CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE AQUICULTURA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA
Weissella cibaria e sua ação probiótica no trato intestinal de surubins
híbridos
Dissertação apresentada como requisito
a obtenção do título de mestre em
Aquicultura, Centro de Ciências
Agrárias, Universidade Federal de Santa
Catarina.
Orientador: José Luiz Pedreira Mourino
Gabriel Fernandes Alves Jesus
Florianópolis
2014
Weissella cibaria e sua ação probiótica no trato intestinal de
surubins híbridos
Por
GABRIEL FERNANDES ALVES JESUS
Esta dissertação foi julgada adequada para a obtenção do título de
MESTRE EM AQUICULTURA
e aprovada em sua forma final pelo Programa de
Pós-Graduação em Aqüicultura.
_____________________________________
Prof. Alex Pires de Oliveira Nuñer, Dr.
Coordenador do Programa
Banca Examinadora:
__________________________________________
Dr. José Luiz Pedreira Mourino – Orientador
__________________________________________
Dra. Cleide Rosana Werneck Vieira
__________________________________________
Dra. Débora Machado Fracalossi
__________________________________________
Dr. Evoy Zaniboni Filho
“... isso é só o fim...”.
Marcelo Nova
AGRADECIMENTOS
À minha família, meus pais e meu irmão, por todo apoio, investimento,
educação e carinho ao longo desses anos,
À minha namorada e amada Sthefanie Caroline Medeiros, por toda
paciência, apoio, carinho, alegrias e momentos perfeitos.
Ao sempre presente orientador e amigo Prof. José Luiz P. Mouriño, por
todo o apoio, ensinamentos, bagunças, confiança, esforços, conselhos e
ajudas ao longo desses 6 anos de amizade e convívio.
Ao coorientador e amigo de braçadas e travessias, Prof. Mauricio
Laterça Martins, por todos os momentos ao longo do curso.
Ao Prof. Felipe do Nascimento Vieira por toda a amizade, brincadeiras,
conselhos, ensinamentos e puxões de orelha ao longo dessa formação.
Aos amigos Bruno Correa da Silva e Adolfo Jatoba pela amizade,
ensinamentos, paciência, brincadeiras e confiança desde os primeiros
dias de LCM.
Ao Prof. Walter Quadros Seiffert, por todo o apoio, a confiança,
amizade e conselhos.
Aos amigos do setor de microbiologia, Gabriella P, Gabriela S., Norha,
Mariana, Jessica, Karine, Scheila, Esmeralda, Juliana, Marysol, Josy,
Marcela, Marco, Marcola, pelos inúmeros momentos de risadas, de
trabalho em grupo, e experimentos.
Aos amigos Marcello e Efrayn por todo apoio, confiança, conselhos,
roubadas, parcerias, bagunças, e pelos, sempre, bons momentos.
Aos amigos de graduação e principalmente Robert Santos, Lucas W.
Miranda e Japaaaa, por todos os momentos que tornam a vida
acadêmica uma das melhores, e com certeza a amizade continuará ao
longo da vida.
A empresa Mar e terra, por todo suporte técnico e financeiro concedido;
Ao LAMAR e principalmente aos Profs. Zenilda Laurita Bouzon e Éder
Carlos Schimdt, pela parceria e por todo o suporte, estrutura e apoio
para realização das análises de microscopia.
Ao LCME por todo o suporte e apoio dos técnicos para realização das
análises de microscopia eletrônica.
Ao LAPAD pela parceria dos técnicos e alunos, além do fornecimento
da ração para o experimento.
Ao NEPAQ pela estrutura e apoio para realização do experimento.
Ao LCM por ter sido minha “casa” ao longo desses anos.
Aos funcionários e amigos do LCM, em especial David, Ilson, Carlos,
“o gaudério” Carlos Biólogo, Rafael biólogo, Seu Xico e Dimas, por
toda a convivência e trabalho duro nesses anos de LCM.
Enfim a todos que de alguma forma contribuíram para que eu chegasse
aqui.
RESUMO
O presente trabalho objetivou avaliar os efeitos da suplementação da
bactéria probiótica Weissella cibaria no trato intestinal e na saúde de
surubins híbridos (Pseudoplatystoma corruscans ♂ e P. reticulatum♀).
Os 96 peixes foram distribuídos em 12 tanques circulares de 100 L, em
sistema de recirculação de água. Os peixes foram alimentados com 3%
da biomassa total durante 45 dias, sendo os peixes do tratamento
alimentados com ração comercial suplementada com probiótico, e os
peixes do grupo controle com ração comercial sem suplementação. O
número de eritrócitos totais, trombócitos e linfócitos se apresentaram
maiores nos peixes alimentados com a suplementação probiótica
(p<0,05). A porcentagem de fagocitose, o título aglutinante e a
concentração total de imunoglobulinas foram maiores nos peixes
alimentados com a suplementação probiótica (p<0,05). Através de
técnicas de microscopia de luz e eletrônica, foi possível verificar a
alteração na microbiota autóctone dos peixes, além do incremento,
daqueles que receberam suplementação probiótica, no comprimento e
largura das vilosidades intestinais, do número de células caliceformes
por vilo, além do perímetro dessas vilosidades. A bactéria W. cibaria foi
capaz de colonizar e alterar a microbiota intestinal, assim como sua
ultraestrura, além de modular os parâmetros hemato-imunológicos.
Palavras-chave: Trato intestinal, Pseudoplatystoma, bactéria ácidolática, ração, colonização, probiótico.
ABSTRACT
This study aimed to evaluate the effects of supplementation of probiotic
bacteria in the intestinal tract Weissella cibaria and health hybrid
surubins (Pseudoplatystoma corruscans ♂ e P. reticulatum♀ ). The 96
fish were distributed into 12 circular tanks of 100 L in water
recirculation system. The fish were fed 3% of the total biomass for 45
days, the fish treatment fed commercial feed supplemented with
probiotics, and fish from the control group with commercial feed
without supplementation. The total number of erythrocytes,
thrombocytes and lymphocytes presented higher in fish fed the probiotic
supplementation (p<0.05). The percentage of phagocytosis, the
agglutination title and the total concentration of immunoglobulins were
higher in the fish fed the probiotic supplementation (p <0.05). Through
techniques of light and electron microscopy, we observed the change in
the indigenous microbiota of fish, plus the increment, by supplemented
animals with probiotics, the length and width of the villi, the number
goblet cells per villus, beyond perimeter of these villis. It was possible
to verify the ability of the bacteria to colonize and W. cibaria alter the
intestinal microbiota, as well as its ultrastructure, and modulate the
hemato-immunological parameters.
Key words: Gut alterations, health status, probiotic, Pseudoplatystoma,
ration.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Esquema de seleção de bactérias probióticas (Adaptado de
Ray et al. (2012). ................................................................................... 26
Figura 2: Complexo responsável por inativar ou ativar a transcrição
de genes alvo, como exemplo a produção de toxinas. Adaptado de
Defoirdt et al. (2004) ............................................................................. 45
Figura 3: Alterações na ultraestrutura intestinal de surubins híbridos
alimentados ou não com suplementação probiótica, durante 45 dias.
Em (A,B,C) Grupo controle em Microscopia de Luz (ML),
Microscopia eletrônica de varredura (MEV) e Microscopia eletrônica
de transmissão (MET) respectivamente; (D,E,F) Grupo probiótico
em ML, MEV, MET, respectivamente. cc células caliceforme, li
linfócitos infiltrados, l lúmen, m mucosa, be borda em escova, b
bacilos, bc bacilococcos, e enterócitos, mv microvilosidades, cd
células de defesa......................... ........................................................... 71
Figura 4: Alterações na microbiota intestinal de surubins híbridos
alimentados (Probiótico) ou não (Controle) com suplementação
probiótica, durante 45 dias, utilizando microscopia eletrônica de
varredura (MEV). Verifica-se (aumento 1.500 x) bactérias com
morfologia de bacilos no Controle e bactérias do gênero bacilococos
no tratamento probiótico. Nota-se também uma maior concentração
de bactérias no tratamento probiótico quando comparado ao
Controle..... ............................................................................................ 72
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Parâmetros hematológicos de surubins híbridos
(Pseudoplatystoma corruscans x P. reticulatum) alimentados durante
45 dias com ração comercial suplementada com probiótico ou sem
suplementação (Controle)...................................................................... 69
Tabela 2: Título aglutinante e atividade antimicrobiana do plasma de
surubins híbridos (Pseudoplatystoma corruscans x P. reticulatum)
alimentados durante 45 dias com ração comercial suplementada com
probiótico ou sem suplementação. ........................................................ 69
Tabela 3: Comprimento e largura das vilosidades, do número de
vilos e de células caliceformes, e do perímetro e área, de surubins
híbridos alimentados ou não com suplementação probiótica durante
45 dias. .................................................................................................. 70
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 ................................................................................ 19
Revisão: Probióticos na aquicultura ................................................. 19
1.
Introdução .............................................................................. 21
2.
Critérios de Seleção de microorganismo probióticos para
aquicultura ............................................................................. 24
3.
Testes in vitro ......................................................................... 27
3.1.
Isolamento das cepas ............................................................. 27
3.2.
Espécies de microorganismos utilizados como probióticos .. 28
3.3.
Antagonismo entre cepas probióticas .................................... 28
3.4.
Formação de esporos ............................................................. 30
3.5.
Crescimento em diferentes concentrações de pH e
resistência à sais biliares ....................................................... 30
3.6.
Resistência a diferentes temperaturas.................................... 31
4.
Testes in vivo ......................................................................... 31
5.
Modo de ação ......................................................................... 33
6.
7.
5.1.
Colonização da microbiota intestinal .................................... 33
5.2.
Inibição competitiva .............................................................. 34
5.3.
Fonte de nutrientes e enzimas digestivas .............................. 34
5.4.
Produção de compostos inibitórios........................................ 38
Imunomodulação .................................................................... 40
6.1.
Efeito nas células imunológicas da mucosa intestinal ........... 40
6.2.
Interação com células imunes ............................................... 41
6.3.
Interferência do quorum sensing ........................................... 44
Biorremediação de água e solo ................................................. 46
JUSTIFICATIVA .......................................................................... 48
OBJETIVOS.................................................................................. 49
HIPÓTESE .................................................................................... 49
CAPÍTULO 2 .................................................................................50
Weissella cibaria e sua ação probiótica no trato intestinal de surubins
híbridos ..................................................................................50
1.
Introdução...............................................................................52
2.
Material e Métodos ..................................................................53
3.
2.1.
Material biológico e manutenção .......................................... 53
2.2.
Preparo do inóculo de probiótico e dietas experimentais ...... 54
2.3.
Delineamento experimental .................................................. 54
2.4.
Análises hemato-imunológicas ............................................. 55
2.5.
Histologia .............................................................................. 57
2.6.
Microscopia eletrônica de transmissão (MET) ..................... 57
2.7.
Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ........................ 58
2.8.
Ganho de peso e sobrevivência ............................................. 58
2.9.
Análises estatísticas .............................................................. 58
Resultados ..............................................................................58
3.1.
Parâmetros hematológicos .................................................... 58
3.2.
Parâmetros imunológicos ...................................................... 58
3.3.
Colonização do trato intestinal .............................................. 59
3.4.
Histomorfometria intestinal .................................................. 59
3.5.
Ganho em peso e sobrevivência ............................................ 60
4.
Discussão................................................................................60
5.
Conclusão ...............................................................................62
6.
Agradecimentos ......................................................................62
7.
Referências .............................................................................62
8.
Referências da introdução geral ................................................73
CAPÍTULO 1
Revisão: Probióticos na aquicultura
21
1. Introdução
A Aquicultura mundial se destaca como umas das principais
atividades na produção de alimentos. A produção aquícola mundial
alcançou o valor recorde em 2010, em 60 milhões de toneladas
(excluindo plantas aquáticas e produtos não alimentares), com um valor
estimado total de $ 119.000.000.000. Em 2010, a produção mundial de
peixes cultivados foi de 59,9 milhões de toneladas, um aumento de
7,5%, quando comparado com 55,7 milhões de toneladas em 2009
(FAO, 2012). Neste cenário, destaca-se a piscicultura continental que
apresentou em 2011 uma produção de 35.596.862 t, 33,7% superior do
que em 2007 onde produziu 26.621.449 t (Fao, 2013). No Brasil a
piscicultura continental apresentou em 2011, cerca de 541.151 t de
pescado, 160% superior a produção de 2007.
A produção aquícola mundial está em constante expansão. Entre
os peixes mais cultivados no país em águas continentais, a tilápia e as
carpas são as de maior importância, juntas somaram 63,4% da produção
nacional de pescado em 2010, seguidas dos peixes redondos nativos
tambaqui (Colossoma macropomum), pacu (Piaractus mesopotamicus),
pirapitinga (Piaractus brachypomus) e seus híbridos, os quais
representaram juntos 24,6% da produção (Brasil, 2010).
À medida que se pretende aumentar a produção seja em pequena
ou larga escala, um quesito importante a ser observado é biossegurança.
Grandes mortalidades de peixes são observadas quando há a
intensificação da produção. A ocorrência de enfermidades tem como
principal fator o desequilíbrio do triângulo epidemiológica patógenohospedeiro-meio ambiente, que consequentemente diminui a capacidade
imunológica dos animais, além de deteriorar a qualidade da água do
cultivo, favorecendo assim o desenvolvimento de doenças (Lizama et
al., 2007).
Durante estes surtos, diversos agentes químicos podem ser
utilizados como tratamentos profiláticos e remediadores às
enfermidades, tais como ácido acético, amônia quaternária, cal, cloreto
de sódio, formol, iodo, metrifonato, sulfato de cobre, verde malaquita,
ácido oxolínico, sulfamerazina, sulfato de magnésio e especialmente os
antibióticos. Estes últimos, diversas vezes, são utilizados
indiscriminadamente e de maneira errônea (Eler e Millani, 2007).
