Bioquímica e Biologia Molecular

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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE FOLHAS E CASCAS DO CAULE
DE Coutarea hexandra (JACQ.) K. SCHUM PELO MÉTODO DE SEQÜESTRO DE
RADICAIS LIVRES (DPPH)
ALEX NAKAUTI KIYOMOTO (Estagiário voluntário/UFV), ISABELLA BARROS
VALADÃO (Estagiário voluntário/UFV), JOAO PAULO VIANA LEITE (Orientador/UFV)
O Brasil tem a flora mais diversa do planeta, quase 22% da flora mundial. Várias dessas espécies
vegetais são empregadas na medicina popular, como a Coutarea hexandra (Jacq.) K. Schum, da
família Rubiaceae, popularmente conhecida como quina. Essa espécie é nativa do bioma cerrado e
usada no preparo de medicação para tratamento de doenças do fígado, entre outras patologias. Nas
doenças hepáticas, o estresse oxidativo tem sido relacionado como um dos fatores desencadeadores
de lesão hepatocelular, resultando em processos inflamatórios agudos e crônicos. Nesse contexto, o
presente trabalho buscou avaliar a atividade antioxidante de extratos provenientes das folhas e
cascas do caule da espécie C. hexandra. O material vegetal foi coletado no município de
Uberlândia, MG. Folhas e cascas do caule foram separadas e submetidas à extração aquosa por
infusão e esses levados a liofilização para a obtenção dos liofilizados. A avaliação da atividade
antioxidante foi realizada pelo método de seqüestro de DPPH (radical livre do 2,2-difenil-1picrilhidrazil), empregando espectrofotômetro com leitura em 517 nm. Os liofilizados foram
avaliados em 6 diferentes concentrações (45µg/ml a 1000µg/ml) frente à solução com radicais
DPPH. Todas as análises foram realizadas em triplicata e apresentadas em percentagem de
inibição (%), calculados em relação à amostra controle (água +DPPH•). Os resultados da eficiência
que cada extrato possui em seqüestrar radical foram obtidos pelo cálculo de Rs que representa a
porcentagem que cada concentração possui para seqüestrar os radicais livres. Ambos os extratos
apresentaram resultados efetivos na decomposição do radical de DPPH na concentração de
100µg/ml, sendo que nessa concentração o extrato das folhas apresentou Rs de 65%, enquanto das
cascas do caule o Rs foi de 81,9%. Os resultados demonstram atividade antioxidante para ambos os
extratos de C. hexandra, o que poderia, em parte, está relacionado a atividade antihepatotóxica
dessa droga vegetal.
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CARACTERIZAÇÃO DOS RESÍDUOS DO PROCESSAMENTO COM Monascus ruber
LARISSA FROEDE BRITO (Não Bolsista/UFV), LÍVIA DIAS DE QUEIRÓS (Estagiário
voluntário/UFV), ALINE FRANCINE SILVA (Estagiário voluntário/UFV), LUCAS BENICIO
CAMPOS (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), FILIPPE ELIAS DE FREITAS SOARES
(Estagiário voluntário/UFV), RAFAEL LOCATELLI SALGADO (Estagiário voluntário/UFV),
FABIANO DE PAULA PEREIRA MACHADO (Bolsista FAPEMIG/UFV), JOSE HUMBERTO
DE QUEIROZ (Orientador/UFV)
A cafeicultura origina grande volume de resíduos líquidos e sólidos gerando despesas
significativas com o tratamento e destinação dos mesmos. O resíduo do fruto do cafeeiro destaca-se
como meio indutor para o crescimento e cultivo de fungos por ser rico em macro e micro
nutrientes. O objetivo desse estudo foi caracterizar e comparar resíduos de café fermentado e não
fermentado com Monascus ruber CCT 1236. A conservação da cepa foi realizada em meio PDA.
Utilizou-se solução contendo 0,1% de MgSO4, 0,1% de KH2PO4 e 1% de NH4Cl para o
enriquecimento do meio contendo o resíduo seco e elevação de seu teor de umidade para 50%. A
esse meio foi adicionada suspensão de esporos. Análises bromatológicas dos resíduos fermentado e
não fermentado foram realizadas segundo os métodos recomendados pelo Instituto Adolfo Lutz. O
teor de umidade foi determinado por secagem direta em estufa à 105ºC até atingir o peso constante.
As amostras foram incineradas em mufla a 550º C para a determinação de cinzas. Lipídios foram
quantificados utilizando-se o extrator Soxhlet e éter de petróleo como solvente. Proteínas foram
determinadas pelo método semimicro Kjeldahl. Carboidratos foram calculados por diferença
percentual, subtraindo-se do total a soma de proteínas, lipídeos, cinzas e umidade. O resíduo bruto
apresentou 10,2% de umidade, 8,5% de cinzas, 1,4% de lipídios, 11,7% de proteínas e 67,9% de
carboidratos totais. Para o resíduo fermentado foram obtidos os 9,9% de umidade, 10,2% de cinzas,
1,2% de lipídios, 17% de proteínas e 61,8% de carboidratos totais. A fermentação promoveu o
aumento do teor de proteínas e a diminuição do teor de carboidratos totais.
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CONSTRUÇÃO DE VETORES PARA EXPRESSÃO DE CELULASES EM Kluyveromyces
marxianus
MARIANA ROCHA LOPES (Estagiário voluntário/UFV), ANCÉLY FERREIRA DOS SANTOS
(Estagiário voluntário/UFV), MARINA QUADRIO RAPOSO BRANCO RODRIGUES
(Estagiário voluntário/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Orientador/UFV), FLAVIA MARIA
LOPES PASSOS (Co-orientador/UFV), MARCIO HENRIQUE PEREIRA BARBOSA
(Colaborador/UFV)
No contexto de limitação da oferta de combustíveis fósseis e fortalecimento das políticas de
desenvolvimento sustentável, ganha especial atenção o etanol obtido a partir do bagaço de cana de
açúcar, resíduo abundante na indústria sucroalcooeira. A hidrólise da celulose, durante a produção
do etanol de segunda geração, é realizada pelo complexo celulolítico: endo-β-1,4-glucanase,
celobiohidrolase e β-glucosidase. Kluyveromyces marxianus são leveduras termotolerantes capazes
de assimilar celobiose e fermentar pentoses e hexoses, além de possuírem um sistema de secreção
eficiente. A obtenção de K. marxianus produtoras de celulases recombinantes poderá aumentar a
eficiência da produção de etanol de segunda geração. O objetivo deste trabalho foi construir
cassetes de expressão para transformação de leveduras K. marxianus a serem utilizadas em
processos de sacarificação e fermentação simultâneas na obtenção de etanol. A partir das
seqüências dos genes eng1(AF331518) e cbhA (AF156268) de Aspergillus niger, e do gene que
codifica uma β-Glucosidase (X05918) de K. marxianus, obtidas no GenBank, desenhamos primers
para amplificação dos três genes, com sítios de restrição correspondentes ao sítio múltiplo de
clonagem do plasmídeo de expressão pKLAC-1 modificado. O plasmídeo pKLAC1 (New England
Biolabs), com a característica de induzir a expressão dos genes clonados por lactose, foi
modificado, neste trabalho, pela introdução do promotor constitutivo do gene adh2 de K. lactis, de
modo a permitir a expressão constitutiva dos genes das celulases. Genes de celulases já foram
expressos em K. marxianus (Hong et al, 2007), porém os autores não obtiveram sucesso na
fermentação da celulose, provavelmente, por expressar os três genes em uma mesma linhagem.
Nós propomos expressar os três genes separadamente em K. marxianus, sendo que a análise da
expressão está em andamento no nosso laboratório.
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EFICIÊNCIA DA SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES PARA
RESISTÊNCIA AO NEMATÓIDE DE CISTO DA SOJA
JULIERME KELLEN DE FREITAS GUIMARÃES (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV),
FERNANDA ABREU SANTANA (Bolsista CNPq/UFV), RAFAEL DELMOND BUENO
(Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), MARTHA FREIRE DA SILVA (Bolsista
PIBIC/CNPq/UFV), PEDRO IVO VIEIRA GOOD GOD (Bolsista FAPEMIG/UFV), EVERALDO
GONCALVES DE BARROS (Co-orientador/UFV), MAURILIO ALVES MOREIRA
(Orientador/UFV)
O crescimento da produção de soja está diretamente relacionado ao desenvolvimento de variedades
adaptadas a varias regiões do país, e também, ao desenvolvimento de cultivares resistente a
patógenos que acometem a cultura. Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência da seleção
assistida por marcadores em um programa de melhoramento para a resistência ao nematóide do
cisto da soja (NCS). Foram utilizados marcadores microssatélites próximos a QTLs de resistência
relatados nos grupos de ligação (GL) G e A2. As populações de melhoramento empregadas foram
originadas do cruzamento entre isolinhas derivadas de Vmax (Resistente) e CD201(Suscetível).
Inicialmente, a partir de 65 populações F5, foram selecionadas sete populações que apresentaram
polimorfismo para os microssatélites utilizados para a seleção. Destas, quatro foram selecionadas
com base em microssatélites localizados nos GL G e A2 (Estratégia 1) e outras três, com base no
GL A2 (Estratégia 2). Estas populações foram avaliadas fenotipicamente quanto à resistência à raça
3 do NCS pela Embrapa/Soja. As famílias F6:7 selecionadas com base na Estratégia 2 foram
altamente suscetíveis. Quatro famílias resistentes e quatro moderadamente resistentes foram
selecionadas com base na Estratégia 1, indicando que o QTL para a resistência ao NCS no GL A2,
não está presente na fonte de resistência utilizada neste trabalho. Famílias F6:7 derivadas das
populações selecionadas com base na Estratégia 1 foram genotipadas com microssatélites do GL G.
Os marcadores avaliados do GL G não permitiram a discriminação das famílias F6:7 resistentes das
moderadamente resistentes, indicando que outros genes de resistência (efeito menor) são
necessários para a seleção da resistência completa à raça 3. Os valores de eficiência de seleção para
os microssatélites Sat_168, Satt309 e Sat_141 foram de 97,05, 96,55 e 93,55% respectivamente,
mostrando que esses marcadores são eficazes na seleção de plantas resistentes e moderadamente
resistentes à raça 3 do NCS.
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INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS POR
EXTRATOS PROTÉICOS E PEPTÍDICOS DA PLANTA CICATRIZANTE MIL FOLHAS
NAYARA GUSMÃO TESSAROLLO (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), MARIA CRISTINA
BARACAT PEREIRA (Orientador/UFV), LANNA CLICIA CARRIJO (Não Bolsista/UFV),
THIAGO RODRIGUES DE SOUZA LOPES (Estagiário voluntário/UFV), PATRÍCIA DIAS
GAMES (Não Bolsista/UFV), HEBRÉIA OLIVEIRA ALMEIDA (Bolsista CAPES/UFV),
ELIZABETH PACHECO BATISTA FONTES (Colaborador/UFV), REGINALDO DA SILVA
ROMEIRO (Colaborador/UFV)
Peptídeos antimicrobianos (AMPs) constituem um mecanismo de defesa primário para diversos
organismos e são expressos em plantas de forma constitutiva ou induzidos por infecção. Mil folhas
(Achillea millefolium L.) é uma planta cicatrizante com propriedades antiinflamatórias e
antimicrobianas, e proteínas e peptídeos podem estar envolvidos nos mecanismos de defesa. O
trabalho visa determinar o potencial antimicrobiano in vitro dos extratos protéicos de folhas da
planta Mil folhas. Folhas secas foram moídas e maceradas em Tris-HCl, benzamidina, PMSF e
tiouréia. O homogenato foi centrifugado (20.000g/4oC/30min) e o sobrenadante denominado
Extrato Solúvel (ES). O precipitado foi ressuspendido em LiCl (PMSF, benzamidina e tiouréia),
centrifugado (20.000g/4oC/30min) e o sobrenadante denominado Extrato de Parede Celular (EP).
ES e EP foram submetidos à ultrafiltração (30kDa, 10kDa e 1kDa), obtendo-se três frações: maior
que 30kDa (ES ou EP>30), entre 10 e 30kDa (ES ou EP10-30) e entre 1 e 10kDa (ES ou EP1-10).
As frações foram fracionadas com (NH4)2SO4. Após ressuspendidas, foram dessalinizadas e
concentradas (membrana 1kDa). A ação antibacteriana das frações ES>30, ES 10-30 e ES1-10 foi
avaliada em três concentrações contra a Clavibacter michiganesis subsp. michiganensis e Ralstonia
solanacearum. Para 16h de cultivo, a inibição do crescimento de R. solanacearum por ES1-10 foi
entre 18,5-30%, e não-dependente da concentração. Já a fração ES10-30 apresentou 10-25% de
inibição, sendo dependente de concentração, e a fração ES>30 promoveu inibição total do
crescimento bacteriano. Para Clavibacter michiganesis subsp. michiganensis, a fração ES1-10
promoveu 17-26% de inibição, ES10-30, 3-11%, e ES>30, 11-60%, sendo dependente de
concentração apenas a inibição promovida pela fração ES10-30. Análises por SDS-PAGE e SDStricina-PAGE permitiram visualizar bandas protéicas e peptídicas. A identificação de proteínas e
peptídeos antimicrobianos pode corresponder a uma nova estratégia biotecnológica para a defesa
de culturas vegetais de importância comercial. (Apoio: FAPEMIG/CNPq/FINEP).
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OTIMIZAÇÃO DO SISTEMA DE EXTRAÇÃO PARA A OBTENÇÃO DE COMPOSTOS
FENÓLICOS PROVENIENTES DA CASCA DE MANGA (Mangifera indica, L.),
VARIEDADE UBÁ
KARINA HUBER (Estagiário voluntário/UFV), JOSE HUMBERTO DE QUEIROZ
(Orientador/UFV), SONIA MACHADO ROCHA RIBEIRO (Co-orientador/UFV), CEPHORA
MARIA SABARENSE (Colaborador/UFV), MARIA ELIANA LOPES RIBEIRO DE QUEIROZ
(Colaborador/UFV)
Cascas de frutas, resíduos da agroindústria, em geral, contêm elevadas concentrações de polifenóis,
os quais apresentam propriedades antioxidantes podendo ser utilizados como substitutos dos
antioxidantes sintéticos na preservação de alimentos. Pouco se sabe, porém, sobre a viabilidade de
uso de tais resíduos em razão das questões de rendimento e de toxicidade. Neste contexto, o
presente trabalho tem como objetivo estabelecer o sistema de extração mais eficiente, para a
obtenção de extratos de compostos fenólicos, a partir do resíduo agroindustrial da manga Ubá. O
indicador de eficiência utilizado foi o percentual de rendimento de extração. As condições testadas
foram: mistura de solventes etanol/ água, nas seguintes proporções 0, 20, 40, 60, 80 e 100%;
tempos de extração de 30 e 60 minutos; e duas extrações sucessivas, utilizando-se a proporção de
0,01 g de farelo da casca de manga para 15 mililitros de solvente extrator. As extrações foram
feitas em três repetições. A eficiência de extração dos compostos fenólicos foi avaliada nos extratos
hidro-alcoólicos e o indicador de eficiência foi a intensidade da absorvância em 765 nm, resultante
da reação dos compostos fenólicos contidos nos extratos com o reagente de Folin-Ciocalteu. Os
resultados foram expressos como valores médios. Houve maior eficiência de extração para o tempo
de 60 minutos e para o sistema de solvente etanol/água 60:40. A segunda etapa de extração
aumentou em 14,6 % a absorvância do extrato, mostrando que duas etapas sucessivas são
necessárias para maximizar a extração dos compostos fenólicos da casca da manga.
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CARACTERIZAÇÃO DA MICROBIOTA INTESTINAL DA LAGARTA DA SOJA,
Anticarsia gemmatalis HÜBNER (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE)
ALYSON GOMES PEREIRA (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), ANDREA DE OLIVEIRA
BARROS RIBON (Orientador/UFV), LILIANE EVANGELISTA VISÔTTO (Bolsista
CAPES/UFV), MARIA GORETI DE ALMEIDA OLIVEIRA (Colaborador/UFV)
Pesquisas focadas em bioquímica da digestão de insetos são essenciais não somente para o
entendimento de aspectos básicos da nutrição desse importante grupo taxonômico, mas
principalmente para o desenvolvimento de métodos mais eficazes de controle. Hoje é sabido que
bactérias intestinais têm um significado biológico muito grande para seus hospedeiros, onde
exercem papel nutricional, de resistência à colonização de pátogenos, entre outros. Até o momento,
não se tem informações a respeito da associação entre Anticarsia gemmatalis, uma praga-chave da
sojicultura nacional, e microrganismos. Nesse contexto, foi estimada a importância da microbiota
intestinal para a lagarta da soja, por meio do estudo da diversidade bacteriana e sua contribuição
para a produção de enzimas hidrolíticas intestinais. Lagartas foram crescidas em folhas de soja ou
em dieta padrão com ou sem antibióticos e a comunidade bacteriana foi avaliada por métodos
dependentes e independentes de cultivo. A contagem de bactérias totais foi de 1,16 x 106 UFC x
mg-1 de intestino, para lagartas criadas em dieta artificial e de 3,677 x 104 UFC x mg-1 de intestino
para lagartas criadas em folhas de soja. A estrutura da comunidade bacteriana foi estudada por
PCR-RFLP. Ao contrário do esperado, a comunidade se manteve relativamente estável ao longo
dos diferentes ínstares larvais, independente da dieta usada para a criação das lagartas. Alteração
foi apenas observada no 6º ínstar, na fase de pré-pupa e no 1º ínstar de lagartas alimentadas com
dieta artificial. A contribuição da microbiota na secreção de enzimas digestivas intestinais foi
estimada por meio da determinação das atividades de lipases e carboidrases usando intestinos de
lagartas criadas em dieta com antibióticos. Entretanto, nem sempre uma relação direta pôde ser
observada, pois os resultados obtidos para tetracilcina e cloranfenicol mostraram resultados
conflitantes em alguns ensaios. Sugere-se, porém uma contribuição da microbiota para a produção
de amilase devido à significativa redução na atividade amilásica mediante criação da lagarta da
soja com dieta contendo cloranfenicol, tetraciclina e ampicilina.
