eduardo moreschi influência da inibição da enzima cox-2 no

UNIVERSIDADE SAGRADO CORAÇÃO
EDUARDO MORESCHI
INFLUÊNCIA DA INIBIÇÃO DA ENZIMA COX-2 NO
PROCESSO DE REPARO DE ENXERTOS
ÓSSEOS AUTÓGENOS INTRAMEMBRANOSOS E
ENDOCONDRAIS
BAURU
2012
EDUARDO MORESCHI
INFLUÊNCIA DA INIBIÇÃO DA ENZIMA COX-2 NO
PROCESSO DE REPARO DE ENXERTOS
ÓSSEOS AUTÓGENOS INTRAMEMBRANOSOS E
ENDOCONDRAIS
Trabalho apresentado ao Programa de
Pós-graduação em Odontologia, área de
concentração: Cirurgia e Traumatologia
Bucomaxilofaciais, da Universidade do
Sagrado Coração, como requisito para a
defesa da Dissertação de Mestrado, sob
orientação da Profa. Dra. Mariza Akemi
Matsumoto.
BAURU
2012
Moreschi, Eduardo
M8439i
Influência da inibição da enzima Cox-2 no processo de
reparo de enxertos ósseos autógenos intramembranosos e
endocondrais / Eduardo Moreschi -- 2012.
50f. : il.
Orientadora: Profa. Dra. Mariza Akemi Matsumoto
Dissertação (Mestrado em Odontologia em Cirurgia e
Traumatologia Buco-maxilo-faciais) – Universidade
Sagrado Coração – Bauru – SP.
1. Ciclo-oxigenase 2. 2. Enxertos ósseos autógenos. 3.
Imuno-histoquímica. 4. Cbfa1/Runx2. 5. VEGF. I.
Matsumoto, Mariza Akemi. II. Título.
Dedico este trabalho:
À Ana Regina,
minha querida esposa, exemplo de dedicação e perseverança.
Aos meus irmãos: Dorival , Marcos e Fernando,
por serem exemplos na minha vida.
Aos meus pais: Dorival (in memoriam) e Lucilia,
por todo amor, cuidado e carinho.
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora,Profa Dra Mariza Akemi Matsumoto. Por quem tenho
grande respeito e admiração.
Aos amigos que colaboraram no trabalho,Cláudia Biguetti, Gustavo Caviquioli e
Leandro Holgado. Sem vocês esse trabalho não seria possível.
Ao meu fiel amigo, Newton Kamei. Por todo companherismo e força nesse
período.
Ao meu amigo e irmão, Michel Zini. Pelos momentos de amizade e trocas de
conhecimento.
À direção do Centro Universitário de Maringá (CESUMAR), nas pessoas dos
magníficos reitor e vice-reitor, Prof. Wilson de Matos Silva e Prof. Wilson de
Matos Silva Filho.Por terem me apoiado nessa conquista.
“EPÍGRAFE”
“Conheça tos as teorias, domine todas as técnicas, mas ao tocar uma alma
humana seja apenas outra alma humana.”
(Carl G. Jung)
RESUMO
O sucesso das reconstruções ósseas de rebordos atróficos utilizando
enxerto ósseo autógeno em bloco, dependem basicamente da sua adequada
adaptação ao leito receptor e características do enxerto, como origem
embriológica endocondral (EC) ou intramembranosa (IM), influenciada por
diversas moléculas locais. Considerando o papel fundamental da enzima ciclooxigenase 2 (Cox-2) no reparo ósseo, o presente estudo objetivou analisar o
efeito da inibição dessa enzima no processo de incorporação de enxertos
ósseos em bloco provenientes da crista ilíaca (EC) e calvária (IM). Para tanto,
32 coelhos machos Nova Zelândia foram divididos em dois grupos: Controle
(EC e IM) – tratados com solução salina, e Anti-inflamatório - AINE (EC e IM) –
tratados com 6mg/Kg de droga anti-inflamatória não esteroidal etoricoxibe,
sendo eutanasiados nos períodos de 7, 14, 30 e 60 dias. A porcentagem de
osso neoformado na interface dos enxertos IM do grupo controle foi 14%,
quando uma marcação mais intensa do fator de transcrição osteoblástico
(Cbfa1/Runx2) foi observada, contra 4,75% do grupo AINE no período de 14
dias (P<0.05). Nenhuma diferença estatística foi detectada entre os enxertos
EC em ambos os grupos, no entanto, o grupo AINE apresentou marcação mais
intensa para Cbfa1/Runx2 nos períodos de 14 e 30 dias. Não ocorreram
diferenças na marcação do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).
Sugere-se que a inibição da Cox-2 influenciou na atividade osteogênica de
enxertos ósseos “onlay” sem, no entanto, prejudicar o reparo ósseo.
Palavras-chave: Ciclo-oxigenase 2. Enxertos ósseos autógenos. Imunohistoquímica. Ossificação intramembranosa. Ossificação endocondral.
Cbfa1/Runx2. VEGF.
ABSTRACT
Success of alveolar reconstructions using onlay autogenous block bone
grafts depends basically on their adequate integration to the recipient bed,
characteristics of the graft, from endochondral (EC) or intramembranous (IM)
embryologic origins, influenced by a number of local molecules. Considering the
fundamental role of cyclooxygenase (COX-2) in bone repair, the aim of the
present study was to analyze the effect of its inhibition in the incorporation of
iliac crest (EC) and calvaria (IM) bone grafts. Thirty two male rabbits were
divided into two groups: Control (EC and IM) –treated with saline solution, and
Nonsteroidal antiinflammatory drug - NSAID (EC and IM) – treated with
6mg/Kg - etoricoxib, to be euthanized after 7, 14, 30 and 60 days. The
percentage of new formed bone in the interface area of the IM control grafts
was of 14%, when more intense Core binding factor 1 (Cbfa1/Runx2) labeling
was registered, against 4.75% of NSAID group at day 14 (P<0.05). No
differences were detected between the EC grafts in both situations, although
NSAID group presented a more intense Cbfa1/Runx2 labeling at days 14 and
30. No Vascular endothelial growth factor (VEGF) labeling differences were
detected. It is suggested that inhibition of COX-2 influences osteogenic activity
of onlay bone grafts but does not impair their healing.
Key-words:
Cyclo-oxygenase
2.
Autogenous
bone
grafts.
Immunohistochemistry.
Intramembranous
ossification.
Endochondral
ossification. Cbfa1/Runx-2. VEGF.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................
05
2 REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................
07
2.1 ORIGEM EMBRIONÁRIA DOS ENXERTOS AUTÓGENOS........................ 07
2.2 MECANISMOS DE AÇÃO DA COX-2 SOBRE O REPARO ÓSSEO............ 10
3 OBJETIVOS....................................................................................................... 15
4 MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................
4.1 ANIMAIS................................................................................................
4.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL.............................................................
4.3 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO......................................................................
4.4 ANÁLISE MACROSCÓPICA DOS ENXERTOS.............................................
4.5 ANÁLISE MICROSCÓPICA MORFOLÓGICA................................................
4.6 ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA................................................................
4.7 ANÁLISE IMUNOHISTOQUÍMICA..................................................................
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................
16
16
16
17
19
19
20
23
24
5 RESULTADOS...................................................................................................
5.1 ANÁLISE MACROSCÓPICA DOS ENXERTOS EM BLOCO.........................
5.2 ANÁLISE MICROSCÓPICA MORFOLÓGICA DAS ÁREAS ENXERTADAS.
5.2.1 Enxerto Calota..................................................................................
5.2.2 Enxerto Ilíaco....................................................................................
5.3 ANÁLISE DA
QUANTIFICAÇÃO
ÓSSEA
POR
MEIO DE
HISTOMORFOMETRIA .................................................................................
5.4 ANÁLISE IMUNOHISTOQUÍMICA..................................................................
5.4.1 Enxerto Calota...................................................................................
5.4.2 Enxerto Ilíaco.....................................................................................
25
25
27
27
29
6 DISCUSSÃO ............................................................................................
40
7 CONCLUSÃO ..........................................................................................
43
REFERÊNCIAS..........................................................................................
44
ANEXO A - Modelo de artigo...............................................................................
55
31
33
34
37
ANEXO B – Normas de Publicação do International Journal of Oral and
Maxillofacial Surgery.......................................................................................
84
5
1 Introdução
Cirurgias realizadas nos ossos da face podem requerer o uso de enxerto
ósseo autógeno para reconstrução de deformidades congênitas ou adquiridas. O
enxerto ósseo também pode ser usado para preenchimento de defeitos em situação
“inlay” (cavidades), promover suporte estrutural em cirurgia ortognática, estabelecer
continuidade em fraturas de face ou ainda reconstruir perímetros perdidos por
tumores, traumas ou perdas funcionais em situação aposicional ou “onlay”.
