Marcio de Souza Dias Dissertacao

Márcio de Souza Dias
Diversidade e potencial de utilização de bactérias fixadoras de N2 em Brachiaria
brizantha
ALFENAS - MG
2015
Márcio de Souza Dias
Diversidade e potencial de utilização de bactérias fixadoras de N2 em Brachiaria
brizantha
Dissertação apresentada à Universidade
José do Rosário Vellano - UNIFENAS,
como parte das exigências do Programa
de Pós-Graduação em Ciência Animal,
área de concentração em Produção
Animal, para a obtenção do título de
Mestre.
Orientadora:Dra. Ligiane Aparecida Florentino
Coorientador: Dr. Adauton Vilela de Rezende
ALFENAS - MG
2015
Dias, Márcio de Souza
Diversidade e potencial de utilização de bactérias fixadoras de N2
em Brachiaria brizantha.—Márcio de Souza Dias.—Alfenas, 2015.
62f.
Orientadora: Profª. Dra Ligiane Aparecida Florentino
Dissertação (Mestrado)- Programa de Pós-graduação
em Ciência animal- Universidade José do Rosário Vellano, Alfenas,
2015.
1.Bactérias promotoras do crescimento vegetal 2. Bactérias
diazotrópicas 3. Recuperação de pastagens I. Título
CDU : 579.8 :633.2(043)
Primeiramente a Deus, por estar presente em
todos os momentos da minha vida e por me
guiar nesta caminhada. Ao meu querido pai
(in memorian) que foi um exemplo de homem
e família. À minha mãe, que sempre acreditou
em mim, à minha irmã, esposa e filhos pelo
apoio companheirismo e carinho.
DEDICO
AGRADECIMENTOS
À Universidade José do Rosário Vellano - UNIFENAS, ao programa de pós-graduação em Ciência
Animal e Laboratórios de Microbiologia e de Fertilidade do Solo, pelas instalações, e na figura das
pessoas, todos os funcionários, professores e colegas do curso de pós-graduação, que me
recepcionaram com respeito, pelos ensinamentos e agradável convivência.
À minha orientadora, Professora Dra. Ligiane Aparecida Florentino, e ao meu coorientador professor
Dr. Adauton Vilela de Rezende, pela oportunidade, pelos ensinamentos e confiança.
A CAPES/PROSUP, pela concessão da bolsa de estudos.
Aos membros da banca examinadora, Dra. Giselle Prado Brigante, Dra. Ligiane Aparecida
Florentino e Dr. Adauton Vilela de Rezende pela disponibilidade, contribuições e sugestões
apresentadas.
Aos professores Dr. João Evangelista Fiorini, Dra. Nelma de Mello Silva Oliveira, pelas
orientações e contribuições ao trabalho.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Microbiologia do Solo, pelos ensinamentos, auxílio no
cumprimento das atividades, pelo apoio, conselhos, incentivo e amizade, em especial aos funcionários
Luciana Rosa Alves Rufino, Lucimara Silva, César A. Cunha, Paulo César Garcia Naves.
Aos colegas do curso de pós-graduação, Denner Lemos, Max Rossi, Mariana Spinelli; e aos colegas de
graduação, Flávia Romam, Larissa Compri, Gustavo Quiroga, Gustavo Matheus Barbosa, Rosane
Veiga Rose, pela amizade, companheirismo, pelo auxílio na condução do experimento e pela ótima
convivência.
Aos amigos Tânia Venga, Jaqueline dos Santos, Adriana Maria Francisco, Sheila Silvério Neves,
Nilton Oliveira Silva, João Batista Neves, Fran Ruffino, Dércio Rabelo, Hyelen Talita, Fabiano Dias
Moreira, Sidnei Marques, Elton Bueno, Alexandra Maria Dias, Marcos Donizete Silva, Angélica
Rodrigues, Rosana Mara Gonçalves, Danusa Dias, Climene Cristina Siqueira, Marli Woelbert, Luiz
Gonzaga Ribeiro Neto, Wanderley Ferreira , Claudiomir da Silva dos Santos, Jô Alves, Angélica P.
Todescato, Nádia Cristina S. Mello, Camila Chioda de Almeida, Heber Garcia Bueno, Teresinha de
Souza Tavares, Elisângela Santos, Elton dos Santos, Renata Tavares, Marcos Bueno Miguel, Narayana
de Deus N. Bregagnoli, Pastor Carlos Roberto Pereira Silva pelo apoio, incentivo e pela amizade.
A todos os meus queridos professores do curso de pós-graduação, Dra. Ligiane Aparecida Florentino,
Dr. Adauton Vilela de Rezende, Dra. Patrícia França, Dr. Kleber Pelícia, Dra. Laura Órfão, Dr. Paulo,
Dr. Amoracir, Dra. Roberta Bessa, Dra. Adélia Celú, pelo apoio, incentivo, ensinamentos, conselhos e
carinho.
Ao meu companheiro, amigo, referência e pai, Maurício Cândido Dias (in memórian), que sempre
estará comigo. Por todo amor, dedicação e ensinamentos; à minha mãe, Anair de Melo Dias, à minha
querida e amada irmã Vera Lúcia de Souza Dias, pelo incentivo e companheirismo, e às minhas tias
Rosângela Nannetti Dias e Aparecida Melo, pela compreensão, incentivo e carinho.
À minha esposa Juliana Ramalho Bolognani Dias, pelo carinho, amor, e paciência ao longo de toda
esta caminhada e aos meus queridos e amados filhos Márcio Vinícius Bolognani Dias e Carlos
Eduardo Bolognani Dias, por todas as vezes que sentia o fardo pesado e eles me recompensavam com
um olhar, um abraço, um sorriso.
"Jamais considere seus estudos como uma obrigação, mas como uma oportunidade
invejável para aprender a conhecer a influência libertadora da beleza do reino do espírito,
para seu próprio prazer pessoal e para proveito da comunidade à qual seu futuro trabalho
pertencer" (A. Einstein)
RESUMO
O objetivo desta pesquisa foi analisar a diversidade de bactérias diazotróficas
associadas e endofíticas de Brachiaria brizantha, estudar o potencial destas em solubilizar
fosfatos inorgânicos de ferro e alumínio, produzir ácido-3-indolacético (AIA) e avaliar o
efeito da inoculação destes isolados em Brachiaria brizantha cv MG 05 Vitória. As bactérias
foram isoladas de amostras de solos cultivados sob B. brizantha e partes de tecido vegetal
desta gramínea, nos períodos seco e chuvoso, nos municípios de Alfenas e Machado, Sul de
Minas Gerais. Foram utilizados cinco meios de cultura semissólidos e semisseletivos: FAM
(Azospirillum amazonense), JMV (Burkholderia sp.), JNFb (Herbaspirillum spp.), LGI (A.
amazonense) e NFb (Azospirillum spp.). Os testes de solubilização de fosfato e produção de
AIA foram realizados in vitro e foram utilizados como critério de seleção dos 22 isolados
bacterianos utilizados na inoculação de B. brizantha cv MG 5 Vitória, cultivada em vasos
contendo 20 dm3 de solo. Foram realizados dois cortes, em que foram avaliados os seguintes
parâmetros: altura (Al), largura (LF) e comprimento da folha (CF), número de perfilhos (NP),
comprimento (CR) e massa seca da raiz (MSR), matéria seca (MS), produtividade de matéria
seca (PMS), fibra em detergente neutro (FDN) e ácido (FDA) e a proteína bruta na matéria
seca (PBMS). Foi obtido um total de 332 isolados, sendo a maioria endofíticos. O maior
número e diversidade foram provenientes do município de Alfenas. No período chuvoso foi
verificado maior número e diversidade de isolados em ambos os Municípios, quando
comparado ao período da seca. Trinta e cinco isolados solubilizaram fosfato de ferro e 78
produziram AIA, destacando-se os isolados UNIFENAS 100-17, 21, 40 e 78, capazes de
desempenhar ambas as funções simultaneamente. A inoculação de estirpes diazotróficas de
origem endofíticas e rizosféricas influenciaram no desenvolvimento de B. brizantha cv MG 5
Vitória, contribuindo para a produção de MS, PMS e PBMS nas duas alturas de corte
destacando-se os isolados UNIFENAS-100-16, 21, 78 cujo teor de PBMS foi superior a 7%.
Palavras-chave: Bactérias promotoras do crescimento vegetal, bactérias diazotróficas,
recuperação de pastagens
ABSTRACT
The objective of this research was to analyze the diversity of nitrogen fixing bacteria
associated and endophytic B. brizantha, study the potential the solubility of inorganic
phosphates of iron and aluminum, produce acid-3-indole acetic (AIA) and to evaluate the
effect of inoculation of these isolates in Brachiaria brizantha cv MG 05 Victoria. The bacteria
were isolated from soil samples grown under Brachiaria and parts of plant tissue this grass,
the dry and wet periods in the municipalities of Alfenas and Machado, southern Minas Gerais.
Five semisolid culture media and semi-selective were used: FAM (Azospirillum amazonense),
JMV (Burkholderia sp.), JNFb (Herbaspirillum spp.), LGI (A. amazonense) and NFb
(Azospirillum spp.). The phosphate solubilization tests and AIA production were performed
in vitro and were used as of 22 bacterial isolates selection criteria used in the inoculation of B.
brizantha cv MG 5 Victoria, grown in pots containing 20 dm3 of soil. There were two cuts, in
what form evaluated the following parameters: height (Al), width (LF) and leaf length (CF),
number of tillers (NP), length (CR) and root dry mass (MSR) dry matter (DM), dry matter
yield (PMS), neutral detergent fiber (NDF) and acid (ADF) and crude protein in dry matter
(PBMS). A total of 332 isolates were obtained, most endophytic. The greatest number and
diversity were from the city of Alfenas. During the rainy season was verified greater number
and diversity of isolates in both municipalities, when compared to the dry season. Thirty-five
isolates solubilized iron phosphate and 78 produced AIA, especially the isolated UNIFENAS
100-17, 21, 40 and 78, able to do both simultaneously. The inoculation of nitrogen fixing
strains of endophytic origin and rhizospheric influenced the development of B. brizantha cv
MG 5 victory, contributing to the production of MS, PMS and PBMS in the two cutting
heights highlighting the UNIFENAS-100-16 isolated, 21, PBMS 78 whose content was more
than 7%.