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PURIFICAÇÃO PARCIAL E CARACTERIZAÇÃO DE AMILASES DE Paecilomyces
marquandii
BRUNO VINICIUS SANTOS VALIATE (Estagiário voluntário/UFV), MARCUS REBOUÇAS
SANTOS (Estagiário voluntário/UFV), MARINA QUADRIO RAPOSO BRANCO RODRIGUES
(Estagiário voluntário/UFV), CARLOS JOULBERT ALVES DE SOUZA (Estagiário
voluntário/UFV), ROBERTA RIBEIRO COURA (Estagiário voluntário/UFV), SÂMIA LIMA
(Estagiário voluntário/UFV), LETICIA MAGALHÃES ARRUDA (Estagiário voluntário/UFV),
JOSE HUMBERTO DE QUEIROZ (Orientador/UFV)
As enzimas amilolíticas são de grande interesse biotecnológico com várias aplicações comerciais
principalmente nas indústrias de processamento de amido. Amilases podem ser obtidas,
alternativamente, através de fermentação em estado semi-sólido utilizando como substrato cascas
de batatas como forma alternativa de aproveitamento de resíduos agroindustriais. O objetivo deste
trabalho foi produzir, purificar parcialmente e caracterizar amilases utilizando resíduo
agroindustrial (casca de batata) e o fungo Paecilomyces marquandii, linhagem isolada e cedida
pelo Laboratório de Fermentações do Departamento de Bioquímica da UFV. O fungo filamentoso
P. marquandii foi selecionado para realização do experimento, por seu potencial na produção de
enzimas amilolíticas. A fermentação foi conduzida em frascos de 1L, tendo como meio de cultura
casca de batata e complemento mineral. As enzimas foram extraídas em tampão fosfato e
submetidas à precipitação diferencial por (NH4)2SO4 seguida de cromatografia de troca iônica em
coluna DEAE-Sepharose. A enzima parcialmente purificada foi submetida a ensaio frente à
variação de pH e temperatura, utilizando-se medida de atividade sacarificante pelo método do
DNS. Realizou-se ensaio de termoestabilidade nas temperaturas 40, 55 e 65°C. Procedeu-se a
caracterização frente a diferentes concentrações dos íons Zn2+ e Ca2+. A enzima mostrou maior
atividade na temperatura de 55°C e pH 5,0 e nestas condições foram determinadas as velocidades
de reação em diferentes concentrações de substrato de modo a se obter os parâmetros cinéticos
aparentes, Km e Vmáx. Verificou-se efeito inibitório por concentrações superiores a 15 mM de
cálcio e acima de 11,25 mM, observou-se inibição máxima pelo íon Zn2+. Os valores de Km e
Vmáx aparentes foram 0,042 g/L de amido e 1,79 mg de açúcar redutor . min-1, respectivamente.
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ANÁLISE MOLECULAR DAS E-NTPases DE Leishmania sp.
ANTONIO PHELIPE CARLETTE ZÓBOLI (Estagiário voluntário/UFV), FELIPE FREITAS DE
CASTRO (Estagiário voluntário/UFV), BRUNO VINICIUS SANTOS VALIATE (Estagiário
voluntário/UFV), LUCAS BORGES PEREIRA (Estagiário voluntário/UFV), RONNY
FRANCISCO DE SOUZA (Não Bolsista/UFV), JULIANA LOPES RANGEL FIETTO
(Orientador/UFV)
L. major, L. infantum e L. brasiliensis apresentam dois genes de E-NTPDases mapeados em seus
genomas: possíveis nucleosídio difosfatase (NTPDase) e guanosina difosfatase (GDPase). estas
enzimas são capazes de hidrólizar nucleotídeos extra-celulares tri e di-fosfatados. A diversa
capacidade ecto-nucleotidásica entre as espécies de Leishmania, sugere o envolvimento dessas
enzimas com a virulência e o controle da resposta imune do hospedeiro. Assim, para avaliar se uma
diferença molecular poderia explicar estes dados, analisamos “in silico” os genes de E-NTPDases
destas espécies. A análise das proteínas deduzidas mostrou alta identidade entre as isoformas de L.
major e L. infantum (90%) e menor identidade entre L. braziliensis e as isoformas apresentadas nas
outras espécies (70%). As GDPases apresentam um domínio amino-terminal extendido presente
somente em E-NTPDases de Kinetoplastideos. Todas as proteínas putativas têm apenas uma região
transmembrana localizada no domínio amino-terminal, mas somente as GDPases possuem um
peptídeo sinal logo após a região transmembrana predita. Estes resultados sugerem que GDPases
poderiam ser secretadas e NTPDases seriam proteínas ancoradas à membrana, provavelmente ectolocalizadas. Análises de sítios de glicosilação mostraram que GDPases apresentam maior número
de sítios de N-glicosilação do que NTPDases. Podemos concluir que E-NTPDases de Leishmanias
têm diferenças moleculares significativas que poderiam explicar a distinção das atividades ectonucleotidásicas. Além disso, esses respectivos genes foram isolados por PCR de DNAg de L.
amazonensis, a região codificadora da NTPDase foi completamente seqüenciada, mostrando alta
identidade com a seqüência de referencia de L. major. A confirmação da localização sub-celular
predita e futuras comparações entre caracterizações bioquímicas das proteínas recombinantes
purificadas serão os próximos passos deste trabalho.
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ANÁLISE MOLECULAR QUANTITATIVA NA DETECÇÃO DO CIRCOVÍRUS SUÍNO 2
CAROLINA REIS DE OLIVEIRA (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), FERNANDA
MIQUELITTO FIGUEIRA DA SILVA (Bolsista CNPq/UFV), GIULIANO BONFÁ (Bolsista/),
ABELARDO SILVA JÚNIOR (Bolsista CNPq/UFV), JULIANA LOPES RANGEL FIETTO (Coorientador/UFV), MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO (Orientador/UFV)
O circovírus suíno 2 (PCV2) é o principal agente etiológico causador da síndrome da refugagem
multissistêmica pós-desmame (PMWS), uma importante doença de perdas em suínos e que está
associada a um conjunto de manifestações clínicas denominada Circovirose suína. Pertencente à
família Circoviridae, o PCV2 é um vírus pequeno, não envelopado de 20,5 nm de diâmetro, sendo
seu genoma composto de uma cadeia simples de DNA circular de aproximadamente 1,7 Kb. Os
objetivos deste trabalho consistiram em coletar amostras de linfonodo, baço, rim, intestino grosso,
fígado e pulmão de 5 animais, padronizar a amplificação de parte do genoma viral por “nested”
PCR e PCR em tempo real (qRT-PCR) e comparar a sensibilidade das duas técnicas. A “nested”
PCR foi padronizada e revelou a presença do PCV2 em todas as amostras evidenciando a
disseminação do vírus. Foi realizada a padronização da PCR em tempo real na qual uma curva
padrão foi construída com auxílio de um DNA plasmidial contendo o genoma viral completo.
Comparando o limite de detecção dos ensaios, o qRT-PCR mostrou ter um limite de detecção
maior, mensurando eficientemente o DNA viral até 102 cópias (5,24 x 10-16g de DNA viral). Em
relação à carga viral, as amostras de linfonodos apresentaram uma carga significativamente maior
em relação às de baço e fígado, sendo que intestino grosso, pulmão e rim foram os órgãos com
menor carga viral média. Com os resultados obtidos neste projeto, podemos afirmar que a PCR em
tempo real é uma metodologia que pode ser utilizada eficientemente para o diagnóstico quantitativo
de PCV2 em animais acometidos pela Circovirose suína.
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AVALIAÇÃO DO EFEITO DA ATIVIDADE DE ENZIMAS DIGESTIVAS PRODUZIDAS
PELA MICROBIOTA DE Anticarsia gemmatalis RELEVANTES À RELAÇÃO INSETOPLANTA
THIAGO RODRIGUES DE SOUZA LOPES (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), MARIA
GORETI DE ALMEIDA OLIVEIRA (Orientador/UFV), LILIANE EVANGELISTA VISÔTTO
(Bolsista CAPES/UFV), NATÁLIA CRISTINA SANTOS COSTA (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV),
ANDERSON MARTINS PILON (Bolsista CNPq/UFV), ANGÉLICA PATARO REIS (Bolsista
FAPEMIG/UFV), ANDREA DE OLIVEIRA BARROS RIBON (Colaborador/UFV), RAUL
NARCISO CARVALHO GUEDES (Colaborador/UFV), JOEL ANTONIO DE OLIVEIRA
(Colaborador/UFV), WELLINGTON GARCIA CAMPOS (Colaborador)
Interações entre bactérias intestinais e insetos têm sido extensivamente estudadas em alguns
sistemas, como cupins e afídeos. Entretanto, pouco se sabe sobre essa associação com Lepidoptera,
a ordem que compreende os principais insetos fitófagos, responsáveis por grandes perdas na
agricultura. Assim, a lagarta-da-soja, Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera: Noctuidae)
torna-se um modelo interessante para estudos dos processos fisiológicos envolvidos nessa
associação. Portanto, esse trabalho buscou verificar se a microbiota afeta as atividades das enzimas
hidrolíticas do intestino de A. gemmatalis, bem como seus parâmetros biológicos de
desenvolvimento. Tetraciclina, cloranfenicol e uma combinação desses antibióticos mais
ampicilina foram incorporados à dieta artificial em cinco doses específicas (0; 30; 40; 50; 60 e 70
µg/mL). Larvas foram alimentadas durante seu ciclo até o ínstar pupal. O antibiótico mais eficiente
na supressão do crescimento bacteriano foi a tetraciclina. A concentração de maior efeito inibitório
foi 70 µg/mL. Atividades enzimáticas do extrato intestinal de larvas criadas com tetraciclina, sobre
quatorze substratos mostraram que a redução da microbiota afetou significativamente a hidrólise de
L-BApNA e tributirato ditiopropanol. Também foi analisado o perfil enzimático ao longo do
desenvolvimento pós-embrionário de larvas criadas com dieta controle e dieta com tetraciclina 70
µg/mL. Observou-se um pico máximo de atividade proteásica, amidásica e lipásica entre os 4º e 6º
ínstares em larvas com a microbiota intacta, enquanto o perfil foi constante naquelas tratadas com
tetraciclina. Tais resultados podem estar correlacionados à pupação prematura, à baixa emergência
e ao aumento da mortalidade em larvas com microbiota reduzida. Esses dados sugerem que a
presença da microbiota exerce influência sobre o processo digestivo e desenvolvimento de A.
gemmatalis, contribuindo possivelmente com a produção de proteases e lipases. Os resultados
desse estudo contribuem para o conhecimento sobre a interação Lepidoptera-microrganismos e
auxiliam as pesquisas de novos métodos direcionados ao controle de pragas.(FAPEMIG, CAPES,
CNPq)
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AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA DELEÇÃO DO GENE ROX1 EM
Saccharomyces cerevisiae
EDGARD VALDOMIRO CHARLES BELO (Estagiário voluntário/UFV), PATRICIA DOS
SANTOS COSTA (Estagiário voluntário/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Orientador/UFV)
Em processos industriais que utilizam leveduras, o oxigênio é um fator limitante para a obtenção
de biomassa celular, sendo que o alto custo de aeração inviabiliza muitos processos em grande
escala. Os estudos que visam maior entendimento da fisiologia deste microorganismo, que possam
ser utilizados para reduzir a exigência por oxigênio são de grande interesse das indústrias. Estudar
os mecanismos de resposta ao oxigênio sobre o sistema respiratório das leveduras pode ser uma
estratégia para tornar o processo mais produtivo. A resposta ao oxigênio em leveduras é
intermediada pela molécula heme e por pelo menos dois fatores de transcrição, Hap1p e Rox1p.
Hap1 induz a transcrição de genes relacionados com o metabolismo aeróbico, Rox1 reprime genes
relacionados com a maximização da utilização de oxigênio quando este está em baixas
concentrações. Neste trabalho nós avaliamos os efeitos da deleção do gene Rox1 em S. cerevisiae
quanto à produção de biomassa e fermentação alcoólica em diferentes concentrações de glicose
como fonte de carbono. Para isto as linhagens W303 e rox1 foram cultivadas em Erlenmeyers
contendo meio YPD 2%, 4% e 10% de glicose e o crescimento celular foi acompanhado através
da medida da densidade óptica a 600 nm e o consumo de glicose e a produção de etanol foram
medidos ao longo do crescimento por HPLC. Nossos resultados demonstram uma maior
capacidade de crescimento do mutante rox1 quando comparado com a sua cepa selvagem em
todas as concentrações de glicose utilizadas. Estes resultados sugerem que a deleção de ROX1
pode ser uma estratégia para o aumento de biomassa em cepas industriais.
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BIOMETRIA E ENZIMAS DO FÍGADO DE CODORNAS JAPONESAS
IGOR MONTEZE FERREIRA (Estagiário voluntário/UFV), ANDERSON DE ALMEIDA
BARBOSA (Bolsista FAPEMIG/UFV), ELISA SIALINO MULLER (Bolsista CAPES/UFV),
GEORGE HENRIQUE KLING DE MORAES (Orientador/UFV)
O fígado é um órgão central nos processos metabólicos, exercendo múltiplas funções e as aves não
possuem sistema linfático plenamente desenvolvido podendo sobrecarregá-lo. Por ser um órgão
atuante em diversas atividades metabólicas, a avaliação das atividades enzimáticas pode predizer
seu status metabólico. Transaminases hepáticas podem alterar suas atividades em função da
luminosidade do meio, sexo, níveis de aminoácidos não-essenciais e proteína. A alanina
aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) são as transaminases mais importantes
no diagnóstico clínico. Objetivou-se determinar o perfil da AST e ALT e a biometria do fígado de
codornas poedeiras (Coturnix coturnix japonica) de um a 25 dias de idade. Foram avaliados os
pesos vivo e do fígado e as atividades das AST e ALT no fígado. Foram utilizadas 90 codornas de
um dia de idade. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com seis idades e seis
repetições, sendo cada animal uma unidade experimental. Aos um, cinco, 10, 15, 20 e 25 dias de
idade cinco animais foram sacrificados e os fígados coletados, pesados, congelados em nitrogênio
líquido e armazenados a -20ºC para posterior determinação das atividades da AST e ALT. O peso
do fígado apresentou crescimento linear em função da idade e não aumentou na mesma proporção
que o peso corporal. As atividades totais da AST e ALT apresentaram crescimento linear em
função da idade. A AST apresentou maior atividade total em relação à ALT. No primeiro dia de
vida a AST e ALT já apresentavam atividades específicas maiores em relação às outras idades. A
atividade por grama de fígado em função da idade da AST foi bem maior que a ALT em todas as
idades. A atividade da ALT por grama de peso corporal apresentou um decréscimo linear em
função da idade. Foi determinado o perfil da AST e ALT no fígado de codornas japonesas.
(FAPEMIG, CNPq)
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CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE SERINO PROTEASES PRODUZIDAS POR
Staphylococcus xylosus ISOLA DO TRATO INTESTINAL DE A. gemmatalis
GEPOLIANO DOS SANTOS CHAVES (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), RAUL NARCISO
CARVALHO GUEDES (Orientador/UFV), FRANCINY MARTINS PILON (Bolsista
CNPq/UFV), AMANDA PETRINA SCOTÁ FERREIRA (Estagiário voluntário/UFV), LÍLIAN
FERNANDES MOREIRA (Bolsista CNPq/UFV), LILIANE EVANGELISTA VISÔTTO (Bolsista
CNPq/UFV), ANDERSON MARTINS PILON (Bolsista CNPq/UFV), ANGÉLICA PATARO
REIS (Bolsista CNPq/UFV), JOEL ANTONIO DE OLIVEIRA (Colaborador/UFV), MARIA
GORETI DE ALMEIDA OLIVEIRA (Coordenador/UFV)
Inibidores de proteases atuam no mecanismo de defesa de plantas contra infestação de insetos e
patógenos. A utilização de genes que codificam inibidores de enzimas digestivas para a obtenção
de plantas resistentes ao ataque de insetos é uma estratégia promissora. Porém, para que isso ocorra
é importante que a planta expresse uma combinação de inibidores que cubra o espectro total de
proteases intestinais. Dessa forma, deve ser considerada a fisiologia do inseto, a bioquímica de sua
digestão e os microrganismos simbiontes. Recentemente foram isoladas diversas bactérias
proteolíticas cultiváveis do intestino da lagarta-da-soja A. gemmatalis. Todas foram capazes de
produzir quantidades significativas de proteases quando cultivadas em meio de cultura adequado.
