é uma maneira de eternizá-los em nossos corações. Aos meus cunhados Bruno e Daniel e ao meu afilhado Enzo, por fazerem parte deste alicerce tão importante chamado família. Aos meus professores, pela dedicação e comprometimento em cumprir tão bem a missão de transferir conhecimento, formando profissionais “pensantes”. Aos meus colegas de classe, pelos momentos de descontração e também de conflitos, pela troca de opiniões e por terem tornado estes quatro anos inesquecíveis para mim. Ao meu orientador Dr. Murillo Lobo Junior e à toda equipe do laboratório de Fitopatologia da Embrapa Arroz e Feijão, em especial ao Laboratório de Ecologia, que tornaram este trabalho possível. Aos meus amigos pelo apoio durante todo curso e por compreender minhas ausências. À toda equipe do Uni-ANHANGUERA pelo cuidado em atender as necessidades de toda a turma e garantir a realização deste curso. 6 Pouca Ciência torna os homens orgulhosos; muita Ciência os torna humildes. Assim, as espigas vazias elevam a cabeça soberba, enquanto as cheias inclinam-se humildemente para a terra”. (Anônimo) "E mesmo que meus passos sejam falsos, mesmo que os meus caminhos sejam errados, mesmo que meu jeito de levar a vida te incomoda, eu sei quem sou, e sei pelo que devo lutar, se você acha que meu orgulho é grande, é porque nunca viu o tamanho da minha (Tião Carreiro) FÉ!" 7 RESUMO Mofo-branco causado pelo fungo Sclerotinia sclerotiorum ocorre frequentemente em feijão, soja, algodão, e mais 400 espécies. Provoca perdas de até 100% e inviabiliza áreas de cultivo. O controle químico apresenta pouca eficiência, pois aplica-se para proteção das plantas, sem alcançar o inóculo do fungo que está no solo. O controle biológico por meio de espécies do fungo Trichodermasp. oferece bons resultados no controle do mofo-branco. Porém, formulados comerciais disponíveis apresentam melhor desempenho em temperaturas próximas a 25ºC. Nota-se redução da eficiência do controle por Trichoderma em regiões com temperaturas moderadas, ideais para ocorrência do mofo branco. O objetivo do trabalho foi selecionar um ou mais isolados de Trichoderma sp. eficientes no controle de S. sclerotiorum a baixas temperaturas. Com o método do bioensaio, preparou-se suspensão de conídios de Trichoderma sp. com concentração de 2x109conídios/mL aspergidos sobre escleródios, e avaliou-se por 30 dias o parasitismo de escleródios de S. sclerotiorum por 27 isolados de Trichoderma sp., da coleção de microrganismos funcionais da Embrapa Arroz e Feijão. Após 30 dias sob 20°C e fotoperíodo de 12 horas, escleródios foram desinfestados e colocados sobre discos de cenoura para avaliar parasitismo e viabilidade. Grande maioria dos isolados de Trichoderma sp. apresentou baixo índice de parasitismo, exceto os isolados TR770 e TR832 os quais proporcionaram mais de 80% de parasitismo. A viabilidade dos escleródios em geral, foi alta, com médias de até 100% de escleródios viáveis. Porém, destacou-se o isolado TR770, com apenas 20% dos escleródios viáveis após aplicação, diferindo dos demais tratamentos. Concluiu-se que em condições de baixa temperatura os isolados de Trichoderma sp. em sua maioria, apresentaram pouca eficiência no controle. Porém, a avaliação da coleção de culturas permitiu a seleção do isolado TR770, que apresentou potencial para o controle do fungo Sclerotinia sclerotiorum sob temperaturas amenas. PALAVRAS-CHAVE:Mofo-branco. Controle biológico.Bioensaio. Coleçãode culturas. 8 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 2 REFERENCIAL TEÓRICO 9 10 2.1Doenças de plantas como causa de perdas de produtividade 11 2.2Mofo-branco e seu manejo 13 2.3Controle biológico 16 2.4Trichoderma como agente de biocontrole de S. sclerotiorum 20 3 MATERIAL E MÉTODOS 23 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 27 5 CONCLUSÕES 29 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 32 9 1 INTRODUÇÃO A população mundial nos últimos 30 anos aumentou em 1 bilhão de pessoas, com uma expectativa de 7,2 bilhões de consumidores em 2015. Deste modo há uma elevação da demanda mundial por alimentos, incluindoproteínas de origem vegetal e animal. O aumento na demanda por grãos provindos do Brasil é estimado em 20% (NEVES, 2009) o que gera oportunidades para o crescimento da agropecuária e um desafio em atender esse mercado em crescimento constante. Existem vários fatores que podem impedir o bom desenvolvimento do agronegócio, entre eles, está a falta de investimento do país em logística, principalmente em relação ao escoamento da produção, na melhoria de estradas, etc. Mas por outro lado, há riscos que se encontram ainda nos sistemas de produção, como os problemas fitossanitários que os produtores enfrentam em suas lavouras, na forma de epidemias de pragas e doenças, que colocam em risco a produção agrícola e todo o investimento aplicado. Como afirma Blum (2006), as perdas provocadas por problemas fitossanitários nas culturas dependem de cada região e dos tipos de práticas adotadas para o manejo e controle dessas enfermidades. De acordo com este mesmo autor, as doenças ou fitomoléstias são alterações deletérias ou maléficas, de ordem bioquímica, fisiológica, citológica, histológica ou morfológica na planta, que constituem os sintomas provocados pela ação contínua de fitopatógenos sobre esses indivíduos.De acordo com Carvalho et al.(2011), a presença de patógenos nas culturas, principalmente habitantes do solo, também provocam perdas de qualidade das sementes e causam desuniformidade na germinação, reduzindo o estande inicial e os rendimentos finais para o produtor. Para que ocorra a doença na planta, é necessária a interação entre três fatores cruciais, que compõem o triângulo da doença: presença de patógeno virulento na área, condições climáticas que favoreçam o desenvolvimento do mesmo e hospedeiro susceptível àquela espécie de patógeno.O homem contribui de forma positiva ou negativa para a ocorrência de doenças na área de cultivo, pois é dele a decisão quanto à época de semeadura, que pode coincidir com a época favorável ao patógeno; a variedade a ser cultivada, que deve ser resistente ou tolerante, se houver essa opção; e a escolha de sementes livres de contaminantes, preferencialmente tratadas com fungicidas específicos, além da rotação de culturas com espécies que não sejam hospedeiras (VIEIRA; PAULA JÚNIOR; BORÉM, 2006). Como exemplo de um importante fitopatógeno pode-se citar o fungo causador do 10 mofo-branco, Sclerotinia sclerotiorum, que ocorre com frequência nos campos brasileiros, principalmente em cultivos de soja e feijão. O manejo de doenças de plantas, visa impedir a entrada do patógeno na área de produção, quando este não está presente pelo método da exclusão, em que utiliza-se sementes sadias e tratadas; além do isolamento do campo de produção, a correta limpeza dos implementos que serão utilizados, entre