Key words: Bacteria promoting plant growth, nitrogen fixing bacteria, pasture recovery
LISTA DE TABELAS
ARTIGO 1
Tabela 1. Valores médios referentes à pluviosidade, temperatura mínima e máxima no
municípios de Alfenas e Machado, nos meses de julho e dezembro de 2013......................... 35
Tabela 2. Características químicas dos solos das áreas de estudo dos municípios de Alfenas e
Machado. ............................................................................................................................. 36
Tabela 3. Número e diversidade de bactérias fixadoras de N2 isoladas de amostras de solo
cultivado sob Brachiaria brizantha e de tecidos vegetais (endofíticas) desta gramínea, nos
municípios de Alfenas e Machado, nos períodos seco e chuvoso. ......................................... 39
Tabela 4. Índice de solubilização (IS) de fosfato de ferro (FePO4.2H2O) em meio sólido
GELP por bactérias diazotróficas de Brachiaria brizantha. .................................................. 39
ARTIGO 2
Tabela 1. Resultado da análise química do solo utilizado no experimento em vasos. ........... 53
Tabela 2. Altura (Al), Largura (LF) e comprimento da folha (CF), número de perfilhos (NP) e
matéria seca (MS) de Brachiaria brizantha cv MG05 Vitória cutivada sob diferentes
tratamentos no primeiro corte e segundo corte. Massa seca radicular (MSR) e crescimento
radicular (CR) segundo corte................................................................................................ 55
Tabela 3. Porcentagem de matéria seca total (MS), produtividade de matéria seca g/vaso
(PMS) de B. Brizantha cv MG05 Vitória cultivada sob diferentes tratamentos no primeiro
corte e segundo corte. Fibra detergente neutro (FDN), fibra detergente ácido(FDA) e proteína
bruta na matéria seca (PBMS) segundo corte. .................................................................... 587
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIA
Ácido-3-indolacético
Al
Altura
BDA
Batata Dextrose Agar
BPCV
Bactérias Promotoras de Crescimento Vegetal
CF
Comprimento da Folha
CR
Crescimento Radicular
DIC
Delineamento Inteiramente Casualizado
FBN
Fixação Biológica de Nitrogênio
FDA
Fibra em Detergente Ácido
FDN
Fibra em Detergente Neutro
IAM
Ácido índole-3-acetamida
IpyA
Ácido-3-pirúvico
IS
Índice de Solubilização
LF
Largura da Folha
MAPA
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MS
Matéria Seca Total
MSR
Matéria Seca Radicular
NI
Número de Isolados
NP
Número de Perfilhos
PB
Proteína Bruta
PBMS
Proteína Bruta na Matéria Seca
PMS
Produtividade de Matéria Seca
RPCPs
Rizobactérias Promotoras de Crescimento de Plantas
SRCV
Substâncias Reguladoras do Crescimento Vegetal
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 ................................................................................................................. 15
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 16
2. REFERENCIAL TEÓRICO ..................................................................................... 17
2.1 Fixação biológica de nitrogênio ......................................................................... 17
2.2 Associações de diazotróficos com espécies vegetais ........................................... 17
2.3 Bactérias promotoras de crescimento vegetal ..................................................... 19
2.4 Solubilização de fosfato ..................................................................................... 20
2.5 Produção de ácido-3-indolacético....................................................................... 21
2.6 Brachiaria brizantha cv MG05 Vitória ............................................................. 22
2.7 Análise bromatológica de pastagens.....................................................................23
2.8 Uso de inoculantes ou biofertilizantes ................................................................ 25
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 26
CAPÍTULO 2 ................................................................................................................. 31
ARTIGO 1:Diversidade de bactérias diazotróficas em pastagens B. brizantha .......... 32
INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 34
MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 35
RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 38
CONCLUSÕES .............................................................................................................. 43
AGRADECIMENTOS................................................................................................... 43
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 43
ARTIGO
2:
Bactérias
diazotróficas
e
as
características
morfológicas
e
bromatológicas de Brachiaria brizantha cv MG05 Vitória ........................................... 50
INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 51
MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 52
RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 55
CONCLUSÕES .............................................................................................................. 62
AGRADECIMENTOS................................................................................................... 62
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 62
15
CAPÍTULO 1
16
1 INTRODUÇÃO
O solo é constituído por organismos microscópicos e macroscópicos que
desempenham diferentes funções como a decomposição e mineralização da matéria orgânica,
a ciclagem de nutrientes e a fixação biológica de nitrogênio (FBN), processos estes que
garantem a manutenção e o equilíbrio no ecossistema terrestre (Moreira & Siqueira, 2006). O
potencial de utilização da FBN tem sido intensamente estudado devido ao fornecimento de
nitrogênio, contribuindo assim para a sustentabilidade agrícola, onde os solos apresentam
baixo nível de fertilidade, principalmente em regiões tropicais.
A degradação das pastagens no Brasil está em torno de 70%, fenômeno este que pode
ser explicado, principalmente, pela baixa fertilidade natural dos solos e pela falta de reposição
de nutrientes (Macedo, 2005). Cerca de 78% do ar atmosférico é constituído por gás
nitrogênio (N2), entretanto, nessa forma, este elemento não está disponível nutricionalmente
para a maioria dos seres vivos. Apenas uma pequena parcela de procariotos que possuem a
enzima nitrogenase é capaz de reduzir o N2 para a forma inorgânica NH3, forma de nitrogênio
disponível para os vegetais e outros organismos.
Os procariotos que realizam esse processo são denominados fixadores de nitrogênio
(N2) ou diazotróficos, e o processo que mediam, a FBN. Esses procariotos estabelecem
associação ou simbiose com espécies vegetais podendo fornecer o nitrogênio total ou parcial
para o desenvolvimento da planta. Como exemplo de associação em gramíneas forrageiras,
como a Brachiaria sp. temos as bactérias associativas endofídicas facultativas do gênero
Azospirillum que podem ser encontradas na rizosfera, interior das raízes, colmos e folhas.
Bactérias desse gênero podem ainda contribuir para o crescimento vegetal por meio de
produção do hormônio ácido-3-indolacético (AIA) (Reis Júnior et al., 2004).
As bactérias fixadoras de N2, podem ser encontradas em vida livre, em associação com
diversas espécies vegetais ou em simbiose com leguminosas. Algumas espécies de bactérias
associativas, além de colonizar abundantemente a rizosfera, podem também ocorrer
endofiticamente, ou seja, invadir o córtex e colonizar tecidos internos em diversas espécies
vegetais sem formar nódulos. Embora também possam ser encontrados em dicotiledôneas, os
resultados demonstram que esta ocorrência é mais generalizada em gramíneas e outras
monocotiledôneas.
O manejo da FBN em gramíneas depende, entre outros, da identificação da(s)
espécie(s) que contribui(em) significativamente para o processo. Como elas não formam
17
estruturas anatômicas diferenciadas (como os nódulos de leguminosas), sua localização e
ocorrência na rizosfera e no interior dos tecidos vegetais é pesquisada colocando-se amostras
de solo, rizosfera, raiz ou outro material vegetal em meios de cultura seletivos para cada
espécie.
Nesse contexto, este estudo foi realizado com o objetivo de analisar a diversidade e o
potencial de bactérias fixadoras de nitrogênio associadas à Brachiaria brizantha cv MG5
Vitória.
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Fixação biológica de nitrogênio
A FBN é um processo essencial para a manutenção da vida, pois o nitrogênio é o
constituinte básico das proteínas, vitaminas e sais minerais, os quais são fundamentais na
nutrição animal, sendo estes sintetizados pelas plantas a partir de carboidratos produzidos no
processo da fotossíntese e de íons como NH4+ e NO3- absorvidos do solo. As principais fontes
desses íons no solo são: a fixação biológica de nitrogênio (175 X 106 ton N ano-1), a fixação
industrial (49 X 106 ton N ano-1) e a fixação atmosférica (10 X 106 ton N ano-1) (Moreira &
Siqueira, 2006).
Apenas algumas espécies de bactérias possuem a enzima nitrogenase que com a
participação de Fe, Mg, Mo e ATP é capaz de transformar N2 em NH3, ocorrendo assim a
redução de N2 e consequentemente o processo FBN pelo qual o nitrogênio presente na
atmosfera é incorporado pelas plantas na forma de nitrato ou amônia (Döbereiner, 1979).
Estas espécies de bactérias podem viver livremente no solo ou em simbiose e associações com
algumas espécies vegetais e até animais. O nitrogênio obtido através de simbioses é muito
menos sujeito a lixiviação, não só porque é translocado diretamente para a planta, mas,
também porque a FBN é autorregulada, isto é, o nitrogênio só é fixado quando este elemento
está limitando o sistema.
2.2 Associações de diazotróficos com espécies vegetais
18
Algumas espécies de diazotróficos podem, além de colonizar abundantemente a
rizosfera, ocorrer endofiticamente, ou seja, invadir o córtex e colonizar tecidos internos em
diversas espécies vegetais sem formar nódulos. Embora também possam ser encontrados em
dicotiledôneas, os resultados demonstram que esta ocorrência é mais generalizada em
gramíneas e outras monocotiledôneas. Espécies mais comumente encontradas são:
Azospirilum spp. (A. lipoferum, A. brasilense, A.amazonense, A. halopraeferans, A. irakense),
Azotobacter paspali, Bacillus polimixa, B. azotofixans, Azoarcus indigens, A.communis,
Acetobacter
diazotrophicus
(syn.
Gluconobacter
diazotrophicus),
Herbaspirillum
seropedicae,
H. rubrisubalbicans e Burkholderia spp.. Espécies dos gêneros Azoarcus,
Acetobacter e Herbaspirillum são consideradas obrigatoriamente ou predominantemente
endofíticas, uma vez que sua ocorrência é praticamente restrita aos tecidos internos vegetais.
Experimentos conduzidos pelo método de incorporação do
15
N2 confirmaram que
várias gramíneas tropicais se beneficiam de nitrogênio fixado biologicamente (Vinhal-Freitas,
2010).
Bactérias diazotróficas isoladas de gramíneas foram identificadas como pertencentes
ao gênero Burkholderia (Van et al. , 1996; Baldani et al., 2000) e a espécie de Burkholderia
isolada de leguminosas apresentou alta similaridade com isolados de gramíneas (Moulin et al.,
2001). Estes resultados mostram uma interessante relação ecológica entre a fixação de
nitrogênio em gramíneas e leguminosas que deve ser estudada no sentido de verificar como
isto atua na sustentabilidade dos ecossistemas.
O manejo da FBN em gramíneas depende, entre outros, da identificação da (s) espécie
(s) que contribui (em) significativamente para o processo. Como elas não formam estruturas
anatômicas diferenciadas (como os nódulos de leguminosas), sua localização e ocorrência na
rizosfera e no interior dos tecidos vegetais é pesquisada colocando-se amostras de solo,
rizosfera, raiz ou outro material vegetal em meios de cultura seletivos para cada espécie. A
ocorrência de espécies endofíticas (que ocorrem dentro dos tecidos) é pesquisada
desinfestando- se superficialmente a amostra com produtos como Cloramina-T ou água
sanitária, entre outros. Frequentemente, mais de uma espécie e até mais de um gênero são
encontrados na mesma espécie vegetal. Além disso, outras espécies não detectadas pelos
meios de cultivo utilizados ou espécies não cultiváveis podem também estar ocorrendo. No
entanto, alguns resultados mostraram correlação com a incidência de determinadas espécies e
as demandas nutricionais da planta. Por exemplo, o número de células de Azospirillum spp. é
constante no solo e na rizosfera (ecto + endorhizosfera) de milho durante todo o ciclo da
planta, porém quando as bactérias da ectorrizosfera são eliminadas através da esterilização
19
superficial com Chloramina-T, verifica-se que o número destas bactérias na endorhizosfera da
raiz aumenta bastante na floração e posteriormente no enchimento de grãos, justamente
quando a demanda de nitrogênio e de outros nutrientes pela planta é maior (Magalhães et al.,
1979). Além disso, os números totais de Azospirillum spp. no interior das raízes se
correlacionaram com o N acumulado em trigo (Baldani et al., 1983).