Neste contexto o presente trabalho fundamentou-se em caracterizar as serino proteases da bactéria
S. xylosus isolada do trato intestinal de A. gemmatalis utilizando o substrato L-BApNA. A bactéria
foi cultivada em meio de cultura constituído de infusão cérebro coração (BHI) acrescidos de 0,1%
de soro albumina bovina (BSA). Verificou-se pronunciada atividade em pH 8,5 e temperatura de
30 ºC. O Km app e a Vmáx app foram 0,12 mM e 14,33 nM.s-1 respectivamente. Os inibidores de serino
proteases TLCK (irreversível) e aprotinina (competitivo) diminuíram significativamente a atividade
da protease bacteriana. Combinando o efeito do inibidor de metalo proteases EDTA com o efeito
de íons cálcio obteve-se serino proteases cálcio-dependentes. Pespstatina A, inibidor de aspartil
proteases e E-64 inibidor de cisteíno proteases não influenciaram as serino proteases bacteriana. Os
resultados de caracterização cinética e de efeito de inibidores de proteases sobre a atividade das
proteases produzidas por S. xylosus, concluem que essa bactéria sintetiza e excreta no lúmen
intestinal de A. gemmatalis, enzimas da família das serino proteases. (CNPQ, FAPEMIG, CAPES)
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UFV / XVIII SIC / OUTUBRO DE 2008 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CCB
CARACTERIZAÇÃO DE MÚLTIPLAS ENZIMAS -GALACTOSIDASES PRODUZIDAS
POR SEMENTES DE Pterogyne nitens
THIAGO AUGUSTO GONÇALVES (Estagiário voluntário/UFV), DANIEL LUCIANO
FALKOSKI (Bolsista CAPES/UFV), MAÍRA NICOLAU DE ALMEIDA (Bolsista CAPES/UFV),
VALERIA MONTEZE GUIMARAES (Co-orientador/UFV), SEBASTIAO TAVARES DE
REZENDE (Orientador/UFV)
-Galactosidases possuem um importante papel no processo de germinação de sementes,
principalmente em leguminosas. Estas enzimas atuam na hidrólise e mobilização de açúcares de
reservas tais como galactomananas, estaquiose, rafinose, bem como de alguns galactociclitóis,
fornecendo monossacarídeos que serão utilizados no metabolismo energético da célula durante o
início do desenvolvimento das plantas. O objetivo deste trabalho foi identificar enzimas galactosidases produzidas por sementes de Pterogyne nitens, uma espécie arbórea nativa ameaçada
de extinção, durante germinação e desenvolvimento da plântula. Os extratos enzimáticos obtidos
em diferentes tempos de embebição foram cromatografados em coluna CM-Sepharose (tampão
acetato, pH 5,15) seguidos de um gradiente crescente de NaCl (0-0,55 M). Quatro diferentes αgalactosidases foram identificadas durante este processo e denominadas α-Gal I, α-Gal II, α-Gal III
e α-Gal IV seguindo a ordem de eluição. . α-Gal I e α-Gal II mostraram máxima atividade quando
incubadas a pH 4 e 5,5 respectivamente, enquanto α-Gal III e IV foram mais ativas a pH 5. α-Gal I,
II, III e IV expressaram suas máximas atividades quando incubadas a 45, 65, 55 e 75 °C
respectivamente. Todas as 4 enzimas hidrolisaram rafinose, mas nenhuma hidrolisou estaquiose ou
melibiose. α-Gal II possui um KM de 39 mM para rafinose enquanto os valores de KM das enzimas
α-Gal I, α-Gal III e α-Gal IV para este substrato foram de 16,4, 15,8 e 16,8 mM respectivamente. αGal II foi detectada somente nos cotilédones enquanto as demais α-galactosidases foram detectadas
nos cotilédones e no eixo embrionário. As α-galactosidases apresentaram diferentes potenciais para
hidrólise de “locust bean gum” sugerindo que estas enzimas podem estar envolvidas na degradação
de galactomananas em P. nitens. Os próximos objetivos deste trabalho serão identificar o papel
fisiológico específico de cada α-galactosidase durante a germinação e avaliar o uso destas enzimas
em aplicações biotecnológicas. (FAPEMIG/CAPES)
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CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DA PROTEÍNA NIG (NSP Interacting GTPase)
JOÃO PAULO BATISTA MACHADO (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), CLAUDINE MARCIA
CARVALHO (Co-orientador/UFV), ELIZABETH PACHECO BATISTA FONTES (Coorientador/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Orientador/UFV)
A proteína NSP (nuclear shuttle protein) de geminivírus facilita o transporte intracelular do DNA
viral do núcleo para o citoplasma e atua juntamente com a proteína MP (moviment protein) na
propagação do DNA viral para células adjacentes. No entanto, o mecanismo pelo qual NSP media
o movimento nucleocitoplasmático do DNA viral não é conhecido. Recentemente, a equipe de
pesquisadores do Laboratório de Biologia Molecular de Plantas identificou uma GTPase
denominada de NIG (NSP interacting GTPase) a partir de uma triagem de proteínas que interagem
com NSP através de um sistema de duplo híbrido de leveduras. Para verificar a interação entre NSP
e NIG in vivo, o cDNA de NIG, além do cDNA de NSP, foram clonados em vetores de expressão
em planta, e as proteínas quiméricas expressas transientemente em folhas de tabaco. Ensaios de coimunoprecipitação foram realizados, e os resultados demonstraram interação entre NSP e NIG.
Com a finalidade de identificar a ação de NIG sob a função de NSP, ambas as proteínas foram coexpressas transientemente em folhas de tabaco, e a observação por microscopia confocal revelou
que NIG desloca NSP do núcleo para o citoplasma. Apesar de sua localização no citoplasma,
ensaios de duplo híbrido demonstraram que NIG exibe atividade de transativação de genes
repórteres em leveduras. Com a finalidade de mapear o domínio de transativação de NIG, deleções
no cDNA da proteína foram fusionadas ao domínio de ligação de GAL4 e a capacidade
transativadora das proteínas truncadas avaliada no sistema duplo híbrido. Os resultados
demonstraram que os domínios aminoterminal (ArfGAP) ou carboxiterminal (Pro-Rich) da GTPase
por si só não conferem atividade transativadora à proteína. Experimentos estão em progresso para
mapear precisamente o domínio transativador de NIG.
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CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E FUNCIONAL DE TRANSFATORES DA
FAMÍLIA NAC DE SOJA (Glycine max)
ROBERTA RIBEIRO COURA (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), CAROLINNE DE SALES
MARQUES (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), ELIZABETH PACHECO BATISTA FONTES
(Co-orientador/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Orientador/UFV)
A Família de Proteínas NAC constituem uma grande família de fatores de transcrição específicos
de plantas. O papel de proteínas NAC em resposta ao estresse abiótico e biótico tem sido descrito
na literatura e várias proteínas NAC têm sido identificadas pó causa da sua interação com outras
proteínas de importância biológica nesses processos. Recentemente isolamos e caracterizamos 7
genes da família NAC em soja, dentre esses genes o NAC3 foi induzido fortemente por estresse
osmótico. Nesse trabalho nós estamos promovendo a transformação estável de plantas modelo
(Arabidopsis thaliana) com o gene NAC3. Este experimento permitirá avaliar os efeitos da
superexpressão deste gene na tolerância ao déficit hídrico e outras condições de estresse. As
plantas Arabidopsis foram transformadas via mergulha floral com Agrobacterium tumefaciens
contendo o vetor pK7NAC3 que permitirá a espressão do gene utilizando o promotor forte S35.
Após a transformação as sementes foram colhidas e plaqueadas em meio contendo o antibiótico
kanamicina para seleção das plantas transformadas. A avaliação das linhagens trangênicas está em
andamento no nosso laboratório. (FAPEMIG; CNPq; FINEP e UFV)
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CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E FUNCIONAL DOS TRANSFATORES GmNAC1,
GmNAC5 E GmNAC6 DE SOJA (Glycine max)
LUCAS BOENO OLIVEIRA (Estagiário voluntário/UFV), CAROLINNE DE SALES MARQUES
(Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), GUILHERME LUIZ PINHEIRO (Bolsista CAPES/UFV),
ELIZABETH PACHECO BATISTA FONTES (Coordenador/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO
(Orientador/UFV)
Os genes NAC de soja (Glycine max) são fatores de transcrição específicos de plantas, envolvidos
em estresses abióticos, diferenciação e desenvolvimento de órgãos, resposta a ferimentos e ataque
de patógenos, sinalização hormonal, controle do ciclo celular e regulação da senescência foliar.
Dada a importância econômica da soja e a potencial utilização de genes NAC como alvos de
estratégias de tolerância, iniciaram-se os estudos da caracterização de genes da família NAC nesta
espécie. Os cDNAs GmNAC1, GmNAC5 e GmNAC6 foram inseridos no vetor de entrada
pCR8|GW|TOPO e posteriormente transferidos para o vetor pDEST32, para obtenção das proteínas
fusionadas ao domínio de ligação de GAL4 e a realização do ensaio de transativação em levedura.
Adicionalmente, os genes NAC foram fusionados a pYFP e expressos transientemente em folhas de
tabaco a fim de avaliar a localização subcelular das proteínas quiméricas, revelando que estas
proteínas se encontram no núcleo da célula. A expressão dos genes NAC foi avaliada nos diferentes
órgãos de soja por qRT-PCR. O acúmulo de mRNA dos transfatores foi avaliado quantitativamente
após tratamento com cicloexamida (indutor de morte celular), zeatina (inibidor de senescência) e
tunicamicina (indutor de estresse no retículo endoplasmático). A expressão transiente em folhas de
tabaco induziu morte celular, evidenciando o envolvimento destas proteínas em eventos de morte
celular. Os resultados destes ensaios sugerem que GmNAC1 está associado à progressão da
senescência e os genes GmNAC5 e GmNAC6 participam em outros processos de morte celular.
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CLONAGEM DE DUAS POSSÍVEIS E-NTPDases Leishmania (Leishmania) infantum
chagasi
LUCAS BORGES PEREIRA (Estagiário voluntário/UFV), TONIELLI CRISTINA SOUSA DE
LACERDA (Estagiário voluntário/UFV), RONNY FRANCISCO DE SOUZA (Não
Bolsista/UFV), BRUNO VINICIUS SANTOS VALIATE (Estagiário voluntário/UFV), ANTONIO
PHELIPE CARLETTE ZÓBOLI (Estagiário voluntário/UFV), FELIPE FREITAS DE CASTRO
(Estagiário voluntário/UFV), MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO (Coorientador/UFV), JULIANA LOPES RANGEL FIETTO (Orientador/UFV)
L. infantum/chagasi é o agente etiológico da leishmaniose visceral no Novo Mundo. Este parasito
(cepa de referência JPCM5) possui dois genes de E-NTPDases mapeados em seu genoma: possível
guanosina difosfatase (GDPase) e possível nucleosídeo difosfatase (NTPDase). A função das ENTPDases é caracterizada pela hidrólise de tri e di-nucleotídeos, sendo previamente demonstrada
em L. amazonensis, L. braziliensis e L. major. A distinta capacidade ecto-nucleotidásica entre
espécies de Leishmania sugere seu envolvimento com a virulência e controle da resposta imune do
hospedeiro dependente de sinalização purinérgica. O objetivo deste trabalho é elucidar as
propriedades bioquímicas destas possíveis proteínas. Para isto, amplificamos e clonamos a região
codificante completa da GDPase (2.1 Kb) e NTPDase (1.2 Kb) no vetor pJET (Fermentas). Estas
construções foram utilizadas na reação de transformação de E. coli DH5α. O sucesso da clonagem
foi confirmado por PCR de colônia utilizando primers específicos e análise por restrição. A
seqüência parcial dos amplicons mostrou 100% de semelhança com a seqüência de referência.
Estes genes foram então transferidos para vetores de expressão em bactérias e leveduras. A
expressão heteróloga e comparação das propriedades bioquímicas destas proteínas recombinantes
consiste no próximo passo deste trabalho.
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EFEITO BIOQUÍMICO, FISIOLÓGICO E COMPORTAMENTAL DE SERINOPROTEASES BENZAMIDINA DE SOJA EM Anticarsia gemmatalis
FABRICIO RAINHA RIBEIRO (Estagiário voluntário/UFV), MARIA GORETI DE ALMEIDA
OLIVEIRA (Orientador/UFV), ANDERSON MARTINS PILON (Bolsista CNPq/UFV),
FERNANDA CRISTINA SILVA (Bolsista IC /projeto/UFV), LILIANE EVANGELISTA
VISÔTTO (Bolsista FAPEMIG/UFV), RAUL NARCISO CARVALHO GUEDES (Coorientador/UFV), JOEL ANTONIO DE O LIVEIRA (Co-orientador/UFV), MAURILIO ALVES
MOREIRA (Co-orientador/UFV), NEWTON DENIZ PIOVESAN (Colaborador/UFV), GILSON
PETRÔNIO DA PAIXAO (Bolsista/UFV)
É postulado que, quando uma planta é atacada ou ferida, ela propicia um aumento nos níveis de
inibidores de proteases na região ferida (resposta local) e ou por toda a planta (resposta sistêmica).
Nesta interação inseto-planta, os insetos podem desenvolver mecanismos de defesa contra os
inibidores de proteases produzidos pela planta. Muitas pesquisas vêm demonstrando o potencial
dos inibidores de proteases em comprometer o desenvolvimento do inseto. Uma praga que se
destaca na cultura da soja é o lepidóptero, Anticarsia gemmatalis. Neste contexto o presente
trabalho fundamentou-se em verificar os efeitos comportamentais, no desenvolvimento pós embrionário e nas proteases digestivas de A.gemmatalis quando ingeriram o inibidor de serinoproteases benzamidina aplicado em plantas de soja da variedade CAC-1, em seis diferentes
concentrações: 0.0, 0.15, 0.30, 0.45, 0.60 e 0.75%. A benzamidina interferiu na resposta
comportamental de lagartas e mariposas, as quais tiveram preferência por plantas que não
receberam pulverizações com benzamidina. O desenvolvimento pós-embrionário também foi
afetado reduzindo o ganho de peso e aumentando a mortalidade. Anticarsia gemmatalis em
situação de ingestão crônica de inibidores apresentaram respostas adaptativas como uma
hiperprodução de tripsinas like sensíveis e/ou insensíveis ao inibidor e a capacidade de sintetizar
outras proteases como é o caso de cisteíno proteases. Portanto, estes dados sugerem que a
utilização de inibidores de protease possa ser uma estratégia promissora no controle de Anticarsia
gemmatalis na cultura da soja. Apoio Financeiro: CNPq / FAPEMIG
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EFEITO DA EXPOSIÇÃO À CIPERMETRINA NA POPULAÇÃO SUSCEPTÍVEL DO
CARUNCHO DO MILHO, Sitophilus zeamais motschulsky (COLEOPTERA:
CURCULIONIDAE)
AMANDA PETRINA SCOTÁ FERREIRA (Estagiário voluntário/UFV), MARIA GORETI DE
ALMEIDA OLIVEIRA (Orientador/UFV), RONNIE VON SANTOS VELOSO (Bolsista
FAPEMIG/UFV), NATÁLIA CAMPOS TEIXEIRA (Não Bolsista/UFV), LILIANE
EVANGELISTA VISÔTTO (Bolsista FAPEMIG/UFV), ANDERSON MARTINS PILON
(Bolsista CNPq/UFV), ANGÉLICA PATARO REIS (Bolsista CNPq/UFV), ELISEU JOSE
GUEDES PEREIRA (Co-orientador/UFV), RAUL NARCISO CARVALHO GUEDES (Coorientador/UFV), JOEL ANTONIO DE OLIVEIRA (Co-orientador/UFV)
Enzimas do metabolismo digestivo e energético de insetos podem contribuir para manutenção do
mecanismo de resistência a inseticidas disponibilizando energia para os processos fisiológicos de
destoxificação. Neste estudo, insetos de uma população susceptível do caruncho do milho,
Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae), e duas oriundas de populações
resistentes a inseticidas piretróides, foram expostas à cipermetrina para avaliar possíveis alterações
na atividade enzimática. Para determinação da concentração letal (CL) utilizada no ensaio, os
insetos foram expostos a concentrações de cipermetrina que variaram de 0,001402 a 11,402 µg
i.a./cm2. A CL10 para os insetos susceptíveis foi utilizada no tratamento das três populações. Foi
observado um baixo nível de resistência para cipermetrina nas duas populações resistentes quando
comparado com outros inseticidas testados nesses insetos. A atividade de três enzimas do
metabolismo energético (lipase, amilase e trealase) e quatro enzimas do metabolismo digestivo
(celulase, cisteíno-protease, serino-protease amidásica e esterásica) foi determinada. A atividade
enzimática variou significativamente entre as três populações de S. zeamais (Wilks’ Lambda <
0,001; F14, 12 = 52,32; P < 0,0001) e foi afetada pela exposição à cipermetrina que reduziu a
atividade das enzimas (Wilks’ Lambda = 0,016; F7, 16 = 53,26; P < 0,0001). As populações
resistentes tiveram maior atividade específica para amilase, lipase, trealase e celulase quando
comparadas com a população padrão de susceptibilidade. Por fim, a redução da atividade dessas
enzimas pode ter afetado a produção adicional de energia para mitigar o estresse fisiológico
provocado pelo inseticida e a síntese e liberação de enzimas destoxificativas. Apoio Financeiro:
FAPEMIG / CNPq
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EFEITO DE TINTURAS DE CAFÉ NO DIABETES TIPO DOIS
PATRÍCIA MARIA AZEVEDO XAVIER (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), TANIA
TOLEDO DE OLIVEIRA (Orientador/UFV), AGNALDO RODRIGUES DE MELO CHAVES
(Voluntário/UFV), LUCIANA MARQUES CARDOSO (Bolsista CNPq/UFV), SERGIO
PACHECO (Co-orientador/UFV), TANUS JORGE NAGEM (Co-orientador/UFV), MARIA
APARECIDA LEÃO (Colaborador), ANCÉLY FERREIRA DOS SANTOS (Estagiário
voluntário/UFV), MARCELO ROCHA DA COSTA (Voluntário), MARILANE KALYETTA
ALMEIDA FONSECA (Voluntário)
O consumo de café tem sido associado a um menor risco de diabetes tipo 2 (DM2). Entretanto os
compostos específicos e mecanismos de ação não são bem conhecidos. O presente experimento foi
realizado para avaliar tinturas de café catuaí vermelho em ratos da raça Winstar com diabetes
induzido por aloxano (60mg/Kg de peso corporal). Para tanto, os animais foram divididos em 5
grupos com seis animais cada. Foram testadas tinturas de café solúvel nas doses de 0,5mL, 1,0mL,
e 2,0mL. O tratamento foi conduzido por 30 dias, nos quais os animais receberam as tinturas por
via oral. Foram coletadas amostras de sangue dos animais para dosagens séricas de glicose,
colesterol e triacilglicerol. As tinturas de café solúvel nas três doses promoveram um pequeno
aumento, porém significativo, nos níveis de colesterol comparado ao grupo doente não tratado.