O uso inadequado destes agentes normalmente ocorre quando não
se conhece o agente causador do surto de enfermidade e/ou mortalidade,
obrigando produtores a utilizar antibióticos com grande espectro de
22
atuação. Os agentes podem ser tanto bactérias Gram-positivas, quanto as
Gram-negativas, além de alguns protozoários. Medidas inadequadas
podem provocar a seleção e a resistência dos patógenos (Klaenhammer
e Kullen, 1999), além de serem uma fonte de poluição ambiental (Boyd
e Massaut, 1999) e prejudicarem a comercialização e saúde humana
(Sapkota et al., 2008). Aliando este problema aos resíduos deixados na
carne dos animais, diversos países baniram o uso de antibióticos em
cultivos. A União Europeia proibiu, a partir de janeiro de 2006, o uso de
antibióticos na produção animal (Luckstadts, 2006). No Brasil, o
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA, 2013) já
proibiu o uso de diversos antibióticos; clorafenicol e nitrofuranos (IN nº
09, 27/06/2003), quilononas e sufonamidas (IN nº 26, 9/07/2009),
espiramicina e eritromicina (IN nº 14, 17/05/2012); como aditivo
alimentar na produção animal. Dessa forma, cada vez mais a profilaxia
se torna um item essencial nas pisciculturas e boas práticas sanitárias
devem ser incorporadas pelos produtores para possibilitar o equilíbrio
do cultivo.
Dentre as práticas sanitárias alternativas, destaca-se a utilização
de aditivos alimentares, como os probióticos, que auxiliam no aumento
da capacidade imunológica dos peixes. Probiótico é uma palavra
derivada do grego que significa a favor da vida, porém desde de 1965 o
uso de seu termo vem sendo continuamente revisto. A definição mais
aceita em estudos animais aquáticos é que probióticos são microorganimos vivos que quando ministrados, colonizam o trato intestinal,
regularizando a flora, competindo com agentes patogênicos e
estimulando o sistema imunológico (Gatesoupe, 1999).
Atualmente no mercado encontramos diferentes fórmulas
comerciais de probióticos testadas e utilizadas em peixes. Porém
observa-se que probióticos isolados de outros animais ou em espécies de
peixes que não sejam o alvo, podem apresentar resultados controversos,
sendo necessário o isolamento e desenvolvimento de probióticos
espécie-específicos, ou seja, probióticos autóctones (Mourino, 2010). O
sucesso da utilização dos probióticos se dá pelo seu potencial de
competição e colonização do intestino, assim a influência de fatores
bióticos e abióticos sobre o microambiente do trato grastrointestinal
resulta na alteração de crescimento dos microorganismos (Gatesoupe,
1999b).
Diferentes microorganismos são usados como probiótico em
piscicultura: bactérias ácido-láticas como Lactobacillus sp., bactérias
esporuladas como Bacillus sp., bactérias gram negativas como
Pseudomonas sp., Vibrio sp. e Aeromonas sp. e leveduras. Contudo,
23
bactérias como Pseudomonas sp. e Vibrios sp. podem ser
potencialmente patogênicas para alguns peixes. Adicionalmente,
bactérias do Gênero Bacillus são utilizadas em formulações comerciais
já que além de produzirem compostos inibitórios durante a esporulação
podem ser facilmente incorporadas nas dietas por possuirem maior
resistência devido aos esporos. Contudo, algumas cepas podem se tornar
patogênicas, causando mortalidades no cultivo (George et al., 2005).
Portanto, é necessário realizar a caracterização fenotípica e, se possível,
molecular a fim de se determinar a existência de patogenicidade do
microorganismos para a espécie cultivada.
A utilização de bactérias ácido-láticas apresenta efeito positivo
registrado em diversas espécies, como robalos, Centropomus spp.
(Barbosa et al., 2011), tilápias, Oreochromis spp, (Jatoba et al., 2011) e
camarões, Litopenaeus vannamei, (Vieira et al., 2007), devido à sua
capacidade de colonizar o trato digestório, alterando a dominância
natural da microbiota intestinal e promovendo melhoria no sistema
imune dos animais (Carnevali et al., 2006; Jatoba et al., 2008; Vieira et
al., 2008). Estes resultados estão relacionados com a alta especificidade
entre o microorganismo probiótico e o hospedeiro, pois todas as cepas
utilizadas nestes trabalhos foram isoladas dos próprios animais em
estudo.
Por outro lado, estudos demonstram que a utilização de bactérias
alóctones também podem apresentar bons resultados e um papel positivo
no bem estar dos peixes (Ridha e Azad, 2012; Standen et al., 2013),
porém há um consenso de que cepas de bactérias ácido-láticas
autóctones possuem maior chance de colonizar o intestino e trazer
benefício à saúde do hospedeiro (Sun et al., 2013). A utilização de cepas
alóctones apresentam uma série de desvantagens como a inserção de
microorganismos exógenos ao ambiente de cultivo, o desconhecimento
dos possíveis efeitos no trato intestinal e sua interação com os demais
microorganismos no ambiente, além da capacidade dessas cepas
sobreviverem ou se manterem em condições viáveis e em concentrações
ótimas no trato intestinal dos animais (Nayak, 2010b),
Em peixes (trutas, Oncorhynchus mykiss, e tilápias do Nilo) as
bactérias ácido-láticas já demonstraram a capacidade de melhorar o
crescimento, o sistema imunológico e a sobrevivência após desafios
experimentais (Nikoskelainen et al., 2003; Panigrahi et al., 2007; Aly,
Mohamed, et al., 2008; Merrifield et al., 2013).
24
2. Critérios de Seleção de microorganismo probióticos para
aquicultura
Ao longo dos anos várias estratégias para modular a composição
da microbiota intestinal a fim de se obter melhores taxas de crescimento,
digestão, imunidade, e resistência a doenças foram estudadas nos mais
diversos ramos da produção animal (Mare et al., 2006; Aly, Mohamed,
et al., 2008; Abd El-Rhman et al., 2009).
Os microorganismos usados como probióticos na aquicultura
devem exercer boa atividade microbiana e sererm seguros, não apenas
para o animal cultivado e o meio em que vivem, mas também para os
humanos. Porém, para ser considerado um probiótico o microorganismo
precisa, de maneira geral, colonizar o trato intestinal possuindo
característica de organismo probionte e ter efeito benéfico para o
hospedeiro, seja ele em resistência a doenças, em crescimento, ou em
qualquer outro fator desejado (Gatesoupe, 1999). Outras características
também devem ser observadas para a seleção mais detalhada do
microorganismo como, por exemplo: deve ser inócuo, deve resistir ao
tempo de armazenamento e transporte, resistir às enzimas do trato
digestório e a bile, não possuir genes de resistência a antibióticos e
possuir propriedades antimutagênicas e anticancerígenas (Coppola,
2004; Munoz-Atienza et al., 2013).
Muitos dos probióticos empregados na aquicultura são
desenvolvidos para uso humano ou para o uso na produção de animais
terrestres. No entanto, a adapataçao do uso desses probióticos em meio
aquático é mais complexo quando comparado ao ambiente terrestre,
podendo esse ser o motivo de muitas vezes não atingir os efeitos
esperados. Dessa forma, o isolamento, caracterização e comercialização
de bactérias probióticas autóctones, adaptadas ao meio, precisam ser
estudadas (Azad e Ai-Marzouk, 2008). Assim, se torna conveniente
seguir alguns critérios de seleção para garantir a chegada íntegra de
bactérias probióticas no trato intestinal dos animais, e o consequente
aumento da efetividade do probiótico na saúde do peixe cultivado.
Após o isolamento, pode ser avaliada a diversidade de critérios de
seleção para pressupor a eficiência do microorganismo probiótico. A
seleção primária mais comum utilizada são os testes de antagonismo in
vitro frente a um conjunto de cepas patogênicas, pois a produção de
compostos inibitórios constitui um fator importante para a seleção.
Além disso, o probiótico deve ter a capacidade de colonizar o intestino,
e para isto, o microorganismo precisa resistir ao trânsito gastrointestinal.
Portanto, é importante que a cepa probiótica seja submetida a testes em
diferentes concentrações de pH, de sais biliares e proteases (Balcazar et
25
al., 2008), a fim de garantir que o microorganismo sobreviva e colonize
o trato intestinal, evitando a colonização de patógenos. Da mesma
forma, são recomendados testes em diferentes temperaturas e
salinidades (para peixes marinhos e estuarinos) com o intuito de obter as
condições ótimas de crescimento e maior produção de compostos
inibitórios (ácidos orgânicos, peróxido de hidrogênio, bacteriocinas)
(Ringo e Gatesoupe, 1998).
Fjellheim et al. (2010) usaram dois critérios de seleção primária
para escolher um conjunto de 500 bactérias candidatas a probióticas de
larvas de bacalhau do Atlântico Gadus morhua. As bactérias dominantes
da flora intestinal foram isoladas utilizando como critério a atividade
antagônica contra Vibrio anguillarum, patogênica para esta espécie.
Com base em critérios como domínio e capacidade fermentativa, o
número total de bactérias foi reduzido a 55 cepas, submetidas a análises
in vitro, verificando-se crescimento e aderência ao muco, produção de
enzimas extracelulares e resistência à bile, assim reduzidas a sete
bactérias potencialmente probióticas para o bacalhau.
Testes adicionais também podem ser realizados como, por
exemplo, testes de inibição entre duas ou mais cepas probióticas. Isto
para verificar se existe antagonismo entre as cepas, em caso de utilizálas em conjunto a fim de se verificar a existência de um efeito sinérgico
entre elas.
Por último, testes in vivo devem ser realizados para verificar a
colonização do probiótico no intestino e posteriormente avaliar os
benefícios do seu uso no hospedeiro, analisando índices hematoimunológicos, índices zootécnicos e a resistência do peixe frente a
infecções experimentais com patógenos.
26
Figura 1: Esquema de seleção de bactérias probióticas (Adaptado
de Ray et al., (2012).
A suplementação com probióticos pode ser realizada diretamente
na água (Li et al., 2006), na dieta artificial (Vieira et al., 2007; Jatoba et
al., 2008) ou no alimento vivo (Arndt e Wagner, 2007). As
concentrações dos microorganismos probióticos podem variar, sendo
recomendável concentrações maiores de 105 unidades formadoras de
colônia (UFC) g-1(Lang et al. 1997). Jatoba et al. (2008) e Vieira et al.
(2007) testaram concentrações de 1 x 108 UFC g-1 de bactérias láticas
suplementadas na ração e obtiveram bons resultados em tilápia-do-Nilo
e camarão marinho, respectivamente, conseguindo alterar a microbiota
27
intestinal e obter efeito probiótico. Contudo, estas concentrações de
bactérias não conseguem se manter estáveis no trato intestinal do animal
sem um fornecimento constante do probiótico, onde as concentrações de
bactérias probióticas no intestino tendem a diminuir, como verificado
por Vieira et al. (2008), onde a ação do probiótico (Lactobacillus
plantarum) no camarão foi apenas de 4 dias.
Portanto, a metodologia proposta para seleção de
microorganismos probióticos para a aquicultura deve incluir: 1)
isolamento a partir do animal a ser estudado, 2) testes de seleção in
vitro, 3) testes in vivo e 4) avaliação dos efeitos no animal.
3. Testes in vitro
3.1. Isolamento das cepas
Embora as bactérias com este potencial sejam isoladas de várias
fontes, na grande maioria das vezes, elas são extraídas do trato
gastrointestinal dos hospedeiros nos quais atuarão. Este é um critério
relevante para a seleção de linhagens de cepas probióticas, pois se
espera que tenham melhor desempenho em ambiente semelhante àquele
do qual ela foi isolada (Morelli, 2000). A origem gastrointestinal das
bactérias probióticas é constatada em diversos trabalhos (Bjornsdottir et
al., 2010; De Souza et al., 2010).
Vale ressaltar a existência de cepas probióticas que não atuam
diretamento no hospedeiro, como as biocontroladoras e
biorremediadoras, que atuam no ambiente de cultivo. Ambas são
microorganismos vivos, porém as biocontroladoras são antagônicas à
patógenos e não colonizam o trato gastrointestinal (GI), diminuem a
carga de bactérias patogênicas somente na água do ambiente de cultivo.
Já as cepas biorremediadoras, melhoram a qualidade da água ou
auxiliam na decomposição da matéria orgânica do cultivo, porém sem
ter relação com bactérias patogênicas (Gatesoupe, 1999). Dessa forma,
uma cepa pode apresentar mais de uma ação, atender a critérios
simultaneamente. Por exemplo, uma bactéria bioremediadora pode
decompor a matéria orgânica do ambiente e produzir compostos que
diminuam a carga de bactérias patogênicas na água.
É de extrema importância definir precocemente qual será o efeito
probiótico que se espera obter nos animais, para que a seleção do
microorganismo seja realizada baseada no caráter desejado. Por
exemplo, para uma seleção que visa à melhora do sistema imune do
hospedeiro, deve-se isolar microorganismos capazes de produzir
compostos antimicrobianos, estimular a formação de imunoglobulinas;
28
para uma seleção que visa o aumento da capacidade digestória, deve-se
selecionar cepas que produzam mais enzimas e ácidos orgânicos; dessa
forma a seleção será direcionada e eficiente, diminuindo custos e mão
de obra (Mourino, 2010).
3.2. Espécies de microorganismos utilizados como probióticos
Como fontes de bactérias com potencial probiótico, podem ser
utilizadas bactérias dominantes no trato gastrointestinal de animais
saudáveis. Mas há também possíveis patógenos com potencial
probiótico que já foram utilizados com este propósito: as vibrionáceas e
Pseudomonas sp. (Gatesoupe, 1999) são um exemplo. O fator que torna
uma cepa, patogênica ou probiótica, é uma pequena variação genética
entre elas ou mesmo o despertar de sua virulência.
Para facilitar o estudo sobre os tipos de cepas probióticas, os
microorganismos utilizados serão divididos em dois grupos: as bactérias
Gram-negativas e as Gram-positivas.
Dentre as Gram negativas, que já tiveram seu efeito probiótico
comprovado, estão os gêneros: Pseudomonas sp., Aeromonas sp (A.
hydrophila., A. sobria), Vibrio sp. (V. fluvialis), dentre outros (Nayak,
2010).