Apesar da pesquisa sobre diazotróficos associativos no Brasil ter se iniciado na década
de 50 por Döbereiner e colaboradores, com os gêneros Azotobacter e Beijerinckia, ela só foi
intensificada a partir da descoberta de novas espécies de Azospirillum (Dobereiner, 1978), que
coincidiu com a chamada “crise do petróleo”, despertando o interesse por alternativas
biológicas aos fertilizantes nitrogenados utilizados na agricultura. A partir de então, várias
espécies novas têm sido descobertas e ensaios de inoculação de diazotróficos associativos em
plantas têm sido realizados no Brasil e em outros países.
Os cálculos da contribuição de N fixado para gramíneas estão em torno de 25 a 50 kg
N ha-1 o que equivale ao suprimento médio de cerca de 17% das demandas da cultura
(Moreira, 2010). Considerando a importância que as espécies produtoras de grãos, como trigo,
arroz e milho, entre outras, são a principal fonte de carboidrato da dieta humana e o alto
potencial fotossintético das gramíneas C4 nos trópicos, esta taxa de FBN, mesmo baixa,
representa uma grande economia nos custos de produção, o que justifica estudos visando seu
manejo.
2.3 Bactérias promotoras de crescimento vegetal
As bactérias promotoras de crescimento vegetal (BPCV) são aquelas capazes de
promover o desenvolvimento da planta de forma direta ou indireta. Estas bactérias promotoras
do crescimento são encontradas na rizosfera e também são conhecidas como “rizobactérias
promotoras de crescimento de plantas” (RPCPs).
Na promoção do crescimento de forma direta, as bactérias sintetizam um composto ou
facilitam a absorção de certos nutrientes do meio ambiente, fornecendo desta forma para a
planta nitrogênio fixado, fósforo solubilizado do solo e fitormônios como as auxinas (Glick &
Bashan, 1997). Também pode ocorrer como efeito direto, a redução do potencial de
membrana das raízes (Bashan & Levanony, 1991) e síntese de algumas enzimas que regulam
o nível de hormônio na planta (Glick et al., 1998). Na promoção indireta do crescimento, a
20
bactéria diminui ou previne os efeitos deletérios de organismos patógenos (Glick & Bashan,
1997), pela síntese de sideróforos (Leong, 1986) e antibióticos.
As substâncias sintetizadas pelas bactérias, conhecidas como substâncias reguladoras
do crescimento vegetal (SRCV) são compostos orgânicos naturais, que influenciam em
processos fisiológicos nas plantas, sendo que estas substâncias também podem ser produzidas
não só pelo micro-organismo, mas também pela própria planta, como as auxinas. Fatores
como disponibilidade de nutrientes, temperatura, pH, composição e quantidade de substrato
na rizosfera afetam a síntese de SRCV (Moreira & Siqueira, 2006).
A maior parte dos estudos envolvendo as BPCV estão relacionadas com a aplicação na
agricultura. Estudos mostram que além da capacidade de fixar nitrogênio, algumas estirpes
dos gêneros Bradyrhizobium e Rhizobium apresentam potencial de utilização de como BPCV
em não leguminosas, como o rabanete (Raphanus sativus L.), na produção de fitormônios,
solubilização de fosfato e produção de sideróforos (Antoun et al., 1998). Juntamente com
resíduos orgânicos, Bacillus subtilis, uma BPCV, apresentou potencial para incrementar a
nutrição e crescimento de algodão (Gossypium L.) e soja (Glycine max L.) (Araujo, 2008).
As BPCV também são utilizadas associadas a bactérias nodulíferas para o melhor
desenvolvimento do vegetal. Silva et al.(2007) observou que quando inoculado BPCV,
Paenibacillus e Bacillus, na simbiose entre caupi (Vigna unguiculata L.) e Bradyrhizobium
(BR2001), ocorreu um aumento na nodulação e como consequência, promovendo uma melhor
fixação de nitrogênio. Petersen et al., (1997), observou que a inoculação de Paenibacillus
polymyxa, juntamente com Rhizobium etli em sementes de feijão (Phaseolus vulgaris L.)
aumentou a densidade de rizóbio na superfície da raiz, mostrando a ação indireta de P.
polymyxa sobre o rizóbio, e também o aumento do número de nódulos e de raízes laterais da
planta. Apesar da importância, as pesquisas sobre a utilização de BPCV ainda são pouco
difundidas.
2.4 Solubilização de fosfato
O Fósforo (P), assim como o nitrogênio, é um elemento exigido em grande quantidade
para o crescimento dos vegetais. Este elemento é constituinte de biomoléculas, como ácidos
nucleicos, coenzimas e outros. Ao mesmo tempo, é um dos nutrientes que mais limita a
produção agrícola, por ser encontrado nos solos em formas altamente insolúveis. Quando
21
disponível nos solos de forma solúvel, as plantas podem absorver o P na solução de solo como
ânions de fosfato, predominantes nas formas de HOP42- e H2PO4- (Wakelin et al., 2004).
Esta baixa disponibilidade nos solos é devido a sua ligação a outros componentes
químicos. Geralmente, em solos ácidos, a maior parte deste elemento se encontra ligado a
óxido de ferro e alumínio e em solos alcalinos ou neutros, este elemento se liga ao cálcio
(Moreira & Siqueira, 2006). Estudos de Barroso & Nahas (2005) sobre as frações de fósforo
encontrados em solos brasileiros sob pastagem, cultivo de milho, mata e florestas,
demonstraram que a mais frequente foi a de fosfato de ferro, seguida de fosfato de alumínio e
fosfato de cálcio.
Alguns fungos e bactérias possuem a capacidade de disponibilizar este fosfato ligado a
outro elemento, processo responsável por aumentar a disponibilidade de P no solo. Estudo
com diferentes espécies bacterianas quanto a sua capacidade de solubilização mostram que
espécies de Rhizobium, Pseudomonas e Bacillus apresentam o maior potencial de
solubilização (Rodríguez & Fraga, 1999).
Segundo a literatura, estes micro-organismos solubilizam o fosfato inorgânico por dois
mecanismos principais, sendo pela produção de ácidos orgânicos ou pela secreção de prótons
(H+) (Illmer et al., 1995). A solubilização do fosfato também varia de acordo com a natureza
do mineral de fosfato fornecido e a composição meio que o micro-organismo é inoculado
(Gyaneshwar et al., 1998). Em campo, esta eficiência varia de acordo com o tipo de solo e a
cultura (Rodríguez & Fraga, 1999).
Inicialmente, Gerretsen (1948) observou que a quantidade de fósforo assimilado pelas
plantas inoculadas com micro-organismos rizosféricos foi maior do que o tratamento sem
inoculação, demonstrando a capacidade dos micro-organismos em solubilizar fósforo
inorgânico, contribuindo assim para o desenvolvimento da planta. Dentre os microorganismos solubilizadores de fosfato, merecem destaque as bactérias fixadoras de nitrogênio
atmosférico, que, além de fornecer o N para o desenvolvimento vegetal, podem também
contribuir com o fornecimento de P para as plantas (Rodriguez & Fraga, 1999; Marra et al.,
2012).
2.5 Produção de ácido-3-indolacético
As auxinas são compostos que estimulam o crescimento, sendo o ácido-3-indolacético
(AIA) a principal auxina encontrada nas plantas.
Nas plantas, o AIA é produzido no
22
meristema apical do caule, folhas jovens, flores, frutos em desenvolvimento e sementes,
sendo que também é encontrado nas raízes. O seu transporte ocorre unidirecionalmente,
através de células parenquimáticas do floema e parenquimáticas que circulam os tecidos
vasculares (Raven et al., 2001) Este fitormônio é o mais estudado e também o que tem maior
ocorrência de produção pelas bactérias.
Entre as BPCV, tem sido demonstrado que o aumento da proliferação da raiz está
relacionada com a biossíntese de AIA. Dobbelaere et al. (1999), estudando mutantes de
Azospirillum, constatou que o aumento da raiz está relacionado com a biossíntese de AIA pela
bactéria, aumentando absorção de nutrientes e a liberação de exudados. Estudos de Kaneshiro
e Kwoleck (1985) demonstraram que a inoculação de mutantes espontâneos de B. japonicum
que produzia mais AIA resultou em um aumento do volume do nódulo da raiz.
Estudos com estirpes de Azospirillum brasilense mostraram a existência de pelo
menos três vias biossintéticas de AIA, sendo duas dependentes de triptofano, via do ácido
indole-3-acetamida (IAM) e a via do ácido indole-3-piruvato (IpyA), e uma via independente
de triptofano (Princen et al., 1993). A via do ácido indole-3-pirúvico (IPyA) é a via principal
para a produção de AIA na presença de triptofano exógeno (Dobbelaere et al., 1999). O
aminoácido L-triptofano funciona como um precursor fisiológico na biossíntese de auxina em
plantas e em micro-organismos (Khalid, 2004).
Chagas-Junior et al. (2009), avaliou em meio de cultura a produção de AIA por
bactérias isoladas de solos da Amazônia, verificando que as 92 estirpes produziram AIA sem
a adição de triptofano, porém, em 52 isolados, a adição e a elevação da concentração de
triptofano aumentaram a produção deste fitormônio. Prinsen et al.(1993) elucidou que 90% do
AIA produzido por Azospirillum brasiliense é sintetizado pela via não dependente de
triptofano.
2.6 Brachiaria brizantha cv MG05 Vitória
As pastagens representam um dos maiores ecossistemas do Brasil, sendo
caracterizadas como complexas, com seus componentes bióticos a abióticos organizados, os
quais interagem entre si, determinando assim, a amplitude das respostas de plantas e animais
(Da Silva et al., 2008).
As gramíneas são classificadas basicamente em duas categorias: C3 (temperadas) e C4
(tropicais como o capim marandu), as quais levam em consideração a sua adaptação
23
ambiental e a sua eficiência fotossintética, respectivamente. Em termos de digestibilidade,
teor de proteína e consumo, as forrageiras temperadas apresentam melhor qualidade (Moreira,
2006), já as forrageiras tropicais proporcionam maior eficiência fotossintética, o que
consequentemente as tornam mais produtivas em termos de matéria seca (Valle, 2001).
Dentre as diversas variedades de plantas forrageiras, a mais utilizada é a do gênero
Brachiaria, a qual pertence à família das poáceas, reunindo cerca de 100 espécies, as quais
são de grande importância econômica, sendo distribuída por regiões tropicais e subtropicais,
ocupando desta forma, a maior parte das pastagens cultivadas (Valle et al., 2009).