outras práticas. Porém, quando o patógeno já se encontra na área, deve-se optar pela rotação de culturas, incorporação profunda de restos de cultura contaminados, que visa a erradicação ou redução da densidade de inóculo (VIEIRA; PAULA JÚNIOR; BORÉM, 2006). Os danos provocados pelo uso excessivo de produtos químicos é assunto recorrente em várias partes do planeta, procura-se substituir ou diminuir este uso para assim, reduzir os efeitos maléficos ao meio ambiente. Como afirma Grigoletti, Santos e Auer (2005), o uso indiscriminado de agrotóxicos gera vários efeitos como a seleção de patógenos resistentes, surtos de doenças antes consideradas secundárias, redução dos organismos benéficos presentes na microbiota do solo, danos à saúde humana, aos animais, ao meio ambiente por meio do acúmulo de resíduos nos solos, água e alimentos, entre outros.A partir daí, surgiu a necessidade de se buscar fontes alternativas de controle, como o controle biológico de doenças de plantas, em que utiliza-se espécies de microrganismos que por meio de mecanismos próprios conseguem inibir ou reduzir o efeito danoso do patógeno sobre a planta. O controle biológico com espécies de Trichoderma vêm sendo retratado em várias publicações e com várias espécies de fitopatógenos. Como destaque o controle do fungo S. sclerotiorum por espécies do fungo Trichoderma sp.Dentre vários trabalhos publicados, com os mais variados resultados, há um déficit quando se trata do controle do mofo-branco em condições ótimas de desenvolvimento da doença, definidas como alta umidade do solo e temperaturas amenas a baixas (15° a 20°C). O Trichoderma, por sua vez, atua melhor na faixa próximo a 25ºC. Esta diferença entre faixas de atuação pode gerar reflexos negativos na eficiência destes produtos no campo, pois é necessário que o produtor controle esta doença em sua época mais favorável. Como afirma Johnson, Bernard e Qian (1987),Trichodermasp. é relatado como importante agente de biocontrole para doenças de solo, como as provocadas por Rhizoctonia sp., Pythium spp., entre outros, porém, apresenta eficiência limitada com doenças mais severas em condições de baixa temperatura. Com isso, o objetivo do trabalho foi selecionar isolados de Trichoderma spp.,que apresentem eficiência no controle de Sclerotinia sclerotiorum, identificando os isolados mais promissores para etapas mais avançadas de seleção de antagonistas. 11 2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Doenças de plantas como causa de perdas de produtividade As perdas na produção causadas por doenças são conhecidas há muitos anos, como a requeima da batata, provocada pelo fungo Phytophthora infestans, que causou a morte de milhões de pessoas entre os anos de 1845 a 1846 na Irlanda, ou a contaminação de produtos provindos de trigo ou cevada pelo fungo Claviceps purpurea, que causa o ergotismo em seres humanos, e em casos mais graves até a morte (AMORIM; REZENDE; BERGAMIN FILHO, 2011). De acordo com Ghini e Bettiol (2000), as doenças ocorrem para manter o equilíbrio biológico e a ciclagem de nutrientes, porém estas se apresentam de forma endêmica, provocando epidemias, resultado da interferência humana neste equilíbrio, que favorece o aumento de microrganismos maléficos, como o cultivo de plantas geneticamente homogêneas. O fator ambiental tem grande influência na ocorrência de doenças, como afirma Ghini (2005): “o ambiente pode influenciar no desenvolvimento e na suscetibilidade da planta hospedeira, a multiplicação, a sobrevivência e as atividades do patógeno, assim como na interação entre planta hospedeira e patógeno”. E reforçamAgrios e Sutton(1997; 1988 apud DIAS et al., 2005, p. 546), “as variáveis climáticas, entre elas a temperatura, exercem importância crucial tanto na infecção quanto na colonização do patógeno, constituindo a variável climática mais correlacionada com respostas biológicas”. Tal importância é relatada em estudos como realizado por Dias et al. (2005), que avaliou o efeito da temperatura no crescimento micelial, produção e germinação de conídios de Colletotrichum sp., encontrou-se a faixa de temperatura entre 22°C e 28°C como a temperatura ideal para o desenvolvimento deste microrganismo. Com diferentes resultados entre os isolados, percebeu-se que a temperatura é uma das principais variáveis que influenciam na infecção e colonização do patógeno sobre o hospedeiro. No campo, as áreas irrigadas por pivô central apresentam geralmente umidade do solo mais elevada, e aliadas a temperaturas amenas (15ºC a 20ºC), proporcionamaos microrganismos boas condições para seu desenvolvimento. Como afirmam Vieira; Paula Júnior e Borém (2006), técnicas que visam o melhor aproveitamento dos recursos e uma melhor produtividade, como o uso da irrigação e adoção doSistema Plantio Direto (SPD), além de vantagens têm apresentado desafios no manejo das lavouras, principalmente quando se trata de doenças causadas por patógenos habitantes dosolo, que encontram nestes locais, condições altamente favoráveis para se desenvolverem. Porém, há também trabalhos que 12 relatam sobre o benefício da palhada do SPD na proteção de plantas em relação a algumas doenças, como o mofo-branco, pois o fungo encontra uma barreira física no momento de liberação de suas estruturas reprodutivas (GÖRGEN et al., 2009). Vários são os casos relatados na literatura sobre patógenos que atacam as culturas, sejam elas de valor econômico ou não, como no trabalho realizado pelos autores Oliveira et al. (2014), em queavaliaram a ocorrência de fungos sobre as folhas de mudas de espécies da Caatinga, responsáveis por provocar manchas foliares. Entre as espécies encontradas estão Oidium sp., Ovulariopsis sp. e Uromyces sp., Alternaria sp.,Colletotrichum sp., dentre outros. Em cultivos de importância econômica, pode se citar como exemploa lavoura de soja, que no final do seu ciclo produtivo é atacada por vários patógenos, que compõem o complexo de doenças de final de ciclo, como exemplo a mancha parda, causada pelo fungo Septoria glycines e a mancha púrpura causada por Cercospora kikuchii. Este conjunto de doenças provocam perdas de produtividade de grãos acima de 30% (CARNIEL; MENOSSO; BALBINOT JÚNIOR, 2014). No cafeeiro, entre as enfermidades de grande importância para a cultura estão aquelas provocadas por espécies de fungos do gênero Colletotrichum. Este fungo provoca doenças como a antracnose em folhas, frutos e ramos, seca de ponteiros e a mancha manteigosa que causam a perda da produtividade do café (PEREIRA et al., 2005). No arroz, dentre as doenças ocorridas está o mal-do-pé causada por Gaeumannomyces graminis que provoca amadurecimento rápido dos grãos e até morte dos perfilhos, o sintoma característico da doença é a coloração marrom escura ou preta na bainha, na base do colmo, o que provoca a morte da planta em estádios avançados. Em experimento