Apresentação do PowerPoint - IBB

Nutrição e Crescimento
Bacteriano
Prof. Adjunto Ary Fernandes Junior
Departamento de Microbiologia e Imunologia
Instituto de Biociências – UNESP
Tel. 14 3880.0412/0413
[email protected]
Características básicas das
bactérias
10 horas  1 bilhão de células
Estudos de Biologia Celular
95% do
peso
seco da
célula
Visão geral do metabolismo celular
Crescimento
bacteriano
+
Motilidade,
Luminescência,
etc
Nutrição: Fornecimento de substâncias
nutritivas para o crescimento
bacteriano
(Energia e Matéria Plástica)
Cultura: Propagação do microrganismo
em condições adequadas
(Exigências Nutricionais e Ambientais)
FATORES NUTRITIVOS (in vitro = in vivo)
Fatores de
Crescimento
NH
Na
Ca
Mg
K
Co
Fastidiosos
Zn Mo Se etc
Ex: Haemophilus influenzae
Hemina (fator X), NAD+ (fator V)
OBS. Não existe um meio de cultura universal
Classificação dos Meios de Cultura
(Substâncias nutritivas  Sintéticos e Complexos)
Classificação dos Meios de Cultura
(Estado fisico)  Agar
Líquido
(Turvação do
meio)
Sólido
(1,5 a 2,0%)
(Colônias)
Semi-Sólido
(0,5%)
(Movimento)
Classificação dos Meios de Cultura
(Poder Seletivo e Diferencial)
Agar Sangue
(Enriquecidos)
Agar Chocolate
Lowenstein - Jensen
Classificação dos Meios de Cultura
(Poder Seletivo e Diferencial)
(Seletivos)
(MAS – Manitol Salt Agar)
(Agar MacConkey)
(Meio seletivo para Bacillus cereus)
Classificação dos Meios de Cultura
(Poder Seletivo e Diferencial)
(Seletivos)
(Eosin Methilen Blue (EMB)
Oxoid Chromogenic Listeria Agar (OCLA)
Classificação dos Meios de Cultura
(Poder Seletivo e Diferencial)
(Diferencial)
(Agar Sangue)
(Padrão de Hemólise)
Classificação dos Meios de Cultura
(Poder Seletivo e Diferencial)
(Diferencial)
Lac +
Lactose (-)
Lac Lactose (-)
(Agar MacConkey)
(Fermentação da Lactose)
(Meio Cromogênico)
(E. coli/coliformes em alimentos e água)
Classificação dos Meios de Cultura
(Poder Seletivo e Diferencial)
(De Enriquecimento)
(Meio de Selenito Cistina)
(Meio de Tetrationato)
Etapas do preparo de um meio sólido
FATORES NUTRICIONAIS
ÁGUA - Solvente; Elevado Calor Específico;
Regula Pressão Osmótica; Participação em
Reações Químicas, Estrutura de
Macromoléculas, etc
FONTE DE ENERGIA = Doadores de Hidrogênio
*Fotossintetizantes  Fototróficas
Quimiossintetizantes  Quimiotróficas
(Quimiolitotróficas e Quimiorganotróficas)
FONTE DE ENERGIA = Doadores de Hidrogênio
RECEPTORES DE HIDROGÊNIOS
Respiração aeróbia  O2.
Respiração anaeróbia  NO3-, SO4-, CO2..
Fermentação  Fermentação Lática, Alcoólica, etc.
Respiração anaeróbia  receptor inorgânico ≠ do O2
(ex: SO42-, NO3-, CO2, S)
4 H2 + SO42- + H+  HS +4 H20
4 H2 + CO2  CH4 + 2 H20
Thiennimitr et al, 2011. Salmonella: the host and its microbiota. Current opinion in Microbiology, v.15, n.02, p.108-114, 2012.
Salmonella, the host and its microbiota. S. Typhimurium uses its virulence factors (flagella, T3SS-1 and T3SS-2) to invade the epithelium and
survive in mononuclear cells. The ensuing inflammatory response results in the epithelial release of an antimicrobial (lipocalin-2) that sequesters
iron chelators (enterobactin) produced by the microbiota, but not an iron chelator (salmochelin) produced by S. Typhimurium. ROS generated by
neutrophils migrating into the intestinal lumen oxidize an endogenous sulfur compound (thiosulfate) to generate a respiratory electron acceptor
(tetrathionate) that enables S. Typhimurium to edge out the fermenting microbiota, thereby enhancing transmission of the pathogen.
Fermentação Composto orgânico produzido durante o
próprio processo fermentativo.
CARBONO (Composição dos Compostos Orgânicos
-Compostos orgânicos - Quimio-heterotróficos.
-CO2 (Fotossíntetizantes) - Fotoautotróficos.