A B. brizantha (Hochst.) Stapf. cv. MG05 Vitória é uma gramínea forrageira com
características específicas, como sendo uma gramínea perene, poliploide, de reprodução
apomítica (Bogdan, 1977). Excelente vigor vegetativo, alta produtividade, com crescimento
entouceirado e talos prostrados que podem se enraizar quando em maior contato como o solo,
podendo atingir até 1,60m de altura. Suas folhas são lanceoladas com pouca pubescência, com
inflorescência em forma de panícula que mede de 40 a 50cm. A MG05 Vitória apresenta uma
ampla adaptação edafoclimática e pode ser recomendada para regiões onde o período de seca
pode chegar a 5 meses e em regiões com precipitações superiores a 3.000 mm anuais.
Uma de suas características é a capacidade de adaptação a solos ácidos e arenosos e com má
drenagem sendo a mais importante a sua boa produção de matéria seca. Apresenta um teor em
torno de 13% de proteína bruta e digestibilidade em torno de 62,3%.
Embora as diferentes espécies de Brachiaria sejam tolerantes ao manejo inadequado e
à deficiência da disponibilidade de nutrientes, estes e outros fatores contribuem no aumento
da degradação de áreas cultivadas com a respectiva gramínea. Por outro lado, uma pastagem
bem manejada favorece a maior cobertura vegetal, contribuindo assim com a conservação do
solo e água (Bonfim-Silva et al., 2011).
2.7 Análise bromatológica de pastagens
Quando se analisa as condições de pastagens tropicais, observa-se que as mesmas
apresentam um potencial elevado no que se refere à produtividade de forragem por área,
entretanto, o teor de proteína é baixo, com alto teor de fibra, o que consequentemente
evidencia a sua baixa digestibilidade.
24
Para que se possa fazer a análise do potencial de produção e crescimento de uma
determinada forrageira, é necessário determinar o teor de substâncias nutritivas por meio de
análises químicas bromatológicas (Silva & Queiróz, 2002).
Segundo Souza (2002), a cultivar B. brizantha vem se destacando no cenário nacional
cujos rendimentos estão entre 10 a 18 toneladas de MS ha-1 ano-1, com valores nutricionais
consideráveis.
Em relação aos teores de MS, constata-se que diferentes intervalos de corte, e com o
avanço da idade das plantas, ocorre o seu aumento, os quais podem variar de 16,0 a 26,6% em
intervalos de 15 a 60 dias de crescimento (Costa et al., 2007).
As maiores alterações que podem ocorrer na composição química das forrageiras são
as decorrentes da maturidade da planta, onde, à medida que esta amadurece, a proporção de
celulose, lignina e hemicelulose, decrescem, e outras frações indigestíveis se elevam,
contribuindo assim com a queda na digestibilidade (Mari, 2003).
O conhecimento quanto à variação da composição química em plantas forrageiras em
seus estádios fenológicos é um dos fatores que devem ser considerados quando se pretende
realizar o manejo adequado, onde a maturação da gramínea promove a redução nos teores de
proteína bruta e elevação no teor de matéria seca, celulose e lignina, o que interfere na
aceitabilidade da gramínea pelos animais. Cortes ou pastejos menos frequentes proporcionam
maior produção da forragem, porém ocorrem alterações na sua composição química (Lista et
al., 2007).
Na avaliação do valor nutritivo e da composição bromatológica de plantas forrageiras,
fatores como fibra em detergente ácido (FDA), fibra em detergente neutro (FDN), proteína
bruta (PB) apresentam um papel importante na análise quanto à qualidade da gramínea (Van
Soest, 1994), pois a digestibilidade está diretamente relacionada aos teores de FDA (lignina e
celulose) e FDN (celulose, hemicelulose e lignina) presentes na forrageira, onde o aumento
significativo do teor de fibras diminuiu a digestibilidade da matéria seca. Quanto menor for o
teor de FDA constituinte da matéria seca (MS), maior será o valor energético, onde nas
gramíneas, valores médios em torno de 35% são considerados bons para efeitos de
digestibilidade (Mesquita et al., 2002).
Estudos realizados por Mesquita et al. (2002), em relação ao estabelecimento de
pastagens formadas por Brachiaria concluíram que a FDN da Brachiaria decumbens
apresentou variação entre 68,1 a 72,4% e a proteína bruta entre 6,2 e 7,6%.
25
Quando se avalia a digestibilidade de um volumoso deve-se levar em consideração os
teores de FDA, pois valores elevados do mesmo diminuem a digestibilidade da MS (Branco,
2006).
A altura da planta, a relação entre colmo e folha, a dinâmica do perfilhamento a
expansão foliar, entre outros fatores, podem ter relação direta em relação à produtividade e
qualidade da forragem (Costa & Paulino et al., 2007).
2.8 Uso de inoculantes ou biofertilizantes
O termo biofertilizante é usado para definir todos os produtos que contenham microorganismos, os quais apresentem a capacidade de influenciar de forma positiva o
desenvolvimento das plantas (Reis, 2006).
A utilização de inoculantes ou biofertilizantes, contendo bactérias diazotróficas tem
como objetivo proporcionar um número suficiente de células capazes de promover a rápida
colonização da rizosfera, o que permitiria um aumento na produtividade, segundo Catroux
(1991).
Deaker et al. (2004) descreve a necessidade dos inoculantes apresentarem
determinadas características, como qual a estirpe utilizada e sua competitividade, o número de
células necessárias ou viáveis para a rápida colonização da rizosfera e do tecido vegetal
(raízes), obtendo assim o maior potencial de utilização destes organismos.
A produção de inoculantes utilizando-se de veículos não tóxicos, solúveis em água e
associadas a estirpes competitivas deve ser levada em consideração para novos estudos e para
o desenvolvimento de novos biofertilizantes, não se esquecendo da responsabilidade social,
ambiental e inovação tecnológica (Fernandes Júnior, 2006).
Segundo Reis, (2006) para que se obtenha sucesso quanto ao uso da inoculação, é
necessário que se faça a seleção de estirpes eficientes e que estas sejam tolerantes ao estresse,
já que as bactérias diazotróficas são encontradas em diferentes tipos de solo e sua
sobrevivência está condicionada a fatores como a salinidade, seca e o pH do solo.
Ferreira et al. (1987) observaram que estirpes do gênero Azospirillum atuam no
crescimento vegetal através do processo de redução do nitrato, o que contribuiria com a planta
26
para que a mesma não dispensasse energia na redução do nitrato à amônia, o que permitiria
um ganho de energia, a qual seria gasta em outros processos vitais à planta.
No entanto, embora os benefícios apresentados, observa-se que os estudos de FBN
ainda são incipientes para as gramíneas do gênero Brachiaria spp, uma vez que ainda não se
encontra disponível no mercado estirpe aprovada como inoculante para este gênero pelo
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA, 2011).
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31
CAPÍTULO 2
32
ARTIGO 1
(Artigo formatado de acordo com as normas da Revista Ciência Rural- ISSN 0103-8478 – B1- a ser submetido)
Diversidade de bactérias diazotróficas em pastagens Brachiaria brizantha
(Diversity of diazotrophic bacteria in pasture Brachiaria brizantha)
Márcio de Souza Dias1; Ligiane Aparecida Florentino2; Adauton Vilela de Rezende 3.
Resumo – O objetivo deste estudo foi analisar a diversidade de bactérias diazotróficas
associadas e endofíticas de Brachiaria brizantha em duas épocas do ano e estudar a
capacidade destas em solubilizar fosfatos inorgânicos e produzir ácido-3-indolacético (AIA).
As bactérias foram isoladas de amostras de solos cultivados sob B. brizantha e partes do
tecido vegetal desta gramínea, coletadas nos municípios de Alfenas e Machado, nos períodos
seco e chuvoso. Foram utilizados cinco meios de cultura semissólidos e semisseletivos: FAM
(Azospirillum amazonense), JMV (Burkholderia sp.), JNFb (Herbaspirillum spp.), LGI (A.
amazonense) e NFb (Azospirillum spp.). Foi obtido um total de 332 isolados, sendo a maioria
endofíticos. Os isolados foram agrupados de acordo com as características morfológicas, que
foram utilizadas para estimar a diversidade utilizando-se o índice de Shannon. Os testes de
solubilização de fosfato e produção de AIA foram realizados in vitro para todos os isolados. O
maior número e diversidade foram provenientes do município de Alfenas. No período
chuvoso foi verificado maior número e diversidade de isolados em ambos os Municípios,
quando comparado ao período da seca. Trinta e cinco isolados solubilizaram fosfato de ferro e
33
78 produziram AIA, destacando-se os isolados 100-17, 100-21, 100-40 e 100-78, capazes de
desempenhar ambas as funções simultaneamente.
Palavras-chave: Fixação biológica de nitrogênio, degradação pastagens, bactérias
promotoras crescimento vegetal.
________________________
1
Universidade José do Rosário Velano – UNIFENAS. 2*Faculdade de Agronomia – UNIFENAS. E-mail:
[email protected] (Autor para correspondência). 3Faculdade de Agronomia – UNIFENAS, Alfenas,
MG.
Abstract - The objective of this study was to analyze the diversity of nitrogen fixing bacteria
associated and endophytic B. brizantha in two seasons and study the capacity the solubility of
inorganic phosphates and produce acid-3-indole acetic (AIA). The bacteria were isolated from
soil samples grown under Brachiaria and parts of the plant tissue of this grass, collected in the
cities of Alfenas and Machado, the dry and wet periods. Five semisolid culture media and
semi-selective were used: FAM (Azospirillum amazonense), JMV (Burkholderia sp.), JNFb
(Herbaspirillum spp.), LGI (A. amazonense) and NFb (Azospirillum spp.). A total of 332
isolates were obtained, most endophytic. Isolates were grouped according to the
morphological characteristics that were used to estimate the diversity using the Shannon
index. Phosphate solubilization and AIA tests were performed in vitro production of all
isolates. The greatest number and diversity were from the city of Alfenas. During the rainy
season was verified greater number and diversity of isolates in both municipalities, when
compared to the dry season. Thirty-five isolates solubilized iron phosphate and 78 produced
AIA, highlighting the isolated 100-17, 100-21, 100-40 and 100-78, able to do both
simultaneously.
Key words: Biological nitrogen fixation, degradation pastures, promoting bacteria plant
growth.
34
INTRODUÇÃO
Estima-se que cerca de 70% das pastagens cultivadas no Brasil encontram-se em
processo de degradação, fenômeno este que pode ser explicado, principalmente, pela baixa
fertilidade natural dos solos das regiões tropicais e pela falta de reposição de nutrientes
(MACEDO, 2005), sendo que o nitrogênio é considerado o elemento mais limitante à
produtividade de Brachiaria spp. (VASCONCELOS, 2006).
Nesse sentido, o uso da biotecnologia da fixação biológica do nitrogênio atmosférico
(N2) (FBN), mediada pelas bactérias diazotróficas ou fixadoras de N2, apresenta-se como uma
alternativa à substituição na utilização de fertilizantes nitrogenados, reduzindo os custos de
produção e também possíveis impactos ambientais provocados pelas reações bioquímicas
deste elemento no solo.