No segundo grupo de microorganismos, os Grampositivos, estão a maioria dos probióticos utilizados em aquicultura,
destacam-se os gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus,
Enterococcus,
Carnobacterium,
Micrococcus,
Streptococcus,
Vagococcus, Aerococcus, Pediococcus e Leuconostoc. Atualmente,
muitas tentativas vêm sendo realizadas com o objetivo de induzir
dominância artificial destas bactérias no trato intestinal de peixes
(Gatesoupe, 1999).
Entre os gêneros citados, devemos destacar as bactérias ácidoláticas e os bacilos (B. subtilis, B. licheniformes, B. circulans) devido a
sua capacidade de produção de compostos antimicrobianos, estimulação
do sistema imune, além de secretarem enzimas digestivas, favorecendo
uma maior digestão e absorção de nutrientes (Ringo e Gatesoupe, 1998;
Ninawe e Selvin, 2009; Nayak, 2010; Ringo et al., 2010).
3.3. Antagonismo entre cepas probióticas
Probióticos podem ser administrados na forma monoespécie ou
multiespécies. Para alcançar resultados ótimos utilizando diferentes
gêneros e espécies, deve-se dar ênfase ao antagonismo entre as cepas,
pois uma bactéria não deve inibir a outra. Assim, evita-se a seleção de
29
cepas resistentes a compostos produzidos por uma única cepa
bacteriana.
Avella et al. (2010) testaram os efeitos de uma mistura de três
gêneros de Bacillus, no crescimento e sobrevivência em larvicultura e
engorda de Dourada, Sparus aurata, 45 e 75 dias após a larvicultura,
constatando um aumento significativo no peso e comprimento das larvas
e juvenis.
Segundo Nayak (2010), os estudos mais recentes têm confirmado
os efeitos benéficos, tanto da forma monoespécie como da multiespécie
(mistura) de cepas probióticas, em condições in vitro e in vivo.
Repetidas vezes, a indução do sistema imune inato em peixes, tem sido
registrada com probióticos multiespécies. Aly, Ahmed, et al. (2008)
demonstraram, por testes in vitro, que Bacillus subtilis e Lactobacillus
acidophilus usados conjuntamente aumentaram o efeito probiótico no
animal, inibindo o crescimento de A. hydrophila e melhorando os
índices de sobrevivência, de ganho de peso, valores do hematócrito,
ensaio de teste do nitroazul de tetrazólio (NBT), e atividade da lisozima
sérica, além de registrarem alta atividade bactericida do soro.
Apesar dos compostos antibacterianos produzidos pelas
candidatas probióticas e de suas propriedades inibitórias in vitro, outros
critérios como: resistência ou não a antibióticos, sua natureza não
hemolítica e seu potencial não patogênico precisam ser levados em
consideração na seleção de uma cepa para esta finalidade (MunozAtienza et al., 2013).
Nos últimos estudos percebeu-se que estas bactérias ácido-láticas
tinham potencial para transferir resistências a antibióticos (Ammor et
al., 2007). Atualmente é descrita em praticamente todas as espécies
bacterianas a existência de resistência a antibióticos possibilitando à
bactéria vantagem de sobrevivência na presença de um determinado
antibiótico (Hayes e Wolf, 1990).
Da mesma forma, Patel et al. (2010) isolaram uma cepa de
bactéria a partir de resíduos do leite. A cepa selecionada demonstrou
susceptibilidade aos antibióticos, reduzindo a possibilidade de doar
genes que determinam resistência às bactérias indesejadas, se
administrados sob a forma de probiótico.
Nayak e Mukherjee (2011) isolaram e selecionaram bactérias do
trato gastrointestinal de três espécies de carpa indiana: Labeo rohita,
Catla catla e Cirrhinus mrigala para a seleção de um probiótico
adequado, encontrando bactérias do gênero Aeromonas, Micrococcus,
Corynebacterium, Plesiomonas, Bacillus e Pseudomonas que
demonstraram atividades antibacteriana contra patógenos. Dentre eles, o
30
B. subtilis resistiu a grandes variações de temperature, pH,
concentrações salinas e demonstrou ser não patogênico, não resistente à
antibióticos e não hemolítico.
O estudo de Munoz-Atienza et al. (2013), investigou a atividade
antimicrobiana de 99 bactérias lácticas, isoladas de animais aquáticos
utilizados como alimento humano, contra patógenos de peixes e a sua
susceptibilidade à antibióticos, revelando atividade antimicrobiana
ampla contra os principais patógenos de peixes Gram-positivos e Gramnegativos, além da resistência à antibióticos em Weissella sp.,
Pediococcus sp., Lactobacillus sp. e Enterococcus sp.
Alguns
probióticos comerciais já atentam para o uso de cepas probióticas não
resistentes a antibióticos, porém muitos não possuem comprovação
científica.
3.4. Formação de esporos
Tanto as cepas esporuladas como as não esporuladas, podem ser
utilizadas como probióticos (Nayak, 2010). Contudo a vantagem de
bactérias esporuladas é sua resistência a amplas faixas de temperatura e
pH, características não atribuídas à outros probióticos. Isto se torna
vantajoso na fabricação de rações suplementadas com tais
microorganismos. Dentre as formas esporuladas, B. subtilis e B.
licheniformes são as cepas probióticas mais comuns utilizadas em
aquicultura. A maior vantagem na utilização deste grupo de bactérias
como probióticos está relacionada com a facilidade de ser produzida em
massa e incorporada em produtos comerciais, pois possuem a
capacidade de esporulação, facilitando sua inclusão em dietas e produtos
comerciais (Ochoa-Solano e Olmos-Soto, 2006).
Os benefícios a longo prazo do uso de bactérias formadoras de
esporos como probióticos é o fato de além de possuírem estabilidade ao
calor, também podem sobreviver ao trânsito através da barreira do
estômago, propriedades essas que não podem ser assegurados com
probióticos fornecidos na forma vegetativa. No entanto, a maioria dos
probióticos disponíveis atualmente são bactérias que não são formadores
de esporos, ou seja, são fornecidas como células vegetativas (geralmente
preparadas liofilizadas), apresentando bons efeitos probiótico (Huang et
al., 2008).
3.5. Crescimento em diferentes concentrações de pH e
resistência à sais biliares
Burbank et al. (2012), isolaram 318 bactérias do trato intestinal
de trutas e, usaram além de outros testes, o de resistência à sais biliares
31
como indicador para a seleção de 24 cepas candidatas à probiótico.
Neste mesmo contexto, Cai et al. (1998) utilizaram diversos critérios de
seleção, dentre eles o de resistência a 10% de sais biliares, para
selecionar uma cepa com potencial probiótico dos 199 microorganismos
isolados do trato GI do peixe linguado (Paralichthys orbignyanus).
A baixa resistência de bactérias probióticas, frequentemente
constatada em ensaio de resistência a sais biliares, é consequência das
condições extremas utilizadas in vitro para simular o ambiente gástrico,
sendo muitas vezes usados valores de pH inferiores e tempo de
exposição superiores aos encontrados in vivo. Por outro lado, outros
experimentos têm demonstrado que linhagens de bactérias ácido-láticas
geralmente são tolerantes às condições ácidas em estudos in vitro (De
Angelis et al., 2006; Lin et al., 2007).
3.6. Resistência a diferentes temperaturas
Dentre os testes realizados in vitro durante a seleção de uma
bactéria candidata a probiótica está a curva de crescimento ideal em
diferentes temperaturas (Vijayan et al., 2006). Dessa forma, busca-se a
faixa na qual a bactéria sobrevive e a temperatura ideal onde atuará no
máximo de sua eficiência.
Poffo e Da Silva (2011) caracterizaram fisiologicamente algumas
bactérias ácido-láticas com potencial probiótico, isolado de sardinhas,
Sardinella brasiliensis, a fim de definir a temperatura ideal para o seu
crescimento.
4. Testes in vivo
Na seleção de cepas com potencial probiótico é comum procederse aos testes in vitro para avaliar a viabilidade dos micro-organimos
como probióticos e, a partir daí, realizar os testes in vivo.
Quando são realizados testes in vivo, é comum identificar a
microbiota endógena, nativa do trato gastrointestinal do hospedeiro, e
compará-la com a microbiota que se estabeleceu no trato após a
administração de uma dieta enriquecida com probiótico. Isto leva à
constatação da alteração e da colonização de tais cepas no trato do
hospedeiro.
Divya et al. (2012) conduziram um estudo para avaliar o
estabelecimento de Bacillus coagulans, Bacillus mesentericus, e
Bifidobacterium infantis no intestino de pós-larvas do peixe ornamental
Puntius conchonius, alimentadas com copépodos enriquecidos com tais
microorganismos, demonstrando uma colonização significativa no
32
intestino dos peixes, bem como efeitos significativos na diminuição de
patógenos do intestino.
Outros fatores também devem ser levados em consideração
quando procede-se aos testes in vivo de cepas probióticas, como o modo
de suplementação, a concentração oferecida e o período de oferta.
Estimar a dose ou a concentração ideal de probiótico é necessário
não só para a proliferação adequada das bactérias no intestino, mas
também para obter os efeitos benéficos causados pelas mesmas,
incluindo sua atividade imunoestimulante. Vários estudos têm
demonstrado que as respostas imunes dos peixes variam em função da
concentração de probióticos. Normalmente a dose ideal é definida por
meio de regressão baseando-se na melhora do crescimento e da proteção
do hospedeiro. Brunt et al. (2007) administraram em truta arco-íris,
Bacillus sp isoladas do trato gastrointestinal de tilápias, definindo a dose
ideal de 2 x 10 8 cél/g e constatando redução nos índices de mortalidade
causada por bactérias patogênicas. Em aquicultura costuma-se usar
doses que variam de 106 à 1010 CFU/g ração (Nayak, 2010b). Song et al.
(2006) registraram aumento da atividade da lisozima no soro sanguíneo
e na pele de M. miiuy nas doses 107 e 109 CFU/ de C. butyricum/g ração,
respectivamente. Doses altas também podem causar mortalidade nos
hospedeiros, como registrado por (Nikoskelainen et al., 2001). Portanto,
é necessário se estabelecer a dose ideal para cada cepa probiótica em
cada hospedeiro.
O período de administração do probiótico também é um fator
importante. Na maioria dos peixes, entre 1 à 10 semanas de tratamento,
percebe-se um ganho de peso, e a melhora dos parâmetros imunes e
resistência à doenças (Nayak, 2010). O tempo de fornecimento varia
conforme o tipo de cepa e com o parâmetro imune em questão que se
deseja modular. Analisando um mesmo parâmetro, constata-se
diferenças nas respostas imunológicas, causadas pelo período de oferta.
Incremento da atividade de “burst” respiratório foi detectado em peixes
alimentados durante 60 dias com suplementação probiótica (DiazRosales et al., 2009). Porém, em ensaio anterior, foi verificado efeito
antagônico quando o probiótico foi ofertado por um período mais curto,
de 4 semanas. Além disso, nem sempre maiores períodos de oferta do
probiótico garantirão melhores efeitos estimulantes no animal.
Enquanto alguns pesquisadores acreditam que um regime de
alimentação longo não é necessário, o regime mais curto de alimentação
pode causar diminuição acentuada na resposta imune nos peixes
(Panigrahi et al., 2005). Esse tipo de declínio pode acontecer devido à
33
dificuldade das bactérias de probióticos para se estabelecerem e se
multiplicar no intestino.
Embora se saiba que o modo de administração dos probióticos
mais eficaz seja pela alimentação, devido a maiores índices de
colonização do trato GI, esta não é sua única forma de uso. Probióticos
também são utilizados diretamente na água de cultivo, causando efeitos
benéficos ao ambiente e ao hospedeiro (Zhou et al., 2010) ou podem ser
incorporadas em rotíferos e artêmias em larviculturas de peixes
(Picchietti et al., 2007; Picchietti et al., 2009a).
5. Modo de ação
Benefícios ligados à administração de probióticos são: exclusão
competitiva de bactérias patogênicas (Vine et al., 2004), fonte de
nutrientes e enzimas digestivas (Mehrabi et al., 2012), modulação do
sistema imunológico (Panigrahi et al., 2004), produção de compostos
antimicrobianos como bacteriocinas e ácidos orgânicos (Balcazar,
Vendrell, et al., 2007; Mandiki et al., 2011).
5.1. Colonização da microbiota intestinal
Segundo Furlan (2004), as bactérias no trato gastrointestinal
podem ser encontradas associadas ao epitélio ou livres na luz intestinal.
As livres devem-se multiplicar rapidamente a fim de compensar a
eliminação pelo movimento peristáltico intestinal, ou mesmo
aglutinarem-se às demais bactérias aderidas na mucosa intestinal. Existe
ainda um prolongamento polissacarídeo do enterócito em direção à luz
intestinal denominado glicocálix ou fímbria. O processo de aderência
das bactérias é feito por meio de polissacarídeos, moléculas de açúcares
ramificados, que se estendem da parede externa da bactéria formando
uma estrutura (glicocálix), que envolve a célula ou mesmo uma colônia
de bactérias. Essa estrutura apresenta outras funções importantes, como
a manutenção da camada aquosa próxima a mucosa intestinal, em pH
neutro, que permite a ação de enzimas de membrana.
Dessa forma, o mecanismo regulador da colonização das
bactérias no epitélio intestinal parece estar baseado na dependência da
aderência do glicocálix de uma bactéria com o glicocálix do enterócito.
Essa ligação entre glicocálix, estudos apontam em muitos casos, pode
ser mediada por uma lectina, que se liga especificamente a um
polissacarídeo. Vale a pena ressaltar, também, que estudos verificaram
que os microorganismos quando em meio de cultura não produzem o
glicocalix, aparentemente utilizando as reservas para multiplicação, e
não aderência, a qual não é necessária nestas circunstâncias.