NITROGÊNIO (Proteínas, Ácidos Nucléicos, Coenzimas)
Orgânica - Aminoácidos, Sais Orgânicos de Amônia.
Inorgânica - NH3, NO3-, N2
ENXOFRE (Aminoácidos Sulfurados, Vitaminas)
-Forma orgânica (Radicais sulfidrilas);
-Forma inorgânica ( SO4- , H2S)
-Forma elementar
FÓSFORO (ATP, Ácidos Nucléicos, Fosfolipídeos, Coenzimas)
-Fosfato inorgânico (PO42- )
-Ca++
ATIVADORES DE ENZIMAS
Minerais na forma de sais:
-Mg++e K+ (Ribossomos)
-Fe++ (citocromos e peroxidases)
(Parede celular de Gram positivas e esporulação)
ELEMENTOS TRAÇOS - Cobalto, Zinco (Atividade de
Enzimas), Molibdênio
FATORES DE CRESCIMENTO - Ex: Vitaminas,
Aminoácidos, Bases Nitrogenadas, Ácidos
Graxos, etc.
FATORES AMBIENTAIS
pH
Temperatura
Aeração (O2)
Osmolaridade
FATORES AMBIENTAIS
pH – Estrutura e funções das proteínas
Maioria na faixa ótima de pH entre 6 e 8.
Ex. Thiobacillus - 1 e 2 (Acidófila)
Vibrio comma - 10 (Alcalinófila)
Obs. Normalmente os meios de cultura são
tamponados.
Bactérias patogênicas  pH ao redor de 7
Valores mínimos, ótimos e máximos de pH durante o
cultivo para algumas bactérias
Organismo
Mínimo
Ótimo
Máximo
Thiobacillus thiooxidans
Sulfolobus acidocaldarius
Bacillus acidocaldarius
Zymomonas lindneri
Lactobacillus acidophilus
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Clostridium sporogenes
Erwinia caratovora
Pseudomonas aeruginosa
Thiobacillus novellus
Streptococcus pneumoniae
Nitrobacter sp
0,5
1,0
2,0
3,5
4,0-4,6
4,2
4,4
5,0-5,8
5,6
5,6
5,7
6,5
6,6
2,0-2,8
2,0-3,0
4,0
5,5-6,0
5,8-6,6
7,0-7,5
6,0-7,0
6,0-7,6
7,1
6,6-7,0
7,0
7,8
7,6-8,6
4,0-6,0
5,0
6,0
7,5
6,8
9,3
9,0
8,5-9,0
9,3
8,0
9,0
8,3
10,0
Acidofílicas
Neutrofílicas
Alcalinofílicas
Temperatura - Velocidade das reações químicas
Concentração
elevada de ácidos
graxos insaturados
garante fluidez da
membrana
plasmática
Patogênicas
ao homem e
animais)
Organização tridimensional das proteínas
permite a manutenção da estrutura
adequada para sua ação em elevadas
temperaturas
Aeração - Metabolismo energético
Facultativo
Aeróbio estrito Anaeróbio estrito
(<0.5-21%)
(18-21% )
(<0,5%)
P. aeruginosa, C.haemolyticum Enterobactérias
Mycobacterium
Microaerófilo
aeróbio (1-5%)
Campylobacter,
Neisseria
Microaerófilo
anaeróbio
(Aerotolerante)
(2-8%)
Bacteroides,
Clostridium
Bactérias aeróbias e facultativas
O2
Metabolismo
Produtos
tóxicos
Sistema de
desintoxicação
Produtos
não tóxicos
O2 + 2 e- + 2 H+  H2O2
O2 + e-  O-2
O2 + H2O2  OH*
O-2 + H2O2  O2 + OH2- + OH*
H2O2 + e- + H+  H2O + OH*
Ação das enzimas superóxido dismutase, catalase e peroxidase. Estas
enzimas eliminam radicais tóxicos do oxigênio que são inevitavelmente gerados
em sistemas vivos na presença de O2.
A distribuição destas enzimas nas células determina a capacidade
destas células existirem na presença de O2 .
Bactérias anaeróbias estritas
O2
Metabolismo
Produtos
tóxicos
O2 + 2 e- + 2 H+  H2O2
O2 + e-  O-2
O2 + H2O2  OH*
O-2 + H2O2  O2 + OH2- + OH*
H2O2 + e- + H+  H2O + OH*
Ausência do
sistema de
desintoxicação
Morte
bacteriana
Danos ao DNA, destroem
componentes lipídicos,
inativam enzimas
Teste da Catalase
Reação positiva produzida por Bacillus sp,
Staphylococcus sp;
Reação negativa produzida por Clostridium sp,
Streptococcus sp.