objetivando-se o controle genético desta doença, avaliou-se 12 genótipos de arroz em relação à resistência relativa, com resultados pouco satisfatórios, em que todos os genótipos avaliados, apresentaram reação de suscetibilidade (PRABHU; FILIPPI, 2002). No tomate, dentre outras doenças, ocorre a septoriose ou mancha-de-septória causada pelo fungo Septoria lycopersici, cada vez mais recorrente nos campos de produção.O patógeno causa severa desfolha o que reduz a produtividade e qualidade dos frutos, com perdas de 100% da produção em alguns casos (RIBEIRO et al., 2013). Alguns exemplos de doenças que ocorrem no maracujazeiro são a mancha bacteriana (Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae), queima foliar (Thanatephorus cucumeris), antracnose (Colletotrichum gloeosporioides), vírus do endurecimento dos frutos do maracujazeiro (CABMV), verrugose (Cladosporium herbarum e Sphaceloma sp.), entre outras. Elas provocam a morte precoce da planta, queda na qualidade e produtividade dos 13 frutos. Em experimento realizado com objetivo de avaliar a incidência de tais doenças sobre seis híbridos e quatro cultivares de maracujazeiro, obteve-se 100% de incidência entre as plantas com diferentes graus de intensidade de infestação (FREIRE, et al., 2014). Há também relatos da ocorrência de doenças em cultivos protegidos (estufas) sendo estas, algumas vezes, mais graves do que as ocorridas em ambiente convencional, devido às condições ambientais mais favoráveis ao desenvolvimento de patógenos (irrigação, densidade de plantas, monocultivo) e o bom estado nutricional apresentado pelas plantas, o que eleva a predisposição das mesmas ao ataque de microrganismos. Os danos provocados por tais doenças além de causar danos aos cultivos, podem inviabilizar a atividade em algumas áreas (VIDA et al., 2004). As sementes utilizadas no cultivo de qualquer cultura, devem ser a primeira preocupação do agricultor, pois junto a elas, podem vir sementes de outras espécies indesejáveis e/ouinóculos de doenças que ocasionará danos à lavoura e consequente redução de produtividade. De acordo com Choudhury (1985) entre os danos causados por sementes infectadas estão a redução da qualidade das sementes, perda de vigor e consequente perda de germinação, queda na produção e introdução de fitopatógenos em áreas isentas. Além disso, a produção de alimentos deve adotar algumas normas e exigências, pois como afirma Neves (2009), o mercado apresenta consumidores cada vez mais exigentes e preocupados com o modo de produção dos países, o que exige maior preparo do agronegócio nacional.E reforçam Pria e Silva (2010), o perfil dos consumidores tem sofrido alteração ao longo dos anos, que estão mais exigentes em qualidade, mas que esta qualidade esteja associada ao mínimo de degradação dos recursos naturais.Ghini e Bettiol (2000) ainda afirmam que, a preocupação da sociedade em relação ao impacto da agricultura no meio ambiente e a contaminação da cadeia alimentar com produtos químicos, têm feito surgir segmentos de mercado com produtos diferenciados, que não utilizam químicos ou que apresentem certificação/selos que comprovem a boa utilização desses produtos.Surge a partir daí, a demanda por uma agricultura sustentável, que visa produzir suprindo as necessidades das gerações atuais e futuras, degradando o mínimo possível o meio ambiente. 2.2 Mofo-branco e seumanejo O primeiro registro da ocorrência de S. sclerotiorum no Brasil aconteceu em 1921 em lavouras de batata (Solanum tuberosum L.) no Estado de São Paulo (CHAVES, 1964), com a transmissão do patógeno por meio de sementes. Atualmente, a doença está presente em 14 todas as regiões agrícolas do país. Nos sintomas iniciais, como descritos por Purdy (1979), há a formação de micélio branco e escleródios tanto no interior como em volta da planta. A presença do micélio branco e cotonoso dá origem ao nome da doença (NASCIMENTO, 2012), e são notados nos tecidos infectados, que se tornam secos, leves e quebradiços e as sementes perdem o brilho, com aspecto enrugado e mais leves (VIEIRA; PAULA JÚNIOR; BORÉM, 2006). O fungo causador do mofo-branco é conhecido desde 1884 por provocar danos em hortaliças como a queda de plântulas (damping-of), em cidades do hemisfério norte (PURDY, 1979). De acordo com Nascimento (2012), omofo-branco,ocorre em regiões com temperaturas amenas e alta umidade, como a Região Sul do Brasil e Chapadas dos Cerrados.O fungo apresenta uma ampla gama de hospedeiros, com exceção das gramíneas (NASCIMENTO, 2012). Como relatado por Purdy (1979) esta doença se tornou muito importante nos cultivos de girassol no Estados Unidos, em 1920, e logo depois em plantações de amendoim, damasco, figo, tomates em estufa, entre outros. Henneberg et al. (2012) ainda ressalta que sua ocorrência está relacionada tanto em regiões temperadas como em tropicais e subtropicais e em condições favoráveis. Sua disseminação se dá principalmente por sementes infectadas. Porém, apesar da ocorrência do mofo-branco nas lavouras ser favorecida em áreas relativamente úmidas e frias, há relatos de sua ocorrência em locais quentes e secos. Purdy (1979) ressalta que o fungo se torna menos ativo em temperturas abaixo de 0°C e acima de 32°C. A infecção do fungo ocorre através da penetração de hifas e secreção de ácido oxálico na planta hospedeira. O ácido oxálico atua na reduçãodo pH da planta hospedeira e auxilia na produção de enzimas que degradam a parede celular, o que compromete as respostas de defesa do hospedeiro (CESSNA et al., 2000).Após a infecção são formadas estruturas de resistência negras e duras, conhecidas por escleródios que por ocasião da colheita caem sobre o solo e sobrevivem por vários anos.Quando as condições de umidade e temperatura favoráveis ao patógeno retornam, os escleródios germinam formam os apotécios, responsáveis por liberar os ascósporos, inóculo primário do fungo (NASCIMENTO, 2012), que infectam as flores das hospedeiras (PURDY, 1979).Quando as flores infectadas caem sobre hastes, folhas ou vagens do feijoeiro, ocorre a infecção das plantas. Os ascósporos permanecem no campo por até 12 dias, e são dispersos pelo vento (FREIRE, 2011) e porrespingos d’água provindos da chuva ou da irrigação, e são depositados nas plantas da mesma área ou em cultivos próximos (VIEIRA; PAULA JÚNIOR; BORÉM, 2006). 