34
5.2. Inibição competitiva
O antagonismo é um fenômeno comum na natureza, onde
interações bacterianas desempenham papel importante no equilíbrio da
microbiota intestinal entre as bactérias benéficas e as potencialmente
patogênicas. A quebra desse equilíbrio é resultante de más práticas de
manejo, ração de baixa qualidade, qualidade de água precária, além de
estresse e fatores ambientais, podem estimular a proliferação de
bactérias patogênicas no hospedeiro (Ringo e Gatesoupe, 1998).
A colonização do trato gastrointestinal dos animais por
probióticos se torna possível após o surgimento e antes da instalação
definitiva de uma microbiota endógena competitiva. Após essa
instalação, somente a adição de doses elevadas de probiótico provocará
a alteração na microbiota natural presente e sua posterior manutenção
(Nikoskelainen et al., 2003; Vieira et al., 2008; Mourino et al., 2012).
Dessa forma, probióticos comerciais muitas vezes são relativamente
ineficazes, por não serem específicos da espécie de peixe trabalhada são
incapazes de sobreviver ou permanecerem viáveis em uma concentração
ideal e efetiva no intestino, uma vez que a flora intestinal endógena dos
animais já se encontra formada (Ghosh et al., 2007)
A colonização é caracterizada pela adesão das bactérias à
superfície da mucosa, ou por associação ao muco ou por aderência as
células epiteliais. A adesão aos sítios e colonização da mucosa são
mecanismos de defesa contra patógenos através da competição por
ligações locais e nutrientes (Westerdahl et al., 1991; Korkea-Aho et al.,
2011).
O processo se inicia com a entrada da bactéria por meio de
partículas de alimentos ou água, seguindo até o trato digestivo onde
podem ser mantidas como parte residente da microflora. Outras são
destruídas por processos digestivos ou eliminadas nas fezes. No trato, o
crescimento bacteriano pode ser inibido por um conjunto de compostos
antimicrobianos produzidos pelo hospedeiro, como: proteases,
bacteriocinas (principalmente bactérias ácido lácticas), lisozimas,
peróxido de hidrogênio, além de diminuir o pH pela produção de ácidos
orgânicos (Gram et al., 1999; Gatesoupe, 2008; Ferguson et al., 2010;
Korkea-Aho et al., 2011; Boutin et al., 2012; Del'duca et al., 2013).
5.3. Fonte de nutrientes e enzimas digestivas
De acordo com Ray et al. (2012), a digestão dos alimentos
depende de três fatores principais: (i) a ingestão de alimentos e a medida
em que o alimento é susceptível aos efeitos de enzimas digestivas, (ii) a
atividade das enzimas e o tempo que o alimento está exposta à ação das
35
enzimas digestivas. Cada um desses fatores é afetado por uma série de
fatores secundários como, por exemplo, pela contribuição da microbiota
do intestino dos peixes. Devido à complexidade e a ecologia variável do
trato digestivo de diferentes espécies de peixes, a presença do estômago,
dos cecos pilóricos e o comprimento do intestino é difícil avaliar a
contribuição exata da microbiota gastrointestinal.
A microflora probiótica é capaz de aumentar a digestibilidade
com a produção de enzimas digestivas, produção de vitaminas do
complexo B (ácido fólico), redução do pH do trato através da produção
de ácidos graxos de cadeia curta, regulação dos movimentos
peristálticos, absorção de minerais como o cálcio e síntese de colesterol
(Vine et al., 2006; Dimitroglou et al., 2011; Parfenov e Bondarenko,
2012; Cornélio et al., 2013).
A hidrólise enzimática bacteriana pode aumentar a
biodisponibilidade de proteínas e de gordura e aumentar a liberação de
aminoácidos livres. Além de ácido lático, ácidos graxos de cadeia curta,
como propiônico e butírico, também são produzidos pelas bactérias
láticas. Quando absorvidos, esses ácidos graxos contribuem para o pool
de energia disponível do hospedeiro e podem proteger contra mudanças
patológicas na mucosa do cólon. Além disso, uma concentração mais
elevada de ácidos graxos de cadeia curta auxilia na manutenção de um
pH apropriado no lúmen do cólon, crucial para a expressão de muitas
enzimas bacterianas sobre compostos estranhos e sobre o metabolismo
de carcinógenos no intestino (Kopp-Hoolihan, 2001).
Adicionalmente, o butirato, além de fornecer energia para as
células epiteliais, proteção contra enterites, aumenta a proliferação e
diferenciação destas células, aumentando a altura das vilosidades
intestinais e o consequente aumento da absorção de nutrientes (Galfi e
Bokori, 1990).
Estudos demonstram que a microbiota intestinal é influenciada
pela composição da dieta. Pedrotti et al. (2013) descreveram que para
peixes onívoros (tilápias e jundiás) alimentados com diferentes fontes de
carboidratos na dieta, houve alteração na microbiota intestinal,
influenciando níveis de bactérias amilolíticas, celulolíticas, lipolíticas,
proteolíticas e bactérias totais cultiváveis nos tratos dos peixes
amostrados.
Os primeiros estudos com produção de enzimas de bactérias
intestinais de peixes são datados da década de 70 (Hamid et al., 1979).
A seguir é apresentada uma tabela com dados recentes de produção de
enzimas por bactérias isoladas do trato intestinal de peixes relacionadas
à nutrição de peixes.
Carpas
Labeo bata
Labeo rohita
Bacillus licheniformis; B. subtilis
Bacillus cereus; B. circulans; B. pumilus
Piaractus
mesopotamicus
Bacillus subtilis, B. velesensis
Citrobacter
sp.;Enterobacter
sp.;Bacillus
coagulans , Bacillus cereus, Bacillus sp.
Cyprinus carpio
Aeromonas sp.
*Quadro continua na página seguinte.
Protease
Carpas
Labeo bata
Bacillus licheniformis; Bacillus subtilis
Citrobactersp.;Enterobactersp.;Bacillus
coagulans, Bacillus cereus , Bacillus sp.
Citrobacter freundii
Gadus morhua
Brochothrix sp. e Brochothrix thermosphacta
Celulase
Salmo salar
Bacillus thuringiensis, B. cereus, Bacillus sp,
Bacillus subtilis e Acinetobacter sp.
Amilase
Fonte de isolamento
Microorganismo
Enzima
produzida
Quadro 1: Microorganismos produtores de enzimas isolados do trato intestinal de peixes.
36
Ghosh et al., 2002
Mondal et al., 2010)
Ray et al., 2010
Peixoto et al., 2011
Jiang et al., 2011
Ray et al., 2012
Mondal et al., 2010
Askarian et al., 2012
Askarian et al., 2012
Referência
36
Quitinase
Fitase
Lipase
Bacillus subtilis; B. atrophaeus
Marinobacter lutaoensis, Ferrimonas balearica,
Pseudoalteromonas piscicida, Enterovibrio
norvegicus, Grimontia hollisae, Photobacterium
damselae spp. damselae, P. leiognathi, P.
lipolyticum, P. phosphoreum, P. rosenbergii,
Vibrio campbelli, V. chagasii, V. fischeri, V.
fortis, V. gallicus, V. harveyi, V. natrigenes, V.
nigripulchritudo,
V.
ordalii,
V.
parahaemolyticus, V. pomeroyi, V. ponticus, V.
proteolyticus.
Agrobacterium; Pseudomonas; Brevibacterium;
Microbacterium; Staphylococcus
Vibriospp.,Acinetobacterspp.
Enterobacteriaceae,
Pseodomonasspp.
Bacillus licheniformis
Teleosteos
Peixes
da
japonesa
costa
Khan et al., 2011
Itoi et al., 2006
Roy et al., 2009
Gatesoupe, 1997
Dicentrarchus labrax
Peixes teleosteos
Ringo et al., 1995
Salvelinus alpinus
37
37
38
O estudo dos probióticos aponta para vários mecanismos de ação
conjunta da adição de bactérias probióticas e os efeitos benéficos de sua
utilização em seu hospedeiro e entre estes efeitos é comum a melhora do
desempenho relacionado à nutrição do animal, seja pela produção
suplementar de enzimas e vitaminas, pelo aumento do crescimento, pelo
aumento da eficiência alimentar ou mesmo na prevenção de desordens
nutricionais incluindo a pré-digestão de fatores anti-nutricionais
presentes em alguns ingredientes (Thompson et al., 1999; Verschuere et
al., 2000).
Após a passagem pelo estômago, na colonização ou mesmo
durante a passagem pelo trato intestinal, as bactérias usam diversas
fontes de açúcares (carboidratos) para seu crescimento e chegam a
produzir uma gama de enzimas digestivas durante este processo, o que
auxilia na digestão do alimento (El-Haroun et al., 2006).
Efeitos significativos na melhora do crescimento e
digestibilidade, também foram observados por De Rodriganez et al.
(2009), quando ofereceram dieta enriquecida com duas cepas
probióticas da família Alteromonadaceae, para juvenis de Linguado,
Senegalese sole.
A ação de microorganismos durante a fabricação de produtos
contendo culturas ou no trato digestivo influencia favoravelmente a
quantidade, a biodisponibilidade e a digestibilidade de alguns nutrientes
da dieta. A fermentação de produtos lácteos por bactérias láticas pode
aumentar a concentração de determinados nutrientes, como vitaminas do
complexo B. As bactérias láticas caracterizam-se pela liberação de
diversas enzimas no lúmen intestinal. Essas enzimas exercem efeitos
sinérgicos sobre a digestão, aliviando sintomas de deficiência na
absorção de nutrientes (Kopp-Hoolihan, 2001).
5.4. Produção de compostos inibitórios
Diversos trabalhos na literatura confrontam bactérias probióticas
com microorganismos patogênicos, a fim de verificar o potencial de
inibição das bactérias probióticas frente as patogênicas.
Burbank et al. (2012) isolaram e testaram, in vitro, bactérias do
trato gastrointestinal de trutas quanto à sua capacidade para inibir o
crescimento de Flavobacterium psychrophilum, o agente causador da
doença de água fria, descobrindo assim, algumas cepas com o potencial
de reduzir ou controlar tal doença. De maneira semelhante Brunt et al.,
(2007) isolaram cepas probióticas de truta arco-íris e carpa (Ciprinus
sp.) que demonstraram bons resultados na redução da mortalidade
39
quando os hospedeiros foram infectados com Bacillus sp. e A. sobria,
respectivamente. A eficácia probiótica de uma bactéria de origem
humana, Lactobacillus rhamnosus também foi constatada na inibição do
crescimento de bactérias patogênicas de peixes e rãs (Pirarat et al.,
2009).
As bactérias ácido-láticas são capazes de secretar peptídeos
antimicrobianos e são utilizadas na conservação de alimentos, assim
como promotor de saúde em humanos e animais.
Bacteriocinas produzidas por bactérias ácido-láticas são
classificados em três grupos principais, sendo os lantibióticos o grupo
mais documentado e explorado industrialmente. Lantibióticos (Classe I),
não-lantibióticos, pequenos peptídeos termoestáveis (Classe II), e
grande proteína lábil ao calor (Classe III) (O'sullivan et al., 2002).
Estudos indicam que estas substâncias probióticas antibacterianas
exercem seus efeitos inibitórios de patógenos, sozinhas ou
sinergicamente. Os componentes lantibióticos, produzidos por bactérias
Gram positivas, como Lactococcus lactis, são pequenos peptídeos
antimicrobianos. Estes peptídeos foram encontrados ativos em
concentrações de nanomolares para inibir patógenos, atingindo os
componentes lipídicos da parede celular bacteriana (Vanderpool et al.,
2008).
Cepas de Lactobacillus produzem amplo grupo de bacteriocinas
com sequências divergentes. Estes peptídeos apresentam um espectro
relativamente estreito de atividade e na sua maior parte, são tóxicos para
bactérias Gram-positivas, como Lactococcus, Streptococcus,
Staphylococcus, Listeria e micobactérias. O principal mecanismo de
ação é por meio da formação de poros na membrana citoplasmática de
bactérias sensíveis, podendo também interferir nas atividades essenciais
de enzimas em espécies mais sensíveis (Vanderpool et al., 2008).
Ainda no conceito de produção de compostos antimicrobianos
pelas bactérias probióticas, Vazquez et al. (2005) selecionaram
microorganismos, confrontando bactérias ácido-láticas com bactérias
patogênicas de Scophthalmus maximus e constataram que os
responsáveis pelos efeitos inibitórios das bactérias patogênicas não eram
as bacteriocinas das bactérias ácido-láticas, e sim, os ácidos acético e
lático produzidos pelas mesmas. Bactérias ácido-láticas isoladas de rãtouro (Rana catesbeiana) de cultivo, também inibiram o crescimento de
uma cepa patogênica pela produção de ácidos orgânicos (Pasteris et al.,
2009).
Na dieta, os ácidos orgânicos funcionam como agentes de
conservação, reduzindo o pH do alimento, inibindo o crescimento
40
microbiano e diminuindo a absorção de organismos patogênicos. No
trato intestinal dos animais, os ácidos orgânicos inibem o crescimento de
bactérias, principalmente as Gram-negativas. Os ácidos na sua forma
não ionizada entram pela parede das bactérias e realizam a liberação de
prótons no citoplasma, onde estas consomem uma grande quantidade de
ATP para exportar os prótons do interior da célula para fora, tentando
manter o equilíbrio do pH intracelular. Esse gasto de ATP resulta em
uma depleção de energia celular e posteriormente a morte (Luckstadts,
2008).
6. Imunomodulação
Ao encontro da imunomodulação, as cepas de bactérias ácidoláticas e/ou probióticas protegem os peixes de possíveis infecções por
bactérias patogênicas, pois diminuem a mortalidade significativamente
após infecções experimentais relatadas por Balcazar et al. (2007) e
comprovadas por Balcazar et al. (2010).
O efeito do uso de probiótico na defesa de peixes contra
microorganismos patogênicos analisando diferentes respostas
imunológicas tais como: interações com células do intestino; efeitos em
células hematológicas relacionadas com defesa inata e aumento na
concentração de compostos sanguíneos de respostas imunes inatas e
adaptativas, será abordado a seguir.
