MH07 - 032
Propaganda
Genes pesquisados 191-B MH07 - 032 BACTÉRIAS AMBIENTAIS PRODUTORAS DE β-LACTAMASES DE ESPECTRO ESTENDIDO (ESβL) ISOLADAS EM UMA ESTAÇÃO DE TRATAMENTO DE ESGOTO Eloiza H. Campana1; Renata C. Picão1; Fernanda V. B. Petrolini1; Juliana P. Cardoso1; Diego M. Assis2; Luis J. Neto3; Ana C. Gales1 1. Laboratório Alerta, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo/SP 2. Departamento de Biofísica, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo/SP Resumo Introdução: Bactérias produtoras de ESβL podem ter sido disseminadas a partir de hospitais para a comunidade. Mais recentemente, este fenótipo, também tem sido observado entre bactérias que habitam ambientes aquáticos. Objetivo: O objetivo deste estudo foi investigar a presença de bactérias ambientais produtoras de ESβL em uma estação de tratamento de efluentes (ETE) brasileira. Metodologia: Alíquotas de 500µL de esgoto sem diluição e diluído foram recuperados a partir de diferentes estágios de tratamento do esgoto e inoculadas em placas de ágar cromogênico, com ou sem adição de imipenem (2µg/mL). A identificação do gênero foi realizada por MALDI-TOF. O teste de sensibilidade foi realizado e interpretado seguindo as preconizações do CLSI para disco difusão. A detecção fenotípica de ESβL foi realizada pelo teste de disco aproximação. Os genes TEM, SHV, CTX-M, GES e OXA foram investigados por PCR e sequenciamento do amplicon. Resultados: Um total de 82 isolados, incluindo Aeromonas spp. (71), Kluyvera spp. (10) e Raoultella spp. (1) foram recuperados. Destes, 27 foram confirmados como produtores de ESβL. As taxas de resistências entre os isolados produtores de ESBL foram: ceftazidima, 48,1%; cefepime, 7,4%; aztreonam, 14,8%; imipenem e meropenem, 14,8%; ciprofloxacina, 14,8%; e amicacina, 3,7%. De acordo com resultados preliminares do seqüenciamento, quatro isolados de Aeromonas spp. codificavam o gene blaGES-1-like (afluente, n=2; tanque de aeração, n=1; e lodo, n=1), um isolado de Aeromonas spp. codificava o gene blaCTX-M-2-like (afluente). No esgoto tratado (efluente) dois isolados de Kluyvera spp. e um isolado de Raoutella spp. carreavam as enzimas GES-5-like e CTX-M-8-like. 19 isolados identificados como produtores de ESβL pelo teste fenotípico não apresentaram amplicons para nenhum dos genes codificadores de ESβL pesquisados. Conclusão: Bactérias ambientais, especialmente Aeromonas spp., desempenham um importante papel na decomposição da material orgânica e, geralmente crescem durante os processos de tratamento de esgoto. A aquisição de genes de resistência por estas bactérias é preocupante uma vez que estes patógenos podem causar infecções oportunistas. Além disso, sua persistência em ambientes aquáticos pode constituir um importante reservatório ambiental de genes de resistência o que poderia dificultar a terapêutica antimicrobiana de infecções adquiridas na comunidade. Introdução Os isolados produtores de β-lactamases de espectro estendido (ESβL) eram, até o final da década de 1990, fundamentalmente associados a infecções nosocomiais sendo infrequentemente isolados como agente etiológico de infecções adquiridas na comunidade1,8. No entanto, o uso de antimicrobianos para o tratamento de infecções comunitárias, assim como o uso destas substâncias na medicina veterinária e na agricultura, pode favorecer a emergência e disseminação de bactérias resistentes aos antimicrobianos também na comunidade e em ambientes naturais. Figura 1. Distribuição das bactérias ambientais recuperadas nas diferentes etapas de tratamento de esgoto. Atualmente, isolados produtores de ESβL são descritos em amostras clínicas de pacientes com infecções adquiridas na comunidade, em animais, produtos alimentares e em diversas amostras ambientais4,7. Os genes que codificam algumas ESβLs são encontrados em integrons, juntamente com outros cassetes gênicos responsáveis pela resistência a outras classes de antimicrobianos5. Uma vez integrados em elementos genéticos móveis, estes determinantes de resistência apresentam maior chance de permanecer e se disseminar em populações bacterianas. O objetivo deste trabalho foi investigar a presença de bactérias ambientais produtoras de ESβL em uma estação de tratamento de efluentes (ETE) localizada em Barueri, São Paulo. Tabela 1. Caracterização dos isolados produtores de ESβL