Hemoglobinopatias: contributo da Genética Molecular

Dia do INSA
A Referência: Função essencial do INSA
Hemoglobinopatias:
contributo da Genética Molecular
João Gonçalves
Unidade de Genética Molecular – Lisboa
Departamento de Genética
[email protected]
UMOL_2009.09.29 _ Dia do INSA (J.G.)
H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
Núcleo de Apoio
Unidade de
Genética
Médica
Unidade
de
Citogenética
Unidade de
Genética
Molecular
Lab.
Lisboa
João Gonçalves
Unidade de
Bioquímica
Genética
Unidade de
Rastreio
Neonatal
Unidade de
Tecnologia e
Inovação
Unidade de
Investigação e
Desenvolvimento
Lab.
Porto
Rosário
Santos
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1
H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular
> Médico Solicita Análise <
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Coa d he
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Hospital – Serviço Hematologia
Serviço Genética
Centro DPN
Lab. Análises Clínicas
Cons. Privado
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> Portador <
Contributo
da <Genética
> Doente
Departamento de
> Casal em Risco, DPN <
Departamento de
Molecular
integra-se
no
Genética
>>>
Avaliação Hematol.
e Bioq.<<<
Promoção da Saúde
Unid de Gené
Genética Molecular Lisb.
Lisb.
e Doenças Crónicas
Programa Nacional
de
Controlo
…das
Cooperação/
partilha de resultados e
Hemoglobinopatias
> Hemoglobinopatias
de conhecimentos
hemoglobinopatias
(Genética Molecular)
Unid. Lab. de Referência
…
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Departamento de
Genética
Unidade de Investigação e
Desenvolv.
> Grupo de Investigação em
hemoglobinopatias e metab.
Ferro
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H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular
Prevalência de portadores de betatalassémia na pop. Portuguesa
Prevalência de portadores de
hemoglobina S na pop. Portuguesa
Martins MC et al (1993) Hereditary anaemias in
Portugal: epidemiology, public health
significance, and control. J Med Genet 30:235-239.
(15208 indivíduos ♂: β tal:0,45%; HbS: 0,32%)
Base Científica
para o
Programa Nacional de Controlo
das Hemoglobinopatias, 1986 (PNCH)
⇒ Cooperação com a OMS
⇒ Coordenação do INSA
DGS: Circ Norm Nº 18/DSMIA de 07/09/2004
Objectivos:
- Prevenção
> Diagnóstico
> Idef. Casais em risco
> Aconselhamento Genético
> DPN molecular
- Tratamento
- Investigação
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Prevalência de portadores de
hemoglobinopatia β em Portugal
População (2006): 10,9 x 106
“Bolsas” de alta prevalência:
Nascimentos (2007): 102 x 103
5-10%
Prevalência (global)
de portadores: 1-2%
Incidência:
HbS
5-10 casos/ano
β-Talassémia
SS,
Inez et al, Arq INSA 1993, 19:27
Sβ-Tal,
β-Talβ-Tal
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DPN de Hemoglobinopatias de 1990 a Set2009
Doença
Normal
Portador
Afectado
Total
Drepanocitose
42
68
28
138
(75,4%)
Tal-Drepanocitose
7
7
1
15
(8.2%)
Talassémia
7
14
9
30
(16.4%)
Total
56
89
38
183
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Agrupamento génico da β globina (11p15.5)
ε
5’
pb
93
5’
Cd
1
Aγ
ϕβ
222
130
1
Gγ
30
31
126
3
850
2
δ
104
β
3’
3’
Gene: HBB
105 146
CD 6: GAG>GTG
(c.20A>T)
p.Glu6Val ⇒ Hb S
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Diagnóstico molecular de Drepanocitose - Metodologias
Análise Molecular:
- Amostras de DNA dos pais (SE; casal PNCH)
- DNA fetal analisado em duplicado (LA; VC)
- Dois métodos de análise molecular (independentes).