Os eventos biológicos que envolvem o reparo e a incorporação dos enxertos
ósseos autógenos são parcialmente conhecidos e seguem iniciando pelo processo
inflamatório,
revascularização,
osteocondução
e
repovoamento
celular,
osteoindução, osteogênese e remodelação.1
O material utilizado para enxertia, dependendo de sua composição e origem,
pode atuar no osso receptor por meio de três mecanismos biológicos: osteogênese,
osteoindução e osteocondução.2,3,4
O único material disponível com a característica de osteogênese é o osso
autógeno.2,5 Sua capacidade de neoformar o tecido ósseo, mesmo na ausência de
células mesenquimais indiferenciadas, caracteriza esta propriedade por ser
composto de células viáveis, as quais produzem fatores de crescimento para este
fim.6
Existem inúmeros trabalhos na literatura acerca da influência das diferentes
origens embriológicas de áreas doadoras, no processo de reparo e manutenção dos
enxertos utilizados na região bucomaxilofacial, inicialmente considerando-se a micro
arquitetura do arcabouço ósseo e a quantidade de osso cortical ou medular.7,8,9,10
Atualmente, evidências apontam para diferenças moleculares e bioquímicas entre os
dois tipos de ossos, como os tipos de proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs)
predominantes11 e metaloproteases envolvidas na reabsorção óssea.12 Tais
resultados vêm demonstrando o comportamento dos enxertos ósseos autógenos
nas áreas reconstruídas, auxiliando no entendimento do clínico frente à sua conduta
quanto ao planejamento cirúrgico e previsão de manutenção.
6
Apesar destes estudos, muito ainda existe a ser descoberto no que se refere
ao entendimento da reparação das áreas de enxertia. Outras moléculas importantes
também estão envolvidas neste processo de reparo e que podem influenciar sua
dinâmica, como a cicloxigenase-2 (Cox-2). Graças às drogas anti-inflamatórias
seletivas para esta enzima, tais como: celecoxibe, rofecoxibe, lumiracoxibe,
etoricoxibe, entre outras, conhecidas por não alterarem a proteção gástrica
produzida pelas prostaglandinas geradas pela enzima Cox-1,13,14,15,16,17 pôde-se
verificar sua importância no processo de reparação do tecido ósseo, a despeito dos
efeitos colaterais que levaram muitos destes medicamentos a serem retirados do
mercado.
A osteogênese pode ser afetada pela ação de diversos mediadores químicos,
tanto hormônios sistêmicos quanto fatores locais.18 O Fator de Crescimento
Endotelial Vascular (VEGF) apresenta a propriedade de induzir a angiogênese,
sendo expressa antes da formação vascular e sua expressão ocorre no processo de
reparo ósseo está diretamente associada com células envolvidas na formação óssea
(osteoblastos).19 Cbfa1/Runx2 é um fator de transcrição, sendo uma proteína
essencial para a formação e diferenciação osteoblástica.20
Sendo assim, justifica-se investigar a ação da inibição da enzima Cox-2 no
processo de reparo de enxertos autógenos endocondral e intramembranoso,
associando a marcação das moléculas VEGF e Cbfa1/Runx2 no processo de
incorporação ao leito receptor e reabsorção, a fim de se contribuir para o
entendimento dos mecanismos biológicos nestas condições.
O presente trabalho objetivou analisar a influencia da enzima ciclo-oxigenase
2 (Cox-2) na inibição do fator de transcrição osteoblástico Core binding Factor 1
(Cbfa1/Runx2) e do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) nas regiões de
interface
entre
enxerto/leito
receptor
quando
da
utilização
de
enxertos
intramembranoso e endocondral, por meio de análise macroscópica da reabsorção
dos enxertos, análise microscópica morfológica, análise histomorfométrica e análise
imuno-histoquímica.
7
2 Revisão da literatura
2.1 Origem embrionária dos enxertos autógenos
Um dos fatores relacionado ao processo de reparo ósseo dos enxertos
autógenos que causou discordância na literatura foi a comparação de enxertos com
origens embriológicas diferentes. Smith e Abramson21, em 1974, foram os primeiros
a pesquisar o comportamento do volume destes
tecidos
após períodos
experimentais em coelhos. Realizaram um estudo comparativo com enxertos ósseos
colhidos da calota craniana, com origem intramembranosa, e enxertos endocondrais
retirados da crista ilíaca, ambos colocados subcutaneamente na bochecha e
subperiostealmente no dorso nasal, analisados em períodos de 1, 3, 6 e 12 meses,
observaram que o enxerto de origem endocondral apresentou severa reabsorção
quando comparado ao enxerto de origem intramembranosa, para todos os tempos
experimentais.
Os
achados
deste
estudo
foram corroborados
por
outras
pesquisas.7,22
Com base em achados clínicos que sugeriam a menor reabsorção dos
enxertos de origem intramembranosa em relação aos endocondrais, Zins &
Whitaker7, em 1983, realizaram um estudo comparativo utilizando como modelo
experimental macacos e coelhos. Em ambos os grupos, o osso intramembranoso
manteve seu volume de maneira mais satisfatória, sendo a perda de volume dos
enxertos de origem endocondral cerca de três vezes maior no grupo dos coelhos e
quatro vezes maior no grupo dos macacos.
Na tentativa de esclarecer o motivo pelo qual os enxertos ósseos com origem
intramembranosa mantinham maior manutenção de volume quando comparado aos
enxertos endocondrais, Kusiak et al.23, em 1985, realizaram um estudo para
avaliação da revascularização de enxertos “onlay”, através da aplicação de material
de contraste (silicone) para avaliações micro-angiográficas de enxertos ósseos
“onlay” em coelhos, nos períodos de 1, 3, 7, 14 e 21 dias . Os autores compararam
enxertos ósseos intramembranosos bi-corticais de arco zigomático com enxertos
endocondrais monocorticais de crista ilíaca, os quais foram posicionados
subperiostealmente sobre o dorso do focinho de 25 coelhos, porém sem utilização
de fixação rígida. Nesta metodologia, os autores encontraram que enxertos
8
intramembranosos
(arco
zigomático)
apresentaram
uma
maior
taxa
de
revascularização em todos os períodos experimentais, comparados aos resultados
da crista ilíaca.
Em contrapartida, trabalhos como de Phillips e Rahn24 (1990) e Sullivan e
Szwajkun9 (1991) utilizando metodologias semelhantes às de Kusiak et al.23 (1985)
observaram maiores taxas de revascularização nos enxertos com origem
endocondral.
Um estudo que elucidou se a origem embriológica pode influenciar na taxa de
revascularização foi o de Pinholt et al.25 em 1994, onde os autores estabeleceram
uma comparação de quatro áreas doadoras de enxerto ósseo distintas em sua
morfologia e origem embriológica. Neste trabalho foram utilizados enxertos
bicorticais de mesma magnitude colhidos da crista ilíaca (endocondral), calota
craniana (intramembranosa), tíbia (endocondral) e mandíbula (intramembranosa), e
todos implantados em região intramuscular de ratos. Encontraram que os ossos da
mandíbula e da crista ilíaca, que possuíam em suas estruturas maior porção de osso
trabecular, tiveram maiores taxas de revascularização frente aos enxertos da tíbia e
calvária, comprovando assim que a origem embriológica não influenciaria nas taxas
de revascularização, mas sim a quantidade de osso trabecular que estes possuem
na sua microarquitetura, o que facilitaria a penetração de vasos no interior destes
tecidos.
Avaliando a participação da revascularização na manutenção do volume de
enxertos ósseos “onlay”, Chen et al.26, em 1994, realizaram um estudo comparativo
entre enxertos oriundos da calota craniana (intramembranoso) e da crista ilíaca
(endocondral) fixados rigidamente no focinho de coelhos. Neste trabalho os autores
constataram que enxertos ósseos “onlay” com microarquitetura mais trabecular
(crista ilíaca) sofreram maiores taxas de reabsorção, mesmo com maior e precoce
revascularização. Esta relação demonstrou que o fator revascularização observado
unilateralmente pode não ser o único que defina o sucesso do enxerto ósseo em
longo prazo.
Alguns estudos demonstram que a manutenção de volume dos enxertos
ósseos “onlay” pode estar intimamente relacionada a microarquitetura e a utilização
de uma fixação rígida, contrariando a teoria da origem embriológica ser a causa que
defina o sucesso desta modalidade de reabilitação ao longo prazo.27 No estudo do
9
efeito da fixação rígida sobre a manutenção de volume dos enxertos ósseos “onlay”,
Phillips e Rahn28 (1988), Phillips e Rahn24 (1990) e Lin et al.29 (1990) demonstraram
que o processo de movimentação dos enxertos é sempre prejudicial para a
sobrevivência destes tecidos, fator este minimizado pela aplicação da fixação rígida
com uso de parafusos de titânio de 1,5 mm.