Método da
vela acesa
(microaerofilia)
Jarra de anaerobiose (Sistema GasPak)
Tampa com
anel
selador
Envelope
contendo
bicarbonado de
sódio e boroidreto
de sódio
Indicador de
anaerobiose
(azul de
metileno)
Placas de
Petri
Grampo
de rosca
Catalisador
de paládio
em pastilha
Câmara de anaerobiose (“Glove Box”)
Osmolaridade - Concentração de solutos no
meio  Disponibilidade de água
Controle da Osmolaridade Transporte ativo de K+ para interior da célula e
eliminação de PUTRESCINA
CRESCIMENTO BACTERIANO
Aumento no número de células no meio de cultivo
Após inoculação no meio de cultura (= “semeadura”)
em condições ótimas
Meio líquido  Turvação do meio de cultivo;
Meio Sólido  Formação de colônias
Concentração Celular = Núm. Cel. / Vol. meio
Densidade Celular = Massa Cel./ Vol. meio
Contagem bacteriana
(Plaqueamento)
Absorbância = 2 - Log de % de Transmissão
NMP
(Número Mais provável)
Volume de
inóculo
Tubos de meio
para cada
grupo de nutriente (grupo de
cinco tubos
cinco tubos
Número de tubos
positivos por
grupo
Combinação de
tubos positivos
Índice de
NMP/100mL
Limites com 95%
de confiabilidade
Inferior
Superior
Fases do crescimento bacteriano
Fisiologicamente
ativas
Progressão
geométrica
(Crescimento << Morte)
(Crescimento
 Morte)
Tempo de
geração
Formas de involução
Taxa de Crescimento x Tempo de
Geração
Semeadura = Inocular (transferir o microrganismo a um meio de
cultura)
SEMEADURA POR ESGOTAMENTO
SEMEADURA EM QUADRANTES
Semeadura Correta
Semeadura Errada
Princípios de Alguns Testes
Bioquímicos
Catalase
Comum em bactérias aeróbias e anaeróbias
facultativas
Staphylococcus, Bacillus (+) e Streptococcus (-)
2 H2O2
2 H2O + O2
Oxidase (Citocromo oxidase)
Oxidação do Citocromo C pelo O2
Para fenilenodiamina é oxidado pela enzima
adquirindo cor vermelha
Neisseria (+), Pseudomonas (+), Enterobactérias (-)
Prova de OF
(Oxidação - Fermentação)
(Carboidrato
Ácido)
Azul de Bromotimol: pH Alcalino (Azul), pH Ácido
(Amarelo)
Glicose Enterobactérias, Staphylococcus
(Fermentam), Pseudomonas, Micrococcus (Oxidam)
Fermentação de Açúcares
Produção de Ácido ou Ácido mais gás
Açúcar a ser estudado + indicador de Andrade
(vermelho em pH ácido)
Enterobactérias  Glicose (Todas), Lactose
(Algumas espécies apenas)
Glicose
Lactose
Família Enterobacteriaceae
Lactose
Agar MacConkey
+
Gêneros
 Escherichia
 Klebsiella
 Enterobacter
 Serratia
Gêneros
 Shigella
 Salmonella
 Proteus
 Providência
Morganella
Vermelho de Metila (VM): Fermentação Mista
(Glicose Acidos Orgânicos)
Vermelho de Metila em pH ácido (4,5) fica Vermelho
E.coli (+), Enterobacter (-)
1
2
3
Voges-Proskauer (VP) Fermentação
Butilenoglicólica
Glicose
Acetilmetilcarbinol (= Acetoina)
2,3 butilenoglicol
Acetoina + Creatinina  composto vermelho
E. coli (-), Klebsiella pneumoniae (+), Enterobacter (+)
Indol
Triptofanase
Triptofano
Indol
Para Dimetilaminobenzaldeído = Reativo de Kovacs + indol 
Composto vermelho.
E. coli (+), Klebsiella-Enterobacter (-)
Não inoculado
+
-
Citrato de Simnons
Citrato de Sódio como única fonte de C
Se bactéria usa (Cresce) – Alcaliniza o meio  Azul
(Azul de Bromotimol)
Klebsiella - Enterobacter (+), E. coli (-)
Uréia
(Urease)
Amônia
Alcalinização do meio (Vermelho Fenol  Vermelho)
E. coli (-), K. pneumoniae (+)
Fenil-Alanina
Desaminação da Fenil-alanina  Ácido Fenilpirúvico
Ac. Fenilpirúvico + Cloreto Férrico  Hidrazina (Cor
verde-garrafa)
Característica de todas espécies de Proteus
-
+
Movimento
Crescimento em meio semi-sólido (0,5% de Ágar)
Imóvel - Cresce só no local da picada: K. pneumoniae
Móvel - Cresce além da picada: E. coli
EPM, MILI
Tríplice Açúcar com ferro
TSI
Métodos Miniaturizados