6.1. Efeito nas células imunológicas da mucosa intestinal
A proteção contra patógenos dos probióticos causada pela
competição pela adesão da parede do intestino é bem estudada em
peixes e comprovada anteriormente por alguns autores (Rombout et al.,
2011)
O aumento da concentração de linfócitos T no intestino de larvas
de robalo (Dicentrarchus labrax) alimentadas com bactéria probiótica
foi relatado recentemente por Picchietti et al. (2009), comprovando o
que já era esperado, que os linfócitos estão presentes em abundância no
muco da parede intestinal de peixes. Em teleósteos, o nível de
organização do sistema linfóide associado ao intestino é inferior ao de
mamíferos, porém é mais difundido, contendo uma grande quantidade
de células linfóides, macrófagos, eosinófilos e neutrófilos granulares.
Por outro lado, ainda não existe consenso sobre a presença de células
dendríticas em peixes.
Dentre essas células destacam-se os macrófagos encontrados em
carpas, os quais possuem grande capacidade ligante. Essas células
podem carregar antígenos do lúmen para posterior degradação na
41
superfície do intestino. Os granulócitos (neutrófilos, eosinófilos e
basófilos) em geral possuem capacidade de produzir e liberar triptase,
peptídeos antimicrobianos como lisozima, piscidina, entre outros; os
quais são altamente relacionados com respostas inflamatórias no
intestino.
6.2. Interação com células imunes
As concentrações de células sanguíneas em geral, assim como os
parâmetros hematológicos sofrem alterações positivas em peixes
alimentados com cepas de bactérias probióticas. Essas alterações podem
ser tanto em quantidade como qualidade. Por exemplo, o valor do
hematócrito (quantidade de células vermelhas em circulação) aumenta
significativamente em tilápias-do-nilo alimentadas com uma mistura de
probiótico (Bacillus subtilis e Lactobacillus acidophilus), como
comprovado pelo estudo de Aly et al. (2008).
Os leucócitos são células de defesa dos peixes que desempenham
um papel importante durante uma infecção. Acredita-se que essas
células comportam-se da mesma maneira que em outros vertebrados, no
qual os probióticos interagem com as células do sistema imune através
de células especializadas do epitélio do intestino, induzindo assim a sua
multiplicação. Essa ativação e multiplicação de leucócitos totais foram
observadas em tilápias alimentadas com L. plantarum (Jatoba et al.,
2011); em trutas alimentadas com Bacillus e E. faecium (Merrifield,
Dimitroglou, Bradley, 2010) e em juvenis de robalo (Centropomus
parallelus) alimentados com L. plantarum (Barbosa et al., 2011).
Nos trabalhos citados anteriormente de Jatoba et al. (2011) e
Barbosa et al. (2011) também foi relatado um aumento na concentração
de linfócitos em peixes alimentados com cepas probióticas. A
abundância de linfócitos no sangue pode ser considerada um indicador
de saúde de peixes, uma vez que essas células desempenham uma ação
importante no sistema inato e adaptativo na defesa de peixes teleósteos.
Outros trabalhos também relatam o aumento de linfócitos sanguíneos
em robalo (Picchietti et al., 2009b), em tilápias (Aly, Ahmed, et al.,
2008) e em trutas arco-íris Newaj-Fyzul et al. (2007), após alimentações
com dietas contendo probióticos.
Os linfócitos-B constituem a defesa inata dos peixes enquanto os
linfócitos-T são responsáveis por respostas mediadas por outras células,
ou seja, precisam de um estímulo prévio (Magnadottir, 2010). Porém
poucos estudos demonstram a relação de aumento ou redução dessas
células em relação à alimentação de peixes com bactérias probióticas
presentes na dieta (Rombout et al., 2011).
42
As imunoglobulinas são produzidas e secretadas pelos linfócitosB como anticorpos e desempenham um papel imunológico importante
em peixes teleósteos (Choi e Kim, 2011). O nível de imunoglobulina
em trutas arco-íris aumentou significativamente após alimentação com
probiótico após apenas uma semana (Nikoskelainen et al., 2003). Esse
resultado foi confirmado por Panagrahi et al. (2005), onde
suplementações de bactérias acido-láticas na dieta, tanto na forma viva
como na forma morta, induziu aumento na concentração de
imunoglobulina no plasma de trutas arco-íris.
Esse aumento na concentração de imunoglobulinas totais no
sangue dos peixes ocorreu também em tilápias-do-nilo alimentadas com
Bacillus sp. e Lactobacillus sp. (Ridha e Azad, 2012); em surubins
híbridos, Pseudoplatystoma sp., alimentados com dietas contendo
Weissella cibaria (Mouriño et al., 2012); e em bagres africanos, Clarias
gariepinus, após alimentação de dietas suplementadas com
Lactobacillus acidophilus.
Assim como descrito acima, Panigrahi et al. (2009) também
relataram aumento da atividade fagocítica em peixes após alimentação
com cepas probióticas. Este aumento de atividade fagocítica da parte
anterior do rim pode ser visto em trutas arco-íris, alimentadas com
diferentes cepas probióticas (Lactococcus lactis ssp, Leuconostoc
mesenteroides, and Lactobacillus sakei) (Balcazar et al., 2007). Porém,
deve-se tomar cuidado com a forma de administração dos mesmos, pois
trabalhos comprovam que a forma de administração das cepas na dieta
probióticas influencia ou não na melhor atividade de fagocitose
(Panigrahi et al., 2005).
As células fagocitárias, tais como os neutrófilos e macrófagos,
desempenham papel importante na defesa antibacteriana, pois
combatem bactérias pela produção de espécies reativas de oxigênio
(ROS), entre elas os ânions superóxidos (O 2-); peróxido de hidrogênio
(H2O2) e radicais livres hidroxilas (OH-) durante a atividade respiratória
(Ellis, 1999).
A produção de ânions superóxidos foi observada por Panigrahi et
al. (2005) em trutas arco-íris alimentadas com probióticos e outros
estudos demonstram que a administração de probióticos Lactobacillus
rhamnosus em dietas de peixes estimulam a atividade respiratória
(Nikoskelainen et al., 2003).
Os estudos de potencial de atividade respiratória utilizam
metodologias específicas (Puangkaew et al., 2004) as quais induzem
essa atividade, não querendo dizer que os peixes estavam com essa
concentração de atividade respiratória alta continuamente. Todavia,
43
resultados desta atividade são controversos, pois em linguado
(Paralichthys olivaceus) não foram observadas diferenças na atividade
respiratória quando alimentados com Lactococcus lactis subsp. Lactis
(Heo et al., 2013), assim como em “seabream” (Sparus aurata)
alimentados com dietas contendo Lactobacillus delbrüeckii ssp. Lactis
(Salinas et al., 2005).
As citocinas são moléculas sinalizadoras intracelulares que
desempenham papel central na modulação de eventos imunológicos e
fisiológicos em animais. Elas são secretadas pelos leucócitos presentes
na parte anterior do rim, os quais são um importante veículo para a
resposta imune de peixes. O aumento da regulação de citocinas tipo,
interleucina (IL1), fator de necrose tumoral (TNF), fator de
transformação de crescimento (TGF) isoladas dos leucócitos da parte
anterior do rim foram observadas em peixes alimentados com probiótico
por Panigrahi et al. (2009). Esse aumento também pode ser observado
em carpas comuns, Cyprinus carpio, alimentadas com extratos de
levedura, também apresentaram um aumento na expressão gênica de
citocinas secretadas pelos leucócitos (Biswas et al., 2012).
A lisozima que está presente no soro dos peixes é importante
enzima bactericida do sistema imune, porém ela tem especificidade para
bactérias Gram positivas (Giron-Perez et al., 2009). Por isso, estudos
enfatizando a resposta humoral em peixes apresentam resultados
controversos. O aumento da atividade sérica da lisozima foi observado
por Merrifield et al. (2010) em trutas arco-íris alimentadas com dietas
contendo Bacillus probionts e confirmada anteriormente por Panigrahi
et al. (2009). Por outro lado, Mouriño et al. (2012) não detectou
diferenças na concentração de lisozima sérica em pintado hibrido
alimentados com W. cibaria quando comparados com peixes que não
receberam probiótico na dieta, assim como Wang, Tian, et al. (2008)
não encontraram diferenças na concentração de lisozima em tilápias
alimentadas com probiótico E. faecium.
Peixes teleósteos possuem as duas vias de sistema complemento,
a via alternativa complementar (ACP) e a via clássica complementar
(CCP). A atividade da ACP é importante nos peixes e é ativada pela
detecção dos lipopolissacarídeos da parede de células Gram negativas e
resulta na quebra da célula bacteriana. No entanto, anticorpos ligados à
parede das bactérias ativam a CCP, assim uma maior quantidade do
sistema complemento podem ser ativada em comparação ao ACP; ou
ainda os anticorpos podem direcionar o CCP para locais na parede
bacteriana onde o sistema complemento pode causar maiores danos às
bactérias (Ellis, 1999). Portanto, peixes suplementados com probiótico
44
apresentariam melhores respostas imunológicas, como aumento na
formação de imunoglobulinas e maior eficiência do sistema
complemento alternativo complementar.
Foi relatado que em trutas marrom (Salmo trutta) (Balcazar et al.,
2007) e em trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss) (Balcazar, et al.,
2007b) alimentadas com bactérias ácido láticas, houve aumento da
atividade sérica do sistema complemento ACP após duas semanas de
suplementação de probiótico. Esse aumento do ACP também ocorreu
em garoupa (Epinephelus coioides) que receberam dieta contendo B.
subtilis na concentração de 10 6 e 108 UFC/mL por 14 dias e em peixes
alimentados com essa mesma bactéria o aumento do ACP ocorreu
também na concentração de 104 UFC/ml após 28 dias. Esses resultados
confirmam que a concentração de bactérias probióticas influencia na
resposta do sistema complemento, assim como o tempo de
suplementação das mesmas (Liu et al., 2012).
6.3. Interferência do quorum sensing
Outro método alternativo de combate às enfermidades bacterianas
é o antagonismo ao quorum sensing, mecanismo pelo qual as bactérias
coordenam a expressão de genes em resposta à densidade populacional
bacteriana, produzindo e detectando pequenas moléculas sinais. Estas
moléculas de comunicação bacteriana que são produzidas por muitas
bactérias. Em geral, as bactérias Gram positivas usam oligopeptídeos
para se comunicar e, as Gram negativas, usam como autoindutores as
moléculas de acil-homoserina-lactona (AHL), podedo estar envolvidas
na regulação de fatores de virulência que somente são expressos em
altas concentrações de células (Fuqua et al., 2001; Hentzer et al., 2003;
Smith et al., 2004; Camilli e Bassler, 2006; Keller e Surette, 2006; Pinto
et al., 2007).
O quorum sensing também pode regular nas bactérias funções
como conjugação, secreção de fatores de virulência, produção de
antibióticos, formação de biofilmes e bioluminescência (Defoirdt et al.,
2004). É por este motivo que diversos trabalhos tem relatado a relação
entre luminescência e toxicidade em vibrios patogênicos para o camarão
(Manefield et al., 2000; Defoirdt et al., 2008; Pande et al., 2013)
Com a interrupção da comunicação entre bactérias patogênicas,
aumenta as chances do hospedeiro em resistir à infecção bacteriana, que
não terá aumento de fatores de virulência, não podendo debilitar assim o
sistema de defesa animal (Rasch et al., 2004)
Compostos que inibem o quorum sensing podem constituir a
nova geração de agentes antimicrobianos com aplicações em diversos
45
campos, incluindo medicina humana e veterinária, agricultura e
aquicultura e podem ser associados a interesses comerciais. Diversas
estratégias para este combate são possíveis. A inibição da geração das
AHL, da sua disseminação e sua recepção (Hentzer et al., 2002).
A maioria das bactérias que produzem as AHL codificam um ou
mais genes homólogos ao luxI do Vibrio fischeri (Figura 1). A expressão
destes genes tem demonstrado que o LuxI- tipo proteína é
suficientemente necessário para produção dos sinais de AHL (Parsek et
al., 1999).
O conhecimento sobre a geração dos sinais pode ser explorado
para o desenvolvimento de inibidores na formação de moléculas como
as AHL envolvidas no quorum sensing. Vários análogos como os Sadenosylhomocysteina, S-adenosylcysteina, e sinefungin tem
demonstrado ser potentes inibidores da síntese de AHL catalisados pela
proteína RhlI da bactéria de P. aeruginosa (Parsek et al., 1999),
enfatizando que estes análogos podem ser utilizados como inibidores
dos sinais de geração do quorum sensing sem afetar enzimas de
eucariotos.
Figura 2: Complexo responsável por inativar ou ativar a transcrição de genes
alvo, como exemplo a produção de toxinas. Adaptado de Defoirdt et al. (2004)
Os sistemas de comunicação de dois componentes dividem
mecanismos comuns regulatórios, onde as moléculas sinais AHL são
sintetizadas pelos precursores de síntese de proteínas I que, através da
interação transcricional, ativam as proteínas R para regular a expressão
dos genes alvo (Figura 1)
Uma das espécies bacterianas mais estudadas quanto ao
mecanismo do quorum sensing é o V. harveyi, o qual possui dois
mecanismos de comunicação reconhecidos como AI-1 usado para
comunicações intra-espécies e um sistema conhecido como AI-2,
46
empregado para comunicações inter espécies (Defoirdt et al., 2004;
Zhao et al., 2006).
Muitos trabalhos vêm sendo realizados na aquicultura com o
isolamento de bactérias probióticas, do trato intestinal de organismos
aquáticos, capazes de degradar AHL´s e apresentarem boas
características para o uso na aquicultura (Tinh et al., 2007; Chu et al.,
2011).