Hardesty e Marsh30 (1990) Donovan et al.31 (1993) e Chen et al.26 (1994)
avaliaram hipótese de que a microarquitetura óssea é um fator importante para a
maior sobrevida dos enxertos “onlay”. Em todos estes estudos realizaram a
comparação
entre
enxertos
ósseos
colhidos
da
calota
craniana,
com
microarquitetura mais cortical, e enxertos de crista ilíaca, os quais possuem em sua
estrutura um tecido mais trabecular. Como resultados, constataram maiores taxas de
reabsorção nos enxertos com microarquitetura mais trabecular (crista ilíaca),
chegando a porcentagens de reabsorção de 72% a 85%. Nos enxertos corticais
(calota craniana) estas taxas de reabsorção mantiveram-se entre 32% a 34 %.
Com os resultados publicados por Ozaki e Buchman32 em 1998, pôde-se
compreender que a microarquitetura dos enxertos ósseos pode ser um fator
biológico mais importante na manutenção de volume, do que a relação com sua
origem embriológica. Estes achados foram obtidos neste estudo, através da
comparação de enxertos com diferentes origens embriológicas e microarquiteturas.
Os autores avaliaram enxertos ósseos “onlay” colhidos da mandíbula de coelhos
(blocos corticais com origem intramembranosa) e enxertos colhidos da crista ilíaca
(blocos corticais e blocos trabeculares com origem endocondral), colocados abaixo
do periósteo na calvária de coelhos. Os resultados dos enxertos ósseos corticais,
tanto da mandíbula quanto da crista ilíaca, mostraram estatisticamente menores
taxas de reabsorção em relação ao enxerto trabecular da crista ilíaca. No entanto,
ao comparar a variação de volume entre os enxertos corticais (mandíbula x crista
ilíaca), os valores permaneceram muito próximos em todos os períodos
experimentais (3, 8 e 16 semanas), o que leva os autores concluírem que a origem
embriológica pode não ser um fator que defina a maior manutenção de volume dos
enxertos ósseos “onlay”.
Os dois tipos de ossos assumem um comportamento distinto durante o
processo de incorporação e reparo nas áreas reconstruídas,7,9 este fator
possivelmente pode ser atribuído às diferenças bioquímicas e moleculares
10
existentes entre ambos.
8,33,34
Suttapreyasri et al.11 (2006) através de estudo in vitro
de culturas celulares de osteoblastos provenientes dos dois tipos de ossos,
demonstraram que o reparo intramembranoso e endocondral em humanos expressa
a ação de diferentes tipos de BMPs. Neste estudo, uma análise semi-quantitativa de
PCR demonstrou que as BMPs 3, 4, 7 e 8 foram expressas mais fortemente no osso
intramembranosso em comparação com o osso endocondral. Já as BMPs 2 e 5
foram altamente expressadas no osso endocondral. Outra possível explicação para
o diferente padrão de incorporação dos dois tipos de ossos segundo Zouhary35
(2010) em humanos, seria o fato de que a densa cortical do osso proveniente da
calvária (intramembranoso) proporciona menor reabsorção dos enxertos onlay
quando comparados ao mesmo tipo de fragmento removido da crista ilíaca
(endocondral).
2.2 Mecanismos de Ação da Cox-2 sobre o Reparo Ósseo
Apesar da Cox-1 ter sido caracterizada como constitutiva por participar de
eventos fisiológicos normais e da Cox-2 ter sido descrita como resultante de reações
inflamatórias,36 pesquisas
demonstram que a enzima Cox-1 também exerce um
papel na gênese da resposta inflamatória e, por outro lado, que a enzima Cox-2
pode também participar
de importantes
eventos
fisiológicos, nem sempre
estando vinculada a processos patológicos e inflamatórios.37
A enzima Cox-2 está
38
angiotensina,
envolvida na regulação do sistema
renina-
39
Ainda, a
assim como em eventos vasoativos e antiaterogênicos.
Cox-2 tem participação hormonal na ovulação e no período final das gestações,
onde sua presença induz às contrações uterinas.40 Além disso, Okada et al.41, em
2000, também relataram que a enzima Cox-2 pode ser responsável por processos
associados ao tecido ósseo, descrevendo que camundongos com deficiência de
Cox-2 apresentaram menor densidade óssea quando comparados a animais
normais, salientando a importância desta enzima no processo de osteogênese.
A osteogênese pode ser afetada pela ação de diversos mediadores
químicos, tanto hormônios sistêmicos quanto fatores locais.18 Dentre eles, o fator de
crescimento
transformador
beta (TGF-β), que
inclui
as
proteínas
ósseas
11
morfogenéticas (BMPs), como a proteína óssea morfogenética 2 (BMP-2) e a
proteína óssea morfogenética 7 (BMP-7), age com estimulação da expressão de
colágeno tipo I nos osteoblastos, aumentando a atividade dessas
regulando a
42
calcificação da matriz óssea.
células e
Outros importantes reguladores de
formação óssea local são os fatores de crescimento derivado das plaquetas (PDGF),
fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1) e fator de crescimento dos
fibroblastos (FGF).18
As prostaglandinas (PGs) podem estimular a reabsorção óssea, sendo
também responsáveis por mediar importantes eventos relacionados ao processo de
formação e reparo ósseo.43 Os osteoblastos produzem PGs de maneira autoregulada, sendo que as PGs podem regular sua própria produção.44 A regulação da
produção de PGs pelas células ósseas pode também ocorrer através de diferentes
estímulos celulares capazes de alterar a quantidade da produção deste mediador
químico.45
As PGs podem ampliar a atividade osteoblástica e a formação óssea, agindo
positivamente na
diferenciação
destas
células.46 Os Anti-inflamatórios não
esteroidais (AINEs), por bloquearem a síntese de Cox-1 e Cox-2, reduzem a síntese
de PGs provenientes da metabolização do ácido araquidônico.47 Em função do
aumento da utilização de AINES com inibição seletiva para Cox-2, estudos recentes
têm demonstrado que a enzima Cox-2 exerce papel crucial sobre o processo
de reparo ósseo.16,48
Sato et al.48, em 1997, avaliaram a expressão das enzimas Cox-1 e Cox-2
durante a osteogênese, induzida por meio da injeção de colchicina, na cavidade
medular de
tíbias de
ratos. A expressão de Cox-1 e Cox-2 foi aumentada
imediatamente antes de ser iniciada a formação óssea. Apenas a expressão de Cox2 foi elevada novamente durante o início da formação do tecido ósseo. Ainda, a
administração diária de indometacina reduziu a indução óssea promovida pela
colchicina nas tíbias dos ratos, indicando a relação entre as PGs e a osteogênese.
Os autores concluiram que ambas as enzimas, Cox-1 e Cox-2, podem estar
envolvidas com a osteogênese, sendo que a Cox-2 apresenta essencial importância
na maturação dos osteoblastos após o inicio do processo de formação óssea.
12
Simon et al.49 (2002) administrando dois anti-inflamatórios seletivos para Cox2, o celecoxibe e o rofecoxibe em ratos, confirmaram por meio de análises
histopatológica, mecânica e radiográfica, processo de reparo inadequado em
fraturas ósseas. As mesmas deficiências foram evidenciadas nos animais que
apresentavam mutação no gene Cox-2.
Posteriormente, Brown et al.50, em 2004, compararam os efeitos do
celecoxibe aos da indometacina no reparo de fêmures de rato. Cinquenta e sete
animais foram divididos em três grupos distintos, sendo que em um deles nenhuma
droga foi administrada, em outro, os animais foram medicados com 1mg/kg de
indometacina ao dia, e no último grupo, os ratos medicados com 3mg/kg de
celecoxibe, ambos diariamente, iniciando no primeiro dia pós-operatório. Os
períodos de avaliação estabelecidos foram de quatro, oito e doze semanas após a
fratura. Foram realizadas análises radiográficas, microscópicas e de resistência
mecânica. No período de quatro semanas, os animais do grupo da indometacina
apresentaram imagem radiográfica e resistência mecânica inferiores aos demais. No
entanto, após doze semanas, nenhuma diferença significativa foi observada entre os
grupos.
O'Keefe et al.51, em 2006, constataram uma redução de 45% na formação
óssea durante a incorporação de aloenxertos ósseos congelados associados à
administração de celecoxibe após 2 semanas, aumentando para 60% após 5
semanas, na dose de 25mg/kg ao dia.
Sato et al.48, 1997, sugeriram o envolvimento da Cox-2 nos estágios iniciais
da osteoblatogênese em estudo utilizando indometacina e colchicina em ratos.
