Influência da microbiota intestinal no perfil das

Concurso BD Biosciences Pesquisador SBI
Projeto Finalista 2013
Influência da microbiota intestinal no perfil das células NKT num modelo
experimental de colite
Cristhiane Favero de Aguiar
ABSTRACT
Inflammatory bowel diseases are disorders that affect millions of people worldwide. The
inflammatory process in these diseases involves innate and adaptive immunity and also an
influence of gut microbiota. NKT cells are a distinct subtype of T lymphocytes that play a role in
intestinal mucosal immunity in experimental models of colitis. Studies regarding the role of NKT
cells, gut microbiota and the inflammatory process in colitis are still scarce. Therefore, our
project aims to relate the influence of gut microbiota in the profile of NKT cells during colitis and
how such change may affect intestinal inflammation. Thus, we will use an experimental model
of DSS-induced colitis to assess the role of NKT cells in colitis and the influence of changing
gut microbiota in the profile of these cells. We will analyze the profile of cytokines and
chemokines involved in this model, the phenotype of NKT cells through flow cytometry,
histology of intestinal tissue and changes in microbiota.
INTRODUÇÃO
As doenças inflamatórias do intestino são uma condição que afeta milhões de pessoas e
compreende duas entidades distintas: a colite ulcerativa (UC) e a Doença de Crohn. A UC e a
Doença de Crohn podem ser consideradas doenças da sociedade moderna, e suas
frequências em países desenvolvidos têm aumentado desde o século 20 [1].
O processo inflamatório na UC é caracteristicamente restrito à camada mucosa, sendo que o
infiltrado pode variar em densidade e composição durante a doença ativa ou estágios de
remissão. Tal infiltrado é composto principalmente de linfócitos, plasmócitos e granulócitos [2].
Portanto, anormalidades na imunidade humoral e celular também ocorrem na UC. Níveis
elevados de IgM, IgA e IgG são comuns nas doenças inflamatórias do intestino, com maiores
níveis de IgG1 na UC [3]. A imunidade adaptativa também participa na UC, com uma resposta
Th2 atípica, indicada pela presença de células NKT no cólon que secretam grande quantidade
de IL-13, mediando a apoptose e disfunção da barreira epitelial [4,5].
Células NKT variantes e invariantes são encontradas no intestino entre os linfócitos
intraepiteliais e também na lamina própria. A ativação descontrolada ou insuficiente das células
NKT pode ter papel importante na patogênese das doenças inflamatórias do intestino [4]. Por
outro lado, a ativação dessas células NKT intestinais por células apresentadoras de antígenos
pode contribuir para a imunidade da mucosa contra bactérias patogênicas e comensais [6].
Essas bactérias patogênicas e comensais compõem a microbiota intestinal, que tem um papel
importante nas doenças inflamatórias intestinais. Tem sido sugerido que alterações na
composição da microbiota intestinal e defeitos na imunidade da mucosa, ou os dois fatores
combinados poderiam levar à UC [1].
R. Alexandre Dumas, 1976 - São Paulo, SP 04717-004 Brazil | 0800 771 71 57 | [email protected] | bdbiosciences.com/br
Concurso BD Biosciences Pesquisador SBI
Projeto Finalista 2013
As interações entre a microbiota intestinal e o sistema imune do hospedeiro começam no
nascimento, sendo que a microbiota modula o desenvolvimento do sistema imune e esse
modula a composição da microbiota [7]. As bactérias do intestino direcionam o
desenvolvimento imune e orquestram a expansão de numerosas populações de células
imunes no intestino, e também desenvolvem importante papel na manutenção da homeostase
imune [8].
Dessa forma, torna-se importante avaliar as interações entre células do sistema imune, como
as NKT, com a microbiota intestinal e observar como a relação entre elas pode afetar o
desenvolvimento das doenças inflamatórias intestinais.
OBJETIVOS
Objetivo Geral: Avaliar a participação e o perfil das células NKT após alteração da microbiota
intestinal num modelo experimental de colite.
Objetivos Específicos
- Caracterizar o fenótipo das células NKT presentes na mucosa intestinal durante o processo
inflamatório de colite;
- Relacionar o fenótipo das células NKT com as diversas formas de alteração de microbiota no
modelo de colite;
- Caracterizar o perfil de citocinas e quimiocinas durante a colite e após alteração da
microbiota.
MATERIAL E MÉTODOS
O estudo utilizará um modelo de indução de colite pela ingestão de Dextran Sulfato de Sódio
(DSS) a 2,5%. Os experimentos serão realizados de acordo com a lei federal 6638 de 1979
que regulamenta o emprego de animais em experimentação científica, e com aprovação pelo
Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de São Paulo (USP).
Usaremos camundongos C57BL/6j, J!18-/- e CD1d-/-, machos, com 8 semanas, pesando de
20 a 28g. Após indução da colite e alteração da microbiota, os intestinos serão removidos dos
animais eutanasiados e processados a fim de se obter os linfócitos da lamina própria. Após
separação pelo gradiente de Percoll, os linfócitos serão marcados com os anticorpos
monoclonais para análise da marcação das moléculas de superfície CD3, CD4, CD69, CD25,
NK1.1, TCR", V"2, V"7, mCD1d. Após estímulo e permeabilização, serão feitas as marcações
intracelulares para IL-4, IFN-# e TNF-!. As marcações serão divididas de acordo com o estudo
e a capacidade de leitura do citômetro.
As amostras serão analisadas no aparelho FACSCanto II, utilizando o software FACSDIVA
(BD Biosciences), e então analisadas com o software FlowJo.
O concurso BD Biosciences Pesquisador SBI visa o reconhecimento e apoio aos
pesquisadores que promovem o constante avanço científico através do incentivo à técnica
de Citometria de Fluxo com Múltipla Marcação no Brasil.
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