O uso de um probiótico, que degrade os AHLs poderia diminuir a
virulência da população bacteriana, aumentando a sobrevivência dos
animais de cultivo (Defoirdt et al., 2008). Como exemplo, culturas
bacterianas com a capacidade de degradar AHLs, isoladas do trato
intestinal de L. vannamei, aumentaram a sobrevivência da larvicultura
de linguado europeu ao serem adicionadas a água de cultivo
Dong et al. (2002) e Lee et al. (2002), demonstraram que um
gene (AiiA), isolado de Bacillus sp. codificava para uma enzima AHL
Lactonase com capacidade de degradar e inativar enzimaticamente as
AHLs. Adicionalmente, demonstraram que este gene se encontrava
amplamente distribuído em diversas subespécies de Bacillus
thuringiensis. Outros trabalhos como o de Ulrich (2004), demonstraram
que se podia interferir no mecanismo de comunicação celular da espécie
Burkholderia thailandensis com a introdução de um cultivo de Bacillus
anthracis (que expresava o gene AiiA) afetando a capacidade de
crescimento e motilidade, prevenindo assim a beta-hemolisis de
eritrocitos de carneiro por parte do B. thailandensis.
7. Biorremediação de água e solo
Os produtos biorremediadores atuam de várias formas nos
ambientes aquáticos, seja reduzindo substâncias inorgânicas e orgânicas
para uso como energia, ou mesmo utilizando o acúmulo de matéria
orgânica no fundo dos viveiros como fonte de carbono para a produção
de biomassa bacteriana. Em ambientes aquáticos, basicamente a única
forma de oxigênio disponível é o dissolvido, que acaba sendo
consumido rapidamente na interface solo/água, tornando o solo um
ambiente anóxico nos viveiros. Devido à presença desta condição, é
importante entender e interpretar o potencial redox do solo, o qual
indica a condição reduzida ou oxidada dos sedimentos depositados.
Resumindo de maneira simples, redox positivo está associado com
suficiente oxigênio para a decomposição e oxidação da matéria orgânica
por vias aeróbicas. Redox negativo está associado à falta de oxigênio,
que favorece a formação e acúmulo de compostos reduzidos e altamente
tóxicos aos animais de cultivo, como o gás sulfídrico (H 2S), o nitrito
47
(NO2-) e o gás metano (CH4). Estes compostos, em geral, não estão
presentes em grandes concentrações na coluna d’água, mas podem estar
potencialmente armazenados no lodo e vir a causar problemas quando
os sedimentos são revolvidos, por exemplo, com o arraste das redes,
gerando estresse dos animais e facilitando os surtos de enfermidades
(Moriarty, 1997; Zhou, Li, et al., 2009).
Diversos gêneros de bactérias são utilizados para melhoria dos
parâmetros de qualidade de água bem como remediação de sólidos e do
nitrogênio amoniacal. O processo de inclusão de microorganismos
autóctones em ambientes aquáticos pode ser chamado de
biorremediação ou mais especificamente de bioaumentação, sendo
considerado uma técnica de biorremediação para acelerar a remoção e a
biodegradação de um contaminante indesejável (Jiao et al., 2011).
Estas técnicas se tornaram cada vez mais procuradas na
aquicultura devido sua intensificação de produção. Dentre as diversas
fontes de isolamento destes microorganismos, estes podem ser
classificados como autóctones, alóctones, geneticamente modificadas
(Jiao et al., 2011).
Outro ponto importante para o entendimento da atuação desta
infinidade de microorganismos é a íntima relação destes com o substrato
necessário para seu crescimento e a possibilidade de degradação e
oxidação do mesmo. Dentro dos tanques de cultivo, por exemplo, temos
microorganismos autotróficos, capazes de utilizar moléculas inorgânicas
como fonte de energia, seja via fotossíntese (envolvendo a luz como
fonte de energia, como as cianobactérias e o fitoplâncton) ou
quimiossíntese (envolvendo os compostos químicos como a amônia e
nitrito como fonte de energia). Um exemplo de bactérias
quimioautotróficas são as bactérias nitrificantes que utilizam a amônia e
o nitrito como fontes de energia e o dióxido de carbono (CO 2) como
fonte de carbono inorgânico. Dessa forma, essas bactérias podem
utilizar a energia liberada no processo de oxidação dos compostos
minerais que contêm o nitrogênio orgânico, para reduzir o carbono
orgânico em dióxido de carbono. Já os microorganismos heterotróficos
como os Bacillus spp. utilizam compostos orgânicos para obter o
carbono, que é essencial para o seu crescimento e desenvolvimento. O
sucesso da inclusão destes microorganismos bioremediadores no
ambiente de cultivo se dá através de certas especificidades como
nitrificação, decomposição da matéria orgânica, absorção de um
contaminante específico. Tais bactérias possuem a capacidade de
imobilizar nitrogênio inorgânico durante as suas atividades metabólicas.
(Moriarty, 1998; Decamp et al., 2008; Jiao et al., 2011).
48
A ação microbiana no sistema aquático aumenta a velocidade da
degradação/decomposição da matéria orgânica e promove à supressão
de crescimento de patógenos na água de cultivo (Zhou, et al., 2009;
Zhou, Wang, et al., 2009; Zhou et al., 2010).
Dessa forma, com a intensificação dos cultivos, a maior produção
de resíduos com a menor troca de água possível, se torna uma
necessidade a utilização de biorremediadores na aquicultura moderna,
onde o aumenta da produtividade pode ser associado a bons parâmentro
de qualidade de água no ambiente de cultivo (Wang et al., 2008).
JUSTIFICATIVA
Para a continuidade no crescimento e desenvolvimento da
atividade aquícola, existe a necessidade de se criar estratégias para a
minimização dos efeitos das doenças nos cultivos. A ferramenta mais
difundida hoje em dia para o controle de bacterioses é o uso de
antibióticos. Porém, estes produtos têm conduzido à seleção de bactérias
resistentes e ao acúmulo destes produtos tanto na carne dos peixes,
como no ambiente.
Devido à necessidade de se reduzir os efeitos do uso de
antibióticos na piscicultura e melhorar o controle e a prevenção de
enfermidades em peixes cultivados, técnicas e produtos alternativos para
prevenir enfermidades, como o uso de probióticos que podem auxiliar
na diminuição do impacto ambiental da atividade além de trazer
benefícios aos cultivos incrementando a renda das pequenas e grandes
propriedades rurais .
Ainda são poucos os estudos capazes de confirmar a existência de
colonização das bactérias probióticas em surubins e suas reais alterações
no trato intestinal dos peixes. Estudos com probiótico, comunidade
microbiana, hematologia, imunologia, morfologia do trato intestinal em
peixes nativos são, ainda hoje, muito limitados. Dessa forma, o
ineditismo desse projeto está em através de técnicas clássicas e
moleculares visualizar a adesão das bactérias probióticas a mucosa
intestinal e suas consequentes alterações estruturais, além de relacionálas com as alterações nos parâmetros hemato-imunológicos. Somente
dessa forma estaremos confirmando a existência de colonização e os
reais benefícios do probiótico ao peixes.
49
OBJETIVOS
Objetivo Geral

Avaliar as alterações na saúde do trato gastrointestinal de
surubins híbridos (Pseudoplatystoma sp.) alimentados com dietas
suplementas com o probiótico Weissella cibaria.
Objetivo Específico:

Avaliar através de histologia a densidade de vilosidades,
alterações nos perímetros das vilosidades, integridade do trato intestinal,
número de células caliciformes no trato gastrointestinal dos surubins
alimentados com dietas suplementadas com probiótico,

Avaliar através de microscopia eletrônica bactérias
probióticas aderidas ao trato gastrointestinal, além de sua ultra-estrutura.

Avaliar as alterações nos parâmetros hemato-imunológicos
em surubins alimentados, durante 45 dias, com dietas suplementadas
com probiótico.
HIPÓTESE
Surubins alimentados, durante 45 dias, com dietas suplementadas
com a bactéria probiótica Weissella cibaria apresentará uma melhora
nos parâmetros hemato-imunológicos, aumento no comprimento e
largura das vilosidades, alterações positivas no trato intestinal além da
presença da bactéria probiótica testada.
FORMATAÇÃO
O capítulo 1 está formatado nas normas da ABNT e será um
capítulo de livro em parceria com a EMBRAPA. O capítulo 2 esta
formatado segundo as normas da revista Aquaculture Nutrition, a qual o
artigo será submetido.
50
CAPÍTULO 2
Weissella cibaria e sua ação probiótica no trato intestinal de
surubins híbridos
Weisella cibaria and its probiotic action on the intestinal tract of the
Brazilian hybrid surubim
Gabriel Fernandes Alves Jesus 1, 2, Felipe do Nascimento Vieira1, Bruno
Correa da Silva3, Marcello Mendes do Santos Junior 1, Thiago Tetsuo
Ushizima4, Eder Carlos Schmidt 5, Zenilda Laurita Bouzon5, Gabriella
do Vale Pereira6, Daniel Merrifield6, Maurício Laterça Martins2 & José
Luiz Pedreira Mouriño 2
1
Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Departamento de
Aquicultura, Laboratório de Camarões Marinhos, Rod. Admar Gonzada
1346, 88040-900, Santa Catarina, Florianópolis, Brasil.
2
Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Departamento de
Aquicultura, AQUOS – Aquatic Organisms Health Laboratory, Rod.
Admar Gonzaga 1346, 88040-900 Florianópolis, Santa Catarina, Brazil;
3
EPAGRI – Pesquisador - Rodovia Admar Gonzaga, 1347, Itacorubi,
Florianópolis - SC, 88034-000
4
Empresa Mar & Terra – P&D - Pimenta Bueno –Rondônia, 76970-000.
5
Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética.
Laboratório Central de Microscopia Eletrônica, UFSC, Brazil – BEG –
Campus Universitário – Trindade – Florianópolis, 88040-900.
6
School of Biological Sciences, Faculty of Science and Environment,
Plymouth University, Drake Circus, Plymouth, PL4 8AA I Portland
Square A410.
51
RESUMO
O cultivo de surubins híbridos (Pseudoplatystoma corruscans ♂ e P.
reticulatum♀ ) no Brasil tem sido afetado por doenças bacterianas. A
fim de evitar esse problema, o desenvolvimento de métodos profiláticos,
como os probióticos, tem se mostrado ferramenta promissora para
combater surtos bacterianos. Este estudo avaliou a suplementação
dietética da bactéria ácido lática, Weissela cibaria, e sua ação probiótica
no trato intestinal de surubins híbrido e suas alterações nos parâmetros
hemato-imunológicos. Um total de 96 peixes foram divididos em 12
tanques acoplados ao sistema de recirculação. Os peixes do tratamento
foram alimentados com ração comercial suplementada com a bactéria
probiótica W. cibaria, por um período de 45 dias, e o grupo controle
alimentado com ração comercial sem suplementação. O número de
eritrócitos, trombócitos e linfócitos
foram maiores nos peixes
suplementados, após 45 dias (p <0,05). A porcentagem de fagocitose, o
título aglutinante e a concentração total de imunoglobulinas foram
maiores nos peixes alimentados com a suplementação de probiótico. A
microbiota intestinal alterada foi observada nos peixes suplementados,
onde houve aumento na concentração de bactérias com morfologia de
baciloccus . Na ultraestrutura intestinal houve aumento no comprimento
e na largura das vilosidades intestinais, o número de células
caliceformes por vilo e do perímetro das vilosidades. A bactéria
probiótica W. cibaria foi capaz de colonizar e beneficiar o trato
gastrointestinal dos surubins, melhorando os parâmetros hematoimunológicos dos peixes.
Palavras-chave: Probiótico, Pseudoplatystoma,
imunologia, bactéria ácido-lática.
ração, hematologia,
ABSTRACT
The hybrid surubim (Pseudoplatystoma corruscans ♂ e P.
reticulatum♀ ) farming in Brazil has been affected by bacterial diseases
althought probiotics are one of the promising prophylactic methods
used. This study evaluated the dietary supplementation of a acid-lactic
bacteria, Weissela cibaria, and its probiotic action on the intestinal tract
52
of the hybrid surubim and on some hemato-immunological parameters.
A total of 96 fish were divided into 12 tanks provided by a recirculation
system, the fish were fed with commercial diet supplemented with the
probiotic bacteria W. cibaria and the others treatments received no
supplementation for a period of 45 days. The number of red blood cells,
thrombocytes and lymphocytes were higher in the supplemented fish
after 45 days (p<0.05). The percentage of phagocytosis, specific
agglutination title and total immunoglobulin concentrations were higher
in fish fed with probiotic supplementation. The altered intestinal
microbiota was observed in the supplemented fish where there was an
increase in the concentration of bacteria in morphology baciloccus. The
intestinal ultrastructure was increase in length and width of intestinal
villi, the number of caliceformes cells, and the perimeter of the villis in
the supplemented fish. The probiotic W. cibaria colonized and benefited
the gastrointestinal tract of the hybrid surubim by improving intestinal
health and hemato-immunological parameters.
Key-words: gut development, probiotic, ration, Pseudoplatystoma,
hematology, immunolog, acid lactic bacteria.
1. Introdução
O surubim híbrido (cruzamento entre Pseudoplatystoma
corruscans macho x P. reticulatum fêmea), importante e valioso para a
aquicultura brasileira, é uma das espécies mais apreciadas na água doce
para consumo humano e comércio de ornamentais na América do Sul
(Roubach et al., 2003). Fatores como bom crescimento, alto rendimento
de carcaça, excelente qualidade de carne, sabor suave, cor clara,
ausência de espinhos intramusculares e alto preço de mercado, fazem
com que esse peixe seja bastante procurado pelos exportadores de
pescado (Campos, 2004, Godinho et al., 2007, Nunez et al., 2011).
Com a intensificação do cultivo de surubins, aliado a más práticas
de manejo, altas densidades, rações de má qualidade e baixa qualidade
de água, o aparecimento de doenças foi inevitável (Moraes and Martins,
2004, Silva et al., 2012). A utilização de probióticos é alternativa
preventiva na manutenção da sáude de peixes cultivados, principalmente
por atuar no sistema imunológico competente e na capacidade de resistir
a doenças e ao estresse (Ringo and Gatesoupe, 1998, Merrifield et al.,
2010a, Ringo et al., 2010, Mouriño et al., 2012).