Ainda, nesta linha, Zhang et al.16, em 2002, demonstraram o papel da Cox-2 na
formação óssea endocondral e intramembranosa, comparando ratos Cox-1-/(knockout), Cox-2-/- (knockout) quando submetidos a fratura de tíbias, observando-se
a persistência de células mesenquimais indiferenciadas e redução acentuada na
osteoblastogênese nas áreas de reparo dos animais Cox-2-/- (knockout), pela
regulação
de
genes
de
diferenciação
óssea
como
Cbfa1
e
osterix.
Subsequentemente a este trabalho, Chen et al.,52 demonstraram a redução na
capacidade mecânica do osso de ratos Cox-2-/- (knockout) após reparação de fratura
no fêmur.
13
Gerstenfeld et al.53 (2003) verificando a expressão de RNAm Cox-1 durante o
processo de reparo de fraturas de fêmur em ratos, observaram que a mesma
permaneceu constante por um período de até 21 dias após o traumatismo. Contudo,
a expressão de RNAm Cox-2 apresentou-se com picos de elevação durante os
primeiros 14 dias do reparo, retornando a níveis basais por volta do 21º dia. Estes
achados comprovaram a participação da enzima Cox-2 no processo de reparo
tecidual. No mesmo trabalho, os autores também demonstraram a influência de dois
anti-inflamatórios distintos, o ketorolac e o parecoxibe no reparo de fraturas ósseas,
em altas e baixas doses. As deficiências mecânicas e microscópicas mais evidentes
foram observadas no grupo tratado com o ketorolac, uma vez comparadas ao grupo
do parecoxibe.
Diferente à estes achados, Matsumoto et al.54 (2008) utilizando ratos como
modelo experimental, confirmaram a não influência de droga seletivas para Cox-2
(celecoxibe) quando administrada em curto prazo, simulando situações pontuais,
como um procedimento cirúrgico.
Zhang et al.16 (2002) demonstraram que a Cox-2 regula importantes fatores
de transcrição, tais como Cbfa1 e Osterix, os quais exercem papel fundamental na
diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos. A presença de tais
fatores de transcrição foi estudada em culturas celulares de medula óssea derivadas
de animais desprovidos de Cox-2 e normais (sem alterações na expressão da
enzima Cox). Foi encontrada redução significativa de Cbfa1 e Osterix na cultura
celular sem Cox-2, sendo que após a administração de PGE2, a expressão destes
fatores retornou aos níveis semelhantes àqueles obtidos no grupo controle (sem
alterações na expressão da enzima Cox), ocorrendo expressão máxima destes
fatores de transcrição, quando da adição de BMP-2 à PGE2. Baseado nos
resultados, a presença de Cox-2 é importante para que haja expressão adequada
dos fatores Cbfa1 e Osterix, críticos no processo de formação óssea associada ao
reparo.16 Corroborando com tais observações, Duncan & Turner55 (1995) e
Forwood56 (1996) verificaram que a formação óssea em resposta ao estresse
mecânico é mediada pela Cox-2.
Afzal et al.57, em 2004, demonstraram por meio de análise da expressão de
mRNA, drástica diminuição do fator Cbfa1 e da proteína osteocalcina, moléculas
14
essenciais para a diferenciação osteoblástica, em osteoblastos de calvária de
camundongos neonatos com ausência desses genes. Sendo o fator de transcrição
Cbfa1 um mediador necessário para a diferenciação das células osteoblásticas, sua
expressão está relacionada à transição dos osteoblastos da fase proliferativa para a
fase de diferenciação.58
O Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) apresenta a propriedade
de induzir a angiogênese, sendo expressa antes da formação vascular e sua
expressão ocorre no processo de reparo ósseo. Está diretamente associada com
células envolvidas na formação óssea (osteoblastos), desempenhando um
importante papel neste processo de reparo.19 A inibição da atividade do VEGF
atrapalha o reparo de fraturas e defeitos criados na cortical de
fêmur em
camundongos,59 diminui fluxo sanguíneo e leva a não-uniões de fraturas no osso
radial de coelhos.60 Assim, a atividade de VEGF é essencial para a angiogênese e
adequado reparo ósseo em resposta à lesão óssea. Esses resultados dão suporte à
hipótese de que a invasão dos vasos sanguíneos tem um papel fundamental na
reparação tecidual, e sugerem que a produção do VEGF é o principal mecanismo
pelo qual a angiogênese e osteogênese estão estreitamente ligados, durante a
reparação óssea.
O VEGF regula a sobrevivência, recrutamento e atividade de células
endoteliais,61 dos osteoblastos 59 e osteoclastos, sendo sua expressão induzida pela
maioria dos fatores de crescimento osteoindutores, bem como pelas PGs.62
15
3 Objetivos
O presente estudo objetivou investigar o processo de reparo de enxertos
ósseos autógenos, sob a inibição de droga anti-inflamatória não-esteroidais
específica para Cox-2. Para isto, realizaram-se procedimentos de enxertia em
calvária de coelhos Nova Zelândia. Foram utilizados como parâmetros de análise
métodos morfológicos, morfométricos e imunoistoquímicos, conforme relacionados a
seguir:
 Quantificação da reabsorção do enxerto por meio de mensuração com
paquímetro digital;
 Padrão histopatológico das lesões coradas em H.E. e Tricrômico de Masson;
 Quantificação óssea da região de interface enxerto/área receptora por meio de
histomorfometria de área;
 Expressão das proteínas Cbfa1/Runx2 e VEGF por marcação imunohistoquímica.
 Possíveis relações entre os parâmetros acima.
16
4 Material e métodos
4.1 Animais
Todos os procedimentos envolvendo o uso de animais foram aprovados pelo
Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Sagrado Coração
(003/2009-CEEA).
Foram utilizados 32 coelhos Nova Zelândia machos, com idade variando de 4
a 6 meses de idade e peso variando de 3 a 4 Kg. Os animais foram colocados em
gaiolas de grade metálica, forradas com bandeja metálica, nas quais procedeu-se
limpeza
diariamente.
Durante
todo
o
período
experimental,
os
animais
permaneceram em biotério da Universidade, sob condições controladas de
temperatura (22 ± 2oC), umidade relativa (55 ± 10%), ciclo de luz de 12 horas
claro/escuro e exaustão, e recebendo água e ração sem restrição.
4.2 Delineamento experimental
Os animais foram distribuídos em dois grupos:
Controle – animais tratados com solução fisiológica salina (0,9%)
AINE – animais tratados com anti-inflamatório não esteroidal etoricoxibe
(Arcoxia®) na proporção de 6mg/Kg
Ambos os grupos receberam enxertos autógenos provenientes de duas áreas
doadoras: calota (intramembranoso) e ilíaco (endocondral). Os animais do grupo
AINE receberam, por via oral, a droga etoricoxibe, iniciando sua administração três
dias antes do procedimento cirúrgico, continuando com a mesma dosagem a cada
24 horas até o período de sacrifício. A medicação foi preparada em solução, a partir
da trituração dos comprimidos. Os animais do grupo controle receberam, por via
oral, solução fisiológica salina (0.9%).
Os pesos corpóreos dos animais, bem como o consumo de dieta e água
foram aferidos semanalmente. Ao final dos períodos experimentais estabelecidos: 7,
17
14, 30 e 60 dias, todos os animais foram eutanasiados para as avaliações
microscópicas. Para tanto, os animais foram anestesiados e sacrificados por meio
de sobre dosagem da droga anestésica. Os enxertos foram removidos com auxílio
de brocas tipo carburundum em baixa rotação, fixados em formalina (Merck, Rio de
Janeiro, Brasil) a 10% por 48 horas e imersas em solução de EDTA a 4% para
desmineralização dos espécimes, até que o mesmo apresente consistência
suficiente para a microtomia. As lâminas com cortes semi-seriados de 5µm de
espessura serão coradas com H.E. (hematoxilina e eosina) e Tricrômico de Masson.
4.3 Procedimento Cirúrgico
Os animais foram submetidos à anestesia geral por meio de injeção
intramuscular de sedativo Xilazina (Bayer S.A., São Paulo, Brasil) na dose de
0,30ml/Kg e de anestésico geral Quetamina (Agener União, São Paulo, Brasil na
dose de 0,20ml/Kg. Com o animal devidamente anestesiado, realizou-se a tricotomia
da região do crânio sendo executado o procedimento de antissepsia da região com
gaze embebida em solução tópica de polivinilpirrolidona-iodo a 10% (PVPI 10%).