- Pesquisa de contaminação materna do DNA fetal (VNTRs)
- Utilização dos controlos necessários que nos permite a validação interna de cada ensaio
1. PCR e Restrição Enzimática
2. BI-PASA (PCR bidireccional específica de alelo)
Mutação: c.20A>T (p.Glu6Val)
Mutação: c.20A>T (p.Glu6Val)
(Bsu 36 I)
C
390 pb
800 pb
N
Dig. Bsu 36 I:
Mutação : 390 pb
Alelo Normal: 213 e 177 pb
500 pb
300 pb
M
f m f
M
N
AS SS AS SS AS AA
C
N
M
AA
AA
SS
AS
AA
controlos
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Sequenciação automática
de fragmentos de DNA obtidos por PCR
(c.20A>T)
p.Glu6Val ⇒ Hb S
GAG>GTG
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DPN de Drepanocitose
Análise Molecular:
- Amostras de DNA dos pais (SE; casal PNCH)
- DNA fetal analisado em duplicado (LA; VC)
- Dois métodos de análise molecular (independentes).
- Pesquisa de contaminação materna do DNA fetal (VNTRs)
- Utilização dos controlos necessários que nos permite a validação interna de cada ensaio
Portador de Hb S
Portadora de Hb S
Mutação: c. [20A>NT] + [=]
(p.Glu6Val)
Mutação: c. [20A>NT] + [=]
(p.Glu6Val)
Pesquisa de contaminação materna
no DNA fetal: VNTR (DXS52)
Mutação: c.20A>T (p.Glu6Val)
pai
c.[20A>T] + [20A>T]
Feto não possui alelo c materno
mãe
feto
feto C. Neg MPM
a
b
c
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H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular
DPN de Drepanocitose
Análise Molecular:
- Amostras de DNA dos pais (SE; casal PNCH)
- DNA fetal analisado em duplicado (LA; VC)
- Dois métodos de análise molecular (independentes).
- Pesquisa de contaminação materna do DNA fetal (VNTRs)
- Utilização dos controlos necessários que nos permite a validação interna de cada ensaio
?
Não foi possível fazer o estudo
do marido desconhecendo-se se tem anemia.
Natural de S. Tomé e Príncipe
C/ Anemia (Hb A2:3,6%; Hb S: 35%)
Pede-se estudo fetal de hemoglobinopatia
Pai inacessível.
Sangue materno
(enviado para Lab Hematologia (PNCH))
?
LA; Gestação de 16 semanas
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?
Não foi possível fazer o estudo do marido
desconhecendo-se se tem anemia.
Natural de S. Tomé e Príncipe
(Hemog: 11,3 g/dL; VGM: 86,0 fL; HGM: 28,9 pg)
Hb F: 2,0%; Hb C:38,0%)
Pede-se estudo fetal de hemoglobinopatia
Inacessível
LA; Gestação de 16 semanas: Afectado – Hb SC
HbC
HbS
Feto: Heterozigótico composto para as mutações
HBB:c.19G>A (HbC); p.Glu6Lys e HBB:c.20A>T (HbS); p.Glu6Val
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H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular
DPN
Análise Molecular:
- Amostras de DNA dos pais.
- DNA fetal em duplicado.
- Dois métodos de análise molecular (independentes).
- Pesquisa de contaminação materna do DNA fetal (VNTRs)
- Utilização dos controlos necessários que nos permite a validação interna de cada ensaio
Confirmação hematológica e bioquímica
Portador de Hb S
Confirmação hematológica e bioquímica
Portadora de Hb S
Mutação: c. [20A>NT] + [=]
f
Despiste de contaminação
materna do DNA fetal
(VNTR)
P M
f CN MP
p1
m
?
p2
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STR
mãe
feto
Pai
Y
X
G MG
AM A
Feto: 6/9 alelos não se encontram no (pai)
8
79 18
35
11 S8
S1
8S D5
3
D
D
vW
12
2p
A1
7
28
11
31
4q
1S
3S
A
G
D2
D1
F
20
S8
D7
51
8S
D1
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H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular
DPN
Análise Molecular:
- Amostras de DNA dos pais.