Benefícios ligados à aplicação dos probióticos já foram
comprovados em diversos estudos, tais como exclusão competitiva de
53
bactérias patogênicas (Vine et al., 2004), fontes de nutrientes e enzimas
digestivas (Lazado et al., 2012, Mehrabi et al., 2012, Sun et al., 2012),
modulação do sistema imunológico (Panigrahi et al., 2004), produção de
bacteriocinas e ácidos orgânicos (Balcazar et al., 2007c, Mahdhi et al.,
2011, Mandiki et al., 2011, Silva et al., 2013).
Balcazar et al. (2007a) observaram correlação entre colonização
das bactérias probióticas no trato intestinal com as respostas não
específicas do sistema imunológico humoral, como a ativação do
sistema complemento e da atividade da lisozima em trutas (Salmo
trutta). Ferguson et al. (2010), alimentando tilápia vermelha
(Oreochromis niloticus) com a bactéria probiótica Pediococcus
acidilactici, durante 32 dias, observaram diminuição de riqueza e
diversidade da comunidade microbiana intestinal, enquanto que a
integridade do trato intestinal e a concentração de leucócitos teciduais
apresentaram-se em níveis normais. Merrifield et al. (2010b)
observaram que as bactérias probióticas se aderiram ao epitélio
gastrointestinal de trutas arco íris, e proporcionaram o aumento no
comprimento das microvilosidades intestinais e da atividade endocítica,
após serem suplementadas durante cinco semanas.
Devido à ausência de trabalhos com probióticos para surubins e
pela sua grande produtividade no centro oeste do Brasil, estudos que
descrevam os efeitos da suplementação com probiótico na dieta por
meio de análise hemato-imunológica, ultraestrutura do trato
gastrointestinal e da comunidade microbiana são importantes na
formação de estratégias preventivas de enfermidades. Portanto, o
objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da suplementação dietética com
a bactéria W. cibaria, por meio de análise dos parâmetros hematoimunológicos, histomorfometria e ultraestrutura do trato intestinal.
2. Material e Métodos
2.1. Material biológico e manutenção
A bactéria Weissella cibaria (CPQBA 001-10 DRM 02), utilizada
como cepa probiótica, foi isolada por Mourino et al., (2012) do trato
gastrointestinal de surubins híbridos sadios e assintomáticos oriundos de
fazendas de cultivo do Mato Grosso do Sul – Brasil. A cepa foi
identificada pela Universidade de Campinas (UNICAMP) pela
amplificação do gene 16S do RNA. Sua manutenção foi realizada em
tubos de ensaio contendo caldo MRS (do inglês “Man-Rogosa-Sharpe
broth”) e ativada em meio MRS ágar, incubada a 35°C por 48 h.
54
Para o ensaio de suplementação foram utilizados 96 surubins
híbridos, com peso médio de 44,3 ± 3,0 g e comprimento de 18,2 ± 2,7
cm, oriundos da Piscicultura Piraí, Mato Grosso do Sul, Brasil.
2.2. Preparo do inóculo de probiótico e dietas experimentais
Os peixes foram alimentados com dieta comercial Supra 42%
juvenil gaiola carnívoro (Acqua line extrusada) com a seguinte
composição, segundo dados do fabricante: umidade (máx.) 12%, energia
digestível 3.800 kcal kg-1, proteína bruta (Mín.) 42%, extrato etéreo
(Mín.) 9%, cálcio (Máx.) 3%, fósforo (min.) 1,5% e vitamina C 500 mg
kg-1.
Para o preparo do inóculo probiótico, a cepa bacteriana W.
cibaria foi repicada em meio de cultura caldo MRS (Difco®) e incubada
a 35°C por 48 h. A ração foi aspergida com inóculo de W. cibaria na
concentração de 10 9 CFU.mL-1 na proporção de 100 mL.kg-1 de ração..
Após isso, a ração foi homogeneizada por 15 min e seca em estufa com
circulação de ar a 35°C por 24 h, para retirada do excesso de umidade.
Para verificar a concentração do probiótico na dieta, três amostras da
ração (um grama cada) foram maceradas com 1 mL de solução salina
estéril 0,65% e posteriormente diluída serialmente nove vezes em tubos
de ensaio em fator 1:10. As diluições de 10 -5 a 10-9 foram semeadas em
placas de Petri contendo os meios de cultura MRS e TSA. As placas de
MRS foram incubadas a 35ºC por 48 h e as de TSA incubadas a 28 ºC
por 24 h. Esse processo foi repetido a cada 15 dias durante o preparo das
dietas, para garantir alta concentração de bactérias probióticas na dieta.
A concentração do probiótico presente na ração, durante o todo
experimento, foi de 1,18 x 107 ± 0,47 UFC.g-1.
2.3. Delineamento experimental
Os 96 surubins híbridos foram aleatoriamente distribuídos em 12
caixas circulares de 100 L, com sistema de aeração e aquecimento
constantes (27,5 ± 2,46 °C), totalizando oito peixes por unidade
experimental. As unidades estavam acopladas ao sistema de recirculação
de água do laboratório experimental, o qual contém filtros aeróbicos e
anaeróbicos com filtração de material particulado, o qual manteve a
qualidade da água, durante o período experimental, em condições
adequadas de cultivo da espécie. Os parâmetros se mantiveram em:
oxigênio dissolvido 8,06 ± 0,56 mg.L-1 e temperatura 27,5 ± 2,46 °C
medidos com oxímetro YSI- 550A; amônia total 1,5 ± 0,5 mg.L-1; nitrito
0,67 ± 0,65 mg.L-1 e nitrato 1,96 ± 1,44 mg.L-1 e pH 7,83 ± 0,39,
medidos com kit colorimétrico Labcon Test.
55
A dieta foi fornecida três vezes ao dia na taxa de 3% da biomassa
total, apenas para a manutenção do peso dos peixes. Os peixes foram
alimentados durante 45 dias, onde seis caixas receberam ração
comercial suplementada com probiótico (100 mL.kg-1 de ração) e as
outras seis caixas apenas ração comercial (Supra 42% juvenil gaiola, 2-4
mm) sem suplementação. Após 45 dias, os peixes permaneceram em
jejum por 24 h para posterior anestesia e coleta de amostras.
2.4. Análises hemato-imunológicas
Para as análises hemato-imunológicas, três peixes por tanque
foram anestesiados com benzocaína (1g:10 L), o sangue coletado por
punção do vaso caudal com seringas de 3 mL (21 G) com
anticoagulante, e realizada a biometria. Alíquotas de sangue foram
coletadas e utilizadas para realização do ensaio de fagocitose. Do
restante foi feito um pool do sangue dos peixes coletados da mesma
caixa. O sangue então foi centrifugado a 1400 g durante 10 min para
retirada do plasma e armazenamento a -20°C para posterioses analises
imunológicas.
A atividade de lisozima foi determinada pelo método de
(Sankaran and Gurnani, 1972) com pequenas modificações, onde uma
suspensão de Micrococcus lysodeikticus liofilizado (Sigma-Aldrich) foi
diluída em tampão fosfato salina (PBS 2, 0.04 M fosfato monobásico,
pH 6.2) na concentração de 0,5 mg.mL-1, imediatamente antes de sua
utilização. Vinte microlitros do plasma, em quintuplicata, foram
semeados em microplaca de fundo chato e adicionados 200 µL da
suspensão de células de M. lysodeikticus em cada poço. Logo após, foi
feita a leitura da absorbância inicial em 492 nm, posteriormente
incubou-se as microplacas por 10 min a 35ºC, e realizou-se a leitura das
absorbâncias finais. A redução na absorbância das amostras foi
convertida em concentração de lisozima (µg.mL -1), determinada pela
curva padrão realizada anteriormente com lisozima de clara de ovos de
galinha (HEWL, Sigma-Aldrich).
A proteína total do plasma sanguíneo foi mensurada com o kit
Proteína Total (Lab Test®). A concentração de imunoglobulina total foi
mensurada de acordo com o método descrito por Amar (2000), onde
misturou-se 50 µL do plasma com 50 µL de solução de polietileno glicol
PEG) (Sigma-Aldrich) 12% e a mistura incubada á temperatura
ambiente por duas horas, a fim de precipitar as moléculas de
imunoglobulina. O precipitado de imunoglobulina foi removido por
centrifugação (5000 g a 4ºC por 10 min) e o sobrenadante retirado e
mensurado a quantidade de proteína total também pelo kit, utilizando-se
56
albumina bovina para confecção da curva padrão. A concentração de
imunoglobulina total está expressa em mg.mL-1, sendo calculada pela
fórmula:
Total Ig (mg/mL) = proteína total do soro - proteína tratada com
PEG
O título da atividade aglutinante do plasma foi realizado em
microplacas de fundo “U” diluído na proporção de 1:1 em PBS do
primeiro ao 12° poço. Após esse procedimento, 50 µL da bactéria
inativada (Aeromanas hydrophila – ATCC 228-08 CPQBA DRM) foi
adicionada em todos os poços na densidade óptica de aproximadamente
0,4 na escala de Macfarland em 550 nm. A microplaca foi incubada a
25°C por 18 h em câmara úmida. A aglutinação foi confirmada
visualmente observando um bottom na superfície do poço. O título de
aglutinação foi considerado recíproco ao ultimo poço que apresentou
aglutinação (Silva et al., 2009).
A atividade antimicrobiana do plasma foi realizada contra duas
bactérias: A. hydrophila e Enterococcus durans (ATCC 19492), em
microplaca de 96 poços com fundo chato, de acordo com Silva et al.
(2009). O inóculo da A. hydrophila foi crescido em BHI a 30°C por 12 h
e o E. durans em TSB preparados na concentração de 0,5 na escala de
Macfarland e diluído em meio de cultura pobre (PB, do inglês Poor
Broth) 100.000 vezes. Posteriormente, foi realizada diluição seriada do
plasma em meio PB no fator 1:2 até o 12° poço. Para controle positivo e
branco, solução salina foi diluída em PB, da mesma forma que o plasma.
Finalmente, 20 µL das bactérias foram adicionados em cada poço da
amostra diluída do plasma e do controle positivo. A microplaca
contendo E. durans foi incubada a 28°C por 24 h e a microplaca
contendo A. hydrophila foi incubada a 28°C por 12 h. O crescimento
dos microorganismos foi determinado em leitora de microplaca (Expert
Plus Asys®) para leitura a 550 nm. A atividade antimicrobiana do
plasma é recíproca à última diluição que apresentou atividade
bactericida.
O sangue foi utilizado para a confecção de extensões sanguíneas
em duplicata e coradas com Giemsa/MayGrunwald (Rosenfeld, 1947)
para a contagem diferencial de leucócitos, bem como contagem total de
leucócitos (WBC) e trombócitos pelo método indireto, segundo
Ishikawa et al., (2008). Uma alíquota foi usada para a determinação do
hematócrito (Ranzani-Paiva et al., 2013) e o restante para posterior
quantificação do número total de eritrócitos (RBC) em câmara de
Neubauer.
57
Para a determinação da porcentagem de leucócitos fagocitários,
0,5 mL do sangue e 0,25 mL de uma suspensão de 1x106 UFC.mL-1 de
A. hydrophila inativada com 10% de formalina tamponada 10% foram
adicionados em tubos de ensaio em que foram mantidos em 28°C por 30
min e homogeneizados a cada 10 min. Após isso, o sangue foi utilizado
para a confecção de extensões sanguíneas em duplicata e as lâminas
coradas com Giemsa/MayGrunwald (Ranzani-Paiva et al., 2013). O
número de leucócitos fagocitários foi contado pela porcentagem do
número total de leucócitos da extensão (Martins et al., 2009).
2.5. Histologia
Amostras da região anterior do intestino médio dos surubins,
região de maior absorção de nutrientes, foram extirpadas a partir de três
peixes por unidade experimental (da Silva et al., 2010) e fragmentos dos
tratos foram fixados em solução de paraformaldeído 2.5 % em tampão
fosfato 0.1 M, pH 7.2, overnight (Schmidt et al., 2009). Após a fixação,
as amostras foram lavadas e desidratadas em séries crescentes de etanol.
Após a desidratação, as amostras foram infiltradas em historesina (Leica
Historesin, Heidelberg, Alemanha). Secções com 5 µm de espessura
foram corados com hematoxilina e eosina e fotografados com o
microscópio Epifluorescent (Olympus BX 41), equipado com o sistema
de captura Image Q Capture Pro 5.1 Software (Qimaging Corporation,
Austin, TX, Estados Unidos da América). Utilizando as imagens, foram
mensurados: comprimento, largura e perímetro das vilosidades (µ);
número de vilos e número de células caliceforme por vilosidade.
2.6. Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
A fim de verificar a integridade das células intestinais, das
microvilosidades e presença de bactérias probióticas, amostras dos tratos
intestinais foram fixadas em solução de glutaraldeído 2.5 %, sacarose
2.0%, tamponadas com cacodilato 0.1 M (pH 7.2) (Schmidt et al.,
2010), pós-fixadas em 1 % tetróxido de ósmio por 4 h, desidratadas em
série de soluções aquosas de concentrações crescentes de acetona. Após
a desidratação, o material foi infiltrado com resina Spurr. As secções
ultrafinas foram feitas em ultramicrótomo e contrastadas em acetato de
uranila e citrato de chumbo. As amostras foram observadas e
fotografadas em microscópio eletrônico de transmissão (JEOL Ltd.,
Tokyo, Japão, a 80 kV).
58
2.7. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
A fim de se verificar a integridade, a concentração e a morfologia
das bactérias aderidas no epitélio intestinal, amostras do trato intestinal
foram fixadas e processadas com a mesma metodologia utilizada para
MET até a etapa de desidratação. As amostras foram então desidratadas
em séries etanólicas e secas em ponto crítico EM-CPD-030 (Leica,
Heidelberg, Alemanha). Subsequentemente, as amostras foram aderidas
a suportes metálicos e metalizadas (Metalizador Blatec, CED 030) com
ouro. A análise e fotomicrografias foram feitas em MEV Jeol 6390 LV
(JEOL Ltd., Tokyo, Japão, a 20 kV).