Após a anti-sepsia, foi realizada anestesia local com cerca de 1 ml de solução de
mepivacaína 2% com adrenalina 1:100.000 (DFL, Rio de Janeiro, Brasil) para
hemostasia local. Posteriormente, realizou-se a incisão de aproximadamente 4 cm
na região de sutura craniana, seguida de divulsão mucoperiostal para exposição do
tecido ósseo a ser abordado (Figura 1 A).
Com brocas trefinas de 0,8cm de diâmetro interno (Neodent, Curitiba, Brasil)
e motor de baixa rotação (Driller, São Paulo, Brasil) com irrigação constante com
solução fisiológica estéril a 0,9%, foram realizadas duas perfurações lateralmente à
linha de incisão (Figura 1 B), alcançando, porém não abrangendo, a dura-máter
removendo-se o tecido ósseo da calota craniana (Figura 1 C). Um dos fragmentos
obtidos foi utilizado como enxertos ósseos intramembranoso em bloco e
posicionados no lado oposto às perfurações, fixados com parafusos de titânio de
1,5mm de diâmetro e 4 mm de comprimento (Neodent, Curitiba, Brasil), conforme
Miranda et al.63 Para a obtenção do enxerto endocondral, procedeu-se a abordagem
à crista ilíaca conforme Faria et al.,64 utilizando-se a mesma broca, a fim de se
manter a mesma dimensão do enxerto intramembranoso (Figura 1 D). O mesmo foi
18
igualmente fixado (Figura 1 E) e posteriormente o retalho reposicionado e realizada
a sutura espiralar contínua com fio 3-0 de poliglactina 910 Vicryl® (Johnson &
Johnson, São Paulo, Brasil).
A
B
C
D
Figuras 1 – A) Exposição do tecido ósseo da calvária; B) Área
doadora proveniente do ilíaco; C) Área doadora proveniente da calota
craniana; D) Enxertos ósseos fixados, convencionou-se lado direito:
calota e lado esquerdo: ilíaco.
Os animais receberam antibiótico (Flotril 2,5%, Schering-Plough S.A., Rio de
Janeiro, Brasil) na dose de 0,2mL/Kg (equivalente a 5mg/Kg de peso de
enrofloxacina) por cinco dias e analgésico de ação central (Tramadol 100mg) na
dose de 0,1ml/Kg imediatamente após o procedimento cirúrgico, em aplicações
intramusculares. Complementando a analgesia, administrou-se por via oral 3mg do
19
analgésico dipirona sódica diluído em soro fisiológico, a cada 12 horas durante 3
dias.
Após o procedimento cirúrgico, os animais foram alimentados com ração
sólida e água sem restrição. As eutanásias foram realizadas nos períodos de 7, 14,
30 e 60 dias por meio de sobredosagem de solução anestésica. Em cada período
foram sacrificados quatro animais, onde foi realizada nova incisão e divulsão da
região previamente operada, para obtenção dos espécimes das regiões enxertadas,
com brocas de carburundum montadas em baixa rotação, sob constante
refrigeração. As peças cirúrgicas foram acondicionadas em frascos contendo formol
a 10% tamponado (Merck), por período de 48 horas. Após este período, as peças
foram lavadas em água corrente por 24 horas, sendo imersas em desmineralizador
EDTA 10%, com trocas a cada 48 horas, até que as peças adquirissem consistência
suficiente para serem cortadas em micrótomo. Sendo posteriormente submetidas a
procedimento histotécnico de rotina e coradas em H.E. e Tricrômico de Masson.
A descrição morfológica das lesões foi realizada em todos os espécimes
considerando a região de interface entre enxerto e área doadora quanto à presença
de infiltrado inflamatório, tecido de granulação e neoformação e maturação óssea.
4.4 Análise macroscópica dos enxertos
Imediatamente após a fixação dos enxertos, foi realizada a mensuração da
sua espessura com paquímetro digital em três pontos a serem determinados. No
momento da remoção dos espécimes nos períodos estabelecidos, os mesmos foram
novamente medidos para fins de análise da quantidade de reabsorção.
4.5 Análise microscópica morfológica
Completado os delineamentos experimentais estabelecidos, procedeu-se a
descrição microscópica morfológica das áreas enxertadas em todos os espécimes
considerando padrão de reparação óssea na área de interface entre enxerto ósseo e
leito receptor, como formação de tecido de granulação, infiltrado inflamatório,
formação de tecido ósseo primário e maturação óssea.
20
4.6 Análise histomorfométrica
Para a análise histomorfométrica, empregou-se a metodologia por contagem
de pontos descrita na literatura,65,66,67,68,69,70 adaptada para o presente estudo, sendo
utilizados os cortes centrais de cada espécime corados em Tricrômico de Masson.
Para este procedimento metodológico, as imagens dos cortes histológicos das
regiões de interface entre enxerto e leito receptor, foram capturadas diretamente do
microscópio Nikon, em aumento de 40x, com uma resolução de 300 dpi.
A imagem capturada foi observada no programa de computador Microsoft
Office Power Point ®, através de slides onde a imagem é visualizada em monitor de
19 polegadas widescreen. Para a realização da contagem o retículo utilizado foi
sobreposto ao monitor (Figura 2), considerando-se os pontos dentro do osso e fora
do osso da área da interface, bem como a área total da interface para posterior
análise de densidade óssea e tratamento estatístico.
Figura 2 – Retículo posicionado sobre a imagem do corte sobre a
tela do computador.
21
Conforme visualizado na Figura 3, representativa, o sistema de retículo
adotado apresentada um total de 412 pontos dispostos de forma de traços não
coincidentes, com espaçamento de 9 mm entre cada ponto, bem como 9mm de
largura, confeccionados em folha tamanho A4 transparente. A largura adotada para
os pontos representa 10x o valor de uma célula, considerando 20 micromêtros para
cada célula, sendo que os 9mm representaram 200 micromêtros.
Figura 3 – Imagem representativa do retículo utilizado
originalmente no trabalho.
Foi avaliado um corte histológico de cada espécime, corados em Tricrômico
de Masson, sendo considerados 3 campos para cada corte histológico, conforme
demonstrado (Figura 4):
22
Figura 4 – Campos 1, 2 e 3, dispostos sequencialmente, representando a interface
entre enxerto e leito receptor de um corte histológico.
Ao final da contagem de pontos, os valores foram somados obtendo-se o
número total de pontos da interface, o número total de pontos que incidiram dentro e
fora do osso, conforme o exemplo abaixo (Figura 5):
Coelho 1 (Calota) - Grupo Controle - Período de 30 dias
Pontos Fora do Osso
Ponto dentro do Osso
Total de Pontos da Interface
Campo 1
98
154
252
Campo 2
136
79
215
Campo 3
100
226
326
Soma
334
459
793
Figura 5 – Exemplo da contagem dos pontos para análise histomorfométrica.
Dessa forma, estimou-se a porcentagem de área ocupada por tecido ósseo
seguindo a seguinte fórmula matemática, conforme Melo (2007):
A = Pt
Po
Onde A = área, Pt = total de pontos da interface e Po= total de pontos no
osso.
Posteriormente, as médias da porcentagem de matriz óssea neoformada de
cada grupo, foram obtidas considerando-se o seguinte exemplo (Figura 6):
23
Grupo Experimental aos 30 dias
Coelho
% pontos dentro do osso
1
10%
2
16%
3
25%
4
8%
média do grupo
15%
Figura 6 – Exemplo do cálculo para obtenção das médias da
porcentagem de matriz óssea neoformada de cada grupo.
4.7 Análise imuno-histoquímica
Para a determinação dos padrões moleculares seguindo a reparação óssea,
foram utilizados marcadores imuno-histoquímicos para VEGF e Cbfa1/Runx2. Desse
modo, cortes de 5µm foram tratados com proteinase K por 30 minutos, a
temperatura ambiente. A peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de
hidrogênio a 2% por 10 minutos e lavados em PBS (Phosphate buffer solution). Após
este período, foram utilizados anticorpos primários policlonais, em temperatura
ambiente por 24 horas, e lavados com PBS por 30 minutos, por três vezes. Após
isto, os cortes foram incubados com o anticorpo secundário por 30 minutos, e em
seguida, corados com o DAB (diaminobenzidina) (DAKO, Lab.) e contra-corados
com Hematoxilina de Harris. Para controle negativo foi omitido o anticorpo primário,
e para o positivo foram utilizadas lesões inflamatórias inespecíficas.
A determinação dos níveis de marcação para cada anticorpo foram realizados
semi-quantitativamente, utilizando-se escores de 1 a 4 (1 = ausente, 2 = leve, 3 =
moderado, 4 = intenso) de acordo com Pedrosa et al.71 A análise foi realizada por
dois avaliadores em sistema de duplo-cego, a partir de imagens registradas em
microscópio Nikon Eclipse (Nikon, Japão). Foram analisados 5 campos de cada
lâmina na região de interface, em aumento de 40x.