15 Nascimento (2012) ressalta que a germinação de apotécios é influenciada pelo fechamento das fileirasda cultura, e é intensificadopelo menor espaçamento entre linhas.Ethuri et al. (2005) destaca que, a germinação miceliogênica do escleródio, que forma o micélio branco característico da doença, ataca a base da planta mais próxima e causa tombamento de pré e pós-emergência, quando a germinação é carpogênica, dando origem ao apotécio, há a liberação de ascósporos (esporos do fungo) e o ataque se iniciará geralmente na parte aérea pela infecção de flores. De acordo com Goulart (2013), o mofo-branco foi constatado pela primeira vez na cultura do algodoeiro em 1996 na cidade de Paracatu, Minas Gerais, onde se cultivava a variedade Deltapine. Freire (2011), ressalta que os primeiros relatos ocorreram nos estados da Bahia e Goiás em áreas cultivadas anteriormente com feijão irrigado por pivô central. Apesar de também ter sido constatada em áreas com algodão de sequeiro, em regiões de altitude, com redução do estande inicial e danos severos em plantas adultas. Os sintomas na cultura do algodão são murcha, necrose e podridão úmida em hastes, pecíolos e maçãs. Os escleródios são formados tanto na parte externa quanto interna das maçãs do algodoeiro, sendo estes maiores do que os formados em soja e feijão, e sobrevivem no solo por vários anos. Quando há condições ambientais favoráveis, os escleródios germinam dando origem a muitos apotécios.Atualmente, a doença está disseminada em quase todas as áreas produtoras, independentemente de serem áreas de cultivo irrigado ou sequeiro. A introdução desta doença em áreas ainda isentas, ocorre principalmente por sementes infectadas com micélio dormente ou com escleródios misturados ou aderidos à elas. Provavelmente,a doença foi introduzida nos campos de produção dos Cerrados, principalmente por sementes de nabo forrageiro, canola, feijão, girassol, soja e algodão contaminadas com estruturas do fungo (GOULART, 2013). O micélio dormente presente nas sementes infectadas, mantêm-se viável por até três anos ena maioria das vezes estes não germinam, mas permanecem viáveis (REIS, 2009).Assim como menciona Goulart (2013), a disseminação da doença ocorre pelo manejo inadequado dos fatores de produção, como a utilização de sementes impróprias, que foram mal ou não beneficiadas, sementes piratas, implementos agrícolas que foram utilizados em áreas contaminadas e que não passaram por um processo de limpeza adequado. O controle químico de doenças é utilizado na maioria das culturas de importância agronômica, já que estas apresentam elevada susceptibilidade à fitopatógenos. Os fungicidas são uma alternativa viável de controle pela fácil aplicação se comparado a outros métodos, e por apresentar geralmente resultados rápidos e satisfatórios. Porém, o uso excessivo desses 16 produtos pode induzir a resistência de fitopatógenos ao ingrediente ativo que o compõe, além dos danos ambientais (BLUM, 2006). De acordo com dados da FAO (Food and Agriculture Organization) em 1998, o Brasil é apontado como um dos países que mais exageram na aplicação de agrotóxicos nas lavouras, principalmente na horticultura (MORAGAS; SCHNEIDER, 2003). Ghini e Bettiol (2000), afirma que o uso de químicos é um método atraente por sua simplicidade, previsibilidade e necessidade de pouco conhecimento sobre o agroecossistema para sua aplicação porém, estima-se que 90% do que é aplicado não atinge o alvo, sendo dissipado para reservatórios de água ou para o solo. Essas perdas provêm da má aplicação, tanto da tecnologia utilizada quanto do momento que o produto foi aplicado. O manejointegrado de doenças (MID) visa reduzir ou eliminar os danos causados pelas enfermidades nas plantas por meio de diferentes técnicas. Essas técnicas buscam atuar sobre os três vértices do triângulo da doença (planta hospedeira, patógeno virulento ou ambiente favorável), e assim reduzir consequentemente as condições favoráveis para que tal doença ocorra (BLUM, 2006). A rotação de culturas é uma das alternativas para o controle de enfermidades, e junto ao SPD há a formaçãoda palhada da cultura anterior que é utilizada por microrganismos, favorecendo o controle biológico natural, porém, esta tática só funciona para os primeiros focos da doença. Inicialmente, observa-se umaredução do inóculo da doença presente na área, no caso do mofo-branco, e de suas estruturas de resistência, os escleródios, como observadoem solos cultivados com soja erotacionados com cultivos contínuos de pastagem por um período de três anos (TRECENTI,2012).Outro método de controle é o tratamento de sementes com fungicidas, que é uma prática econômica e eficaz para evitar ou retardar a disseminação do fungo, além de auxiliara boa emergência das plântulas e diminuir as necessidades de ressemeadura (GOULART, 2013). De acordo com Freire (2011), não existem variedades resistentes ao mofo branco e o manejo químico além de oneroso, apresenta pouca eficiência, devido à barreira física apresentada pelo dossel da cultura no momento da aplicação. Umaferramenta para o controle do mofo-branco muito importante e bastante utilizada nos locais de ocorrência, é o controle biológico aplicado, por meio da introdução deantagonistas como espécies do fungo Trichoderma spp. 2.3 Controle biológico O uso do MID, auxilia na manutençãodas populações de patógenos abaixo do nível de dano econômico e minimiza os efeitos negativos ao ambiente (VIEIRA; PAULA JÚNIOR; 17 BORÉM, 2006). Dentro deste manejo integrado está o controle biológico de doenças, que se trata da“redução da densidade de inóculo ou das atividades determinantes da doença provocado por um patógeno ou parasita, nos seus estados de atividade ou dormência, por um ou mais organismos, realizado naturalmente ou por meio da manipulação do ambiente, hospedeiro ou antagonista, ou pela introdução em massa de um ou mais antagonistas”(BAKER e COOK 1974 apud GRIGOLETTI; SANTOS; AUER,2005). De acordo com Grigoletti, Santos e Auer (2005), o controle biológico quando comparado ao químico, não apresenta efeito imediato e total, sendo necessário integrar outros métodos de controle ao sistema. A eficiência do controle biológico está associada ao melhor conhecimento da interação patógeno x antagonista, e dos fatores edafoclimáticos, que podem se tornar limitantes ao potencial antagonístico do bioagente quando estiverem fora do ideal. Há muitos anos, os seres humanos têm adotado práticas empíricas de controle biológico de enfermidades de plantas. Esse conhecimento foi passado de geração para geração, até chegar nos modernos experimentos e técnicas adotadas atualmente. No século XX, vários cientistas introduziram, conscientemente, antagonistas em meios de cultivo contendo patógenos, e obtiveram bons resultados, como no experimento realizado por Hartley (1921), se testou o controle do tombamento de plantas com fungos selecionados in vitro (ROMEIRO, 2007). Os cientistas perceberam que era possível reduzir a severidade de doenças com microrganismos introduzidos ou nativos. A partir daí, muitostrabalhos foram publicados em torno deste tema. A busca pela produção sustentável de alimentos, deve levar em consideração a redução do uso de insumos químicosnas lavouras, principalmente os produtos fitossanitários, e optar por outras alternativas que favoreçam o processo biológico e natural em todo o sistema (PRIA; SILVA, 2010). De acordo