No entanto, a FBN tem sido mais difundida no cultivo de leguminosas, formando
uma interação simbiótica, evidenciada pela formação de nódulos radiculares e/ou caulinares
(MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). Mas, diversos estudos indicam o benefício da inoculação
com as bactérias diazotróficas em diferentes gramíneas forrageiras (DIDONET et al., 1996;
CAVALLET et al., 2000; OLIVEIRA et al., 2007). Nesse caso, não ocorre a formação de
nódulos e essas bactérias podem se estabelecer na rizosfera dessas plantas, formando uma
associação, ou serem encontradas no interior dos tecidos (endofíticas).
A inoculação de estirpes bacterianas diazotróficas em Brachiaria spp. indicam que
estas podem fornecer parte do N necessário ao desenvolvimento vegetal, suprindo até 40 kg N
ha-1 (BODDEY & VICTORIA, 1986; BRAZ et al., 2013). Além do fornecimento do
nitrogênio, estudos indicam que essas bactérias podem contribuir para a promoção do
crescimento vegetal por meio da produção de hormônios, como o ácido-3-indolacético (AIA),
35
solubilização de fosfatos inorgânicos e controle de patógenos (BASHAN & HOLGUIN,
1997; CAVALLET et al., 2000; REIS JÚNIOR et al., 2004).
Apesar dos benefícios apresentados, observa-se que os estudos de FBN ainda são
incipientes para as gramíneas do gênero Brachiaria spp. Nesse sentido, o objetivo deste
estudo foi analisar a diversidade de bactérias diazotróficas associadas e endofíticas de
Brachiaria brizantha e a capacidade destas em solubilizar fosfatos inorgânicos de ferro e
alumínio e produzir o hormônio AIA.
MATERIAL E MÉTODOS
As amostras de solo e de tecido vegetal (raízes) utilizadas no estudo foram coletadas
em áreas de pastagens cultivadas com B. brizantha, sendo três nos municípios de Alfenas
(P01: S 21º 27,638' e W 045º 55, 692'; P02: S 21º 23,921' e W 045º 56, 199'; P03: S 21º
23,167' e W 045º 56, 474') e três no município de Machado (P01: S 21º 39.836' e W 045º
59.707'; P02: S 21º 38.883' e W 046º 01.681'; P03: S 21º 37.707' e W 046º 01.385'),
localizados na região Sul do Estado de Minas Gerais, nos períodos seco e chuvoso,
respectivamente, julho e dezembro de 2013 (tabela 1).
Tabela 1. Valores médios referentes à pluviosidade, temperatura mínima e máxima no
Período de seca
Período chuvoso
Parâmetros
Alfenas
Machado
Alfenas
Machado
Pluviosidade (mm)
26,4
43,0
158,6
148,0
Temperatura mínima (ºC)
16,7
12,0
23,2
19,0
Temperatura máxima (ºC)
18,2
29,0
24,5
32,0
municípios de Alfenas e Machado, nos meses de julho e dezembro de 2013.
Dados obtidos em: http://www.inmet.gov.br
36
As amostras de solos foram coletadas na camada de 0-20 cm, seguindo a
metodologia adotada por GUIMARÃES et al., (2012). Esses mesmos pontos foram utilizados
para coleta de raízes de B. brizantha. O material coletado (solo e raízes) foram conservados
em caixas térmicas a 4ºC. As amostras de solos foram submetidas a análises das
características químicas conforme métodos compilados em EMBRAPA (2011) (tabela 2).
Tabela 2. Características químicas dos solos das áreas de estudo dos municípios de Alfenas e
pH (H2O) P
Local
K Ca²+ Mg²+ Al³+ H + Al SB
mg dm-3
cmolc dm-3
t
T
V m
MO
%
dag Kg-1
Alfenas
P01
5,6
P02
6
P03
0,5 30
2,4
0,8
0
2,8
3,3 3,3 6,1 54 0
34
3,7
1,0
0
3,1
4,7 4,7 7,8 60 0
43
5,5
0,5 114 2,4
0,8
0,1
3,8
3,5 3,6 7,3 48 3
42
P01
5,3
1 128 1,8
0,8
0,5
7,2
2,9 3,4 10,1 29 15
35
P02
5,2
0,5 68
0,7
0,6
0,6
4,7
1,5 2,1 6,2 24 28
45
P03
5,6
0,5 120 1,6
0,7
0
2,5
2,6 2,6 5,1 51 0
33
1
42
Machado
Machado.
O isolamento das bactérias diazotróficas foi realizado por meio da inoculação das
amostras (solo e raízes), em frascos contendo meios de cultura semissólidos e semisseletivos:
NFb (Azospirillum spp.), JNFb (Herbaspirillum spp.), LGI (A. amazonense) (DÖBEREINER
37
et al., 1995), JMV (Burkholderia spp.) (REIS et al., 2004) e FAM (Azospirillum amazonense)
(MAGALHÃES & DÖBEREINER, 1984).
A metodologia utilizada para realização da inoculação do solo e das raízes nos
diferentes meios de cultivo foi de acordo, respectivamente, com DINIZ et al. (2012) e
SANTOS et al. (2013). Após o isolamento, procedeu-se a purificação e as bactérias foram
inoculadas novamente nos meios de origem para confirmação da capacidade de fixação de N2,
evidenciada pela formação da película na superfície dos meios. Posteriormente, procedeu-se a
caracterização morfológica em meio batata dextrose Agar (BDA), contendo azul de
bromotimol, em que foram avaliados os seguintes parâmetros: tempo de crescimento (rápido,
intermediário, lento), alteração do pH do meio (neutro, ácido, ácido/alcalino, alcalino), cor
(amarelo, creme), forma (regular, irregular), absorção de indicador (sim, não), produção de
exopolissacarídeo (escassa, baixa, média, alta). Essas características foram utilizadas para
agrupar os isolados e estimar a diversidade pelo índice de Shannon-Weaver, sendo
determinada pela fórmula a seguir:
= −Σ[ ln ]
em que: H’ = índice de Shannon-Weaver; ni = número de grupos formados com as diferentes
características culturais; N = número total de isolados; ln = logaritmo na base natural.
Os isolados foram avaliados quanto à capacidade de solubilizar fosfato de ferro
(FePO42H2O) e de alumínio (AlPO4.2H2O), utilizando-se respectivamente os meios GELP e
GES (SYLVESTRES-BRADLEY, 1982) e seguindo-se a metodologia adotada por MARRA
et al. (2012). A cada três dias, por um período de 12 dias, com o auxílio de um paquímetro
digital, foi medido o diâmetro da colônia e do halo de solubilização, obtendo-se assim o
índice de solubilização (IS) de acordo com BERRAQUERO et al. (1976), que classifica os
isolados em baixa (IS < 2 mm), média (2 ≤ IS < 4 mm) e alta (IS > 4mm) capacidade de
solubilização. Foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado (DIC) e os valores de IS
38
foram comparados pelo teste de Skott-Knott a 5% de probabilidade, utilizando-se o programa
Sisvar (FERREIRA, 2011).
Devido ao grande número de isolados, a produção de AIA foi determinada conforme
metodologia descrita por BRICK et al. (1991) e CATTELAN(1999). Utilizaram-se quatro
repetições, sendo avaliadas a presença ou ausência da produção de AIA, de acordo com a
formação de halo avermelhado ao redor das colônias bacterianas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foi obtido um total de 332 isolados, dos quais, 203 oriundos do município de
Alfenas, sendo 135 de origem endofítica e 68, do solo. No município de Machado foram
obtidos 129, sendo 79 de origem endofítica e 50 oriundos do solo. Esses isolados bacterianos
foram isolados dos cinco diferentes meios de cultivo, de acordo com a seguinte distribuição:
15% foram isolados a partir do meio FAM, 20% do meio JMV, 21% do meio LGI, 21% do
meio NFb e 23% do meio JNFb.
Estes meios semissólidos e semisseletivos são amplamente utilizados em estudos
visando capturar populações de bactérias diazotróficas que colonizam o solo e espécies de
gramíneas, como a Brachiaria sp., (DÖBEREINER, 1988; REIS JÚNIOR et al., 2004;
BRASIL et al., 2005). A tabela 3 apresenta o número e diversidade desses isolados de acordo
com o período de coleta e os municípios estudados.
39
Tabela 3. Número e diversidade de bactérias fixadoras de N2 isoladas de amostras de solo
cultivado sob Brachiaria brizantha e de tecidos vegetais (endofíticas) desta gramínea, nos
municípios de Alfenas e Machado, nos períodos seco e chuvoso.
Local/
Ponto de amostragem
Solo
Endofítica
Período
Período
Seco
Chuvoso
Seco
Chuvoso
NI1
IS2
NI1
IS2
NI1
IS2
NI1
IS2
P01
9
1,89
13
2,20
18
2,03
32
2,56
P02
4
1,39
23
2,48
17
1,93
34
2,57
P03
1
-
18
2,18
7
1,95
27
2,64
P01
6
1,56
13
2,25
8
1,26
15
1,95
P02
2
0,69
16
1,93
9
1,58
29
2,66
P03
-
-
13
1,94
1
-
17
2,20
Alfenas
Machado
1
Número de isolados; 2Índice de Shannon-Weaver
De acordo com os dados da tabela 3, o maior número de isolados foi oriundo do
município de Alfenas. Esse resultado pode estar relacionado às melhores condições químicas
apresentadas pelos solos coletados no município de Alfenas (tabela 2). Segundo KENNEDY
et al. (2004), a disponibilidade de nutrientes é um dos fatores que influencia positivamente a
comunidade bacteriana do solo.
No entanto, em ambos os municípios, a maior disponibilidade de água no solo foi
fator determinante para a presença do maior número de isolados no período chuvoso quando
comparado ao período da seca. Resultados semelhantes foram encontrados por REIS JR et al.
40
(2004), estudando a densidade de Azospirillum amazonense em Brachiaria humidicola, B.
decumbens cv. Basilisk e B. brizantha cv. Marandu em solos do Cerrado e da Mata Atlântica.
A diversidade observada pelo índice de Shannon apresentou a mesma tendência dos
dados referentes ao número de isolados, ou seja, a maior diversidade foi obtida no município
de Alfenas, sendo que no período chuvoso foi observada maior diversidade de isolados de
ambos os municípios, quando comparado ao período da seca. A influência da água na maior
diversidade de bactérias diazotróficas endofíticas da cultura do milho também foi observada
por ROESCH et al. (2007). Além disso, a melhoria das condições químicas dos solos
coletados no município de Alfenas pode ter contribuído para o aumento da diversidade das
bactérias diazotróficas.
Considerando o potencial de contribuição das bactérias fixadoras de N2 nas áreas de
Estirpes
IS (mm)
pastagens, a avaliação da ocorrência destas em diferentes períodos do ano é de extrema
relevância para o manejo das áreas de pastagens, justificando a realização de estudos
semelhantes em diferentes regiões do Brasil (REIS JÚNIOR et al., 2004; BRASIL et al.,
2005).