- DNA fetal em duplicado.
- Dois métodos de análise molecular (independentes).
- Pesquisa de contaminação materna do DNA fetal (VNTRs)
Confirmação hematológica e bioquímica
Portador de Hb S
Confirmação hematológica e bioquímica
Portadora de Hb S
Mutação: c. [20A>NT] + [=]
f
Despiste de contaminação
materna do DNA fetal
(VNTR)
P M
f CN MP
p1
m
?
p2
UMOL_2009.09.29 _ Dia do INSA (J.G.)
H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular
?
Portador de Hb S
??
Portadora de Hb S
Sequenciação completa
do gene HBB
8
H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular
Diagnóstico e prevenção de hemoglobinopatia
Portador
LAB
População
Caso-índice
Rastreio
(doentes e portadores)
LAB
História familiar
LAB
Rastrear parceiro
S
LAB
STOP
N
Portador?
Amniocentese ou
biópsia do córion
S
N
Doente?
Portador?
STOP
Aconselhamento
S
DPN?
N
STOP
DPN-LAB
STOP
N
Afectado?
S
IVG?
S
IVG
N
STOP
H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular
Lab./Unidade Genética Molecular
DPN de Hemoglobinopatia
-
Qualidade/Referência
- Recepção de produtos Biológico (colheitas)
> Registos
- Extracção de DNA (diferentes métodos)
> Dif. produtos biológ. (SP; LA; Vil.)
- Diferentes métodos de análise
> PCR - Dig. enzimática
Validação
> BI-PASA
interna dos
> ARMS
resultados
> Sequenciação
Lab.
Referência
?
- Leitura e Interpretação dos resultados por TDT e TSS
- Registo de resultados
- Validação final/global dos resultados
- Elaboração de relatórios directivas internacionais
- Participa em ensaios de avaliação externa da qualidade
9
H em oglobinopatias :Contributo da Gen é tica M olecular - Função Referência
- Experiência e o conhecimento acumulado ao longo dos anos necessário à função referência
- Frequência regular de cursos/acções de formação específicas patologia no âmbito da AEQ
- Acreditaç
Acreditação do Laborató
Laboratório/ensaios especí
específicos de determinado teste gené
genética molecular
- Utilização de métodos/ensaios validados; Validação interna de resultados
- Participação em reuniões internacionais de AEQ onde se estabelecem as directivas/recomendações UE
- Participação em exercícios de avaliação externa da qualidade (UK NEQAS; 2002)
- Formação no âmbito das actividades de prestação de serviços a profissionais de saúde e ensino Sec. Sup.
- Colaboração próxima com laboratório de nível 2 que permite resolver casos complexos
- Actuação como consultor/licenciamento Lab. para a validação de testes genéticos > Lab nível 2
- Colabora em investigação no âmbito do diagnóstico molecular em causa > Lab nível 2
- Organiza cursos/congressos AEQ/acções de formação de boas práticas laboratoriais a nível nacional >Ln2
Prioridade
Acreditaç
Acreditação do Laborató
Laboratório/ensaios especí
específicos de determinado teste gené
genética molecular
> Estabilizaç
Estabilização das equipas; solucionar necessidades de pessoal
> Reorganizaç
Reorganização de espaç
espaços/obras (cumprir directivas internacionais)
> Reparaç
Reparação de equipamento/substituiç
equipamento/substituição equipamento obsoleto
> Actualizaç
Actualização dos procedimentos; Impressos e Instruç
Instruções trabalho
> Operacionalidade do Programa Informá
Informático
> Aquisiç
Aquisições de consumí
consumíveis
10
AGRADECIMENTOS
> Susana Gomes
> Todos os elementos do Departamento de Genética
> Todos os elementos do Dep. Prom. Saúde e Doenças Crónicas
> Médicos
> Utentes
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