Somente o tratamento com a tintura de café solúvel (0,5 mL) não resultou em um aumento
estatisticamente significativo. As porcentagens de redução das concentrações de glicose e
triacilglicerídeo variaram entre 20 e 49% e 27 e 57%, respectivamente. Os benefícios das tinturas
de café utilizadas neste trabalho nos níveis de glicose e triacilglicerol indicaram que estas tinturas
podem ser promissoras para o tratamento do diabetes.
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UFV / XVIII SIC / OUTUBRO DE 2008 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CCB
ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE VARIEDADES RESISTENTES AO
NEMATÓIDE DE CISTO DA SOJA DESENVOLVIDAS POR DIFERENTES
PROGRAMAS DE MELHORAMENTO DO BRASIL
JULIERME KELLEN DE FREITAS GUIMARÃES (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV),
RAFAEL DELMOND BUENO (Bolsista FAPEMIG/UFV), FERNANDA ABREU SANTANA
(Bolsista CNPq/UFV), GABRIELA ANTONIA DE FREITAS ROCHA (Bolsista
PIBIC/CNPq/UFV), PEDRO IVO VIEIRA GOOD GOD (Bolsista FAPEMIG/UFV), EVERALDO
GONCALVES DE BARROS (Co-orientador/UFV), MAURILIO ALVES MOREIRA
(Orientador/UFV)
A informação sobre a diversidade genética pode ser usada para prevenir a vulnerabilidade da
cultura ao ataque de pragas e doenças, evitando a erosão progressiva da base genética de
populações de melhoramento. Este trabalho objetivou avaliar a diversidade genética em cultivares
de soja resistente ao nematóide de cisto da soja (NCS) desenvolvidas por seis programas de
melhoramento do Brasil, por meio de microssatélites. Dentre os 36 genótipos avaliados, estão
cultivares resistentes e genótipos originais (fontes de resistência ao NCS e a cultivar Lee - padrão
de suscetibilidade). Foram utilizados 24 microssatélites próximos aos QTLs (Quantitative trait
loci) de resistência ao NCS presentes nos grupos de ligação (GL) G, A2, D2, E, J e M. A
diversidade genética de cada loco microssatélite foi avaliada pelo conteúdo de informação de
polimorfismo (PIC) e pela dissimilaridade média de um genótipo em relação aos outros genótipos
avaliados. Realizou-se a análise de agrupamento pelo método de Tocher. A análise de variância
molecular (AMOVA) baseou-se na matriz de distância genética, considerando como fonte de
variação os diferentes programas de melhoramento e as cultivares de cada programa. Foi obtido um
total de 77 alelos para as 36 cultivares com uma média de 3,2 alelos/loco. O PIC variou de 0,11 a
0,71 com média de 0,36. Entre as cultivares originais encontrou-se um número de alelos maior que
entre as comerciais. Dentre as variedades elites avaliadas Vmax e BRSGOIara foram as mais
divergentes. Os resultados da AMOVA mostraram que existe diferença significativa entre os
diferentes programas de melhoramento e dentro das cultivares de cada programa, evidenciando que
os programas avaliados apresentam objetivos comuns quanto ao desenvolvimento de variedades
resistentes ao NCS apesar de utilizarem estratégias diferentes. A base genética quanto à resistência
ao NCS nas variedades comerciais avaliadas é muito estreita, sendo necessário aumentar a
diversidade de genes utilizados.
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ESTUDO FUNCIONAL DE MUTANTES DA PROTEÍNA RPL10 DE Arabidopsis thaliana
ELICIANE CEVOLANI MATTOS (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), ANESIA APARECIDA
DOS SANTOS (Bolsista CNPq/UFV), LILIAN HASEGAWA FLORENTINO (Bolsista
CNPq/UFV), ELIZABETH PACHECO BATISTA FONTES (Orientador/UFV)
Em Arabidopsis thaliana, o gene L10 codifica uma proteína ribossomal (rpL10) identificada
previamente pela sua capacidade de interagir com a proteína quinase NIK1 (NSP interaction
kinase) em ensaio de duplo híbrido. Experimentos recentes demonstraram que rpL10 de A. thaliana
atua como substrato da proteína NIK1 e que a fosforilação de rpL10 por NIK1 modifica a
localização subcelular da mesma, sugerindo que ambas podem participar de uma via de sinalização
celular em resposta a estresse biótico, como infecção viral. Assim, o objetivo deste trabalho foi
identificar os sítios de fosforilação em rpL10 associados à via de sinalização antiviral mediada por
NIK1. Foram identificados in silico quatro resíduos de serina como possíveis sítios de fosforilação.
Por mutagênese sítio dirigida, estes resíduos foram substituídos por um de alanina. Os plasmídeos
contendo as mutações foram seqüenciados e as mutações nos nucleotídeos 310 (rpL10S104A) e 501
(rpL10S168A) foram confirmadas. As seqüências mutadas foram transferidas para vetor de expressão
em bactérias e em plantas. As proteínas mutantes foram expressas em E. coli, purificadas por
afinidade e submetidas a ensaios de fosforilação in vitro. Os mutantes apresentaram baixas
percentagens de fosforilação por NIK1, sendo a percentagem de autofosforilação de NIK1 também
reduzida na presença dos mutantes. Para analisar o efeito da mutação na localização de rpL10
mediada por NIK1, os mutantes foram fusionados a GFP ou YFP e sua localização subcelular
determinada por microscopia confocal em folhas de tabaco expressando transientemente as
proteínas. O mutante rpL10S104A apresentou baixa percentagem de células com rpL10 no núcleo na
ausência (6,8%) e na presença de NIK1 (10,9%), já o mutante rpL10S168A apresentou percentagem
mais elevadas, com uma localização preferencialmente nuclear, na ausência (48,4%) ou na
presença de NIK1 (41,2%), sugerindo que os dois sítios sejam importantes para fosforilação de
rpL10 por NIK1 e para a localização subcelular de rpL10.
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UFV / XVIII SIC / OUTUBRO DE 2008 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CCB
EXPRESSÃO ECTÓPICA DA PROTEÍNA CINASE (NIK) EM TOMATE: ANÁLISE DA
SUSCETIBILIDADE À INFECÇÃO VIRAL
DANIELA INES LORETO SARAIVA (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), SILVANA RODRIGUES
PIRES (Não Bolsista/UFV), ANESIA APARECIDA DOS SANTOS (Bolsista CNPq/UFV),
ELIZABETH PACHECO BATISTA FONTES (Orientador/UFV)
Geminivírus são vírus de DNA que infectam plantas, constituídos de partículas icosaédricas,
geminadas. Possuem dois componentes genômicos: o componente A responsável por codificar
proteínas relacionadas com a replicação e a encapsidação viral; e o componente B responsável por
codificar proteínas relacionadas com o movimento viral. Foi descoberto pelo nosso grupo de
pesquisa que a proteína viral de movimento núcleo-citoplasma (NSP) é capaz de interagir em
ensaio de duplo híbrido com proteínas de tomate, soja e Arabdopsis, designadas NIK (NSP
Interacting Kinase). E em estudos posteriores foi demonstrado que a inativação do gene NIK em
Arabdopsis aumenta a susceptibilidade dos mutantes à infecção por geminivírus. Visando elucidar
o possível papel de NIK no mecanismo de proteção à infecção viral, este estudo propôs uma
avaliação dos efeitos da super expressão de NIK na resposta de tomate à infecção por geminivírus e
a tobamovírus. Tobamovírus são vírus de RNA fita simples, sentido positivo, encapsidados em
partículas alongadas e rígidas. Que possue seu RNA genômico codificando duas proteínas
relacionadas com a replicação e seus RNAs subgenômicos codificando a proteína capsidial e a
proteína de movimento célula-célula. Assim sendo, partindo de plantas de tomate transformadas
com o vetor 35S-AtNIK1, para a super expressão da proteína NIK em tomateiro, foram realizados
ensaios de infectividade com ToYSV (Geminivirus) e com TMV ( Tobamovirus). Nos ensaios com
ToYSV as plantas transformadas mostraram um maior acúmulo viral e uma maior severidade de
sintomas comparadas com plantas selvagens. Enquanto nos ensaios com TMV as plantas
transformadas tiveram uma resposta hipersensível em tabaco mais rápida do que em plantas
selvagens, mas não apresentaram diferenças de severidade de sintomas em relação às plantas não
transformadas. Os resultados obtidos revalidam experimentos anteriores, e reforçam o papel
fundamental de NIK na proteção à infecção viral, não somente a geminivírus.
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UFV / XVIII SIC / OUTUBRO DE 2008 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CCB
EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA NTPDase-1 DE Trypanosoma cruzi
FERNANDA GOMES CARDOSO (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), TATIANA DIAS
ARAÚJO (Bolsista/), DANIELA ARRUDA COSTA (Colaborador/), MATHEUS SILVA E
BASTOS (Colaborador/UFV), XÊNIA MACEDO SOUTO (Estagiário voluntário/UFV), RONNY
FRANCISCO DE SOUZA (Não Bolsista/UFV), BRUNO VINICIUS SANTOS VALIATE
(Estagiário voluntário/UFV), FELIPE FREITAS DE CASTRO (Estagiário voluntário/UFV),
MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO (Co-orientador/UFV), JULIANA LOPES
RANGEL FIETTO (Orientador/UFV)
O Trypanosoma cruzi, um parasita intracelular obrigatório, é o agente etiológico da doença de
Chagas. Diferentes proteínas têm sido identificadas em sua superfície, as quais estão envolvidas na
troca de metabólitos e nas interações com o hospedeiro. A NTPDase-1 é uma proteína da família ENTPDase ou apirase (EC 3.6.1.5). Essa família é composta por enzimas que hidrolisam
nucleosídeos tri- e di-fosfatados capazes de regular a sinalização purinérgica, agindo como
moléculas de virulência. O objetivo deste trabalho foi expressar a NTPDase-1 em sistema
procarioto a fim de caracterizar bioquimicamente esta enzima. Inicialmente, o gene NTPDase-1
completo, contendo um peptídeo-sinal hipotético para secreção, foi transferido para um vetor
plasmidial de expressão em bactéria (pET21b) contendo códon para hexa-histina carboxi-terminal.
Essa construção foi utilizada para transformar bactérias Escherichia coli (BL21-DE3). A expressão
da proteína recombinante foi induzida por 4 horas com 0,1 mM de IPTG. Essa proteína foi
purificada em coluna de afinidade contendo Co2+ ou Ni2+-agarose. Para a purificação foram
realizados vários testes, com diferentes concentrações de imidazol. Foi concluído que a proteínaalvo é eluída com tampão contendo 40 mM de imidazol, sendo realizadas lavagens com soluções
de 5 mM de imidazol para a retirada de proteínas não-específicas. A efetividade da purificação
pôde ser comprovada através de eletroforese SDS-PAGE. Análises por Western blot comprovaram
que as duas bandas presentes no gel após a purificação da proteína pertencem à NTPDase-1, sendo
o peptídeo-sinal reconhecido e clivado pelo sistema bacteriano. A descoberta de moléculas
envolvidas com o processo de infecção e o conhecimento da função dessas biomoléculas têm
grande potencial para ser usado em abordagens como o de desenho de novas drogas.
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UFV / XVIII SIC / OUTUBRO DE 2008 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CCB
EXPRESSÃO HETERÓLOGA E CARACTERIZAÇÃO DA NTPDase-1 de Trypanosoma
cruzi
XÊNIA MACEDO SOUTO (Estagiário voluntário/UFV), Matheus de Souza Bastos
(Colaborador/UFV), FERNANDA GOMES CARDOSO (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV),
MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO (Colaborador/UFV), JULIANA LOPES
RANGEL FIETTO (Coordenador/UFV)
As E-NTPDases são enzimas que hidrolisam nucleotídeos extracelulares capazes de modular a
sinalização purinérgica em mamíferos. Em T. cruzi as E-NTPDases parecem facilitar a infecção e
aumentar a virulência. Uma atividade ecto-NTPDase foi preveamente caracterizada na superfície
do T. cruzi e um cDNA de 2282 pb que codifica para uma proteína desta família foi clonado e
denominado NTPDase-1. Para melhor caracterizar a NTPDase-1 de T. cruzi neste trabalho
realizamos a expressão heteróloga desta enzima em sistema procarioto. Análises in silico da
seqüência deduzida de aminoácidos prevê uma possível clivagem de um peptídeo-sinal na posição
36 da porção amino-terminal, imediatamente após um possível segmento transmembrana,
sugerindo que a NTPDase-1 possa ser produzida como uma proteína solúvel exportada. Usando
essa informação, desenhamos primers específicos e amplificamos somente a região codificante da
porção solúvel da proteína, corrrespondete à 1700 pb e clonamos em vetor de expressão pET21b,
este sistema fusiona a proteína alvo com uma cauda C-terminal de histidinas que facilita a
purificação por cromatografia de afinidade em resina de Niquel ou Cobalto. A construção
NTPDase-1-HexaHIS-pET21b foi usada para transformar células BL21-DE3 de E. coli. As
proteínas recombinantes foram expressas após 1 hora de indução pela adição de IPTG. A
NTPDase-1 recombinante foi purificada a partir da fração solúvel e insolúvel e mostrou-se
biologicamente ativa hidrolisando 2-17 nmol ATP/mg protein-1.h-1. Ensaios com substratos
específicos mostraram que esta enzima é capaz de usar substratos di e trifosfatados. A atividade
ATPase foi maior em pH entre 6,5-7,5, na presença de Mg2+ ao invés de Ca2+. O uso de inibidores
de E-NTPDases mostrou parcial inibição das atividades ATPDase. Efeitos similares foram
observados nas formas infectivas do parasito. Concluímos que a NTPDase-1 foi produzida de
forma ativa podendo ser usada para ensaios biológicos, cristalização e avaliação do potencial como
novo alvo no desenvolvimento de quimioterapia específica.
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EXPRESSÃO HETEROLÓGA E PURIFICAÇÃO DA GDPase DE Leishmania major
FELIPE FREITAS DE CASTRO (Estagiário voluntário/UFV), RONNY FRANCISCO DE
SOUZA (Não Bolsista/UFV), BRUNO VINICIUS SANTOS VALIATE (Estagiário
voluntário/UFV), ANTONIO PHELIPE CARLETTE ZÓBOLI (Estagiário voluntário/UFV),
LUCAS BORGES PEREIRA (Estagiário voluntário/UFV), FERNANDA GOMES CARDOSO
(Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO (Coorientador/UFV), JULIANA LOPES RANGEL FIETTO (Orientador/UFV)
As Leishmanioses são doenças cujos agentes etiológicos são protozoários do gênero Leishmania,
sendo L. major um dos agentes etiológicos da forma tegumentar desta doença. As E-NTPDases são
enzimas que hidrolisam nucleosídeos tri e di-fosfatados, sendo capazes de modular a sinalização
purinérgica em mamíferos. Atividades enzimáticas clássicas de E-NTPDases foram previamente
demonstradas em diferentes espécies de Leishmania, incluindo L. major, sendo postuladas como
fatores de virulência para estes parasitos. Dois genes desta família foram mapeados no genoma de
L. major e nomeados por similaridade de sequência como NTPDase e GDPase. Com o intuito de
caracterizar o produto gênico denominado GDPase de L. major, foi realizada a clonagem da região
codificante (2022 pb), obtida por PCR de DNAg, no vetor de amplificação TOPO (Invitrogen).
Posteriormente o gene transferido para o vetor de expressão bacteriano pET21b (Novagen). Essa
construção foi utilizada para transformar células de Escherichia coli (BL21-DE3). A expressão foi
induzida por 2 h com IPTG. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade usando
coluna de Niquel-agarose (Ni-NTA). Vários testes de lavagem e eluição com diferentes
concentrações de imidazol como competidor foram realizados. Análises por SDS-PAGE mostraram
que a eluição mais efetiva foi em concentração de 80 mM de imidazol e a fração com maior
conteúdo protéico purificado foi conseguida a partir da fração solúvel. Testes preliminares de
atividade enzimática, utilizando ATP como substrato, foram realizados mostrando que a mesma se
encontra ativa. Uma completa caracterização bioquímica, a cristalização da proteína e pesquisas
por inibidores específicos são perspectivas deste trabalho.
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FILOGEOGRAFIA MOLECULAR DE Psychotria ipecacuanha (RUBIACEA) COM BASE
NA SEQÜÊNCIA NUCLEOTÍDICA DA REGIÃO ITS DE DNA RIBOSSOMAL.