Quanto à solubilização de fosfatos inorgânicos, nenhum foi capaz de solubilizar o
fósforo ligado ao alumínio (AlPO4.2H2O), o que pode ser devido à toxidez deste elemento à
célula bacteriana (MADIGAN et al., 2004). Já em relação ao fosfato de ferro (FePO4.2H2O),
35 isolados bacterianos foram capazes de solubilizar o fósforo (tabela 4).
Tabela 4. Índice de solubilização (IS) de fosfato de ferro (FePO4.2H2O) em meio sólido
GELP por bactérias diazotróficas de Brachiaria brizantha.
41
100-40
10,34 a
100-05
8,27 b
100-01; 100-02; 100-59
7,12 ± 0,25 c
100-23; 100-116
6,14 ± 0,19 d
100-08; 100-15
5,42 ± 0,01 e
100-35; 100-14; 100-16; 100-70; 100-71; 100-78; 100-82; 100-32
4,35 ± 0,48 f
100-09; 100-44; 100-69
3,50 ± 0,13 g
100-12; 100-43; 100-49; 100-51; 100-67; 100-17; 100-33; 100-34;
2,81 ± 0,29 h
100-265
100-07; 100-28; 100-30; 100-31; 100-42; 100-280
2,09 ± 0,28 i
De acordo com os valores apresentados na tabela 4, observa-se uma grande
variabilidade entre os isolados em solubilizar fosfato de ferro, sendo que cerca de 50% dos
isolados apresentaram IS > 4 mm, sendo considerados, segundo BERRAQUERO et al.
(1976), como alta solubilização de P. SILVA FILHO & VIDOR (2000), relatam que a
capacidade de solubilizar fosfato varia de acordo com o tipo de micro-organismo, a presença
de fontes de carbono e a disponibilidade de nutrientes no solo
A maioria dos isolados que solubilizaram fosfato de ferro foi obtida no período da
seca, sendo somente os isolados 100-116, 100-265 e 100-280 capturados no período chuvoso.
Esses resultados apresentam grande relevância para o fornecimento de fósforo para as plantas,
uma vez que no período da seca a disponibilidade de fósforo reduz devido à sua baixa
mobilidade no solo (NOVAIS et al., 2007). Nesse sentido, verifica-se que apesar da redução
no número e diversidade de isolados neste período do ano (tabela 3), a comunidade de
diazotróficos presente continua atuando na promoção do crescimento vegetal.
42
Quanto à produção de AIA, dos 332 isolados analisados, 78 (100-03; 17; 19; 21; 26;
34; 38; 40; 47 e 48; 50; 52 a 55; 61 a 63; 72; 73; 78; 85; 88; 105; 125; 129; 130; 137; 138;
142 a 145; 147; 150 a 153; 159; 163; 167; 170 a 173; 178; 181; 184; 185; 198; 212; 223; 227;
228; 230; 238 a 240; 263; 274; 281; 282; 303; 307; 308; 310; 311; 313 a 315; 317; 318; 321 a
323; 325; 330; 331) produziram AIA quando cultivados no meio contendo triptofano.
Diferentemente do observado para os solubilizadores de P, os produtores de AIA
foram obtidos, preferencialmente, na época chuvosa. Destes, 49 foram isolados de tecidos de
B. brizantha (endofíticos), sendo 17 oriundos do período da seca e 32 do período chuvoso. Os
demais isolados, 29, foram oriundos das amostras de solos, sendo que seis do período da seca
e os demais do período chuvoso. Em relação aos processos de solubilização de P e produção
de AIA, destacam-se os isolados 100-17, 21, 40 e 78, capazes de desempenhar ambas as
funções.
Segundo CROZIER et al. (1988), o AIA estão entre os fitormônios de crescimento
vegetal produzidos por Azospirillum e outros gêneros de bactérias diazotróficas, sendo este o
mais ativo e de melhor caracterização.
SARWAR e KREMER (1995) avaliaram alguns isolados de origem rizosférica de
diferentes plantas, e verificaram que isolados associados à raiz são mais eficientes na síntese
de AIA do que os não associados às plantas. A auxina, sintetizada por organismos rizosféricos
pode produzir repostas rápidas como o aumento da elongação celular, como respostas lentas
no que diz respeito à divisão e diferenciação celular (DOBBELAERE et al., 2003). São várias
as vias de síntese da auxina, sendo que o Triptofano é um precursor deste hormônio, pois a
sua adição nos meios de cultura (Salkowski) promove o aumento da síntese. O gênero
Azospirillum é amplamente estudado em função da sua interação com gramíneas e por
produzir auxina por diferentes vias.
43
CONCLUSÕES
A diversidade de bactérias diazotróficas em pastagens de Brachiaria brizantha está
relacionada à disponibilidade de água, no entanto, verifica-se o potencial destas em atuar
como promotoras do crescimento vegetal, independente do período do ano.
AGRADECIMENTOS
A CAPES/PROSUP, pela bolsa de mestrado, e ao CNPq, pela bolsa de Iniciação
Científica.
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50
ARTIGO 2
(Artigo formatado de acordo com as normas da Revista Ciência Rural- ISSN 0103-8478 – B1- a ser submetido)
Bactérias diazotróficas e as características morfológicas e bromatológicas de Brachiaria
brizantha cv MG 05 Vitória
(Diazotrophic and the morphological and qualitative characteristics of Brachiaria
brizantha cv MG 05 Victory)
Márcio de Souza Dias1; Ligiane Aparecida Florentino2*; Adauton Vilela de Rezende 3.
Resumo - Objetivou-se com esse trabalho avaliar o efeito da inoculação de diferentes isolados
diazotróficos sobre características morfológicas e bromatológicas de Brachiaria brizantha cv
MG05 Vitória. O experimento foi conduzido em vasos contendo 20 dm3 de solo durante 83
dias, com dois cortes, cujos tratamentos foram constituídos por: inoculação com 22 estirpes
bacterianas isoladas de B.brizantha e com a estirpe Azospirillum brasilense, e dois controles:
sem inoculação sendo o primeiro apenas com N-plantio e o segundo com N-plantio e Ncobertura.
Foi utilizado o delineamento em blocos casualizados com quatro repetições.
Foram analisados os seguintes parâmetros anatômicos: altura, largura e comprimento da folha,
número de perfilhos, peso seco da raiz e comprimento da raiz, matéria seca, produtividade de
matéria seca, fibra em detergente neutro e ácido, e a proteína bruta na matéria seca. A
inoculação
de
estirpes
diazotróficas
endofíticas
e
rizosféricas
influenciaram
no
desenvolvimento do capim B. brizantha cv MG05 Vitória, contribuindo positivamente com a
produção de matéria seca, produtividade de matéria seca e proteína bruta na matéria seca,
destacando-se os isolados UNIFENAS-100-16, 21, 78, cujo teor de proteína bruta na matéria
seca foi superior a 7%.
Palavras-chave: FBN, matéria seca, forrageiras
_______________________
1
Universidade José do Rosário Velano – UNIFENAS. 2*Faculdade de Agronomia – UNIFENAS. E-mail:
[email protected] (Autor para correspondência). 3Faculdade de Agronomia – UNIFENAS, Alfenas,
MG.
51
Abstract - The objective of this study was to evaluate the effect of inoculation of different
diazotrophics isolated on morphological and qualitative characteristics of B.brizantha cv
MG05 Victoria. The experiment was conducted in pots containing soil 20 dm3 for 83 days,
two courts, whose treatments were: inoculation with 22 isolated bacterial strains B.brizantha
and with Azospirillum brasilense strain, and two controls: without inoculation with the first
only with N-planting and the second N-planting and N-coverage. The design was used in a
randomized block design with four replications. The following anatomic parameters were
analyzed: height, width and length of the sheet, number of tillers, dry root weight and root
length, dry weight, dry matter yield, neutral and acid detergent fiber, and crude protein in dry
matter. Inoculation of endophytic strains and rhizospheric influenced the development of the
grass B. brizantha cv MG05 Victoria, positively contributing to the production of dry matter,
dry matter yield and crude protein in dry matter, highlighting the UNIFENAS-100- isolated
16, 21, 78, which crude protein content in the dry matter was in excess of 7%.
Key words:. FBN, dry matter, forage.
INTRODUÇÃO
O Brasil é considerado um dos maiores produtores e exportadores mundiais de carne
bovina, em que predomina o sistema de criação extensiva, caracterizado pela necessidade de
extensas áreas de cultivo de forrageiras (FONSECA et al., 2006), destacando-se o gênero
Brachiaria (AMBIEL et al., 2008).
Estima-se que cerca de 70% das pastagens brasileiras encontram-se degradadas ou
em vias de degradação, devido, principalmente, ao excesso de pastejo, baixa fertilidade
natural dos solos brasileiros e pela falta de reposição de nutrientes, em especial o nitrogênio
(MACEDO, 2005), indicando a necessidade de medidas de manejo visando recuperar estas
52
áreas e garantir a produtividade. VASCONCELOS (2006) destaca a importância do
nitrogênio como sendo um dos elementos mais limitantes à produtividade de Brachiaria spp.
A utilização da fixação biológica de nitrogênio (FBN) tem sido mais difundida no
cultivo de leguminosas, formando uma interação simbiótica, evidenciada pela formação de
nódulos radiculares e/ou caulinares (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). No entanto, diversos
estudos indicam o benefício da inoculação com as bactérias fixadoras de N2 em diferentes
gramíneas forrageiras (DIDONET et al., 1996; CAVALLET et al., 2000; OLIVEIRA et al.,
2007a). Nesse caso não ocorre a formação de nódulos e essas bactérias podem se estabelecer
na rizosfera dessas plantas, formando uma associação, ou serem encontradas no interior dos
tecidos (endofíticas).
A inoculação de estirpes bacterianas fixadoras de N2 em Brachiaria spp. indicam que
estas podem fornecer parte do N necessário ao desenvolvimento vegetal, suprindo até 40 kg N
ha-1 (BODDEY & VICTORIA, 1986; BRAZ et al., 2013). No entanto, embora se considerem
os benefícios apresentados, observa-se que os estudos de FBN ainda são incipientes para as
gramíneas do gênero Brachiaria spp, uma vez que ainda não se encontra disponível no
mercado estirpe aprovada como inoculante para este gênero pelo Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (MAPA, 2011).
Desta forma, objetivou-se com esta pesquisa avaliar o efeito da inoculação de
diferentes isolados diazotróficos sobre características morfológicas e bromatológicas de
Brachiaria brizantha cv MG05 Vitória.
MATERIAL E MÉTODOS
Foi conduzido experimento em vasos no viveiro de mudas florestais da Faculdade de
Agronomia da Universidade José do Rosário Vellano (UNIFENAS), em Alfenas (MG), cujo
período de condução foi de agosto a novembro de 2014, período em que a temperatura média
53
registrada foi de 17,3 a 27,6ºC, pluviosidade de 382 mm e altitude de 860 metros (latitude 21º
27’, longitude 45º 56’). A tabela 1 apresenta as características químicas do solo utilizado no
experimento.
Tabela 1. Resultado da análise química do solo utilizado no experimento em vasos.