com Ghini e Bettiol (2000), agricultura sustentável envolve o manejo adequado dosrecursos naturais, evitando a degradação do ambiente de forma a permitir asatisfação das necessidades humanas das gerações atuais e futuras. Dessa forma é possível reduzir o risco de surgimento de raças de organismos patogênicos resistentes a certos tipos de ingredientes ativos dos agroquímicos; a menor contaminação dos recursos naturais, como solos, rios, lençóis freáticos, etc., e manter os ecossistemas locais estáveis e equilibrados, entre outros benefícios (BLUM, 2006). O Controle biológico é uma boa alternativa, pois visa a manutenção do equilíbrio do agroecossistema, em que o antagonista por meiode mecanismos próprios, consegue reduzir os efeitos danosos da ação dos fitopatógenos ao hospedeiro, utilizando estratégias como a aplicação maciça de antagonistas, o que auxilia na alteraçãodo ecossistema de modo a 18 favorecer o desenvolvimento do bioagente (GRIGOLETTI; SANTOS; AUER, 2005). Como afirma Carvalho et al. (2011), o controle biológico pode reduzir a quantidade de produtos químicos aplicados na lavoura, ou até mesmo extinguir essa prática no processo produtivo, dependendo dos fatores ambientais encontrados na área, o grau de severidade que a doença se encontra e a forma de manejo adotado na cultura.Esta estratégia de controle pode ser usada desde o início do planejamento de uma lavoura, como no tratamento de sementes por meio de bactérias e leveduras para reduzir o mal-do-pé ou a giberela do trigo, ou ainda a proteção contra fungos maléficos presentes no solo que causam tombamento de plântulas, como Rhizoctonia solani (MARIANO, et al., 2004). Entre os organismos que apresentam potencial para atuarem como bioagentes, há espécies de fungos, bactérias, nematoides e vírus. As espécies de fungos e bactérias apresentam maior facilidade para a multiplicação massal, tornando mais prática a preparação de bioprodutos formulados que serão disponibilizadas ao comércio (BLUM, 2006), o que contribui para maior oferta desses produtos no mercado. Dentre os microrganismos mais utilizados para o desenvolvimento de bioprodutos, destacam-se para o controle de insetos as bactérias Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus e os fungos Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Lecanicillium spp. e Isaria spp. Já para as enfermidades de plantas, destacam-se a bactéria Bacillus subtilis e espécies do fungo Trichoderma (BETTIOL; MORANDI, 2009), largamente utilizado em pesquisas ao redor do mundo. Blum (2006) destaca que as espécies de fungo mais utilizadas sãoAcremonium, Ampelomyces, Arthrobotris, Candida, Pythium, Trichoderma, Tuberculina, Verticilium, etc., e as espécies de bactérias são Agrobacterium radiobacter, Bacillussubtillis, Erwinia herbícola, Pseudomonas fluorescens.Estes microrganismos originam produtos utilizados para os mais diversos agentes fitopatogênicos. Os agentes de biocontrole utilizam-se de mecanismos para atuarem sobre os fitopatógenos, caracterizados por hiperparasitismo, antibiose, competição, parasitismo, predação, hipovirulência, proteção cruzada e indução de resistência no hospedeiro (BLUM, 2006). Dentre os principais patógenos estudados para controle biológico estão Fusarium, Rhizoctonia, Macrophomina, Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis e Crinipellis, que atacam várias culturas como feijão, soja, algodão, fumo, morango, tomate, etc. (BETTIOL; MORANDI, 2009). De acordo com Grigoletti, Santos e Auer (2005), o parasitismo é o mais eficiente mecanismo de controle biológico natural pois, o antagonista necessita das mesmas condições do patógeno para sobreviver, sendo assim, quando estes bioagentes são coletados no mesmo ambiente onde serão utilizados, a possibilidade de se adaptarem e serem eficientes 19 é maior. Espécies de Trichoderma sp. podem atuar por meio de antibiose, competição ou hiperparasitismo, utilizando um mecanismo ou a associação de vários. O antagonista envolve a hifa do hospedeiro e cresce utilizando o conteúdo celular das células mortas e assim impede o crescimento do patógeno, além de parasitar estruturas de resistência, como escleródios de fungos (LIMA, et al., 2009). Vários trabalhos publicados visam o controle de doenças por meio de microrganismos antagonistas, como no trabalho realizado por Cunha et al. (2006), queanalisaram a inibição do crescimento de bactérias fitopatogênicas por rizobactérias, além da promoção do crescimento radicular e parte aérea da planta proporcionados por essas espécies benéficas. Utilizou-se isolados de B.subtillis, obtendo bons resultados na inibição do crescimento de Pseudomonas chichorii.Concluíram que em nível de campo, este método de controle pode substituir ou minimizar o uso de antibióticos nas lavouras de eucalipto.Em outros testes,desta vez realizados em laboratório, alguns microrganismos com potencial para se tornarem bioagentes foram avaliados, quanto à produção de sideróforos, quitinases ou celulases, alémda capacidade desses bioagentes em induzir resistência às plantas hospedeiras, obtendo resultados satisfatórios (BARRA et al., 2008). Melo e Valarini (1995), isolaram 18 rizobactérias da rizosfera do pepino e observaram que além de atuarem como protetoras do sistema radicular contra o crescimento de fitopatógenos, como o fungo Fusarium solani,por meio do mecanismo da antibiose,promoviam também o crescimento das plantas.Outros autores, avaliaramesta mesma classe de bactérias (rizobactérias) no controle de fungos que atacam a cultura do citros, como Phythophthora parasitica e P. citrophthora responsáveis por causar a podridão de raízes de mudas em condições de viveiro. Observou-se a inibição significativa do crescimento micelial dos patógenos, por meio da produção de substâncias tóxicas (antibiose), além de considerável promoção de crescimento das plântulas (AMORIM; MELO, 2002).Outro exemplo do uso de bactérias no controle biológico de enfermidades de plantas, utilizou-se isolados de Pseudomonas chlororaphis e Bacillus subtilis para o controleda podridão radicular (Pythium aphanidermatum) em alface hidropônica, obtendo bons resultados quanto à promoção de crescimento das plantas e à inibição do patógeno com a produção de antibióticos e competição por espaço e nutrientes (CORRÊA; BETTIOL; SUTTON, 2010). Ao comparar o efeito da aplicação de fungicidas biológicos à base de Trichoderma sp., para o controle da requeima do tomateiro, Souza et al. (2014), observou valores de severidade de doença entre 11,2 e 11,3%, o que sugere elevada eficácia do biocontrole, este sucesso pode estar associado à capacidade que este bioagente apresenta de sobressair aos 20 mecanismos de defesa dos patógenos, o alto potencial de competição e resistência aos fatores abióticos. Os autores concluíram que a capacidade micoparasítica das espécies de Trichoderma sp., o torna