FLÁVIA REIS DE CARVALHO BATISTA (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), LUIZ
ORLANDO DE OLIVEIRA (Orientador/UFV)
Poaia (Psychotria ipecacuanha) é uma espécie medicinal que ocupa uma posição de destaque na
medicina popular brasileira. Atualmente, a exploração descuidada e o desmatamento levaram a um
severo declínio demográfico da população natural. Os resquícios de populações ocorrem em três
áreas claramente definidas: 1- América Central e região noroeste da América do Sul; 2- Região
sudoeste da Amazônia Brasileira; 3- Floresta Atlântica, ao longo da costa brasileira. Nós usamos
dados de seqüências do genoma nuclear para desenvolver um estudo de filogeografia molecular da
poaia abrangendo as regiões de distribuição da espécie. A região espaçadora interna transcrita
(ITS), de indivíduos coletados em Rondônia, Mato Grosso, Floresta Atlântica e Panamá, foi
submetida a reações de PCR e posteriormente seqüenciadas. ITS de 6 indivíduos da Floresta
Atlântica foram clonados, pois apresentaram polimorfismo intragenômico. Todas as seqüências
obtidas a partir de fragmentos de PCR ou de clonagem foram corrigidas manualmente no programa
Sequencher versão 4.1.4, sendo posteriormente analisadas no aplicativo computacional TCS 1.13,
revelando que as populações da Floresta Atlântica apresentam maior diversidade genética,
enquanto as populações na Amazônia e América Central apresentaram ribótipos únicos. Duas redes
de ribótipos foram obtidas; uma une indivíduos do Brasil, tendo os ribótipos com origem na
Floresta Atlântica ocupando a posição central e conectando os ribótipos da Amazônia. A outra rede
une indivíduos do Panamá. Os dados moleculares favorecem a hipótese de que a região da Floresta
Atlântica abriga as populações ancestrais, a partir das quais derivaram as populações da Amazônia
(Mato Grosso e Rondônia). Além disso, revelam um distanciamento grande entre indivíduos do
Brasil e do Panamá. A análise das regiões conservadas e das estruturas secundárias da região ITS
auxiliou no entendimento da história evolutiva da poaia em regiões disjuntas. (FAPEMIG)
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IDENTIFICAÇÃO DE PARTÍCULAS VIRAIS EM LAGARTAS DESFOLHADORAS DO
DENDEZEIRO (Opsiphanes sp.) ATRAVÉS DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE
TRANSMISSÃO
KELLY MAYRINK BALMANT (Estagiário voluntário/UFV), CAROLINE SOUSA DIAS
(Estagiário voluntário/UFV), SERGIO OLIVEIRA DE PAULA (Orientador/UFV)
O dendezeiro (Elaeis guineensis, Jacq.) tem como principal produto o óleo extraído industrialmente
da polpa do fruto cuja demanda vem crescendo de forma acelerada há quase dez anos. Como
qualquer monocultura, o aumento da área plantada proporciona sérios problemas no equilíbrio
biológico e o desenvolvimento de pragas, principalmente insetos desfolhadores, cujos danos geram
queda de produtividade. Dentre os desfolhadores do dendê destacam-se os lepidópteros em especial
o gênero Opsiphanes. Considerando-se que o ecossistema de uma floresta homogênea é bastante
frágil, e que o uso de inseticidas convencionais pode trazer sérios danos ao equilíbrio, acredita-se
que os produtos de baixo impacto ecológico possam ser de grande valia no controle de lagartas
desfolhadoras. Por isso, as viroses de insetos têm sido muito estudadas, devido ao potencial
ambientalmente favorável ao manejo de pragas. Lagartas do gênero Opsiphanes foram coletadas
em plantações de dendê no estado do Pará. Essas apresentavam sintomas como regurgitação, típico
de infecção viral. Com o intuito de realizar um controle biológico dessa lagarta foi feita uma etapa
de identificação e caracterização desse vírus. Para tanto, lagartas infectadas e mortas foram
trituradas em tampão de homogeneização. O extrato foi submetido a ciclos de centrifugação. O
precipitado foi suspenso em tampão TE e posteriormente aplicado em um gradiente de sacarose de
densidade 1,17 a 1,30 g/mL e ultracentrifugado a 24.000rpm a 4oC. A banda formada localizada no
terço superior do tubo, na qual estariam as supostas partículas virais, foi coletada e após
centrifugação de 12.000rpm/15min a 4oC as partículas virais foram suspensas em água e
armazenadas a -20oC. Esse extrato purificado foi examinado ao microscópio eletrônico de
transmissão, sendo as preparações contrastadas negativamente com acetato de uranila 1%. Durante
a observação ao microscópio eletrônico foram encontradas partículas virais de 46-50 nm,
confirmando, dessa forma, a infecção viral das lagartas do gênero Opsiphanes.
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UFV / XVIII SIC / OUTUBRO DE 2008 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CCB
IDENTIFICAÇÃO DE PARTÍCULAS VIRAIS EM LAGARTAS DESFOLHADORAS DO
EUCALIPTO (Thyrinteina arnobia) ATRAVÉS DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE
TRANSMISSÃO
KELLY MAYRINK BALMANT (Estagiário voluntário/UFV), CAROLINE SOUSA DIAS
(Estagiário voluntário/UFV), SERGIO OLIVEIRA DE PAULA (Orientador/UFV)
O gênero Eucalyptus foi introduzido no Brasil em 1824 e passou a ser plantado com fins
comerciais em 1904. Porém, somente a partir da década de 70, devido à expansão da indústria
siderúrgica e de papel e celulose, ocorreu a implantação de grandes maciços florestais no Brasil. As
monoculturas sofrem bastante com problemas de pragas. Dentre as diversas pragas, os lepidópteros
desfolhadores destacam-se nas plantações de eucalipto. A lagarta parda, Thyrinteina arnobia, é
considerada o principal lepidóptero desfolhador das florestas brasileiras de eucalipto. O uso de
produtos químico, ou seja, inseticidas, para o controle dessas lagartas desfolhadoras, tem sido
largamente utilizado, pela facilidade de aplicação e baixo custo. Mas, esses inseticidas têm a
desvantagem de poderem causar um impacto biológico. Por isso, o controle biológico é uma
alternativa que vem sendo bastante estudada para o controle de lagartas desfolhadoras. Tendo em
vista a importância econômica das lagartas desfolhadoras para as plantações de eucalipto e a
necessidade de fornecer subsídios para viabilizar métodos de controle alternativos, uma vez que já
é conhecida a importância do uso de bioinseticidas, foi realizada uma etapa para identificar e
caracterizar os vírus que infectam Thyrinteina arnobia, com o intuito de empregarmos estes vírus
no controle biológico destas pragas. Para tanto, lagartas doentes foram maceradas; o extrato obtido
foi submetido à centrifugação e ultracentrifugação. As supostas partículas virais foram purificadas
por ultracentrifugação em gradiente de sacarose 10-40%. A banda formada localizada no terço
superior do tubo, na qual estariam as supostas partículas virais, foi coletada e armazenada a -20oC.
Esse extrato purificado foi examinado ao microscópio eletrônico de transmissão, sendo as
preparações contrastadas negativamente com acetato de uranila 1%. Durante a observação ao
microscópio eletrônico foram encontradas partículas virais de 27-30 nm, confirmando, dessa
forma, a infecção viral da Thyrinteina arnobia.
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UFV / XVIII SIC / OUTUBRO DE 2008 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CCB
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS PROTEÍNAS DO VÍRUS QUE INFECTA
LAGARTA DESFOLHADORA DO DENDEZEIRO
KELLY MAYRINK BALMANT (Estagiário voluntário/UFV), CAROLINE SOUSA DIAS
(Estagiário voluntário/UFV), SERGIO OLIVEIRA DE PAULA (Orientador/UFV)
O controle biológico é uma técnica utilizada para combater espécies que são nocivas através da
introdução de um inimigo natural no ecossistema, reduzindo os prejuízos causados por elas.
Quando bem planejado, o controle biológico acarreta evidentes vantagens em relação ao uso de
agentes químicos, representando uma alternativa mais econômica ao de inseticidas. A maioria dos
inseticidas apresenta amplo espectro de atuação e matam de modo não específico animais
ecologicamente importantes e potencialmente úteis. Os inimigos naturais têm preferências muito
específicas para certos tipos de pragas e podem não causar dano a outros animais benéficos e a
pessoas, havendo menos perigo de impacto sobre o ambiente e qualidade da água. Para alcançar
bons resultados, todo programa de controle biológico deve começar com o reconhecimento dos
inimigos naturais da "praga-chave da cultura". A monocultura do dendezeiro sofre com ataque de
pragas, principalmente dos insetos desfolhadores como lepidópteros em especial o gênero
Opsiphanes. Muitas lagartas desse gênero encontradas em plantações de dendê no estado do Pará
apresentam sintomas de infecção viral, tais como regurgitação. Como o primeiro passo para a
realização de um controle biológico é o reconhecimento dos inimigos naturais, foi realizada uma
etapa de identificação e caracterização do vírus que infecta essa lagarta. Assim, 80g de lagartas
doentes foram maceradas; o extrato obtido foi submetido à centrifugação e ultracentrifugação. As
supostas partículas virais foram purificadas por ultracentrifugação em gradiente de sacarose 1040%. A banda formada localizada no terço superior do tubo, na qual estariam as supostas partículas
virais, foi coletada e armazenada a -20oC. Foi realizada uma separação eletroforética das proteínas
virais (SDS-PAGE) dessa banda para identificação protéica. Constatou-se a presença de quatro
bandas de peso molecular de aproximadamente 14, 34, 42 e 55 KDa. Esse perfil eletroforético
descarta a possibilidade das partículas virais serem Baculovírus (vírus que normalmente infecta
insetos).
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INFLUÊNCIA DA EXTRAÇÃO DO LIPÍDIO DE DIFERENTES FONTES PROTÉICAS
NA DIGESTIBILIDADE IN VITRO
ZAIRA BRUNA HOFFMAM (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), MARIA GORETI DE
ALMEIDA OLIVEIRA (Orientador/UFV), RITA DE CÁSSIA OLIVEIRA SANT´ANA (Bolsista
CNPq/UFV), FABRÍCIA QUEIROZ MENDES (Bolsista FAPEMIG/UFV), PATRICIA
APARECIDA FONTES VIEIRA (Bolsista CNPq/UFV), GEPOLIANO DOS SANTOS CHAVES
(Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), CHRISTIANO VIEIRA PIRES (Co-orientador/), THIAGO
RENNÓ DOS MARES GUIA (Co-orientador/), MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO
(Co-orientador/UFV), JOEL ANTONIO DE OLIVEIRA (Colaborador/UFV)
As proteínas são as macromoléculas mais abundantes nas células vivas tendo como principal
função na dieta suprir o organismo de aminoácidos indispensáveis em quantidades adequadas para
síntese e manutenção dos tecidos corporais. A determinação da digestibilidade protéica de um
alimento é um fator importante para estimar a sua qualidade, sendo o método in vitro uma
alternativa rápida e fácil. O presente trabalho teve como objetivo determinar a digestibilidade in
vitro de proteínas de fontes animal e vegetal, integrais e desengorduradas, verificando assim se o
lipídio interfere na técnica in vitro de queda de pH e pH estático. Foram utilizadas as seguintes
fontes proteicas: carne de boi, carne de frango, carne de peixe, carne de porco, feijão vermelho,
leite em pó, proteína texturizada de soja (PTS), quinoa, soja IAC 17 e soja IAC 24 (resistentes ao
ataque de Anticarsia gemmatalis), soja IAC PL-1 (convencional), soja UFV TN 105 (isenta de
lipoxigenase) e soja UFV TN 105 KL (isenta de lipoxigenase e inibidor de tripsina kunitz). A
determinação de proteína das amostras foi feita pelo método semimicro Kjeldhal, usando o fator
6,25 para conversão de nitrogênio em proteína. Para desengordurar e quantificar os lipídios totais
das amostras utilizou-se o método de Soxhlet. A digestibilidade foi determinada pelo método in
vitro de pH estático, quantificando-se o volume de NaOH 0,1M usado para manter o pH em 8,0 e
pelo método de queda de pH, medindo-se o pH após 10 minutos de queda. Os dados obtidos foram
submetidos à análise pelo Teste de Tukey por meio do programa estatístico SAEG versão 9.1 –
2007. No presente trabalho, não houve diferença estatística entre o conteúdo de lipídio e a
digestibilidade protéica, indicando que o lipídio das amostras não interferiu no método de
digestibilidade in vitro de queda de pH e pH estático. (FAPEMIG/CNPq )
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UFV / XVIII SIC / OUTUBRO DE 2008 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CCB
INFLUÊNCIA DO BALANÇO ELETROLÍTICO NA QUALIDADE MINERAL ÓSSEA DE
FRANGOS DE CORTE
IGOR MONTEZE FERREIRA (Estagiário voluntário/UFV), GILSON MENDES ARAÚJO
(Voluntário/), FLÁVIO MEDEIROS VIEITES (Co-orientador/), ANDERSON DE ALMEIDA
BARBOSA (Bolsista FAPEMIG/UFV), ELISA SIALINO MULLER (Bolsista CAPES/UFV),
GEORGE HENRIQUE KLING DE MORAES (Orientador/UFV)
A seleção genética em frangos de corte para características como crescimento rápido,
principalmente para massa muscular, vem provocando demandas crescentes do sistema ósseo. O
desbalanço esquelético–biomecânico decorrente deste processo pode sofrer influência de fatores
genéticos e sexuais, determinando a prevalência de certas deformidades. Porém outros fatores
como temperatura ambiente, infecção e nutrição também podem interferir. O balanço eletrolítico
(BE) interfere no crescimento, apetite, desenvolvimento ósseo, na resposta ao estresse térmico e no
metabolismo de certos nutrientes como aminoácidos, minerais e vitaminas. Assim, objetivou-se
determinar o valor de BE para o melhor desempenho das tíbias de frangos de corte. Foram
utilizados 1560 pintinhos machos de um a 21 dias, divididos em blocos casualizados, com seis
repetições e 26 aves por unidade experimental. As rações basais foram a base de milho e farelo de
soja, sendo suplementadas com cloreto de amônio, carbonato de potássio e bicarbonato de sódio
em substituição ao material inerte, de forma a obter 6 níveis de BE ( 50; 0; 50; 100; 150 e
200mEq/kg). Aos 7, 14 e 21 dias, uma ave de cada repetição foi eutanasiada, as tíbias foram
retiradas, limpas e congeladas a -20°C. Os ossos foram desengordurados e incinerados em mufla a
550°C por 4h e pesados. Os resultados foram expressos em porcentagem de cinzas em relação ao
peso do osso seco e desengordurado. O BE aos 7 dias influenciou de forma linear crescente
(P<0,05) o conteúdo de cinzas dos ossos. Para as idades de 14 e 21 dias não houve diferenças
significativas, porém, para essas idades, os melhores resultados foram de 150 e 100 mEq/Kg,
respectivamente. Os pintinhos aos 7 dias são mais sensíveis a variações na dieta sendo
recomendando adição de 200 mEq/Kg na ração. (FAPEMIG, CNPq)
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ISOLAMENTO DE FUNGOS PRODUTORES DE DEXTRANASE E OTIMIZAÇÃO DA
PRODUÇÃO DA ENZIMA
LUCAS BENICIO CAMPOS (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), FABIANO DE PAULA
PEREIRA MACHADO (Bolsista FAPEMIG/UFV), RAFAEL LOCATELLI SALGADO
(Estagiário voluntário/UFV), FILIPPE ELIAS DE FREITAS SOARES (Estagiário
voluntário/UFV), LARISSA FROEDE BRITO (Não Bolsista/UFV), MARIA ROMÉRIA DA
SILVA (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), LÍVIA DIAS DE QUEIRÓS (Estagiário voluntário/UFV),
SEBASTIAO TAVARES DE REZENDE (Colaborador/UFV), ROBERT WEINGART BARRETO
(Colaborador/UFV), JOSE HUMBERTO DE QUEIROZ (Orientador/UFV)
Dextranases (EC 3.2.1.11; α-1,6-D-glicano-6-glicanohidrolase) são enzimas que hidrolisam
ligações α-(1,6)D-glicosídicas em polissacarídios de dextrana. Podem ser utilizadas na indústria
açucareira para diminuir a viscosidade e facilitar o clareamento de produtos intermediários. Outra
promissora aplicação seria a prevenção e tratamento contra placas bacterianas, visto que dextranas
destacam-se como componentes estruturais da matriz polissacarídica que facilitam a adesão de
bactérias cariogênicas. Este trabalho teve como objetivos isolar microrganismos produtores de
dextranase e otimizar a produção da enzima. Para o isolamento, foram utilizadas placas de petri
com meio sólido contendo dextrana como única fonte de carbono. As placas foram inoculadas com
amostras de solo e caldo de cana em diversas diluições. Após isolado, o fungo com maior atividade
de dextranase foi identificado no laboratório de Clínica de Doenças de Plantas do Departamento de
Fitopatologia da Universidade Federal de Viçosa. Para a produção da enzima, utilizou-se meio
líquido submetido à agitação durante 7 dias a 30ºC. Farelo de trigo, bagaço de cana, amido e
dextrana foram avaliados como fontes indutoras para produção de dextranase. Diferentes valores de
pH (3,0 a 9,0) e temperatura (20, 25, 30 e 35ºC) também foram avaliados. Após crescimento, o
meio líquido foi filtrado e centrifugado. O extrato enzimático foi submetido aos ensaios de
atividade de dextranase. Dentre oito fungos isolados, três apresentaram elevada atividade de
dextranase sendo que um deles (Paecilomyces marquandii) se destacou e foi selecionado para dar
continuidade ao trabalho. Dextrana foi selecionada como a melhor fonte de carbono indutora da
produção de dextranase e os valores de pH e temperatura que resultaram em maior produção da
enzima foram 7,0 e 30ºC, respectivamente. Esse estudo demonstrou grande potencial do fungo
Paecilomyces marquandii para a produção de dextranase e, após purificação e caracterização
bioquímica da enzima, serão avaliadas aplicações biotecnológicas.