24
4.8 Análise estatística
Os resultados obtidos nas análises macroscópica e histomorfométrica dos
enxertos provenientes da calota e ilíaco foram submetidos à análise de
homogeneidade das variâncias pelo teste de Levene, seguida da análise para
amostras independentes pelo teste de Mann-Whitney.
O teste foi aplicado para
verificar a diferença existente entre os grupos controle e AINE para o mesmo
período de tempo e enxerto utilizado.
Na análise imuno-histoquímica, de acordo com o teste de Levene para análise
de variância, foram aplicados os testes para amostras independentes t-Student ou
Mann-Whitney. Os testes foram aplicados para verificar a diferença entre os grupos
controle e AINE quanto à expressão das moléculas Cbfa1/Runx2 e VEGF para o
mesmo período de tempo e enxerto utilizado. Em seguida, a diferença estatística
entre os tempos (7, 14, 30 e 60 dias) para cada grupo e cada proteína
separadamente, foi determinada pelo teste não paramétrico Kruskal-Wallis (ANOVA)
ou ANOVA seguido do teste de Tukey, segundo a homogeneidade das variâncias. O
nível de significância considerado em todas as análises foi de p≤0,05.
25
5 Resultados
5.1 Análise macroscópica dos enxertos em bloco
As médias da reabsorção óssea dos enxertos de calota e ilíaco nos grupos
controle e AINE nos períodos experimentais de 7, 14, 30 e 60 dias, podem ser
observadas nas respectivas Tabelas 1, 2, 3 e 4.
O processo de reparo dos enxertos ósseos autógenos provenientes da calota
e ilíaco, do grupo AINE, demonstrou-se similar ao grupo controle para os períodos
experimentais de 7, 14 e 30 dias (Tabelas 1, 2 e 3). A diferença estatisticamente
significatica (p<0,05) entre os grupos foi observada apenas para o enxerto
proveniente da calota no período experimental de 60 dias, sendo que o grupo AINE
apresentou menor média de reabsorção (Tabela 4). A Figura 7 demonstra a
representação gráfica das médias de reabsorção (mm) óssea dos enxertos, obtidas
após 7, 14, 30 e 60 dias em enxertos de calota e ilíaco.
Tabela 1 – Médias e desvios-padrão da reabsorção óssea obtidas após 7 dias
pós-operatório, nos enxertos de calota e ilíaco.
Grupo
Controle
AINE
Reabsorção óssea (mm)
calota
0,00± 0,00a
0,30± 0,41a
Reabsorção óssea (mm)
ilíaco
0,50 ± 0,40a
0,07 ± 0,15a
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante (p<0,05) entre os grupos.
Tabela 2 - Médias e desvios-padrão da reabsorção óssea obtidas após 14 dias
pós-operatório, nos enxertos de calota e ilíaco.
Grupo
Controle
AINE
Reabsorção óssea (mm)
calota
0,87± 0,09a
0,57± 0,29a
Reabsorção óssea (mm)
ilíaco
0,87 ± 0,47a
0,5 ± 0,00a
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante (p<0,05) entre os grupos.
26
Tabela 3 - Médias e desvios-padrão da reabsorção óssea obtidas após 30 dias
pós-operatório, nos enxertos de calota e ilíaco.
Grupo
Reabsorção óssea (mm)
calota
0,45± 0,61a
0,45± 0,1a
Controle
AINE
Reabsorção óssea (mm)
ilíaco
0,65 ± 0,62a
0,25 ± 0,20a
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante (p<0,05) entre os grupos.
Tabela 4 - Médias e desvios-padrão da reabsorção óssea obtidas após 60 dias
pós-operatório, nos enxertos de calota e ilíaco.
Grupo
Controle
AINE
Reabsorção óssea (mm)
calota
0,50± 0,24a
0,05± 0,1b
Reabsorção óssea (mm)
ilíaco
0,62 ± 0,47a
0,45 ± 0,44a
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante (p<0,05) entre os grupos.
*
Figura 7 – Representação gráfica das médias de reabsorção (mm) óssea dos
enxertos, obtidas após 7, 14, 30 e 60 dias em enxertos de calota e ilíaco.
*diferença estatística (p<0,05) observada no enxerto de calota no período
experimental de 60 dias.
27
5.2 Análise microscópica morfológica das áreas enxertadas
5.2.1 Enxerto Calota
No período de 7 dias, no Grupo Controle nota-se um tecido de granulação
ricamente vascularizado, na região de interface entre o enxerto e o leito receptor,
discreto infiltrado inflamatório mononuclear, com presença de células fibroblásticas e
finos componentes fibrosos. Focos de coágulo são visualizados neste período. Não
se visualizou atividade osteoclástica ou osteoblástica. No Grupo AINE notou-se
quadro semelhante, exceto pela presença de lacunas de Howship na superfície
externa de dois enxertos, com presença de osteoclastos. Após 14 dias, o Grupo
Controle apresentou focos de atividade osteogênica com formação de tecido
primário originado a partir de ambas as superfícies, leito receptor e enxerto ósseo.
Há predomínio desta neoformação nas áreas periféricas do enxerto com trabéculas
neoformadas interligando as duas superfícies. De permeio, ainda há presença de
tecido de granulação rico em vasos sanguíneos. Atividade osteclástica nas
trabéculas neoformadas também foram observadas. O Grupo AINE igualmente
mostrou neoformação óssea nas superfícies do enxerto e leito receptor, com
predominância de tecido conjuntivo frouxo na região central da interface. No período
de 30 dias, o Grupo Controle mostrou integração do enxerto ao leito receptor,
observando-se a presença de trabéculas ósseas ora primárias, ora em processo de
maturação onde se mostraram menos celularizadas, algumas apresentando células
de revestimento na superfície, bem como linhas basofílicas de reversão. O enxerto
de calvária mostrou-se em fase de remodelação, igualmente marcado por evidentes
linhas irregulares de reversão. Grupo AINE, com predomínio de tecido conjuntivo na
região de interface e neoformação óssea em ambas as superfícies, do leito receptor
e enxerto. Após 60 dias, os enxertos de ambos os grupos estavam integrados ao
leito receptor por tecido ósseo ainda com focos de remodelação. (Figura 8 A - D).
28
CG
CG
Rb
Rb
A
250 µm
B
CG
250 µm
CG
Rb
Rb
C
250 µm
D
250 µm
Figure 8 – Enxerto Calota – A, B) Controle – Neoformação óssea (setas) na area de
interface em A no período de 14 dias; integração do enxerto (CG) no período de 60
dias em B ao leito receptor (Rb). C, D) C- AINES – Neoformação óssea (setas) a
partir das superfícies do enxerto (CG) e leito receptor (Rb) demonstrado C no
período de 14 dias; integração do enxerto observada após 60 dias em D (A, C –
Tricrômico de Masson Masson; B, D – H&E)
29
5.2.2 Enxerto Crista ilíaca
Aos 7 dias, no Grupo Controle notou-se presença de enxerto ósseo viável
apresentando cortical externa e abundante tecido medular. A região de interface
mostrou-se preenchida por coágulo. Neste período, não se observou atividade
osteogênica. No Grupo AINE, o qual apresentou região de interface preenchida
predominantemente por tecido de granulação. Após 14 dias, o Grupo Controle exibiu
tecido medular ósseo em contato com o leito receptor, e notou-se discreta atividade
osteoclástica nas trabéculas do enxerto, bem como mínima atividade osteogênica a
partir da superfície do leito receptor. O Grupo AINE mostrou a presença de tecido de
granulação e neoformação óssea na superfície receptora. A porção externa do
enxerto também se mostrou bastante irregular. Aos 30 dias, a persistência do tecido
de granulação na interface entre enxerto e leito receptor foi observada no Grupo
Controle. Apesar de haver deposição de novo tecido ósseo sobre as trabéculas do
enxerto, não se visualiza presença de ponte óssea entre as duas superfícies,
caracterizando integração do enxerto. Observa-se remodelação do fragmento
enxertado. Já o Grupo AINE apresentou poucos sinais de remodelação do enxerto,
predominando tecido conjuntivo fibroso nas regiões centrais da interface, ainda
mostrando atividade osteogênica nas superfícies ósseas. Presença de moderado
infiltrado inflamatório mononuclear. A incorporação era mais evidente nas áreas
periféricas do enxerto. Após 60 dias, em ambos os Grupos Controle e AINE os
enxertos estavam integrados, com a persistência de tecido medular do próprio
enxerto (Figura 9 A – D).