uma boa opção para o controle biológico do fungo Phythophthora infestans, causador da requeima, em condições de campo.Em outro estudo, objetivou-se encontrar antagonistas presentes naturalmente nas raízes de pepino cultivado em estufa, por meio do isolamento de fungos potenciais no controle do mofo-branco. No local foram encontrados isolados pertencentes a quatro gêneros: Trichoderma, Fusarium,Aspergillus e Penicillium, com destaque para o gênero Trichoderma, que apresentou maior número de isolados comtotal de 73, e melhor desempenho nos testes in vitro. Este fungo parasitou todos os escleródios formados pelo patógeno, e modificou a consistência dos mesmos (amolecimento) o que causou consequente perda da viabilidade dessas estruturas. Concluiu-se que isolados de Trichoderma sp. são excelentes agentes de biocontrole de S. sclerotiorum, além disso, seu uso não apresenta danos à saúde humana e ao meio ambiente (ETHURI, et al., 2005). Kupper, Gimenes-Fernandes e Goes (2003), encontraram resultados um pouco diferentes ao avaliar o potencial de controle de Colletotrichum acutatum que causa a queda prematura dos frutos cítricos, por isolados de Bacillus subtilis e espécies de Trichoderma sp., em testes realizados in vitro e in vivo. Não obtendo bons resultados no controle in vivo, por espécies de Trichoderma sp., devido ao curto período de incubação (48h), visto que, este fungo necessita de maior tempo para se estabelecer e apresentar eficiência pois, nos testes realizadosin vitro, o mesmo apresentou maior produção de metabólitos quando incubado por maior período de tempo. Já os isolados de B. subitilis proporcionaram os menores níveis de severidade da doença, por meio do mecanismo da antibiose, considerado desse modo um bom agente de controle para C. acutatum. 2.4 Trichoderma como agente de biocontrole de S. sclerotiorum O controle biológico do mofo-branco pode ser feito por biofungicidas à base de Trichoderma sp. A eficiência do bioproduto está relacionadaà eficiência da cepa selecionada, às condições ambientais e à concentração de esporos presente no formulado. Há relatos de sua maior eficiência em solos equilibrados, onde se utiliza SPD com boa formação de palhada (TRECENTI, 2012). Para que haja um efetivo controle, é necessário a redução de fatores como a quantidade de inóculo primário; a taxa de aumento de epidemias, e a duração da interação hospedeiro-patógeno (VIEIRA; PAULA JÚNIOR; BORÉM, 2006). 21 O primeiro estudo envolvendo espécies deTrichoderma sp. foi relatado no ano de 1936, em que se testou a inativação do vírus do mosaico comum do fumo por filtrados de culturas de Trichoderma (BETTIOL; MORANDI, 2009). Desde então, vários cientistas vêm se empenhando em pesquisas referentes a este tema, obtendo resultados diversos. Os autores Carvalho et al.(2011), testaram o controle de Sclerotinia sclerotiorum e outros fitopatógenos, sobre sementes de feijão inoculadas artificialmente. As sementes contaminadas foram tratadas com Trichoderma harzianum, e logo após colocadas para germinar. Avaliou-se a germinação em condições de laboratório e ao campo e o estado físico das plântulas. Como resultado, obtiveram no total, redução acima de 60% da incidência dospatógenos avaliados nas sementes. A redução da incidência deS. sclerotiorumnas sementes, particularmente, apresentou valores acima de 90% de eficiência, porém, não diferiu estatisticamente do controle químico sob as mesmas condições. Lima et al. (2009), utilizou meio de cultura rico em nutrientes, constituído de cenoura e fubá para o crescimento do fungo de Sclerotinia sclerotiorum, logo após, este micélio foi transferido para outra placa contendo micélio de Trichoderma sp. para avaliar o pareamento de culturas destes microrganismos, as placas inoculadas com os fungos, tanto de S. sclerotiorumquanto de Trichoderma sp., foram incubados a 25°C por um período de 120h, na ausência de luz. Obtendo resultados entre 0 a 2,6 escleródios formados pelo fungo S. sclerotiorum, com algumas destas estruturas parasitadas pelo fungo de biocontrole, e a maioria dos tratamentos apresentou redução do crescimento do patógeno. Em outro estudo, comparou-se a frequência de isolados de Trichoderma sp., extraídos de solos do Alasca, àqueles isolados tolerantes ao frio, extraídos de solos do Tennessee, e avaliou-se o crescimento desses isolados em diferentes temperaturas, a 10°C e 12°C, obtendo como resultado, maior esporulação em 12°C, com espécie mais frequente deT. viride (JOHSON; BERNARD; QIAN, 1987). A relação entre o potencial de biocontrole de doenças em regiões com temperaturas mais frias, e o local que os isolados foram coletados, não foi abordado pelos autores, podendo ser este o ponto crucial para o sucesso do biocontrole. Figueiredo et al. (2010), avaliou o possível controle de S. sclerotiorum por espécies de Trichoderma sp. e Ulocladium atrum juntamente com fungicidas químicos, os autores observaram resultados satisfatórios em relação aos isolados de Trichodermasp. para antagonismo, porém o isolado de U. atrum não foi eficiente para o controle de S. sclerotiorum. Com relação ao controle químico, todos os fungicidas testados apresentaram eficiência, com destaque para Tiofanato metílico. Ao aplicar os tratamentos simultaneamente 22 (químico e biológico) nos testes in vivo, houve redução de 30% da incidência da doença sobre as plantas. Geralmente o fungoTrichoderma sp. se desenvolve em temperaturas moderadas, com níveis ótimos e máximos para o bom desenvolvimento de seu metabolismo e propriedades antagonistas. Com isso, avaliou-se o antagonismo de isolados de Trichoderma sp. a isolados de Heterobasidion annosum, que ataca árvores de florestas boreais, em diferentes temperaturas, por meio do pareamento de culturas. Notou-se eficiência de 63% na inibição quando incubados sob 21°C, 33% sob 15°C, e crescimento lento e difícil dos isolados de Trichoderma quando colocados a 4°C, sendo que alguns dos isolados não apresentaram crescimento (NIKOLAJEVA et al., 2012). O que demonstra a forte influência da temperatura na eficiência do controle biológico. Como afirma Ghini (2005), “testes conduzidos em ambientes controlados podem caracterizar efeitos isolados de determinados fatores ambientais nas interações patógenohospedeiro” e “para doenças estudadas em ambientes fechados, os resultados geralmente não são representativos”. Corroborado por Grigoletti, Santos e Auer (2005), os testes realizados in vitro, apesar de sua praticidade para avaliar o comportamento do microrganismo em relação à adaptação, crescimento e reprodução, podem por muitas vezes, diferir dos resultados encontrados em campo.O teste do bioensaio se mostra viável devido a sua facilidade e por ser pouco oneroso, o que facilita sucessivas repetições. Porém, é necessário dispor de maior espaço para a realização do trabalho. Pois, para a coleta dos resultados é necessário de no mínimo 60 dias e durante este tempo novas baterias de testes poderão ser montadas em um outro local, o que evita que esse período fique ocioso. 