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UFV / XVIII SIC / OUTUBRO DE 2008 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CCB
ISOLAMENTO DOS FUNGOS Acremonium zeae E Acremonium sp. E FERMENTAÇÃO
EM ESTADO SÓLIDO PARA PRODUÇÃO DE CELULASES E HEMICELULASES
DAYELLE SÂMILA PESSOTTI DE OLIVEIRA GONÇALVES (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV),
MAÍRA NICOLAU DE ALMEIDA (Bolsista CAPES/UFV), BRENDA RABELLO CAMARGO
(Estagiário voluntário/UFV), VALERIA MONTEZE GUIMARAES (Co-orientador/UFV),
OLINTO LIPARINI PEREIRA (Co-orientador/UFV), SEBASTIAO TAVARES DE REZENDE
(Coordenador/UFV)
A certeza do esgotamento das fontes de combustíveis fósseis como petróleo e carvão mineral fez
com que a procura por alternativas menos poluentes e renováveis, como o álcool, se tornassem uma
necessidade. Dentro deste contexto as biomassas lignocelulósicas são muito atraentes devido ao
baixo custo e grande disponibilidade. Sua degradação em açúcares fermentáveis por atividade
enzimática de modo economicamente viável, atualmente é alvo de pesquisas apoiadas por governos
e indústrias da iniciativa privada. Neste trabalho foram isolados, pela técnica de isolamento direto
em placa, os fungos endofíticos de milho Acremonium zeae (EA082) e Acremonium sp. (EA0810)
com grande potencial de degradação de biomassa. O bagaço de cana foi utilizado como fonte de
carbono indutora de celulases e hemicelulases em fermentação no estado sólido. O bagaço foi
umidificado com meio mineral contendo NaNO3 6,g/L, K2PO4 1,5 g/L, KCl 0,5g/L, MgSO4 0,5g/L,
FeSO4 0,01g/L e ZnSO4 0,01g/L em uma porcentagem de 76%. Em erlenmeyers de 125 mL foram
colocados 7g do bagaço úmido e após esterilização foram adicionados 3 discos (diâmetro de 8 mm)
retirados das bordas externas das culturas. Os erlenmeyers foram incubados em uma temperatura
média de 25oC e retirados para análise em intervalos de 72h. As enzimas foram extraídas por
incubação à temperatura ambiente sob agitação por 1/2 h, posteriormente filtradas e armazenadas
em geladeira. Altas atividades de celulase, celobiase e xilanase foram detectadas nos sobrenadantes
de EA082 e de EA0810. Entretanto as hemicelulases alfa-galactosidase e beta-xilosidase foram
produzidas em baixa quantidade pelos dois fungos. Portanto, os fungos EA082 e EA0810 que
foram crescidos utilizando bagaço de cana como suporte e fonte de carbono, produziram celulases
e hemicelulases importantes para a degradação de biomassas lignocelulósicas. ( FAPEMIG,
CNPq e CAPES)
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UFV / XVIII SIC / OUTUBRO DE 2008 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CCB
MÉTODO ALTERNATIVO PARA PURIFICAÇÃO PARCIAL DE AMILASE DE Zea
mays
VIVIAN FERREIRA DOS SANTOS CORRÊA (Estagiário voluntário/UFV), CIRO CÉSAR
ROSSI (Estagiário voluntário/UFV), DANIELLE MENDES SILVA (Estagiário voluntário/UFV),
APARECIDA DAS DORES TEIXEIRA (Estagiário voluntário/UFV), ANDRÉIA CNOSSEN
(Estagiário voluntário/UFV), ANTONIO PHELIPE CARLETTE ZÓBOLI (Estagiário
voluntário/UFV), SEBASTIAO TAVARES DE REZENDE (Orientador/UFV), JOSE
HUMBERTO DE QUEIROZ (Co-orientador/UFV)
Amilases são um dos grupos mais importantes de enzimas industriais, responsáveis por 25-33% da
produção mundial de enzimas. O lucro pode ser aumentado simplificando-se o processo de
purificação enzimática, geralmente feita por cromatografias sucessivas. A capacidade do alginato
de se ligar a α-amilases, podendo-se recuperá-la por precipitação com cálcio e eluição com maltose
1M apresenta-se como alternativa na purificação enzimática. O objetivo deste trabalho foi realizar
a purificação parcial e caracterização da amilase produzida por Zea mays, uma fonte enzimática
barata e abundante no Brasil, utilizando-se o método da precipitação com alginato. A amilase do
milho foi produzida por incubação de dez sementes em placas de Petri cobertas com papel de filtro,
embebido com de água destilada por 8 dias, à temperatura ambiente em local escuro. O extrato foi
obtido por trituração das sementes, em 15 mL de tampão fosfato 10 mM, pH 7,5. O homogenato foi
filtrado e 1 mL da solução obtida foi adicionado a 0,5 mL de alginato 2%, 0,1 mL de tampão TrisHCl 50 mM, pH 7,0. Após 1h a 25°C, o complexo foi precipitado pela adição de 0,1 mL de CaCl 2
1M. A amostra foi centrifugada e o pellet foi lavado e ressuspendido em Tris-HCl, 50mM, pH 7.0,
contendo maltose 1M, que desliga o complexo amilase-alginato. Após 4h a 4°C o alginato foi
precipitado por adição de 0,1mL de CaCl2 1M. Depois de centrifugação, obtivemos a enzima
parcialmente purificada no sobrenadante. Foram realizados testes para avaliar o valores de pH e
temperatura de maiores atividades e determinação de Km e Vmáx, utilizando-se amido 0,5% como
substrato e medindo-se a absorbância pelo método de FUWA. A purificação foi satisfatória,
confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida. Os valores de temperatura e pH ótimos, Km
e Vmáx foram, 65°C 5,0, 2,19 mg/mL e 39.45 mg/min, respectivamente.
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UFV / XVIII SIC / OUTUBRO DE 2008 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CCB
OBTENÇÃO E REGENERAÇÃO DE PROTOPLASTOS EM Phaeoisariopsis griseola
LEANDRO LIRA GONZAGA (Estagiário voluntário/UFV), SWIANY SILVEIRA LIMA
(Bolsista CNPq/UFV), ELZA FERNANDES DE ARAUJO (Co-orientador/UFV), MARISA
VIEIRA DE QUEIROZ (Orientador/UFV)
O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) é considerado uma excelente fonte de proteínas e
constitui uma das bases alimentares da população brasileira. Essa leguminosa é acometida pelo
fungo Phaeoisariopsis griseola (Sacc) Ferraris, agente etiológico da mancha-angular que ocorre
em mais de 60 países e pode ocasionar perdas de até 70% na produção feijoeiro no Brasil. Devido a
importância dessa doença, se faz necessário o desenvolvimento de técnicas que permitam
contribuir para o entendimento da biologia deste fitopatógeno. Nesse contexto, a obtenção e
regeneração de protoplastos permitirão determinar o cariótipo eletroforético, realizar transformação
genética e fusão de protoplastos, possibilitando a análise funcional de genes. O objetivo desse
trabalho foi isolar e regenerar protoplastos do fungo P. griseola. Para a obtenção dos protoplastos
foram empregados 500mg de micélio do isolado Ig865, patótipo 63-31, o estabilizador osmótico
KCl 0,8M em tampão fosfato 10mM pH 5.8 e a enzima lítica “Lysing Enzymes” extraída de
Trichoderma harzianum (“Sigma Chemical Co.”), na concentração de 7mg/mL. A preparação foi
incubada a 30ºC e 80rpm. Para determinar o melhor estabilizador osmótico para a regeneração dos
protoplastos foram testados os seguintes estabilizadores osmóticos adicionados ao meio de polpa
de tomate: manitol 0,6M; sorbitol 0,5M; e sacarose 0,6 e 0,7M. Periodicamente, os protoplastos
foram observados e contados em microscópio óptico com auxílio de câmara de Neubauer,
apresentando tamanho e aspecto uniforme. Os protoplastos (6x106/mL) foram obtidos após quatro
horas de tratamento e as freqüências de regeneração variaram de 0,041 a 0,084%. A maior
freqüência de regeneração obtida foi de 0,084% quando sacarose 0,6M foi utilizada. Este trabalho
descreve, pela primeira vez, um protocolo para a obtenção e regeneração de protoplastos em P.
griseola. Este resultado terá uma aplicação imediata em estudos genéticos com este importante
fitopatógeno, visando entendimento dos mecanismos de patogenicidade.
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UFV / XVIII SIC / OUTUBRO DE 2008 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CCB
PADRÃO COMPORTAMENTAL E CONSUMO DE O2 DE POPULAÇÕES
RESISTENTES E SUSCEPTÍVEL DO CARUNCHO DO MILHO EXPOSTAS À
CIPERMETRINA
FABRICIO RAINHA RIBEIRO (Estagiário voluntário/UFV), MARIA GORETI DE ALMEIDA
OLIVEIRA (Orientador/UFV), RONNIE VON SANTOS VELOSO (Bolsista CAPES/UFV),
JEANNE SCARDINI MARINHO (Bolsista CAPES/UFV), FERNANDA DA CONCEIÇÃO
MORAES (Estagiário voluntário/UFV), LILIANE EVANGELISTA VISÔTTO (Bolsista
FAPEMIG/UFV), ANDERSON MARTINS PILON (Bolsista CNPq/UFV), ELISEU JOSE
GUEDES PEREIRA (Colaborador/UFV), RAUL NARCISO CARVALHO GUEDES (Coorientador/UFV), JOEL ANTONIO DE OLIVEIRA (Co-orientador/UFV)
O consumo de O2 e o padrão comportamental de caminhamento foram avaliados em Sitophilus
zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae) oriundos de uma população padrão de
susceptibilidade (Sete Lagoas) e duas populações resistentes (Jacarezinho e Juiz de Fora). Foram
realizados bioensaios concentração-mortalidade para verificar o nível de resistência das populações
à cipermetrina e obter a concentração letal que causa 10% de mortalidade dos insetos susceptíveis
(CL10). Essa concentração foi usada no tratamento com o inseticida nas três populações. Foi
observado um baixo nível de resistência para cipermetrina nas duas populações resistentes, quando
comparado com outros inseticidas testados. Insetos das populações resistentes caminharam maiores
distâncias e tiveram maior velocidade média de caminhamento (P < 0,05), o que pode ser reflexo
da maior disponibilidade energética. Por outro lado, o tratamento com inseticida aumentou o
período de inatividade dos insetos susceptíveis (P = 0,0134). O consumo de O2 foi semelhante entre
as populações e entre grupos expostos e não expostos à cipermetrina (P > 0,05). É possível que a
semelhança no consumo de O2 seja um reflexo da ausência de desvantagem adaptativa nas
populações resistentes, pois a manutenção da resistência pode não estar demandando uma maior
taxa metabólica. Esse resultado poderia refutar a hipótese da mitigação do efeito tóxico do
inseticida pelo aumento da atividade metabólica quando os insetos são expostos a esses produtos.
Entretanto, a ausência de alterações no consumo de O2, após o tratamento com inseticida, pode ser
devido ao baixo nível de resistência que os insetos oriundos das populações de Jacarezinho e Juiz
de Fora apresentaram para a cipermetrina. Apoio Financeiro: FAPEMIG / CNPq
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PRODUÇÃO DE ADENOVÍRUS RECOMBINANTES, CONTENDO A ORF2 DO
CIRCOVÍRUS SUÍNO 2, CANDIDATOS A PROTÓTIPOS VACINAIS.
PEDRO MARCUS PEREIRA VIDIGAL (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), ABELARDO SILVA
JÚNIOR (Bolsista CNPq/UFV), MAURO PIRES MORAES (Co-orientador/), JULIANA LOPES
RANGEL FIETTO (Co-orientador/UFV), MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO
(Orientador/UFV)
O circovirus suíno 2 (PCV2) é o principal agente causador da Síndrome da Refugagem
Multissistêmica Pós-desmame (PMWS), estando associado a diferentes síndromes em suínos. A
manifestação das síndromes associadas ao PCV2 é denominada Circovirose suína. O genoma do
PCV2 possui três ORFs principais, sendo a ORF2 a codificadora da proteína do capsídeo viral.
Existem perspectivas promissoras em relação ao aprimoramento de métodos vacinais para controlar
a Circovirose suína. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi construir um sistema de expressão
gênica da ORF2 do PCV2 em vetores de adenovírus. A ORF2 do PCV2 foi amplificada pela PCR e
clonada em vetor pGEM-T easy. Células de Escherichia coli DH5 foram transformadas com o
plasmídeo (pGEM-ORF2), o material genético multiplicado e a clonagem confirmada por
seqüenciamento e ensaio de restrição com a enzima EcoRI. A ORF2 foi liberada pelas enzimas AclI
e NheI e clonada no vetor pAD5-Blue, previamente clivado pelas enzimas ClaI e XbaI. Células de
E. coli TOP10 foram transformadas com esta construção (pAd5- ORF2). Esta, por sua vez, foi
clivada e linearizada pela enzima PacI, sendo trasnfectada em células da linhagem HEK 293. A
verificação da expressão da proteína do capsídeo viral do PCV2 foi confirmada por ensaio de
imunoperoxidase em monocamada de células (IPMA). Após alcançarem um completo efeito
citopático, as células transfectadas foram centrifugadas e o sobrenadante congelado a -80ºC. A
purificação dos adenovírus recombinantes foi realizada em gradiente descontínuo de cloreto de
césio, utilizando-se 30 garrafas de 25 cm3 para o crescimento das células 293 infectadas com uma
multiplicidade de infecção (MOI) de, aproximadamente, um. Os vírus purificados foram dialisados
e a suspensão viral foi aliquotada e conservada. A expectativa deste trabalho é possibilitar, por
meio desta construção, a produção de uma vacina recombinante que contribua para o controle
eficiente da infecção pelo PCV2 no Brasil.
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PRODUÇÃO DE SORO POLICLONAL ANTI-GDPase DE Leishmania major
BRUNO VINICIUS SANTOS VALIATE (Estagiário voluntário/UFV), RONNY FRANCISCO
DE SOUZA (Não Bolsista/UFV), FELIPE FREITAS DE CASTRO (Estagiário voluntário/UFV),
LUCAS BORGES PEREIRA (Estagiário voluntário/UFV), ANTONIO PHELIPE CARLETTE
ZÓBOLI (Estagiário voluntário/UFV), FERNANDA GOMES CARDOSO (Bolsista
PROBIC/FAPEMIG/UFV), MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO (Coorientador/UFV), JULIANA LOPES RANGEL FIETTO (Orientador/UFV)
As Leishmanioses compreendem um conjunto de enfermidades cujos agentes etiológicos são
espécies do gênero Leishmania. As leishmanioses se divididem em duas formas clínicas: visceral e
tegumentar, sendo a L. major agente etiológico da forma tegumentar Existem dois genes da família
E-NTPDases mapeados no genoma de L. major denominados nucleosídeo difoafatase (NTPDase) e
guanosina difosfatase (GDPase). As E-NTPDases possuem como função a hidrólise de
nucleosídeos tri e di-fosfatados emodulam a sinalização purinérgica em mamíferos. Em
Leishmania sp parece que estas enzimas estão envolvidas com a captação de purinas e modulação
da resposta imune do hospedeiro. A isofomra GDPase de L. major foi expressa em sistema
bacteriano (pET21b) e purificada por cromatografia de afinidade (NTI-agarose). Esta proteína
purificada foi utilizada para produção de soro policlonal em coelho. As injeções continham a
proteína GDPase recombinante como imunógeno e saponina como adjuvante, na concentração de
40μg de cada em um volume final de 800μL. As injeçãões foram feitas via sub-cutânea em duas
doses, seguida de uma terceira dose sem saponina, com intervalos de quinze dias entre cada
injeção. Antes de cada aplicação e quinze dias depois da última injeção foi retirada uma alíquota de
aproximadamente 5,0 mL de sangue para separação dos soros pré-imune e imunes. Foi realizado
ensaio de western blotting para verificar a qualidade e titulação do soro imune. A melhor condição
de ensaio foi verificada com a diluição de 1:5000. O uso deste antisoro como ferramenta em
ensaios de localização subcelular da proteína nas diferentes formas evolutivas do parasito, ensaios
de imunoprecipitação e sua utilização em coluna afinidade para purificação de receptores
específicos são perspectivas deste trabalho. (FAPEMIG, UFV)
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UFV / XVIII SIC / OUTUBRO DE 2008 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CCB
PROPRIEDADES BIOQUÍMICAS E CINÉTICO-ENZIMÁTICAS DE CISTEÍNO
PROTEASES PRODUZIDAS POR BACTÉRIA ISOLADA DO TRATO INTESTINAL DE
Anticarsia gemmatalis
FERNANDA CRISTINA SILVA (Bolsista IC /projeto/UFV), RAUL NARCISO CARVALHO
GUEDES (Orientador/UFV), FRANCINY MARTINS PILON (Bolsista CNPq/UFV), ZAIRA
BRUNA HOFFMAM (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), NATÁLIA CAMPOS TEIXEIRA
(Não Bolsista/UFV), LILIANE EVANGELISTA VISÔTTO (Bolsista FAPEMIG/UFV),
ANDERSON MARTINS PILON (Bolsista CNPq/UFV), ANGÉLICA PATARO REIS (Bolsista
CNPq/UFV), JOEL ANTONIO DE OLIVEIRA (Co-orientador/UFV), MARIA GORETI DE
ALMEIDA OLIVEIRA (Co-orientador/UFV)
A Anticarsia gemmatalis é considerada uma das pragas-chave da sojicultura, sendo
economicamente importante em função das perdas que ocasionam a esta lavoura. Vários estudos
ligados a caracterização das proteases digestivas deste inseto já foram realizados. Recentemente,
foram realizados estudos sobre a contribuição da microbiota intestinal na bioquímica e fisiologia de
A. gemmatalis. Todas foram capazes de produzir quantidades significativas de proteases quando
cultivadas em meio de cultura adequado. Existe, portanto, evidências de que, além das proteases
produzidas pelas próprias células de A. gemmatalis, há também proteases que são sintetizadas por
microrganismos presentes no trato intestinal desses insetos Neste contexto o presente trabalho
fundamentou-se em caracterizar as cisteíno proteases da bactéria Bacillus cereus isolada do trato
intestinal de A. gemmatalis, frente o substrato L-BApNA. A bactéria foi cultivada em meio de
cultura constituído de infusão cérebro coração (BHI) acrescidos de 0,1% de soro albumina bovina
(BSA). Verificou-se pronunciada atividade em pH 7,5 e temperatura de 35 ºC. O Km app e a Vmáx app
foram 0,67 mM e 75,57 nM.s-1 respectivamente. O inibidor E-64 diminuiu significativamente a
atividade da protease bacteriana. Combinando o efeito do inibidor de metalo proteases EDTA com
o efeito de íons cálcio obteve-se cisteíno proteases cálcio-dependentes. Um aumento de TLCK no
meio fez com que a atividade de cisteíno protease bacteriana diminuísse gradativamente, fato
atribuído à reação desse inibidor com resíduo de aminoácido histidina na tríade catalítica de
cisteíno proteases. Pespstatina A, inibidor de aspartil proteases e Aprotinina, inibidor de serino
proteases não influenciaram as cisteíno proteases bacterianas. Os resultados de caracterização
cinética e de efeito de inibidores de proteases sobre a atividade das proteases produzidas por B.