30
IG
IG
Md
Rb
Rb
A
250 µm
B
IG
250 µm
IG
Md
Rb
Rb
C
250 µm
D
250 µm
Figure 9 – Enxerto crista ilíca – A, B) Controle – Enxerto ósseo com predomínio de
osso medular (IG) em contato com o leito receptor (Rb) no período de 14 dias em A;
após 60 dias, enxerto ósseo com manutenção de osso medular abundante (Md), em
B. C, D) AINE – enxerto ósseo com osso medular (IG) em contato com o leito
receptor (Rb) em C, no período de 14 dias; tecido ósseo medular predominante (IG)
aos 60 dias, em D, mesmo após a incorporação do enxerto. (A, C – Tricrômico de
Masson; B, D – H&E)
31
5.3 Análise da quantificação óssea por meio de histomorfometria
A quantificação óssea da região de interface enxerto/área receptora por
meio de histomorfometria dos enxertos da crista ilíaca demonstrou um padrão
similar entre os grupos Controle e Experimental nos períodos de 7, 14 e 30 dias,
não havendo diferença estatisticamente significante (p<0,05). No entanto, houve
diferença estatística entre os grupos Controle (14,0±6,29) e AINE (4,75±2,0) nos
enxertos de calota craniana, no período de 14 dias(Tabelas 5, 6 e 7). No período
de 60 dias não foi possível a contagem dos pontos devido à formação óssea na
região de interface. A figura 10 demonstra a representação gráfica da análise
histomorfométrica na região da interface em todos os grupos.
Tabela 5 - Médias e desvios-padrão da análise histomorfométrica obtida após 7
dias pós-operatório, nos enxertos de calota e ilíaco.
Grupo
Controle
AINE
Matriz óssea (%)
Calota
0,00± 0,00a
0,00± 0,00a
Matriz óssea (%)
Ilíaco
0,00 ± 0,00a
0,00 ± 0,00a
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante (p<0,05).
Tabela 6 - Médias e desvios-padrão da análise histomorfométrica obtida após
14 dias pós-operatório, nos enxertos de calota e ilíaco.
Grupo
Controle
AINE
Matriz óssea (%)
Calota
14,00± 6,29a
5,00± 2,00b
Matriz óssea (%)
Ilíaco
1,00 ± 2,00a
0,00 ± 0,00a
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante (p<0,05).
32
Tabela 7 - Médias e desvios-padrão da análise histomorfométrica obtida após
30 dias pós-operatório, nos enxertos de calota e ilíaco.
Grupo
Controle
AINE
Matriz óssea (%)
Calota
18,00± 16,00a
6,00± 5,00a
Matriz óssea (%)
Ilíaco
7,00 ± 3,00a
8,25 ± 3,40a
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante (p<0,05).
Figura 10 – Representação gráfica da análise histomorfométrica na região da
interface de todos os grupos
33
5.4 Análise imuno-histoquímica
Os resultados da análise imuno-histoquímica semi quantitativa estão
demonstrados na Tabela 8, onde se observam os escores médios referentes à
imunomarcação de cada anticorpo nos diferentes períodos e grupos.
Tabela 8 – Médias dos escores da imuno-histoquímica para Cbfa1/Runx2 e fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF) nos diferentes grupos e
períodos.
Grupo
Enxerto
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
AINE
AINE
AINE
AINE
AINE
AINE
AINE
AINE
Calota
Calota
Calota
Calota
Ilíaco
Ilíaco
Ilíaco
Ilíaco
Calota
Calota
Calota
Calota
Ilíaco
Ilíaco
Ilíaco
Ilíaco
Período
(dias)
7
14
30
60
7
14
30
60
7
14
30
60
7
14
30
60
Cbfa1/Runx2
VEGF
4
4
4
3
4
4
4
2
4
4
4
3
3
4
4
3
4
4
4
3
4
4
4
3
4
4
4
4
4
4
4
4
Escores de 1 a 4 (1 = ausente, 2 = leve, 3 = moderado, 4 = intenso) de acordo com Pedrosa et al.71
34
5.4.1 Enxerto Calota
Um padrão similar de marcação imuno-histoquímica para Cbfa1/Runx2 foi
observada entre os Grupos Controle e AINE para o enxerto de calota craniana.
Intensa marcação citoplasmática foi observada nos períodos de 7, 14 e 30 dias para
todos os grupos, nas células fibroblásticas do tecido de granulação e nas células
osteoblásticas, relacionadas com atividades osteogênicas e de maturação. Houve
diferença estatística (p<0,05) apenas entre o período de 14 dias (4,00±0,00), com
marcação mais intensa nesse período, e o período de 60 dias do Grupo Controle,
quando a marcação tornou-se moderada (3,00±0,00). No Grupo AINE, nenhuma
diferença estatística foi encontrada, com a persistência de uma marcação intensa do
anticorpo. A imunoexpressão citoplasmática de VEGF também foi intensa no Grupo
Controle, sendo marcado em osteoblastos e células endoteliais a partir do período
de 14 dias. Não foram detectadas diferenças estatísticas entre os períodos. Da
mesma forma, uma intensa marcação foi observada no Grupo AINE em todos os
períodos avaliados (Figura 11 A - D). Os resultados da imunomarcação são
mostrados nas Tabelas 9 e 10.
35
VEGF
Runx-2
Ob
Ob
A
100 µm
B
100 µm
VEGF
Runx-2
Figura 3 – A, B) Calvarial Control Group – Intense osteoblasts (Ob) Runx-2 and VEGF
labeling at day 14; C, D) NSAID Group - Weak Runx-2 labeling at day 60 in the cells of
connective tissue, in C (arrow), and persistant intense VEGF labeling at the same period
C
100 µm
D
100 µm
Figura 11 – A, B) Calota Grupo Controle – Intensa marcação de Runx-2 e VEGF em
osteoblastos (Ob) no período de 14 dias; C, D) Grupo AINE – Fraca marcação para
Runx-2 nas células do tecido conjuntivo, no período de 60 dias, em C (seta), e
persistência de intensa marcação para VEGF nesse mesmo período em D
Tabela 9 – Médias e desvios padrão obtidas para expressão de Cbfa1/Runx2 em
cada grupo e período, para enxerto proveniente de calota.
Períodos
7 dias
14 dias
30 dias
60 dias
Controle
3,60±0,54 A,a,b
4,00±0,00 A,a,b,c
3,60±0,54 A,a,b
3,00±0,00 A,a,b,d
AINE
3,80±0,44 A,a
4,00±0,00 A,a
3,80±0,44 A,a
3,40±0,54 A,a
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante (p<0,05).
Letras maiúsculas: comparação em cada período experimental (linha)
Letras minúsculas: comparação no grupo no decorrer dos períodos (coluna)
36
Tabela 10 - Médias e desvios padrão obtidas para expressão de VEGF em cada
grupo e período, para enxerto proveniente de calota.
Períodos
7 dias
14 dias
30 dias
60 dias
Controle
3,80±0,44 A,a
4,00±0,00 A,a
4,00±0,00 A,a
3,20±0,83 A,a
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante (p<0,05).
Letras maiúsculas: comparação em cada período experimental (linha)
Letras minúsculas: comparação no grupo no decorrer dos períodos (coluna)
AINE
4,00±0,00 A,a
4,00±0,00 A,a
4,00±0,00 A,a
4,00±0,00 A,a
37
5.4.2 Enxerto Crista Ilíaca
A imunomarcação para Cbfa1/Runx2 uma tendência de ser mais intensa nos
períodos de 14 e 30 dias no Grupo Controle, especialmente nas células próximo as
regiões mais vascularizadas e células osteoblásticas envolvidas na síntese de novo
tecido ósseo, embora, não houve diferença estatística. Aos 60 dias, a marcação
mostrou-se fraca nas células da porção medular da região da interface, havendo
diferença estatística dos demais períodos experimentais. Diferentemente, o Grupo
AINE exibiu forte marcação em todos os períodos analisados, incluindo o período
mais tardio de 60 dias, possivelmente devido ao atraso no processo de neoformação
óssea observado na microscopia morfológica, no entanto, havendo diferença
estatística entre o período de 60 dias quando comparado com 14 e 30 dias.
Coerentemente, a expressão de VEGF foi intensa em osteoblastos e células
endoteliais a partir do dia 14 em enxertos do Grupo Controle, tornando-se menos
intensa no período de 60 dias. O Grupo AINE apresentou marcação intensa durante
todos os períodos. (Figura 12; Tabelas 11 e 12)
38
VEGF
Runx-2
*
A
100 µm
Runx-2
B
100 µm
VEGF
*
Ad
d
C
100 µm
D
100 µm
Figura 12 – A, B) Fraca imunomarcação do enxerto da crista ilíca no Grupo Controle no
período de 60 dias (setas); C, D) Marcação intensa no Grupo AINES para o mesmo período
na células medulares (setas) e do tecido conjuntivo(*)
Tabela 11 - Médias (± desvio padrão) obtidas para expressão de Cbfa1/Runx2 em
cada grupo e período, para enxerto proveniente do ilíaco.