recuperados nas diferentes etapas de tratamento do esgoto na ETE. Fases do tratamento do esgoto (número de isolados recuperados) Pressão Seletiva (imipenem 2µg/mL) Isolados produtores de ESβL (n) PCR e Sequenciamento (n) PCR negativo ESβL (n) Não Aeromonas spp. (8) CTX-M-2-like (1) GES-1 (1) Aeromonas spp. (6) Sim Aeromonas spp. (1) GES-7/IBC-1 (1) Não Tanque de Aeração (20) Não Aeromonas spp. (7) GES-1 (1) Aeromonas spp. (6) Lodo (10) Não Aeromonas spp. (2) GES-1 (1) Aeromonas spp. (1) Não Aeromonas spp. (6) Não Aeromonas spp. (6) Raoutella spp. (1) GES-5a and CTX-M-8 like (1) Não Kluyvera spp. (2) GES-5a and CTX-M-8 likeb (2) Não Afluente (21) Material e Métodos Amostras de água. Amostras de esgoto foram coletadas no afluente, tanque de aeração, lodo e efluente da ETE. Alíquotas de 500µL diluídas e não diluídas foram diretamente semeadas em placas de ágar cromogênico (Difco Chromagar Orientation; Becton, Dickinson and Company, New Jersey, EUA) com ou sem adição de imipenem (2µg/mL). Efluente (31) Sim a- O sequenciamento revelou a presença da substituição de uma glicina-para-serina na posição 170 de Ambler9. b- Possível KLUG. Identificação bacteriana. A identificação do gênero foi realizada por espectrometria de massa, utilizando o aparelho MALDI-TOF MS microflex LRF (Bruker Daltonik). A interpretação dos resultados foi realizada pelo software MALDI Biotyper 2.0 (Bruker Daltonik). Teste de sensibilidade aos antimicrobianos. O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos das amostras foi determinado pela técnica de disco difusão de acordo com as recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2009)2. Como controles de qualidade foram utilizadas as cepas de Escherichia coli ATCC 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Detecção fenotípica de ESβL por disco aproximação. O teste foi realizado de acordo com a metodologia de disco aproximação descrita previamente6. Os isolados foram considerados positivos para a produção de ESβL quando houve o aparecimento de deformações do halo de inibição ou o de uma zona fantasma entre o substrato e o inibidor, para pelo menos um dos substratos testados. Para o controle de qualidade, foi utilizada a cepa Klebsiella pneumoniae ATCC 700603. Detecção genotípica. A pesquisa dos genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaGES e blaOXA foi realizada pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR). Os parâmetros da ciclagem variaram de acordo com a sequência alvo. A análise do intengron foi realizada por PCR das regiões conservadas 5’ e 3’ destes elementos. Figura 2. Perfil de sensibilidade das amostras produtoras de ESβL. AK, amicacina; ATM, aztreonam; FEP, cefepima; CTX, cefotaxima; FOX, cefoxitina; CAZ, ceftazidima; CRO, ceftriaxona; CIP, ciprofloxacina; ETP, ertapenem; CN, gentamicina; IPM, imipenem; MEM, meropenem; SXT, sulfametoxazol-trimetoprim; TE, tetraciclina. Tabela 2. Perfil de Sensibilidade das amostras produtoras de ESβL por gênero. Sequenciamento e interpretação dos resultados. Os amplicons obtidos foram sequenciados, usando o equipamento Applied Biosystems 3130 Genetic Analyser. A seqüência de nucleotídeos e a respectiva seqüência de aminoácidos foram analisadas usando o pacote de software Lasergene (DNAStar, Madison, WI, USA) e então comparadas com as sequências disponíveis na internet utilizando a ferramenta BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Resultados Na ETE, foram recuperadas 186 bactérias, sendo 82 (44,1%) bactérias ambientais. Entre elas, Aeromonas spp. (71), Kluyvera spp. (10) e Raoultella spp. (1). A distribuição dos isolados ambientais por gênero e etapa de tratamento pode ser visto na Figura 1. Destes isolados, 27 (32,9%) foram confirmados como produtores de ESβL pelo teste de disco aproximação. Estes isolados foram recuperados do afluente (33,3%), tanque de aeração (26%), lodo (7,4%) e efluente (33,3%) da ETE (Tabela 1). Gêneros Aeromonas spp. Kluyvera spp. Raoutella spp. (Número testado) (24) (2) (1) Antimicrobianos Testados S% R% S% R% S% R% Amicacina 91,6 4,2 100 - 100 - Aztreonam 66,7 16,6 100 - - -* Cefepima 91,6 4,2 100 - - 100 Cefotaxima 8,4 91,6 - 100 - 100 Cefoxitina 58,3 37,5 - 100 - 100 Ceftazidima 16,7 54,2 100 - - -* Ceftriaxona - 87,5 - 100 - 100 Ciprofloxacina 75 16,6 100 - - -* Ertapenem 75 4,2 - 100 - 100 Gentamicina 87,5 4,2 100 - 100 - Imipenem 87,5 4,2 - 100 - 100 Meropenem 95,8 4,2 - 100 - 100 Sulfametoxazol-trimetoprim 62,5 37,5 100 - 100 - Tetraciclina 66,7 4,2 100 - 100 - *Isolado Intermediário As taxas de resistências entre os isolados produtores de ESβL foram: ceftazidima, 48,1%; aztreonam, 14,8%; imipenem e meropenem, 14,8%; ciprofloxacina, 14,8%; cefepime, 7,4% e amicacina, 3,7% (Figura 2). O perfil de sensibilidade por gênero pode ser visto na Tabela 2. Conclusão No alfuente foi recuperado um isolado de Aeromonas spp. que apresentava o gene o blaCTX-M-2-like. Um isolado de Aeromonas spp. apresentava o gene blaGES-7/IBC-1. Ainda no afluente, um isolado de Aeromonas spp. codificava o gene blaGES-1, cuja análise do respectivo integron evidenciou a presença do cassete aacA7, que codifica uma aminoglicosídeo acetil transferase. No tanque de aeração (n=1) e lodo (n=1), dois isolados de Aeromonas spp. apresentaram o gene blaGES-1. No efluente, dois isolados de Kluyvera spp. e um isolado de Raoutella spp. carreavam os genes que codificam as enzimas GES-5 e CTX-M-8-like (Tabela 1). • Um número importante de bactérias ambientais foi recuperado em todas as etapas de tratamento de esgoto. Entre estas, uma porcentagem significante de isolados eram produtores de ESβL; O sequenciamento das regiões flanqueadoras dos genes blaGES demonstrou que estes genes, em todos os isolados, estavam inseridos em integron de classe 1. 19 isolados identificados como produtores de ESβL pelo teste fenotípico não apresentaram amplicons para nenhum dos genes codificadores de ESβL pesquisados. • Todas as ESβLs descritas neste trabalho já foram identificadas em isolados clínicos no Brasil, demonstrando a importância destas espécies como reservatórios de genes de resistência; • Três isolados carreavam uma variante de GES com atividade hidrolítica sobre os carbapenens; • Os genes blaGES foram identificados em integrons de classe 1. Tais elementos estão frequentemente associados a elementos genéticos móveis tais como transposons que, por sua vez, podem estar localizados em plasmídeos. Assim, estes achados podem evidenciar o potencial de disseminação destes determinantes de resistência intra- ou interespécies. Referências 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Cantón R, Novais A, Valverde A, Machado E, Peixe L, Baquero F, Coque TM. Prevalence and spread of extended-spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae in Europe. Clin Microbiol Infect. 2008; 14(S1): 144-53. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2009. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Tenth Approved standard M2-A10. CLSI, Wayne, PA. Clinical Laboratory Standards Institute. 2011. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: twentieth-one Informational Supplement M100-S21. CLSI, Wayne, PA. Girlich D, Poirel L, Nordmann P. Diversity of clavulanic acid-inhibited extended-spectrum β-lactamases in Aeromonas spp. from the Seine River, Paris, France. Antimicrob Agents Chemother. 2011; 55(3): 1256-61. Jacoby GA, Sutton L. Properties of plasmids responsible for production of extended-spectrum- β-lactamases. Antimicrob Agents Chemother. 1991; 35:164-9. Jarlier V, Nicolas MH, Fournier G, Philippon A. Extended broad-spectrum β lactamases conferring transferable resistance to newer beta-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns. Rev Infect Dis. 1988; 10(4): 867-78. Moore JE, Watabe M, Millar BC, Loughrey A, McCalmont M, Goldsmith CE, Heaney JC, Buckley T, Egan C, McDowell DA, McMahon MA, Dooley JS, Xu J, Rooney PJ. Screening of clinical, food, water and animal isolates of Escherichia coli for the presence of blaCTX-M extended spectrum β-lactamase (ESβL) antibiotic resistance gene loci. Ulster Med J.2010; 79(2): 85-8. Oteo J, Pérez-Vázquez M, Campos J. Extended-spectrum-β-lactamase producing Escherichia coli: changing epidemiology and clinical impact. Curr Opin Infect Dis. 2010; 23(4): 320-6. Wachino J, Doi Y, Yamame K, Shibata N, Yagi T, Kubota T, Arakawa Y. Molecular characterization of a cephamycin-hydrolyzing and inhibitor-resistant class A β-lactamase, GES-4, possessing a single G170S substitution in the omega-loop. Antimicrob Agents Chemother. 2004; 48(8):2905-10. Eloiza Helena Campana Rua Pedro de Toledo, 781/6º andar fundos Vila Clementino – São Paulo, São Paulo 04039-032 [email protected]