P
K Ca²+ Mg²+ Al³+ H + Al SB
pH
t
T
V M
MO
-3
-3
(H2O) mg dm
cmolc dm
%
dag Kg-1
5,2
0,5
21
0,3
0,2
0,2
2,6
0,6 0,8 3,2 18 26
6
Antes da instalação do experimento foi feita a correção do solo, visando elevar a
saturação por bases a 70% e a adubação de implantação foi constituída por 500 kg ha-1 de
P2O5 na forma de superfosfato simples e 120 kg ha-1 de K na forma de cloreto de potássio,
quando cada vaso recebeu respectivamente 5g e 1,2 g.
Para o plantio, utilizaram-se mudas de B. brizantha que foram cultivadas por 21 dias
em bandejas de isopor contendo substrato orgânico. Após, estas foram transferidas para vasos
contendo 20 dm3 de solo (latossolo vermelho escuro com textura argilosa), sendo cultivadas
seis plantas por vaso, Durante o período do experimento, o solo foi mantido irrigado de
acordo com sua capacidade de campo. Foram utilizados 2,28 g vaso-1 de uréia (N plantio)
cinco dias após o transplantio em todos os vasos.
Os tratamentos utilizados constaram da inoculação com 22 estirpes bacterianas
pertencentes à coleção da UNIFENAS (UNIFENAS-100-02, 06, 16, 17, 21, 28, 30, 31, 33,
34, 35, 40, 42, 43, 49, 51, 67, 69, 71, 78, 82 e 280) isoladas de B. brizantha e de comprovada
capacidade de solubilizar fosfato e produzir o fitormônio ácido-3- indolacético (AIA) in vitro.
Além disso, foram utilizados mais três tratamentos: um inoculado com a estirpe Azospirillum
brasilense, aprovada como inoculante para as culturas do milho, trigo e arroz (MAPA, 2011)
e outros dois controles sem inoculação, o primeiro contendo somente N plantio (2,28g vaso-1
/controle negativo) e o segundo contendo N plantio (2,28 g vaso-1) e N cobertura (2,28g vaso-1
54
/controle positivo), sendo a cobertura realizada em dois momentos 20º e 58º dia. Foi utilizado
o delineamento em blocos ao acaso, com quatro repetições por tratamento, onde os dados
obtidos foram comparados pelo teste de Scott-Knott, a 5% de probabilidade, com o programa
Sisvar (FERREIRA, 2011).
Os isolados diazotróficos selecionados foram cultivados em meio líquido BDA e
incubados por três dias, sob agitação, a 28°C, tempo suficiente para que as culturas atingissem
a fase log de crescimento, contendo, aproximadamente 108 células mL-1. Uma alíquota de 5
mL desta suspensão de células foi inoculada nas plantas sete dias após serem transplantadas.
Vinte dias após o transplantio, foi realizada a adubação de cobertura (2,28 g vaso-1) no
tratamento contendo N plantio + N cobertura.
Após 58 dias de cultivo, quando as plantas atingiram 40 cm de altura, foi realizado
um corte a 10 cm acima da superfície do solo para uniformização dos tratamentos. Nesse
período, as plantas foram novamente inoculadas, conforme descrito anteriormente e realizouse novamente a adubação de cobertura no tratamento contendo N plantio + N cobertura.
No 26º dia após o corte de uniformização, as plantas atingiram novamente a altura de
40 cm e foram analisados os seguintes parâmetros anatômicos: altura, largura e comprimento
da folha, número de perfilhos e comprimento e peso seco das raízes. A porcentagem de
matéria seca total (MS), fibra em detergente neutro (FDN), fibra em detergente ácido (FDA) e
teor da proteína bruta na matéria seca (%PBMS) foram realizadas segundo metodologia
descrita por SILVA & QUEIRÓZ (2002).
Os dados foram submetidos à análise estatística, e as médias das quatro repetições
foram comparadas pelo teste de Scott-Knott, a 5% de probabilidade, utilizando-se o programa
Sisvar (FERREIRA, 2011).
55
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Efeitos significativos da inoculação de isolados diazotróficos sobre as plantas de
Brachiaria foram observados, no primeiro e no segundo corte, em relação aos parâmetros
altura da planta, largura da folha, comprimento da folha e número de perfilhos, onde os
parâmetros, peso da matéria seca e comprimento da raiz, foram observados apenas no
segundo corte, conforme dados apresentados na tabela 2.
Tabela 2. Altura (Al), Largura (LF) e comprimento da folha (CF), número de perfilhos (NP) e
matéria seca (MS) de Brachiaria brizantha cv MG05 Vitória cultivada sob diferentes
tratamentos no primeiro corte e segundo corte. Massa seca radicular (MSR) e crescimento
radicular (CR) segundo corte.
Tratamentos
Não
inoculados
N plantio +
N cobertura
N plantio
Inoculados
Azospirillum
100-02
100-06
100-16
100-17
100-21
100-28
100-30
100-31
100-33
100-34
100-35
100-40
100-42
100-43
Al1
(cm)
1º Corte
LF1
CF1
(cm) (cm)
1
NP
41,75a 1,77a 32,30a 37,0a
29,68a 1,20c 19,05i 15,3b
39,45a
44,23a
34,78a
43,25a
44,38a
41,98a
45,08a
43,65a
43,40a
45,78a
40,93a
40,55a
45,13a
43,88a
44,43a
1,18c
1,46b
1,33c
1,14c
1,23c
1,45b
1,39b
1,25c
1,41b
1,43b
1,28c
1,40b
1,50b
1,43b
1,30c
15,78j
23,93e
21,75g
11,05l
26,38c
25,00d
15,15k
21,55g
21,95f
16,88j
19,23i
20,98g
20,33h
30,00b
19,23i
18,5b
18,8b
16,5b
16,5b
14,8b
17,3b
14,3b
17,8b
18,0b
16,5b
18,3b
19,3b
18,5b
17,8b
17,0b
Al1
(cm)
LF1
(cm)
2º Corte
CF1
NP1
(cm)
MSR1
(g)
CR1
(cm)
43,80a 1,76a 54,27a 57,5a 16,42a 61,82a
42,12a 1,41b 35,82g 25,5b
29,82b
42,37a
43,65a
42,15a
42,12a
38,22a
44,05a
41,82a
44,52a
43,95a
45,05a
43,90a
41,30a
42,67a
44,50a
1,30b
1,60a
1,45b
1,24b
1,35b
1,59a
1,53a
1,33b
1,54a
1,57a
1,41b
1,53a
1,65a
1,55a
1,44b
26,50k
40,20e
36,55g
18,55l
44,32c
42,02d
25,45k
36,25g
36,85f
28,37j
32,32i
35,27g
34,12h
50,42b
32,27i
31,0b
31,2b
27,5b
27,5b
24,5b
29,0b
23,5b
29,2b
30,0b
27,5b
30,5b
32,0b
30,7b
29,5b
28,2b
9,42b 35,57c
11,27b
10,12b
13,80a
8,25b
14,57a
13,35a
9,87b
10,8b
11,10b
8,97b
8,72b
11,12b
13,30a
11,07b
9,92b
45,15b
40,95b
48,62a
41,35b
48,92a
49,70a
50,32a
50,50a
42,90b
42,70b
31,25c
51,10a
44,40b
24,60c
42,70b
56
100-49
43,10a 1,29c
100-51
44,50a 1,40b
100-67
45,95a 1,34c
100-69
43,00a 1,23c
100-71
42,80a 1,38b
100-78
43,50a 1,34c
100-82
44,28a 1,32c
100-280
41,78a 1,22c
CV(%)
17,72 9,85
1
Médias seguidas da mesma
22,93f 16,3b
18,93i 17,3b
18,58i 18,0b
21,30g 16,8b
19,03i 19,3b
21,95f 20,3b
22,40f 17,8b
22,10f 21,3b
2,78 17,58
letra, na coluna,
42,27a 1,41b 38,55f 27,2b 8,75b 51,92a
43,67a 1,52a 31,80i 28,7b 9,05b 44,82b
43,17a 1,46b 31,20i 29,7b 12,25a 43,35b
43,22a 1,34b 35,80g 27,7b 6,80b 34,45c
43,60a 1,52a 31,97i 32,0b 11,02b 33,97c
43,35a 1,47b 36,85f 33,7b 14,20a 45,65b
42,22a 1,46b 37,65f 29,5b 11,85a 52,65a
40,67a 1,34b 37,12f 35,5b 8,55b 41,62b
6,97 9,62 2,83 17,98 29,81 15,27
não diferem entre sí pelo teste de Scott-Knott,
considerando o valor nominal de 5% de significância.
Em relação ao parâmetro altura, os resultados experimentais nos permitiram concluir
que não houve efeito significativo em ambos os cortes, pois todas as plantas inoculadas
apresentaram altura semelhante aos observados em relação ao controle positivo e negativo,
entretanto, no segundo corte, o tratamento inoculado com A. brasilense apresentou altura
inferior aos demais tratamentos. GUIMARÃES et al. (2011) relata que, em se tratando de
pastagens constituídas por Brachiaria, o parâmetro altura, em específico altura elevada,
facilita o pastejo e em contrapartida o desempenho do animal, estabelecendo assim, a relação
entre maior altura do pasto e a maior produção de massa seca, entretanto, BONFIM-SILVA et
al.(2010) destaca que o parâmetro altura deve estar relacionado à idade da planta e à
qualidade desta quanto à disponibilidade ao animal.
Houve efeito significativo dos diferentes tratamentos sobre a largura das folhas em
ambos os cortes, onde os tratamentos inoculados com as estirpes bacterianas UNIFENAS100-02, 21, 28, 31, 33, 35, 40, 42, 51 e 71 foram semelhantes entre si e superiores ao controle
negativo, destacando-se a contribuição da FBN no que se refere ao aumento da largura da
folha, o que colaboraria com a eficiência fotossintética, o que de acordo com TAIZ &
ZEIGER (2004), as folhas apresentam a capacidade de se adaptarem aos fatores ambientais e
57
que o aumento em sua largura permitiria a proteção de mecanismo que atua na fotossíntese
em relação ao excesso de radiação.
Quanto ao comprimento da folha, houve efeito significativo no primeiro e segundo
corte, onde os tratamentos UNIFENAS-100-02, 17, 21 e 42 apresentaram médias superiores a
alcançada pelos demais tratamentos e pelo controle negativo onde pode ser observada a
contribuição destes isolados ao longo do experimento. Ressalta-se ainda que a contribuição
destes isolados foi superior ao tratamento Azospirillum.
Em relação ao número de perfilhos, observou-se, em ambos os cortes, que a
contribuição dos isolados em relação a este parâmetro foi significativa, sendo observado um
aumento em torno de 60% no número de perfilhos do segundo corte em relação ao primeiro.
Estudos realizados por ALEXANDRINO et al. (2005) corroboram com os resultados
alcançados, onde plantas submetidas a diferentes doses de nitrogênio apresentaram diferenças
significantes quanto ao perfilhamento ao longo do tempo, o que evidenciaria o efeito positivo
da inoculação micro-organismos diazotróficos, e que de acordo com MARTHA JÚNIOR et
al. (2004), esta disponibilidade de nitrogênio no solo contribuiria positivamente no aumento
da fotossíntese, o que consequentemente contribuiria com o maior estímulo ao perfilhamento.