Períodos
7 dias
14 dias
30 dias
60 dias
Controle
3,60±0,54 A,a
3,60±0,54 A,a
3,80±0,44 A,a
2,20±0,44 A,b
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante (p<0,05).
Letras maiúsculas: comparação em cada período experimental (linha)
Letras minúsculas: comparação no grupo no decorrer dos períodos (coluna)
AINE
3,40±0,54 A,a
4,00±0,00 A,a,b
4,00±0,00 A,a,c
3,00±0,00 A,a
39
Tabela 12 - Médias (± desvio padrão) obtidas para expressão de VEGF em cada
grupo e período, para enxerto proveniente do ilíaco.
Períodos
7 dias
14 dias
30 dias
60 dias
Controle
3,80±0,44 A,a
3,80±0,44 A,a
3,60±0,54 A,a
3,00±0,00 A,a
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante (p<0,05).
Letras maiúsculas: comparação em cada período experimental (linha)
Letras minúsculas: comparação no grupo no decorrer dos períodos (coluna)
AINE
3,80±0,44 A,a
3,80±0,44 A,a
3,80±0,44 A,a
4,00±0,00 A,a
40
6 Discussão
Um grande número de pesquisas têm sido desenvolvidas sobre a
interferência dos
defeitos ósseos
AINEs COX-2 específicos sobre reparos de fraturas ósseas e
49, 51, 72
. Neste sentido, a enzima COX-2 foi escolhida como o objeto
de estudo do presente trabalho. Sabe-se que, após a comercialização dos coxibes,
patologias
crônicas
músculo-esqueléticas,
tais
como
artrite
reumatóide
e
73
osteoartrite, foram rotineiramente tratadas com esse tipo de droga . No entanto, há
uma falta de investigações sobre a influência destas drogas durante a incorporação
de enxertos ósseos autógenos provenientes da crista ilíaca e calota craniana,
portanto de diferentes origens embriológicas.
Os dados obtidos a partir dos efeitos de AINES COX-2 específicos,
mostraram que os enxertos intramembranosos e endocondrias responderam de
maneira diferente frente à inibição da enzima COX-2, sugerindo que a sua
expressão seja distinta nesses ossos. Resultados observados a partir da análise
microscópica revelaram um atraso no reparo de enxertos da crista ilíaca, mesmo
sem a administração da droga, em comparação com os enxertos da calota craniana,
especialmente no período de 14 dias, quando esperava-se a presença de trabéculas
ósseas na área de interface entre o leito receptor e o enxerto. Nos enxertos
endocondrais, uma constituição principalmente medular foi observada, na qual, a
osteogênese ocorreu em continuidade com as trabéculas do enxerto. Para alguns
clínicos, esta característica física da crista ilíaca oferece uma melhor qualidade para
a interligação da matriz de osso neoformado e a superfície esponjosa do enxerto,
considerando-se uma vantagem para uma melhor incorporação. Esta situação não
foi totalmente constatada em nosso estudo, uma vez que mesmo no período de 30
dias, observou-se uma ausência de pontes ósseas na região central da interface,
apesar da presença de osso neoformado na superfície das trabéculas. No entanto,
há que se ressaltar, que em humanos os enxertos removidos da região de crista
ilíaca embora reservem as mesmas características estruturais deste modelo
experimental, são notavelmente maiores aos utilizados no presente trabalho.74 Este
fator deve ser considerado à eventual comparação com impressões clínicas
divergentes do exposto acima.
41
No presente estudo, verificou-se que as características físicas da
superfície interna da cortical dos blocos da calota craniana permitiram uma melhor
adaptação ao leito receptor, sendo esta uma das possíveis razões que pode ter
contribuído para uma integração mais rápida quando comparado com o da crista
ilíaca, cuja superfície de contato é esponjosa e irregular. A influência desta diferença
estrutural está em conformidade com a literatura
7, 9, 23
. Ainda, o comportamento
distinto durante o processo de incorporação e reparo nas áreas reconstruídas com
os dois tipos de ossos,7,9 pode ser atribuído às diferenças bioquímicas e moleculares
existentes entre ambos.8,33,34
A maioria dos estudos disponíveis sobre a influência da COX-2 no processo
de reparo ósseo foram realizados em defeitos ósseos e fraturas criados
artificialmente
16, 75
. No entanto, o processo de reparo de um enxerto em bloco é
diferente de um defeito ósseo ou uma fratura, uma vez que a consolidação é
dependente de um grande número de fatores, tais como o tempo de latência entre a
remoção do enxerto e a sua adaptação, o tipo de osso, imobilização do fragmento,
características do leito receptor, revascularização do enxerto, recrutamento de
células responsáveis pela reabsorção do osso enxertado promovendo a sua
substituição por um novo osso, e também de capacidades técnicas do cirurgião, tais
como a qualidade da adaptação do bloco ósseo no leito receptor. Deste modo, a
necessidade de mais estudos considerando estes fatores é evidente, pois além das
diferenças existentes entre os enxertos e tipos de defeitos, as diferenças na
posologia de drogas, modelo experimental, o tipo de lesão óssea, bem como as
metodologias utilizadas para a análise, podem levar à controvérsias quando os
estudos são comparados 74, 76. A administração prolongada do AINE foi instituída no
presente estudo, já que há sugestões de que a curto prazo a inibição da COX-2 não
interfere significativamente no reparo ósseo 54.
Apenas dois operadores calibrados foram responsáveis pelos procedimentos
cirúrgicos, e a medicação foi administrada pelo mesmo colaborador. Dificuldades na
administração do fármaco relatadas por Hak et al. (2011)75 foram contornadas pela
adição de uma essência de morango à solução da droga eterocoxib, não alterando a
eficácia da droga, ficando os animais mais atraídos pela medicação, com mínimo
42
estresse durante a administração. Esses cuidados foram tomados, a fim de diminuir
as variáveis que poderiam alterar os resultados. Os parafusos de titânio foram
removidos após desmineralização dos espécimes, e nenhum deslocamento dos
blocos foi detectado durante esta manipulação ou no momento da remoção dos
espécimes.
A imunomarcação de Cbfa-1/Runx-2
nos
enxertos
endocondrais
e
intramembranosos do Grupo Controle foram coerentes com a análise histológica,
mostrando intensa expressão até o período de 30 dias, tornando-se fraca no último
período.
Inicialmente,
uma
melhor
manutenção
do
volume
de
enxertos
intramembranosos pode ser atribuídade à uma revascularização precoce do osso,
como mostrado em estudos com diferentes modelos animais7, 23, 28.
Atualmente, uma dúvida se torna evidente, especialmente pelos resultados do
comportamento clínico em seres humanos da utilização de enxertos endocondrais e
intramenmbranosos, quando a integração de enxertos endocondrais parece ser mais
estável e uniforme, ao contrário dos resultados do presente estudo e de outros na
literatura . Diante dessa divergência, Zins et al.77 corrobora enfatizando a falta de
estudos consistentes que possam responder determinadas perguntas, como se o
aumento na revascularização do enxerto intramembranoso melhoraria a manutenção
do volume ósseo ou, por outro lado, se uma revascularização tardia poderia retardar
sua reabsorção. A nível molecular, a rápida expressão do inibidor tecidual o
metaloproteinase-1 (TIMP-1) nos enxertos intramembranosos, explica o processo de
revascularização precoce, quando comparado aos enxertos endocondrais78. No
entanto, não apenas as diferenças no tipo de osso utilizado devem ser
consideradas, uma vez que o modelo animal deve ter influenciado estes resultados e
um protocolo uniforme ainda não foi estabelecido para este tipo de análise. Além
disso, as características do leito receptor variam em pacientes humanos,
dependendo do local anatômico e qualidade do osso do rebordo.
43
7 Conclusão
Considerando-se as limitações do presente estudo, os resultados obtidos
permitiram as seguintes conclusões:

Observou-se padrão de reabsorção distinto para cada tipo de osso,
intramembranoso e endocondral, com menor reabsorção do enxerto
proveniente da calota;

Houve melhor incorporação dos enxertos de calota quando comparados com
os enxertos da crista ilíaca;

A quantificação óssea da região de interface enxerto/área receptora por meio
de histomorfometria demonstrou-se mais no grupo Controle, apenas nos
enxertos de calota craniana e no período de 14 dias;

A inibição da enzima Cox-2 não interferiu de maneira significativa na
marcação de Cbfa1/Runx2 e VEGF durante o processo de reparo de enxertos
provenientes da calota e ilíaco.
44
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