23 3 MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi realizado no Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Arroz e Feijão, localizada em Santo Antônio de Goiás.Inicialmente, foi feita a produção massal de escleródios, por meio do método adaptado de Garcia, Juliatti e Cassemiro (2012). Neste procedimento, 100 grãos de feijão foram colocados em Erlemeyers de 250 ml de capacidade, contendo 10 ml de água destilada, e deixados em embebição por um período de 24 horas. Após esse período, os grãos de feijão passaram por um processo de autoclavagem a 121°C por 20 minutos. Decorridas mais 24 horas, foram inoculados com cinco discos de 6mm de diâmetro de BDA (Batata Dextrose Agar), em que se cultivou previamenteoisolado de Sclerotinia sclerotiorum SS-12obtido na coleção de fungos e microrganismos funcionais do Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Arroz e Feijão. Durante 30 dias, os Erlemeyers contendo grãos de feijão inoculados com S. sclerotiorum, foram mantidos em BOD’s a 25 °C, e submetidos a agitação manual diária para melhor formação de escleródios dentro do recipiente. Após o período de formação dos escleródios, eles foram submetidos à lavagem em água corrente, para total separação dos restos de feijão aderidos, e posteriormente colocados para secar em temperatura ambiente. Para a montagem do teste, foi utilizado o método do bioensaio,o qual mais se aproxima da realidade encontrada no campo e elimina efeitos tendenciosos encontrados nos testes in vitro. Utilizou-se caixas gerbox de 11 x 11 x 3,5 cm contendo 200 gramas de solo autoclavado, com umidade mantida próxima a 150% da capacidade de campo. Os escleródios obtidos em meio de feijão, foram dispostos sobre o solo em cinco linhas e cinco colunas, totalizando 25 escleródios por caixa e utilizou-se delineamento inteiramente ao acaso. (Figura 1). Essas caixas foram colocadas em sala climatizada com 20+ 1°C de temperatura e fotoperíodo de 12 horas. Preparou-se uma suspensão de esporos com concentração de 2x109conídios/mlde espécies do fungo Trichoderma spp., que foram aspergidos sobre estes escleródios para posterior avaliação. 24 Figura 1. Montagem do Teste do Bioensaio, com destaque para alinhamento de escleródios dentro da caixa gerbox (dir.) e delineamento inteiramente casualizado das caixas gerbox em sala climatizada (esq.). Os 27 isolados de Trichoderma spp. em estudo (Tabela 1) foram recuperados da coleção de fungos e microrganismos funcionais do Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Arroz e Feijão, provindos de solos do Estado doParaná. Para a produção de conídios de Trichoderma spp., utilizou-se 10 gramas de arroz parbolizado previamente autoclavado em Erlemeyers, por 40 minutos à 121°C (Figura 2). Após o resfriamento dos grãos de arroz, estes foram inoculados com cincos discos de 6mm de diâmetro de BDA, contendo o micélio do antagonista. Logo em seguida os recipientes foram colocados em incubadoras BOD’s e mantidos a 25 + 1°C por sete dias e fotoperíodo de 12 horas, submetidos a agitações diárias, para melhor formação de conídios sobre os grãos de arroz (Figura 3). Isolados TEST TR727 TR728 TR730 TR739 TR748 TR750 Origem PR PR PR PR PR PR PR Isolados TR755 TR757 TR758 TR762 TR770 TR773 TR776 Origem PR PR PR PR PR PR PR Isolados TR782 TR784 TR786 TR788 TR811 TR813 TR819 Origem PR PR PR PR PR PR PR Isolados TR822 TR824 TR825 TR832 TR833 TR835 TR836 Origem PR PR PR PR PR PR PR Tabela 1. Identificação dos isolados de Trichoderma sp. utilizados no experimento e seu local de origem. 25 Figura 2. Meio de cultivo à base de arroz parbolizado para produção de conídios de Trichoderma sp. Figura 3. Formação de conídios de Trichoderma sp. em grãos de arroz, após 7 dias de incubação. Decorridos os sete dias, houve boa formação micelial dentro dos recipientes, o que propiciou a continuidade dos procedimentos. Adicionou-se 5mL de água destilada dentro do Erlemeyer, para agitação e obter uma suspensão de conídios. Esta suspensão foi filtrada em tecido, dentro de tubos Falcon (Figura 4). Houve a diluição dessa suspensão, para ajuste da concentração de esporos para 2x109 conídios/mL. A contagem de conídios foi feita em câmera de Neubauer, com auxílio de microscopia ótica. Esta concentração de conídios foi escolhida de acordo com a quantidade de esporos viáveis indicada pelos fabricantes com produtos à base de Trichoderma sp. registrados no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). 26 Figura 4. Filtragem da suspensão de conídios de Trichoderma sp. Preparadas as suspensões, estas foram pulverizadas sobre os escleródios, com auxílio de um borrifador manual, sendo 10 mL de suspensão por caixa e três repetições por isoladode Trichoderma sp. (Figura 5). Além da testemunha em que houve a pulverização com água destilada. As caixas foram incubadas a 20°C + 1°C e submetidas a pesagens semanais, para acompanhamento da queda de umidade e consequente reposição de água, afim de manter a capacidade de campo próxima a 150%. Passados 30 dias, os escleródios foram submetidos à avaliação visual em relação ao parasitismo dos isolados de Trichoderma sp. As avaliações foram feitas de forma a avaliar a presença ou não de micélio característico do fungo de biocontrolesobre os escleródios, calculando-se assim a porcentagem de escleródios parasitados (Figura 6). Figura 5. Aspersão de suspensão de Trichoderma sp. sobre escleródios de Sclerotinia sclerotiorum. 27 Figura 6. Avaliação visual da presença de micélio de Trichoderma sp. sobre os escleródios. Após 60 dias da inoculação dos escleródios pelo Trichoderma sp., estes foram cuidadosamente removidos das caixas com solo e colocados, cada um, sobre discos de cenoura previamente esterilizadas, em placas de Petri, contendo um disco de papel filtro ao fundo, umedecido com 1um de água destilada, para manter a umidade dentro da placa, sem a adição de antibióticos. Após incubação por 5 dias a 20 °C, avaliou-se os escleródios quanto à sua viabilidade, por meio do crescimento micelial característico do fungo S. sclerotiorum sobre os discos de cenoura, que se trata de um substrato rico em nutrientes e portanto viável para o desenvolvimento fúngico, tanto de S. sclerotiorum quanto de Trichoderma spp.Em experimento com objetivo de testar diferentes meios para a produção massal de escleródios in vitro, observou-se bons resultados em relação aos meios de cultura contendo cenoura, grãos de feijão, girassol e fubá (GARCIA; JULIATTI; CASEMIRO, 2012). Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e ao teste de ScottKnot a 5% para separação de médias. 