2.8. Ganho de peso e sobrevivência
As pesagens iniciais e finais foram feitas individualmente para
todos os peixes. Os cálculos de desempenho foram feitos para cada
unidade experimental, somente com os dados da primeira e última
pesagem dos peixes. Foram determinados: peso inicial (g); peso final
(g); ganho de peso (g) e sobrevivência (%).
2.9. Análises estatísticas
Para comparação das médias entre os tratamentos foi realizado o
teste de Levene para verificação de homocedasticidade, em seguida o
teste de Shapiro-Wilks, para normalidade dos dados. Os dados que não
apresentaram homogeneidade de variâncias foram transformados em
log10 (x+1) e posteriormente, foi realizado Teste t de student, com nível
de significância de 5%.
3. Resultados
3.1. Parâmetros hematológicos
Houve aumento significativo no número de eritrócitos,
trombócitos e linfócitos no sangue dos animais alimentados com ração
suplementada com probiótico (Tabela 1). O número total de leucócitos,
monócitos, eosinófilos, basófilos, neutrófilos, assim como na
porcentagem de hematócrito não apresentaram diferença significativa
entre os animais alimentado com dieta suplementada ou não com
probiótico.
3.2. Parâmetros imunológicos
O título aglutinante do plasma contra A. hydrophila, a
porcentagem de fagocitose e a concentração de imunoglobulina total,
59
foram maiores nos peixes que receberam alimentação suplementada
com a bactéria probiótica W. cibaria (Tabela 2). Apesar disso, não
houve influência da suplementação com probiótico na ração sobre a
atividade de lisozima, porcentagem de fagocitose e proteína plasmática
total dos peixes (Tabela. 2). Desde então, a atividade antimicrobiana do
plasma contra A. hydrophila e E. durans também não apresentou
diferença significativa entre os animais suplementados ou não.
3.3. Colonização do trato intestinal
A capacidade de colonização do trato gastrointestinal da bactéria
probiótica Weissella cibaria foi confirmada em experimentos anteriores,
utilizando técnicas dependentes de meio de cultura, onde a concentração
de bactérias ácido-lácticas se mantiveram viáveis na concentração de
4,87 ± 0,30 Log CFU g-1 (Mourino et al., 2012).
No presente trabalho, a MEV do trato intestinal mostrou maior
concentração de bactérias colonizando o tecido dos peixes alimentados
com probiótico caracterizadas em sua maioria bacilococcus e bacilos.
Por outro lado, os peixes não suplementados com probiótico
apresentaram menor concentração de bactérias aderidas ao epitélio
intestinal, em sua maioria bactérias com morfologia de bastonetes e
coccus (Figura 3B e E).
3.4. Histomorfometria intestinal
Os peixes alimentados com dieta suplementada com probiótico
apresentaram aumento significativo no comprimento e largura das
vilosidades intestinais, número de vilos, número de células caliceformes
por vilosidade, maior perímetro do vilo caracterizando maior absorção
intestinal e área superficial devido ao maior número de dobras e
ramificações da mucosa (Tabela 3).
A MET confirmou que os animais alimentados com as duas
rações apresentaram total integridade da mucosa intestinal. O epitélio
intestinal apresentou células intactas e bem definidas, ausência de
vacúolos e espaços intercelulares, com bordas de escova organizadas e
bem desenvolvidas (Figura 3C e F).
Os peixes alimentados com probiótico apresentaram maior
densidade de microvilosidades. Também foi observado, no lúmen
intestinal, a presença de células de defesa (trombócitos e eosinófilos),
assim como a presença de bactérias morfologicamente parecidas com a
probiótica testada W. cibaria (Figura C e F).
60
3.5. Ganho em peso e sobrevivência
No presente estudo, não houve diferença significativa no ganho
de peso dos animais, onde o grupo controle obteve um ganho de 19,44 ±
3,08g e o os animais suplementados de 18,92 ± 2,25g (p=0,64).
Os animais mantiveram-se saudáveis, aceitando bem a dieta e o
manejo. A sobrevivência dos animais apresentou média de 97,6 ± 1,1%
no grupo controle e 98,8 ± 1,8% no tratamento, não apresentando
diferença significativa (p=0,79).
4. Discussão
O aumento no número de eritrócitos pode estar associado com o
aumento da absorção de ferro, que pode ser aumentada pela ação dos
probióticos (Silva et al. 2008). Esse ferro uma vez absorvido será
transformado, na medula óssea, em células vermelhas jovens que, irão
maturar e migrar para o sistema circulatório. Dessa forma, quanto maior
for a absorção de ferro, maior poderá ser o número de eritrócitos e a
concentração de hemoglobina no plasma (Bell, 1999).
O probiótico pode ter induzido um aumento da produção ou
liberação de linfócitos e trombócitos nos animais suplementados, o que
pode ser interessante, como estas células têm funções importantes no
sistema imunológico dos peixes (Tavares-Dias, 2003). O aumento do
número de trombócitos e linfócitos sugere uma melhora no sistema
imunológico nos peixes alimentado com probióticos. Corroborando o
presente resultado, outros autores relataram aumento no número de
linfócitos e trombócitos no sangue de tilápia do Nilo (O. niloticus)
(Jatoba et al., 2011) e robalo (Centropomus parallelus) (Barbosa et al.,
2011) após suplementação dietética com probiótico.
A suplementação da bactéria probiótica Weissella cibaria
incrementou o sistema imunológico dos animais, verificado pelo
aumento de imunoglobulina total no plasma sanguíneo. O mesmo foi
verificado em trabalhos anteriores com trutas arco-íris suplementadas
com bactéria probiótica Lactobacillus rhamnosus (Panigrahi et al.,
2005) e surubins híbridos suplementados com bactéria W. cibaria
(Mouriño et al., 2012).
No presente trabalho, o aumento da concentração de
imunoglobulina e da aglutinação nos animais alimentados com
suplementação probiótica pode estar associado ao aumento do número
de linfócitos, também incrementado pelo probiótico. Corroborando com
esse estudo, Panigrahi et al. (2009) observou o aumento de
imunoglobulina total em animais suplementados com bactéria
probiótica L. rhamnosus, além do incremento na porcentagem de
61
fagocitose e atividade de lisozima. O incremento imunológico em
animais alimentados com probiótico já foi verificado em trabalhos
anteriores (Balcazar et al., 2007b, Demeterova et al., 2009, Son et al.,
2009, Chiu et al., 2010, Merrifield et al., 2010a). Os processos de
aglutinação e inibição dos agentes patogênicos consistem em dois
mecanismos de resposta imunológica. São constituídos por moléculas
presentes no plasma sanguíneo chamadas lectinas e imunoglobulinas. As
lectinas são proteínas capazes de se ligar a açúcares presentes na parede
celular de bactérias, porém apresenta menor especificidade quando
comparadas às imunoglobulinas, produzidas pelos linfócitos B, as quais
apresentam grande ação ligante contra antígenos.
Histologicamente, a parede intestinal de surubins híbridos
consiste em quatro camadas a partir do lúmen, que são: mucosa,
submucosa, muscular interna e externa, e serosa. A mucosa intestinal
consiste em um epitélio simples, a lâmina própria com a presença,
principalmente, de enterócitos, células caliceformes e leucócitos
infiltrados.
O aumento na morfometria intestinal pode estar relacionado à
capacidade das bactérias probióticas inibirem a adesão de bactérias
patogênicas no epitélio intestinal. Resultados semelhantes utilizando-se
peixes alimentados com ração suplementada com bactéria probiótica
foram verificados em estudos anteriores em Sparus aurata (Cerezuela
et al., 2012) e utilizando a bactéria Lactobacillus rhamnosus em tilápiasdo-nilo (Pirarat et al., 2011).
Os peixes do tratamento probiótico apresentaram maior número
de células caliceformes quando comparados ao controle. Dessa forma,
um maior número de células caliceformes aliadas ao muco e a presença
de leucócitos infiltrados, implicam em elevada resistência a patógenos
intestinais (Deplancke and Gaskins, 2001).
Através da MET foi possível verificar que tanto os tratos
intestinais dos peixes suplementados com probiótico, como os do grupo
controle se mostraram intactos na barreira epitelial, com junções
intercelulares e desmossomos, enterócitos organizados, ausência de
translocações, dano celular, edemas e inflamações. O mesmo efeito foi
verificado em trabalhos anteriores com Salmão do Atlântico (Ringo et
al., 2007), testando a bactéria Pedicoccus acidilactici em Tilápiasvermelhas ( Ferguson et al., 2010) e o efeito de bactérias probióticas na
colonização e alterações das microvilosidades em truta arco-íris
(Merrifield et al., 2010b)
Através de MEV foi possível verificar maior concentração de
bactérias colonizando a mucosa intestinal, nos animais que receberam
62
suplementação probiótica, sendo elas na grande maioria bacilococos,
morfologia semelhante a bactéria W. cibaria. Já nos peixes que não
receberam a suplementação probiótica verifica-se uma menor
colonização, baseada em uma flora endógena de bacilos (figura 4). Nas
amostras de MET, é possível verificar a presença de células bacterianas
com morfologia similar ao da bactéria probiótica testada W. cibaria
associadas ao muco, além de grande número de células sanguíneas de
defesa, apenas nos animais suplementados. A colonização do trato
intestinal e a associação de células bacterianas ao muco intestinal
encontrado neste estudo, corroboram as observações de Merrifield et al.,
(2010b).
5. Conclusão
A bactéria probiótica Weissella cibaria foi capaz de colonizar o
trato gastrointestinal dos surubins híbridos, alterar a ultraestrutura e a
microbiota intestinal presente, imunomodular parâmetros hematoimunológicos.
6. Agradecimentos
Os autores agradecem ao CNPq (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo suporte financeiro,
pela bolsa de PDI à J.L.P. Mouriño, pela bolsa de produtividade em
pesquisa à M.L. Martins (CNPq 302493/2010-7), bolsa de mestrado à
Capes e a empresa Mar e Terra pelo fornecimento dos peixes, Ao
Laboratório Central de Microscopia Eletrônica pelo apoio e estrutura
para realização das análises de microscopia eletrônica.
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69
Tabelas
Tabela 1: Parâmetros hematológicos de surubins híbridos (Pseudoplatystoma
corruscans x P. reticulatum) alimentados durante 45 dias com ração comercial
suplementada com probiótico ou sem suplementação (Controle)
Controle
Probiótico
Valor-p
1,65 ± 0,15
1,90 ± 0,05*
0,0073
Trombócitos (x103.µL-1)
36,90 ±2,96
48,9 ±1,04*
0,0431
Leucócitos (x10 . µL
82,40 ±1,43
89,1 ±1,41
0,4777
64,00 ±1,43
84,0 ±1,25*
0,0382
2,08± 0,97
1,38 ± 0,35
0,1213
Eosinófilos (x103. µL-1)
3,08 ± 2,23
2,98 ± 1,51
0,6233
Basófilos (x10 . µL
19,20 ± 0,63
17,7 ± 0,61
0,1688
2,16 ± 0,98
2,55 ± 1,35
0,5909
Hematócrito (%)
24,91± 2,96
26,08± 1,89
*Diferença significativa de acordo com teste t (p<0,05).
Dados apresentados em média ± desvio padrão.
0,4912
Eritrócitos (x10 .µL
6
-1
3
)
-1
Linfócitos (x10 . µL
3
-1
)
Monócitos (x10 . µL
3
-1
3
-1
)
)
)
Neutrófilos (x10 . µL
3
-1
)
Tabela 2: Título aglutinante e atividade antimicrobiana do plasma de surubins
híbridos (Pseudoplatystoma corruscans x P. reticulatum), alimentados durante
45 dias com ração comercial suplementada com probiótico ou sem
suplementação.
Controle
Probiótico
Valor-p
10,46± 1,12
10,75±1,30
0,7113
23,63± 1,15
24,42±1,43
0,4235
Imunoglobulina Total (mg.ml )
0,93 ± 0,73
2,11±0,15*
0,0426
Fagocitose (%)
7,00 ± 1,94
9,75±2,98*
0,0172
Título aglutinante
7,40 ± 0,54 8,40±0,54*
*Diferença significativa de acordo com teste t (p<5%).
Dados apresentados em média ± desvio padrão
0,0203
-1
Lisozima (µg.ml )
-1
Proteína total (mg.ml )
-1
70
Tabela 3: Comprimento e largura das vilosidades, do número de vilos e de
células caliceformes, e do perímetro dos vilos, de surubins híbridos alimentados
ou não com suplementação probiótica durante 45 dias.
Histomorfometria
Controle
Probiótico
Valor- p
Comprimento (µm)
670 ±60,59
917,8 ±110,3*
0,0006
Largura (µm)
114,4±10,66
197,2±28,77*
0,0023
29±1,64
32,5±0,35*
0,0061
4,00±2,55
6,00±2,7*
0,0075
1406,82±411,3
1994,3 ± 663,3*
0,0003
Número de vilos
Células Caliceformes
Perimetro (µm)
*Diferença significativa de acordo com teste t (p<5%).
Dados apresentados em média ± desvio padrão
71
Figuras
Figura 3: Alterações na ultraestrutura intestinal de surubins híbridos
alimentados ou não com suplementação probiótica, durante 45 dias. Em (A,B,C)
Grupo controle em Microscopia de Luz (ML), Microscopia eletrônica de
varredura (MEV) e Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
respectivamente; (D,E,F) Grupo probiótico em ML, MEV, MET,
respectivamente. cc células caliceforme, li linfócitos infiltrados, l lúmen, m
mucosa, be borda em escova, b bacilos, bc bacilococcos, e enterócitos, mv
microvilosidades, cd células de defesa.
72
Figura 4: Alterações na microbiota intestinal de surubins híbridos alimentados
(Probiótico) ou não (Controle) com suplementação probiótica, durante 45 dias,
utilizando microscopia eletrônica de varredura (MEV). Verifica-se (aumento
1.500 x) bactérias com morfologia de bacilos no Controle e bactérias do gênero
bacilococos no tratamento probiótico. Nota-se também uma maior concentração
de bactérias no tratamento probiótico quando comparado ao Controle.
Controle
Probiótico
73
8.
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