cereus, concluem que essa bactéria sintetiza e excreta no lúmen intestinal de A. gemmatalis,
enzimas da família das cisteíno proteases. (CNPq, FAPEMIG, CAPES)
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UFV / XVIII SIC / OUTUBRO DE 2008 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CCB
PURIFICAÇÃO EM SISTEMA DE EXPRESSÃO HETERÓLOGO E OBTENÇÃO DE
ANTISORO POLICLONAL DE TRANSFATORES DA FAMÍLIA NAC DE SOJA (Glycine
max)
LUCAS BOENO OLIVEIRA (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), GUILHERME LUIZ
PINHEIRO (Bolsista CAPES/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Co-orientador/UFV),
ELIZABETH PACHECO BATISTA FONTES (Orientador/UFV)
A capacidade das plantas em responder às diversas condições de estresse depende de uma defesa
coordenada que culmina na tolerância a essas condições restritivas. Recentemente, nossa equipe de
pesquisadores utilizou uma abordagem genômica para identificar o transcriptoma de soja induzido
por estresse osmótico e por estresses do retículo endoplasmático (RE). Neste estudo foi
identificado que o gene que codifica o transativador ATAF é co-regulado por esses dois estresses e
possivelmente faz parte de uma via inédita de resposta a estresses em plantas. Assim sendo, foram
iniciados os estudos da caracterização do gene GmATAF, bem como dos outros genes da família
NAC presente em soja (GmNAC1-GmNAC6). Uma ferramenta importante na investigação da
função de proteínas é o desenvolvimento de sistemas de produção de proteínas recombinantes de
interesse. Portanto, o objetivo deste trabalho consiste na purificação das proteínas ATAF, NAC3 e
NAC6 e produção de anticorpos policlonais para as mesmas. As regiões codificadoras das três
seqüências foram amplificadas de forma a inserir uma extensão de nucleotídeos para recombinação
específica com o vetor pDONR201, de acordo com o sistema Gateway (Invitrogen). Em seguida, as
seqüências foram transferidas para o vetor pDEST17, para a expressão destas proteínas fusionadas
à cauda de histidina. As construções foram utilizadas para a transformação da linhagem bacteriana
BL21(DE3). Após a indução dos genes por IPTG, as proteínas quiméricas foram purificadas por
cromatografia de afinidade usando a resina Ni-NTA (Qiagen). A análise da expressão e
homogeneidade foi realizada através de SDS-PAGE. As proteínas foram eficientemente purificadas
e serão posteriormente usadas na imunização de coelhos para produção de anticorpos.
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REDUÇÃO DO TEOR DE ÁCIDO LINOLÊNICO EM SEMENTES DE SOJA: II.
DIVERGÊNCIA GENÉTICA DE PROGENITORES E POPULAÇÕES SEGREGANTES
PARA APLICAÇÃO EM RETROCRUZAMENTOS ASSISTIDOS POR MARCADORES
MOLECULARES
GABRIELA ANTONIA DE FREITAS ROCHA (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), LORÊTA BUUDA
DA MATTA (Bolsista CAPES/UFV), PEDRO IVO VIEIRA GOOD GOD (Bolsista CNPq/UFV),
MARCELO SALGADO GOMES OLIVEIRA (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), EVERALDO
GONCALVES DE BARROS (Co-orientador/UFV), MAURILIO ALVES MOREIRA
(Orientador/UFV)
Em programas de retrocruzamentos assistidos, a determinação da divergência genética entre
progenitores recorrentes e as linhagens segregantes é de fundamental importância. Os objetivos
deste trabalho foram (1) realizar análise de divergência genética entre progenitores (recorrentes e
doadores) e (2) selecionar genótipos com menor teor de ácido linolênico e geneticamente mais
próximos do progenitor recorrente, com base em marcadores microssatélites (SSR). Foram
utilizados 47 marcadores SSR, amplificados em oito genótipos de soja (A29, CS303TNKCA,
Tucunaré, CD01RR8384, CD219RR, CD222, CD224, e CD225RR). A variedade A29 é um
genótipo mutante que apresenta baixo conteúdo de ácido linolênico. As medidas de dissimilaridade
entre os progenitores foram estimadas pelo Complemento do Índice Ponderado. Foram utilizados
os métodos de Tocher, UPGMA e Ward para realizar o agrupamento dos progenitores. As
distâncias genéticas estimadas entre progenitores variaram de 0,45 a 0,81. As linhagens CD224 e
CD219RR apresentaram a menor dissimilaridade genética. As maiores dissimilaridades ocorreram
entre as variedades A29 com CS303 e A29 com Tucunaré. Os métodos de agrupamento Tocher e
Ward formaram cinco grupos: (I) Tucunaré, CD 224 e CD 219RR; (II) CD 01RR e CD 222;
(III) CD 225; (IV) CS303; e (V) A29. Com o método UPGMA foram formados quatro grupos,
incluindo CD225 no grupo II dos métodos anteriores. Com base em duas populações F2 oriundas
do cruzamento entre A29 x CS303TNKCA (AC) e A29 x Tucunaré (AT), foi realizada a seleção
dos genótipos geneticamente mais próximos aos progenitores a serem utilizados como recorrentes
(CD01RR8384, CD219RR, CD222, CD224, e CD225RR). Nas populações F2, foram selecionados
10 genótipos mais similares, em relação a cada progenitor recorrente, para o cruzamento AC, e 4
genótipos mais similares para o cruzamento AT. Houve coincidência entre os indivíduos
selecionados para cada progenitor recorrente, o que pode ser explicado pela relativa proximidade
do background genético dos progenitores recorrentes.
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UFV / XVIII SIC / OUTUBRO DE 2008 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CCB
AJUSTES METODOLÓGICOS PARA BIOPROSPECÇÃO DE PEPTÍDEOS DE DEFESA
EM SEMENTES DE SOJA GERMINADAS PARA APLICAÇÃO NO AGRONEGÓCIO
JOSÉ FABIANO DE SENA NETTO (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), MARIA CRISTINA
BARACAT PEREIRA (Orientador/UFV), MEIRE DE OLIVEIRA BARBOSA (Bolsista
CAPES/UFV), PATRÍCIA DIAS GAMES (Não Bolsista/UFV), TÂNUS HENRIQUE ABDALLA
PEREIRA (Estagiário voluntário/UFV), HEBRÉIA OLIVEIRA ALMEIDA (Bolsista
CAPES/UFV), PAULO WAGNNER PEREIRA ANTUNES (Não Bolsista/UFV), ELIZABETH
PACHECO BATISTA FONTES (Colaborador/UFV), REGINALDO DA SILVA ROMEIRO
(Colaborador/UFV)
Peptídeos com propriedades antimicrobianas estão presentes em várias espécies de plantas,
podendo ocorrer em vários órgãos vegetais, incluindo sementes. O objetivo deste trabalho foi
ajustar metodologias que otimizem o processo de purificação visando a obtenção de peptídeos
antibacterianos em sementes de soja germinadas por 48 horas (SG48), para aplicação no
agronegócio. As SG48 foram trituradas em liquidificador e maceradas em tampão de extração
contendo inibidores de proteases. O homogenato foi centrifugado e o sobrenadante foi submetido à
precipitação com sulfato de amônio sólido (35% sat/2h), e centrifugado. O sobrenadante foi
submetido a aquecimento seletivo (80ºC por 15 min.) e novamente centrifugado. À semelhança,
outra extração foi realizada onde a etapa de aquecimento não foi realizada. Os sobrenadantes
obtidos foram fracionados em cromatografia de exclusão molecular (CEM) (Sephadex G50). Os
eluatos obtidos foram analisados por SDS-Tricina-PAGE. As frações após CEM (sem etapa de
aquecimento) foram agrupadas em 4 pools (P1 a P4) e utilizadas para avaliação da atividade
antibacteriana contra as bactérias fitopatogênicas Ralstonia solanacearum e Clavibacter
michiganensis subsp. michiganensis. A análise de SDS-Tricina-PAGE, das frações obtidas após
CEM (com etapa de aquecimento seletivo), evidenciou que o aquecimento seletivo levou à
aglomeração de peptídeos de GS48 o que não foi verificado na fração não aquecida, quando
comparo-se o gel de SDS-Tricina-PAGE após CEM. Inibições do crescimento bacteriano foram
verificadas para ambas as bactérias, especialmente para P4. Estes resultados sugerem que a etapa
de aquecimento seletivo não é indicada em etapas iniciais do processo de purificação de peptídeos
uma vez que ocasiona uma menor recuperação dessas moléculas. As frações parcialmente
purificadas de SG48 que apresentaram atividade antibacteriana são promissoras para bioprospecção
de moléculas relacionadas à defesa de plantas. (CNPq/FAPEMIG/FINEP).
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UFV / XVIII SIC / OUTUBRO DE 2008 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CCB
INFLUÊNCIA DA EXTRAÇÃO DA CASCA DA SOJA E DO FEIJÃO NA
DIGESTIBILIDADE PROTÉICA IN VITRO
JÚLIA CRISTINA CARDOSO CARRARO (Estagiário voluntário/UFV), MARIA GORETI DE
ALMEIDA OLIVEIRA (Orientador/UFV), FABRÍCIA QUEIROZ MENDES (Bolsista
FAPEMIG/UFV), FABRICIO RAINHA RIBEIRO (Estagiário voluntário/UFV), FERNANDA
CRISTINA SILVA (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), CHRISTIANO VIEIRA PIRES (Coorientador/), JOEL ANTONIO DE OLIVEIRA (Co-orientador/UFV), THIAGO RENNÓ DOS
MARES GUIA (Co-orientador/), RITA DE CÁSSIA OLIVEIRA SANT´ANA (Bolsista
CNPq/UFV), MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO (Co-orientador/UFV)
As proteínas são compostos orgânicos complexos, essenciais aos organismos animal e humano, que
têm sua estrutura básica formada por uma cadeia de aminoácidos. As necessidades mínimas de
proteína requeridas para o crescimento e a manutenção do organismo são determinadas pela
eficiência de sua utilização biológica, resultante da inter-relação entre a qualidade e a quantidade
da proteína ingerida. As técnicas de digestibilidade protéica in vitro baseiam-se em digerir as
amostras com enzimas proteolíticas em condições padronizadas, diferindo entre elas apenas o
número e a natureza das enzimas a serem utilizadas e a medida final a serem realizadas. O presente
trabalho teve como objetivo determinar a influência das cascas na digestibilidade in vitro de
proteína em fonte vegetal. Foram utilizados como fontes de proteína o feijão vermelho e soja UFV
TN 105 (isenta de lipoxigenase). A determinação de proteína das amostras foi feita pelo método
semimicro Kjeldhal, usando o fator 6,25 para conversão de nitrogênio em proteína bruta. Para a
retirada de casca das amostras, os grãos selecionados foram lavados e aquecidos para o
desprendimento da casca. Em seguida, as cascas foram retiradas manualmente, grão a grão. A
digestibilidade foi determinada pelo método in vitro de queda de pH, medindo-se o pH após 10
minutos de queda. Os dados obtidos foram submetidos à análise pelo Teste de Tukey por meio do
programa estatístico SAEG versão 9.1 – 2007. A fibra, presente principalmente na casca dos grãos,
interferiu na digestibilidade in vitro no método de queda de pH. Sendo assim, faz-se necessário a
retirada da casca dos vegetais ricos em fibra para utilização das equações utilizadas no método de
queda de pH, o que não corresponde à realidade de consumo de alguns alimentos. Desse modo, fazse necessário a dedução de outra equação exclusiva para alimentos fibrosos. (CNPq)
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UFV / XVIII SIC / OUTUBRO DE 2008 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CCB
ANÁLISE PROTEÔMICA DE PLANTAS DE TOMATE SUBMETIDAS A ESTRESSE
BIÓTICO POR Xanthomonas campestris pv. vesicatoria
MARIANA LIMA BORONI MARTINS (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), MARIA CRISTINA
BARACAT PEREIRA (Orientador/UFV), PAULO WAGNNER PEREIRA ANTUNES (Não
Bolsista/UFV), MEIRE DE OLIVEIRA BARBOSA (Bolsista CAPES/UFV), HEBRÉIA
OLIVEIRA ALMEIDA (Bolsista CAPES/UFV), REGINALDO DA SILVA ROMEIRO (Coorientador/UFV)
A resistência natural das plantas a patógenos é baseada em mecanismos pré-formados e em
mecanismos induzidos. Após uma infecção, mecanismos latentes de defesa que conferem
resistência induzida, são ativados. O objetivo foi identificar proteínas e peptídeos diferencialmente
expressos em tomateiros (Solanum lycopersicum) inoculados com a bactéria
fitopatogênicaXanthomonas campestris pv. vesicatoria, visando desenvolver produtos comerciais
para o controle de doenças de plantas. Grupos de plantas de tomate foram inoculados com
propagos do patógeno em três diferentes tempos. As folhas foram coletadas (25 dias) formando
quatro grupos: plantas sem inóculo e plantas colhidas 1, 7 e 14 dias após a inoculação. As folhas
foram maceradas com Tris-HCl 50 mM, pH 7,0 acrescido de inibidores de proteases e
centrifugadas. Os sobrenadantes foram denominados extratos solúveis (ES). Aos precipitados foi
adicionado LiCl 1,5 M, deixou-se sob agitação overnight e centrifugou-se. Os sobrenadantes
corresponderam aos extratos de parede celular (EP). Fracionou-se os extratos por sulfato de amônio
35-75%sat e em faixas de massas moleculares em Amicon®, utilizando-se membranas de faixa de
exclusão de 30, 10 e 1 kDa em seqüência. Posteriormente, submeteram-se as amostras de ES a
cromatografias de troca aniônica (SAX-HPLC). As amostras de EP e os picos catiônicos (P1)
eluídos durante cromatografia de troca iônica de ES 1-10 foram submetidas à cromatografia de fase
reversa (C18-HPLC). Analisou-se picos selecionados por espectrometria de massa (MALDITOF/TOF). Os cromatogramas de troca aniônica e fase reversa referentes aos quatro tratamentos de
ES e EP, quando comparados, apresentaram diferenças com relação à presença, formas e
intensidades de picos. Obteve-se 12 resultados de massas moleculares, que variaram de 1802,083 a
8452,687 Da (massas peptídicas). A identificação de proteínas e peptídeos diferencialmente
expressos que estejam relacionados com vias de defesa e, ou, que atuem diretamente inibindo
patógenos, é importante para o desenvolvimento de novas técnicas de controle biológico.
(CNPq/FAPEMIG/FINEP).
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AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS LIOFILIZADOS DOS
EXTRATOS AQUOSOS DE FOLHAS E CASCAS DO CAULE DE Bathysa cuspidata (A.
ST.-HIL.) HOOK.F.
ISABELLA BARROS VALADÃO (Estagiário voluntário/UFV), ALEX NAKAUTI KIYOMOTO
(Estagiário voluntário/UFV), JOAO PAULO VIANA LEITE (Orientador/UFV)
A espécie Bathysa cuspidata (A.St.-Hil.) Hook.f. pertence a família Rubiaceae, sendo nativa de
regiões de Mata Atlântica, o que coloca a espécie sob ameaçada de extinção, já que o bioma tem
sofrido grande pressão antrópica. Levantamento etnofarmacológico em comunidades do entorno do
Parque Estadual da Serra do Brigadeiro (PESB), realizado pelo nosso grupo de pesquisadores,
apontou essa espécie como sendo utilizada no preparo de medicação para tratamento de doenças do
fígado. Atualmente, os extratos de folhas e cascas dessa planta estão sendo testados por
pesquisadores da UFV sobre diferentes modelos de testes in vivo e in vitro, entre esses, o que avalia
a atividade antioxidante. Nas doenças hepáticas, o estresse oxidativo tem sido relacionado como
um dos possíveis fatores desencadeadores de lesão hepatocelular. Buscando investigar possíveis
mecanismos associados a ação antihepatotóxica de folhas e cascas de B. cuspidata, o presente
trabalho avaliou a atividade antioxidante dos liofilizados dos extratos aquosos dessa droga vegetal.