28 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Houve diferença significativa entre os tratamentos para avaliação do parasitismo de escleródios, com valores de 0% a mais de 80%. Os isolados foram divididos em três grupos.Em que houve baixo controle, os valores variaram de 0% a 30% de escleródios parasitados. Os isolados com desempenho intermediário alcançaram médias de 36% a 59%. Apenas dois isolados o TR770 e o TR832 apresentaram eficiência no parasitismo de escleródios superior a80% (Figura 7). Figura 7. Parasitismo de isolados de Trichoderma spp.sobre escleródios de Sclerotinia sclerotiorum, após pulverização manual, sob temperatura de 20°C. Os resultados se mostram importantes em relação ao comportamento do fungo em estudo, de forma a buscar a melhor forma para sua replicação em condições de campo, para uma melhor atuação do agente de biocontrole sobre o patógeno.Os autores Paula Júnior et al. (2012), que avaliaram a aplicação de Trichoderma sp., em cultivos de feijão de outonoinverno, na região da Zona da Mata Mineira, observaram que não houve efeito da aplicação de Trichoderma sobre a incidência de mofo-branco, com resultados de até 100% de severidade, fato este se deve às condições favoráveis ao desenvolvimento do patógeno encontradas nesta época do ano em que as temperaturas variaram de 15,4°C a 18,4°C, e a alta concentração de inóculo do fungo presente na área. A redução da doença só ocorreu nos tratamentos em que se utilizou fungicidas químicos. Os autores afirmam, ainda, que apesar de 29 apresentarem bons resultados no controle do mofo-branco em quase todas as áreas de cultivo pelo país, espécies de Trichoderma sp. podem não ser eficientes quando aplicados em regiões com temperaturas moderadas, visto que o antagonista é mais adaptado em temperaturas em torno de 25°C. A partir do gráfico percebe-se que houve 6% de parasitismo sobre os escleródios do tratamento testemunha, que foram pulverizados com água destilada. Este fato se deve ao parasitismo natural que ocorre nos solos, em situação de campo. Mesmo após o solo ter sido autoclavado, alguns microrganismos ainda permanecem nele, o que torna possível tal resultado. A viabilidade de escleródios determinada sobre discos de cenoura é mostrada no gráfico a seguir (Figura 8). Após o teste de Scott-Knot a 5% os isolados foram separados em 4 grupos, em que os dois primeiros (a e b) apresentam altos índices de viabilidade com médias em torno de 50% a 100% de escleródios viáveis. As letras c e d indicam viabilidade abaixo de 40%, apenas os isolados TR770, TR832 e TR 836 fazem parte destes grupos, com destaque para o isolado TR770 queapresentou diferença significativa em relaçãoaos outros tratamentos, com 20% de escleródios viáveis. Figura 8. Viabilidade de escleródios de Sclerotinia sclerotiorum após inoculação por isolados de Trichoderma spp., avaliada em discos de cenoura, com separação de médias pelo teste de Scott-Knot a 5%. 30 De acordo com estes resultados, será feita a identificação da espécie a que pertencem os isolados. Além do controle ao fungo causador do mofo-branco, pode-se testar também o controle de outros fungos fitopatogênicos habitantes do solo, como Fusarium sp., Rhizoctonia sp., entre outros, em diferentes faixas de temperatura e a recomendação deste controle para outras plantas hospedeiras de S. sclerotiorum. 31 5 CONCLUSÃO Os resultados se mostraram promissores para o objetivo principal do estudo, que é de selecionar um ou mais isolados que possuam eficiência no controle S. sclerotiorum em baixas temperaturas. Portanto, em vista da grande diversidade de isolados pertencentes à coleção de microrganismos do Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Arroz e Feijão, em torno de 900 isolados de várias partes do país, novos estudos deverão ser feitos com este mesmo objetivo. A maioria dos isolados de Trichoderma sp.testados neste trabalho não foi eficiente no parasitismo de escleródios de S. sclerotiorum. Os isolados TR770 e TR832 se destacaram com os melhores resultados para parasitismo e merecem ser encaminhados para novas etapas da seleção de antagonistas. O isolado TR770 apresentou os melhores resultados para parasitismo e viabilidadede escleródios, em relação aos isolados avaliados no estudo, o que demonstra seu potencial para controlar escleródios de S. sclerotiorum em condições de temperaturas amenas, porém, precisará ser feito estudos de campo. 32 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AHMADI, Mohammad Reza; JAVAN-NIK-KHAH, Mohammad; AGHJANI, Mohammad Ali; GHOBAKHLOOL, Marzie. 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PROVENIENTES DA REGIÃO SUL DO BRASILPARA O CONTROLE DE Sclerotinia sclerotiorum FREITAS, Leticia Dias de¹; LOBO JUNIOR, Murillo² ¹Aluna do curso de Agronomia do Centro Universitário de Goiás – Uni-ANHANGUERA. ²Orientador Dr. Murillo Lobo Junior, Embrapa Arroz e Feijão. Mofo-branco causado pelo fungo Sclerotinia sclerotiorum ocorre frequentemente em feijão, soja, algodão, e mais 400 espécies. Provoca perdas de até 100% e inviabiliza áreas de cultivo. O controle químico apresenta pouca eficiência, pois aplica-se para proteção das plantas, sem alcançar o inóculo do fungo que está no solo. O controle biológico por meio de espécies do fungo Trichodermasp. oferece bons resultados no controle do mofo-branco. Porém, formulados comerciais disponíveis apresentam melhor desempenho em temperaturas próximas a 25ºC. Nota-se redução da eficiência do controle por Trichoderma em regiões com temperaturas moderadas, ideais para ocorrência do mofo branco. O objetivo do trabalho foi selecionar um ou mais isolados de Trichoderma sp. eficientes no controle de S. sclerotiorum a baixas temperaturas. Com o método do bioensaio, preparou-se suspensão de conídios de Trichoderma sp. com concentração de 2x109conídios/mL aspergidos sobre escleródios, e avaliou-se por 30 dias o parasitismo de escleródios de S. sclerotiorum por 27 isolados de Trichoderma sp., da coleção de microrganismos funcionais da Embrapa Arroz e Feijão. Após 30 dias sob 20°C e fotoperíodo de 12 horas, escleródios foram desinfestados e colocados sobre discos de cenoura para avaliar parasitismo e viabilidade. Grande maioria dos isolados de Trichoderma sp. apresentou baixo índice de parasitismo, exceto os isolados TR770 e TR832 os quais proporcionaram mais de 80% de parasitismo. A viabilidade dos escleródios em geral, foi alta, com médias de até 100% de escleródios viáveis. Porém, destacou-se o isolado TR770, com apenas 20% dos escleródios viáveis após aplicação, diferindo dos demais tratamentos. Concluiu-se que em condições de baixa temperatura os isolados de Trichoderma sp. em sua maioria, apresentaram pouca eficiência no controle. Porém, a avaliação da coleção de culturas permitiu a seleção do isolado TR770, que apresentou potencial para o controle do fungo Sclerotinia sclerotiorum sob temperaturas amenas. PALAVRAS-CHAVE: Mofo-branco. Controle biológico. Bioensaio. Coleção de culturas.
