Análise da expressão gênica através de PCR em tempo real da

56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
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Análise da expressão gênica através de PCR em tempo
real da Enzima Piruvato Descarboxilase em linhagem
industrial da levedura Dekkera bruxellensis
Liberal, ATS; Torres, RRNB; Morais Jr, MA
Laboratório de Genética de Microorganismos, Departamento de Genética, UFPE
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Palavras-chave: Fermentação alcoólica, Dekkera bruxellensis, PDC, ARO 10, Expressão gênica.
Introdução: Nos diversos processos fermentativos, inclusive na fermentação das destilarias de álcool combustível,
a principal levedura contaminante é a Dekkera bruxellensis. A adaptação dessa levedura ao processo industrial pode
ser explicada através da identificação e análise dos genes responsáveis pelas vias do metabolismo central e genes
relacionados que vem sendo feito pelo nosso grupo de pesquisa a partir do banco de dados do seqüenciamento
desta levedura. Identificamos recentemente dois genes na D. bruxellensis, 2774ARO10Db e 3332ARO10Db, ambos
relacionados ao gene PDC que codifica enzimas da família piruvato descarboxilase, responsáveis pelo ponto chave
no metabolismo fermentativo da glicose em Saccharomyces cerevisiae. Nas leveduras o piruvato é descarboxilado
a acetaldeído pela piruvato descarboxilase e, subsequentemente, a etanol pela álcool desidrogenase no processo
conhecido como fermentação alcoólica. Objetivos: Analisar a expressão gênica dos dois genes PDC identificados
na D. bruxellensis, através da PCR em tempo real. Métodos: Foi utilizada a linhagem industrial GDb248 da
levedura D. bruxellensis, isolada da fermentação alcoólica. O cultivo celular desta levedura foi submetido a dois
experimentos, um de resposta rápida (cultivo e coleta após 1 hora) e um de resposta lenta ( foram coletadas
alíquotas do cultivo em 0,1DO e 1DO de concentração celular durante aproximadamente 24horas), e em ambos
foram utilizados dois meios de cultivo YNB sem aminoácidos e sem sulfato de amônia com 2% de glicose, sendo
que no primeiro, foi adicionado 5g/L de sulfato de amônia e no segundo 3,06g/L de fenilalanina. Todas as amostras
coletadas foram submetidas à extração de RNA (Kit Total RNA isolation – NucleoSpin RNA II). A partir do RNA
extraído foi sintetizado o cDNA (kit ImProm-II™ Reverse Transcription System Promega II). Os ensaios de PCR em
Tempo Real foram realizados na plataforma ABI Prism 7300 Applied Biosystems (kit SYBR Green PCR Master Mix).
Resultados: Nos dois experimentos os genes 2774ARO10Db e 3332ARO10Db apresentaram maior expressão no
meio suplementado com fenilalanina e repressão no meio suplementado com sulfato de amônia. No experimento
de resposta rápida o gene 3332ARO10Db foi 28 vezes mais expressso que o gene 2774ARO10Db. Enquanto que no
experimento de resposta lenta o gene 2774ARO10Db é que foi 5 vezes mais expresso que o gene 3332ARO10Db.
Conclusões: Os dois genes PDC encontrados na D. bruxellensis respondem positivamente ao meio com fenilalanina
adicionada. Além disso, o gene 3332ARO10Db é responsável pela resposta rápida, enquanto o gene 2774ARO10Db
é responsável pela resposta lenta, quando a D. bruxellensis é cultivada em meio suplementado com fenilalanina.
Apoio Financeiro: CNPq, Capes