Apenas os isolados UNIFENAS-100-17 e 28 apresentaram médias inferiores ao controle
negativo.
Quanto ao parâmetro massa seca radicular os resultados obtidos pelos tratamentos
UNIFENAS-100-06, 17, 21, 40, 67, 78, 82 e o controle positivo foram idênticos entre si e
superiores aos valores encontrados pelos tratamentos Azospirillum, UNIFENAS-100-02, 16,
28, 30, 31, 33, 34, 35, 42, 43, 49, 51, 69, 71 e 280, estes semelhantes entre si e o controle
negativo.
Já em relação ao crescimento radicular, observa-se que os tratamentos inoculados
com as estirpes bacterianas UNIFENAS 100-06, 17, 21, 28, 30, 31, 35, 49 e 82 foram
58
semelhantes ao controle positivo, e superior aos resultados obtidos pela A. brasilense
indicando o potencial destes isolados em contribuir para o crescimento radicular, o que pode
ser atribuído à produção de AIA e capacidade de solubilizar fosfato inorgânico de ferro
(FePO4.2H2O) por estas bactérias, e que consequentemente, de acordo com AGUILARPIEDRAS et al. (2008), proporcionaria maior desenvolvimento vegetal devido à maior
aquisição de água e nutrientes do solo.
Situação semelhante foi observada para os dados de MSR, em que a inoculação
proporcionou resultados semelhantes ao controle positivo, exceto os tratamentos UNIFENAS100-34, 42, 69, 71 e controle negativo que foram semelhantes entre si e inferiores aos demais
tratamentos. OLIVEIRA et al. (2007a) constataram em seus estudos com B. brizantha cv.
Marandu, que esta gramínea, em específico, apresentava uma maior produção de forragem
quando comparadas a testemunha (sem inoculação de diazotróficos e sem aplicação de N),
demonstrando assim, a importância da inoculação como uma alternativa sustentável, e ao
mesmo tempo, um contribuinte para o aumento da produção de forragem.
A tabela 3 apresenta os parâmetros bromatológicos referentes a matéria seca total
(MS) e produtividade de matéria seca (PMS), referentes ao primeiro e segundo corte e os
valores obtidos para fibra em detergente neutro (FDN), fibra em detergente ácido (FDA) e
proteína bruta da matéria seca (PBMS).
59
Tabela 3. Porcentagem de matéria seca total (MS), produtividade de matéria seca g/vaso
(PMS) de B. brizantha cv MG05 Vitória cultivada sob diferentes tratamentos no primeiro
corte e segundo corte. Fibra detergente neutro (FDN), fibra detergente ácido(FDA) e proteína
bruta na matéria seca (PBMS) segundo corte.
Tratamentos
1º Corte
MS1
PMS1
(%)
(g)
1
MS
(%)
1
PMS
(g)
2º Corte
FDN1
FDA1
(%)
(%)
PBMS1
(%)
Não
inoculados
N plantio +
N cobertura
N plantio
18,92 b
8,15 a
15,06 b 25,62 a 65,37 b 45,10 a
14,01a
20,00 b
5,22 b
15,69 b
61,87 b 48,85 a
4,50 e
25,94 a
21,38 b
20,69 b
22,38 b
26,20 a
23,49 b
24,17 a
22,17 b
23,17 b
21,72 b
21,52 b
20,36 b
20,33 b
23,09 b
25,95 a
22,44 b
23,06 b
25,95 b
20,78 b
20,94 b
22,62 b
22,30 b
0,91 c
6,05 b
5,32 b
1,90 c
2,86 c
4,10 b
3,83 b
5,41 b
5,30 b
3,60 b
4,80 b
4,78 b
4,89 b
4,67 b
4,53 b
5,07 b
4,90 b
5,91 b
5,11 b
4,52 b
4,44 b
4,54 b
17,61 a 5,15 c
16,52 b 8,65 b
16,13 b 6,82 c
15,89 b 4,95 c
16,55 b 6,19 c
16,72 b 10,74 b
17,77 a 4,10 c
18,05 a 8,26 b
17,06 b 6,40 c
15,97 b 6,00 c
17,47 a 7,00 c
16,61 b 8,20 b
16,82 b 8,47 b
17,42 a 6,41 c
17,99 a 6,04 c
16,66 b 7,01 c
16,70 b 6,90 c
18,77 a 7,34 c
19,29 a 7,56 b
16,58 b 7,09 c
17,52 a 6,63 c
17,12 b 6,13 c
64,05 b
66,02 b
68,28 a
63,82 b
65,64 b
65,29 b
70,13 a
69,85 a
65,65 b
66,73 b
66,73 b
67,95 a
63,68 b
65,14 b
71,75 a
66,21 b
67,99 a
72,06 a
69,21 a
69,11 a
63,92 b
69,16 a
7,23 c
5,68 d
4,95 e
9,24 b
7,12 c
7,42 c
4,66 e
5,69 d
6,36 d
7,17 c
5,99 d
6,03 d
6,44 d
5,07 e
5,95 d
7,05 c
5,78 d
5,10 e
5,64 d
5,32 e
7,48 c
5,11 e
8,34 b
Inoculados
Azospirillum
100-02
100-06
100-16
100-17
100-21
100-28
100-30
100-31
100-33
100-34
100-35
100-40
100-42
100-43
100-49
100-51
100-67
100-69
100-71
100-78
100-82
42,53 a
44,64 a
44,81 a
44,99 a
52,04 a
50,23 a
42,51 a
49,23 a
43,55 a
45,95 a
48,03 a
44,57 a
51,78 a
43,23 a
47,60 a
48,81 a
54,49 a
45,69 a
47,81 a
43,38 a
44,87 a
46,93 a
60
100-280
22,88 b 4,55 b
17,77 a 5,66 c 65,90 b 44,87 a 5,55 d
CV(%)
10,58
25,52
7,86
20,60
5,58
89,28
9,82
1
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre sí pelo teste de Scott-Knott,
considerando o valor nominal de 5% de significância.
Em relação à porcentagem de matéria seca (MS), observou-se que em ambos os
cortes houve efeito significativo, pois as médias observadas foram superiores ao controle
positivo e negativo, destacando-se os tratamentos inoculados com A. brasilense e as estirpes
UNIFENAS-100-17, 28, 30, 34, 42, 43, 67, 69, 78 e 280. SILVA et al. (2004) destaca que
pastagens formadas com Brachiaria apresentam uma relação entre altura da gramínea e
produção de MS, ou seja, quanto maior for a altura da planta maior será a produção de MS.
Segundo BORGES et al. (2002), o intervalo existente entre os cortes influencia diretamente
na porcentagem de MS, onde, quanto maior for o intervalo entre os respectivos cortes, maior
será a produção de MS. Estudos realizados por OKON e VANDERLEYDEN (1997) apontam
que os organismos fixadores de N2 participam não só da fixação de nitrogênio como também
dos processos fisiológicos e morfológicos das plantas inoculadas.
Quanto à produtividade média de matéria seca (PMS), observou-se que os
tratamentos contendo os isolados UNIFENAS-100-02, 21, 30, 35, 40, 69 foram semelhantes
ao controle positivo e superiores aos tratamentos Azospirillum e UNIFENAS-100-06, 16, 17,
28, 31, 33, 34, 42, 43, 49, 51, 67, 71, 78, 82 e 280, estes semelhantes entre si e inferiores ao
controle negativo.
Os resultados alcançados nos tratamentos contendo Azospirillum, UNIFENAS-10016, 17, 21, 33, 49 e 78, no que se refere à proteína bruta na matéria seca, apresentaram médias
superiores às alcançadas pelos demais tratamentos, inclusive ao controle negativo, onde o
percentual alcançado foi superior 7%; tais resultados são expressivos, e de acordo com VAN
SOEST (1994), plantas forrageiras com teores de proteína bruta abaixo deste percentual
61
podem contribuir com a diminuição da digestibilidade dos animais devido à inadequada
disponibilidade de nitrogênio para os micro-organismos que atuam no rúmen, o que
consequentemente diminuiria sua população, o que reduziria o processo de digestão e ingestão
de matéria seca. Dessa forma, valores acima de 7%, alcançados pelos tratamentos estariam
dentro dos valores necessários para se atender às exigências proteicas do animal, destacandose o tratamento UNIFENAS-100-16, o qual alcançou a média de 9,24% de PBMS,
ressaltando-se
os
isolados
UNIFENAS-100-21
e
78,
os
quais
demonstraram,
simultaneamente, a capacidade de solubilizar fosfato de ferro e produzir AIA, fatos estes que
podem ter contribuído positivamente com o teor de PBMS, entretanto, este pode variar em
relação ao vegetal, sua respectiva idade, a parte do vegetal que será avaliada e até mesmo a
adubação utilizada (BUTOLO, 2002).
Os tratamentos UNIFENAS-100-06, 28, 30, 35, 43, 51, 67, 69, 71 e 82, no que diz
respeito ao teor de FDN, os tratamentos apresentaram valores superiores ao controle positivo,
negativo e demais tratamentos. Quanto ao FDA, os resultados experimentais nos permitiram
concluir que não houve efeito significativo e que todos os tratamentos apresentaram médias
semelhantes, inclusive em relação ao controle positivo e negativo, entretanto, deve-se
ressaltar que valores médios de FDN acima de 72% e FDA em torno de 40 % estão de acordo
com os encontrados por outros autores (OLIVEIRA et al., 2007b); em B. brizantha constatouse FDN 78,6% e FDA de 49,6% (GOMES, 2003). Quanto maior for o valor do FDA
encontrado na forrageira, menor será a digestibilidade do alimento, pois a fibra indigestível
contém uma proporção de FDA, e o valor nutritivo de uma forrageira é determinado pela
composição química da mesma (QUEIROZ, 2011). Desta forma os tratamentos Azospirillum,
UNIFENAS-100-28, 42 e 71 apresentaram o menor teor de FDA, o que representaria maior
digestibilidade.
62
O uso de bactérias diazotróficas, o manejo de forma adequado das pastagens e do
solo não apresentam pontos negativos, muito pelo contrário, apresentam-se como alternativas
vantajosas sob os aspectos econômico e ambiental (ITZIGSOHN et al.,2000).
CONCLUSÕES
A inoculação de estirpes diazotróficas endofíticas e rizosféricas influenciaram no
desenvolvimento do capim B. brizantha cv MG 05 Vitória, contribuindo positivamente com a
produção de MS, PMS e PBMS nas duas idades de corte destacando-se os isolados
UNIFENAS-100-16, 21, 78, cujo teor de PBMS foi superior a 7%.
AGRADECIMENTOS
A CAPES/PROSUP, por ter me concedido bolsa de mestrado. À Universidade José
do Rosário Vellano (UNIFENAS), por ter me apoiado e auxiliado no desenvolvimento desta
pesquisa, cedendo os equipamentos do Laboratório de Análise de Alimentos e Bromatologia.
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