O material vegetal foi coletado no entorno do PESB e as folhas e cascas do caule, separadamente,
foram submetidos a extração por infusão, simulando o uso popular. Em seguida, o infuso foi levado
ao liofilizador até obtenção do extrato seco. Aos extratos, em diferentes concentrações
livres (DPPH ), onde o descoloramento da solução indica a habilidade do extrato em reduzir o
radical livre. Ambos os extratos apresentam atividade antioxidante, apresentando concentrações
entre os extratos avaliados. Essa atividade antioxidante dos extratos pode estar relacionada com o
efeito farmacológico da planta indicado pela população. Estudos mais aprofundados com essa
espécie estão sendo realizados para investigar a atividade antihepatotóxica.
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BIOPROSPECÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE EXTRATOS DE
TANCHAGEM (Plantago major L.) PARA APLICAÇÃO COMERCIAL
THIAGO RODRIGUES DE SOUZA LOPES (Estagiário voluntário/UFV), MARIA CRISTINA
BARACAT PEREIRA (Orientador/UFV), LANNA CLICIA CARRIJO (Não Bolsista/UFV),
NAYARA GUSMÃO TESSAROLLO (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), HEBRÉIA
OLIVEIRA ALMEIDA (Bolsista CAPES/UFV), PATRÍCIA DIAS GAMES (Não Bolsista/UFV),
ELIZABETH PACHECO BATISTA FONTES (Colaborador/UFV), REGINALDO DA SILVA
ROMEIRO (Colaborador/UFV)
A Tanchagem (Plantago major L.) é uma planta de amplo uso medicinal. Sua propriedade
cicatrizante pode estar relacionada à presença de peptídeos antimicrobianos nas folhas, os quais
têm sido encontrados em diversas plantas e aplicados comercialmente na defesa contra patógenos,
tais como bactérias, fungos e vírus. Portanto, esse trabalho buscou extrair, purificar e identificar
peptídeos, bem como testar sua atividade antibacteriana nos extratos fracionados de folhas de
Tanchagem. Para isso, folhas limpas e secas de Tanchagem foram maceradas em tampão Tris HCl,
acrescido de PMSF, benzamidina e tiouréia. O sobrenadante obtido após a centrifugação foi
denominado extrato solúvel (ES), e o precipitado foi ressuspendido em LiCl na presença de
inibidores de proteases e centrifugado; o sobrenadante correspondeu ao extrato de parede celular
(EP). Os extratos ES e EP foram submetidos à ultrafiltração em equipamento de pressão positiva,
Amicon, utilizando membranas com limite de exclusão de 30kDa, 10kDa e 1ka para
fracionamento, sendo obtidas três frações concentradas de cada extrato: 1-10kDa, 10-30kDa e
maior que 30kDa. Cada uma das seis frações foi submetida separadamente a fracionamento salino
por precipitação com (NH4)2SO4 (35-75%) e posteriormente dessalinizada em membrana de 1
kDa (Amicon). As seis frações obtidas foram analisadas por gel SDS-PAGE e SDS-tricina-PAGE,
sendo obtidas bandas que evidenciaram as respectivas massas moleculares de cada fração. Os
ensaios da atividade antibacteriana contra as bactérias fitopatogênicas Ralstonia solanacearum e
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis mostraram que o crescimento de ambas as
bactérias foi parcialmente inibido por todas as frações. Para 12 h de cultivo, houve inibição de até
64% para C. michiganensis subsp. michiganensis (ES/1-10kDa) e 52% para R. solanacearum
(ES/1-10kDa). Etapas de purificação em HPLC e o seqüenciamento por espectrometria de
massas complementarão esse estudo, e no futuro, os peptídeos identificados poderão ser aplicados
para uso comercial e biotecnológico, para diferentes finalidades. (FAPEMIG, CNPq, FINEP)
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CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICO-CINÉTICA DE CISTEÍNO-PROTEASES
SOLÚVEIS DO INTESTINO MÉDIO DE Anticarsia gemmatalis
NATÁLIA CRISTINA SANTOS COSTA (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), RAUL NARCISO
CARVALHO GUEDES (Orientador/UFV), EDUARDO GOMES DE MENDONÇA (Bolsista
CAPES/UFV), ZAIRA BRUNA HOFFMAM (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), DENISE
TORRES DA CRUZ REIS (Bolsista CNPq/UFV), ANGÉLICA PATARO REIS (Bolsista
CNPq/UFV), ANDERSON MARTINS PILON (Bolsista CNPq/UFV), LILIANE EVANGELISTA
VISÔTTO (Bolsista FAPEMIG/UFV), MARIA GORETI DE ALMEIDA OLIVEIRA (Coorientador/UFV), JOEL ANTONIO DE OLIVEIRA (Co-orientador/UFV)
Os inibidores de proteases, que marcam proteases de insetos específicas, são candidatos para uso
em plantas geneticamente modificadas para controle destas pragas. Um primeiro passo para se
alcançar isso é a caracterização das enzimas proteolíticas do intestino desses insetos. O objetivo
deste estudo foi caracterizar cisteíno-proteases solúveis do intestino médio de Anticarsia
gemmatalis utilizando o substrato sintético L-BApNA. Verificaram-se dois valores de pH com
pronunciada atividade enzimática, sendo eles pH 3,6 e 8,0. A temperatura de maior atividade foi
35oC. O KM app e a Vmáx app encontradas foram 2,28mM e 297,63nM/s, respectivamente. Quatro
inibidores de proteases foram testados, sendo cada um deles de uma classe de protease: TLCK
(inibidor de serino-protease), E-64 (inibidor de cisteíno-protease), EDTA (inibidor de metaloprotease) e Pepstatina A (inibidor de aspartil-protease). A inibição mais pronunciada foi verificada
quando E-64 foi adicionado ao meio, uma vez que em todas as concentrações testadas foi
diminuída significativamente a atividade de cisteíno-protease. A diminuição significativa dessa
atividade indica ser a enzima do tipo papaína-like. Um aumento na concentração do inibidor de
serino-protease TLCK no meio de reação fez com que a atividade de cisteíno-protease caísse
gradativamente. EDTA e Pespstatina A não influenciaram significativamente a atividade dessa
protease. (CAPES, CNPq, FAPEMIG)
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INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA EM PLANTAS DE TOMATE POR Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria - EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE PROTEÍNAS E INDUÇÃO
DE AMPs.
MARIANA LIMA BORONI MARTINS (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), MARIA CRISTINA
BARACAT PEREIRA (Orientador/UFV), PAULO WAGNNER PEREIRA ANTUNES (Não
Bolsista/UFV), PATRÍCIA DIAS GAMES (Não Bolsista/UFV), FLÁVIO AUGUSTO DE
OLIVEIRA GARCIA (Bolsista CAPES/UFV), NAYARA GUSMÃO TESSAROLLO (Estagiário
voluntário/UFV), REGINALDO DA SILVA ROMEIRO (Co-orientador/UFV)
A resposta à infecção por patógenos pode levar as plantas a desenvolver uma resistência aumentada
a ataques futuros, uma vez que a planta produz diferentes metabólitos que auxiliam na sua
proteção, dentre eles os peptídeos antimicrobianos (AMPs). Este fenômeno é conhecido como
indução de resistência. O objetivo foi avaliar a resposta de plantas de tomate (Solanum
lycopersicum) ao ataque pelo patógeno Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Grupos de
tomateiros foram inoculados com propagos do patógeno em três diferentes tempos. Após 25 dias de
semeadura, coletou-se as folhas, obtendo-se quatro grupos: plantas sem inóculo e plantas colhidas
1, 7 e 14 dias após a inoculação. Antes da coleta, avaliou-se as plantas quanto à severidade da
doença. As folhas foram maceradas com Tris-HCl 50 mM, pH 7,0 acrescido de inibidores de
proteases e centrifugadas. Os sobrenadantes foram denominados extratos solúveis (ES). Aos
precipitados foi adicionado LiCl 1,5 M, deixou-se sob agitação overnight e centrifugou-se. Os
sobrenadantes corresponderam aos extratos de parede celular (EP). No ES, avaliou-se as atividades
das enzimas indicadoras do estado de indução Peroxidase, Fenilalanina Amônio-Liase,
Lipoxigenases, β-1,3-glucanases e quitinases. Os extratos de ES e EP foram separados em SDSPAGE 12% e em SDS-Tricina-PAGE 16,5%. Posteriormente foram fracionados por sulfato de
amônio 35-75%sat e por faixas de massa molecular, usando-se membrana de faixa de exclusão de
1, 10 e 30 kDa em seqüência em Amicon®. A atividade antimicrobiana das amostras de ES e EP
1kDa foi testada contra as bactérias Ralstonia solanacearum e Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis. A resposta da planta ao patógeno variou de acordo com a severidade da doença:
observou-se aumento da atividade das enzimas e expressão diferencial de proteínas entre os
diferentes tratamentos, confirmando a indução de resistência. O teste antimicrobiano mostrou que
as amostras testadas contêm moléculas biologicamente ativas, possivelmente AMPs, capazes de
inibir o crescimento microbiano.(CNPq/FAPEMIG/FINEP).
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QUALIDADE NUTRICIONAL DE DIFERENTES FONTES PROTEICAS
FERNANDA DA CONCEIÇÃO MORAES (Estagiário voluntário/UFV), MARIA GORETI DE
ALMEIDA OLIVEIRA (Orientador/UFV), FABRÍCIA QUEIROZ MENDES (Bolsista
FAPEMIG/UFV), PATRICIA APARECIDA FONTES VIEIRA (Bolsista CNPq/UFV), RITA DE
CÁSSIA OLIVEIRA SANT´ANA (Bolsista CNPq/UFV), ANGÉLICA PATARO REIS (Bolsista
CNPq/UFV), NEUZA MARIA BRUNORO COSTA (Co-orientador/UFV), THIAGO RENNÓ
DOS MARES GUIA (Co-orientador/), JOEL ANTONIO DE OLIVEIRA (Co-orientador/UFV),
RAUL NARCISO CARVALHO GUEDES (Co-orientador/UFV)
Proteínas são essenciais para animais. O valor nutricional das proteínas depende de sua
digestibilidade, da biodisponibilidade de aminoácidos essenciais, ausência de toxicidade e fatores
antinutricionais. O objetivo desse trabalho foi avaliar a digestibilidade protéica, o PER e NPR das
seguintes fontes de proteína: caseína, carne de porco, carne de peixe, carne de frango, albumina,
proteína de soro de leite, leite em pó, aveia, quinoa e cinco variedades de soja. A avaliação da
qualidade protéica foi conduzida por meio de ensaios biológicos, durante 14 dias, utilizando-se
ratos machos, raça Wistar, recém desmamados. As dietas continham teores de 9 a 10% de proteína.
Para o cálculo da digestibilidade, as dietas foram marcadas com índigo-carmim e as fezes coletadas
do 8° ao 11° dia do experimento, acondicionadas individualmente sob refrigeração. Após o período
de coleta, foram secas em estufa a 105°C durante 24 horas. Foram resfriadas, pesadas e moídas
para determinação do teor de nitrogênio, utilizando o método semimicro Kjeldhal. As dietas de
caseína, albumina, proteína de soro de leite e as carnes de porco, peixe e frango apresentaram
maiores valores de digestibilidade, não diferindo entre si e apresentando valores entre 92,84 % a
95,54 %. Já as que continham soja foram as que apresentaram menor valor de digestibilidade
(73,23 % a 78,04 %). Para valores de PER e NPR, leite em pó, caseína, albumina, proteína de soro
e as carnes de porco, peixe e frango apresentaram os maiores valores. A menor digestibilidade das
variedades de soja prova que a presença de fatores antinutricionais reduz a biodisponibilidade das
proteínas. (FAPEMIG/CNPq )
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INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE Ralstonia solanacearum E DE Clavibacter
michiganensis subsp. michiganensis POR EXTRATOS PEPTÍDICOS DE FOLHAS DE
BERINJELA
TÂNUS HENRIQUE ABDALLA PEREIRA (Estagiário voluntário/UFV), MARIA CRISTINA
BARACAT PEREIRA (Orientador/UFV), HEBRÉIA OLIVEIRA ALMEIDA (Bolsista
CAPES/UFV), MEIRE DE OLIVEIRA BARBOSA (Bolsista CAPES/UFV), PATRÍCIA DIAS
GAMES (Não Bolsista/UFV), JOSÉ FABIANO DE SENA NETTO (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV),
ELIZABETH PACHECO BATISTA FONTES (Colaborador/UFV), REGINALDO DA SILVA
ROMEIRO (Co-orientador/UFV)
Peptídeos antimicrobianos (AMPs) desempenham um papel importante na primeira linha de defesa
de plantas contra a invasão de patógenos. Algumas variedades de plantas de berinjela são pouco
susceptíveis a alguns fitopatógenos possivelmente por expressarem compostos naturais de defesa, e
AMPs podem estar envolvidos nesse mecanismo. O objetivo desse trabalho foi a bioprospecção de
peptídeos com atividade antimicrobiana obtidos de folhas de berinjela (variedade ´Florida
Market´). As folhas foram pulverizadas em nitrogênio líquido e maceradas em tampão Tris-HCl
contendo EDTA, benzamidina, PMSF e tiouréia. O extrato foi centrifugado e o sobrenadante
corrrespondeu ao Extrato Solúvel (ES). O precipitado foi lavado (água), extraído em LiCl (EDTA,
PMSF, benzamidina, tiouréia), o homogenato foi centrifugado e o sobrenadante correspondeu ao
Extrato de Parede Celular (EP). ES e EP foram fracionados (sulfato de amônio e aquecimento) e
submetidos à cromatografia de exclusão molecular (Sephadex-G10). Foram obtidos quatro pools
para ES e quatro para EP, que foram ultrafiltrados (membrana de 1000 Da) para dessalinização.
Essas frações foram submetidas a testes de atividade antimicrobiana contra as bactérias
fitopatogênicas Ralstonia solanacearum e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Todos
os pools foram testados em duas concentrações. R. solanacearum mostrou-se mais susceptível aos
efeitos inibitórios de ambos os extratos. Tanto para ES quanto para EP, o pool 1 mostrou-se mais
efetivo na inibição do crescimento de ambas as bactérias, em geral para a maior concentração
utilizada, atingindo mais de 60% de inibição para ES pool 1 na maior concentração avaliada. As
frações foram analisadas por SDS-Tricina-PAGE e foi possível visualizar bandas peptídicas com
massas moleculares inferiores a 6.000 Da. Peptídeos antimicrobianos identificados poderão ser
utilizados como princípios ativos no desenvolvimento de defensivos naturais e ainda utilizados
como agentes antimicrobianos para animais nas indústrias farmacêuticas e veterinária. (FAPEMIG,
CNPq, FINEP)
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REDUÇÃO DO TEOR DE ÁCIDO LINOLÊNICO EM SEMENTES DE SOJA: I.
ESTIMATIVAS DE HERDABILIDADE, CORRELAÇÕES E GANHO DE SELEÇÃO EM
POPULAÇÕES F2
GABRIELA ANTONIA DE FREITAS ROCHA (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), LORÊTA BUUDA
DA MATTA (Bolsista CAPES/UFV), PEDRO IVO VIEIRA GOOD GOD (Bolsista CNPq/UFV),
MARCELO SALGADO GOMES OLIVEIRA (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), EVERALDO
GONCALVES DE BARROS (Co-orientador/UFV), MAURILIO ALVES MOREIRA
(Orientador/UFV)
O alto teor de ácidos graxos polinsaturados é responsável pela redução da estabilidade à oxidação e
da qualidade do óleo de soja, tanto para fins alimentícios quanto industriais. Nesse contexto, o
presente trabalho teve como objetivo estimar a herdabilidade e ganho de seleção em populações de
soja segregantes para teor de ácido linolênico (C18:3 Δ9,12,15). Duas populações de plantas F2
derivadas dos cruzamentos entre A29 x CS303TNKCA (AC) e A29 x Tucunaré (AT), tiveram suas
sementes analisadas por cromatografia gasosa para a determinação do teor de ácidos graxos. Foram
analisadas 36 sementes das variedades CS303TNKCA e A29, 18 da variedade Tucunaré, 287 e 255
sementes das populações F2 derivadas dos cruzamentos entre AC e AT, respectivamente. A partir
desses dados foram estimados os valores de herdabilidade no sentido amplo, ganho de seleção e
correlação de Pearson. Para a característica teor de C18:3 na população F2 oriunda do cruzamento
entre AC, obteve-se herdabilidade no sentido amplo de 72,10% com ganho de seleção de -28,42%.
Na população oriunda dos progenitores AC, a herdabilidade no sentido amplo foi de 88,90% e
ganho de seleção de -47,16%. Esses dados indicam que a seleção pode ser feita em gerações
precoces e essas populações são promissoras para o desenvolvimento de novas variedades com
reduzido teor de ácido linolênico. A correlação entre ácido oléico (C18:1 Δ 9) e C18:3 foi negativa
e significativa (p<0,01) nas duas populações, -0,24 na população AC e -0,26 na população AT.
Esses resultados demonstram que é possível realizar a seleção indireta para aumento de C18:1. Os
genótipos selecionados serão utilizados para dar início a um programa de retrocruzamentos
assistidos por marcadores moleculares para a obtenção de variedades produtivas, com baixo
conteúdo de C18:3 e alto conteúdo de C18:1.