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EXAME de ENGENHARIA GENÉTICA
(Época Especial)
Data: 12 de Setembro de 2006
Duração máxima: 2h 30 min
Para o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes conta o cancro, é essencial
compreender os mecanismos de resistência intrínseca ou adquirida a fármacos
anticancerígenos e identificar os alvos e o modo de acção destes. Organismos modelo,
como é o caso da levedura Saccharomyces cerevisiae, são preciosas ferramentas para o
desenvolvimento dos estudos necessários.
Nos últimos anos, o tratamento de doentes com leucemia crónica mieloide (CML), que
representa 15% das leucemias em adultos, alterou-se consideravelmente devido
principalmente à utilização de Imatinib (IM). Muitos dos novos doentes diagnosticados
pela primeira vez na fase crónica da CML tratados com IM conseguem respostas estáveis
a longo prazo; no entanto, um grupo de doentes não previamente expostos ao fármaco, tal
como a maioria dos pacientes em fase avançada do tratamento, apresentam resistência à
terapia. Pretende-se pois compreender os mecanismos de resistência a IM em CML e
identificar novos alvos de acção do IM, recorrendo à levedura, não só como modelo
experimental eucariótico mas também como célula hospedeira para a expressão
heteróloga de genes humanos de interesse. Suponha que se encontra num laboratório que
acompanha mais de 220 pacientes de CML, de vários hospitais portugueses, antes de
iniciarem o tratamento com IM e durante o curso da terapia. Desses, aproximadamente
15% apresentam resistência ao tratamento com IM, embora os mecanismos subjacentes a
esta resistência se não encontrem determinados em cerca de 70%. Na pesquisa de novos
genes e mecanismos de resistência a IM e da acção do IM pretende-se recorrer a células
primárias de pacientes com CML e ao modelo eucariótico fundamental S. cerevisiae
usando diversas estratégias experimentais:
1) a análise do fenótipo de uma colecção de mutantes da levedura em que todos os
genes não essenciais foram individualmente eliminados, com vista à identificação
dos que apresentem uma susceptibilidade a IM alterada. Esses mutantes foram
obtidos por recurso a uma cassete de eliminação, explorando a conhecida capacidade
de recombinação homóloga deste organismo.
Esquematize, justificando, os vários passos/condições experimentais essenciais ao
sucesso da preparação de cada um destes mutantes.
2) a análise comparativa do transcritoma (transcritómica) e do proteoma (proteómica)
da levedura com vista à identificação de genes cuja expressão se altera por exposição
a stresse causado por IM.
a) Justifique a selecção destas 2 abordagem experimentais e esquematize o tipo de
experiências que deveria planear para o efeito.
b) Refira-se sumariamente aos avanços científicos e tecnológicos que vieram tornar
possível estas análises de expressão global, ao nível do genoma.
c) Indique as vantagens/limitações das 2 abordagens tendo em atenção o referido
objectivo.
3) pesquisa in silico de genes humanos homólogos a genes da levedura seleccionados
entre os identificados com base nas referidas abordagens pós-genómicas. A essa
pesquisa seguir-se-á a análise dos níveis de expressão e de polimorfismos em células
de doentes portugueses com CML resistentes à terapia com IM e da sua expressão
heteróloga na levedura. A expressão heteróloga na levedura permite vir a realizar
com facilidade estudos de análise funcional, quer no que respeita ao seu
envolvimento na resistência a IM quer estudos bioquímicos mais detalhados dos seus
produtos, por exemplo, confirmar a actividade biológica de eventuais bombas de
efluxo (proteínas membranares que promovem a expulsão activa da célula) de IM.
Para produzir uma dessas proteínas transportadoras de interesse na levedura,
pretende usar como vector de clonagem um vector de vai e vem, capaz de replicar na
levedura e em E. coli.
a) Qual o interesse de usar este tipo de vector.
b) A marca de selecção do vector de clonagem para utilizar em levedura é uma
marca dita auxotrófica (para uracilo; ura) e a marca para usar em E. coli é um
gene que confere resistência a Ampicilina (AmpR). Por que razões se recorre a 2
genes diferentes para a selecção de transformantes nessas 2 células hospedeiras e
como se poderão seleccionar esses transformantes?
c) O vector de clonagem é centromérico e contém o promotor GAL1 de levedura,
forte e induzível, e uma região que codifica um péptido com 6 histidinas (6HIS) e
o gene GFP (que codifica uma proteína verde fluorescente).
c1)
Justifique
a
razão
pela
qual
se
considera
importante
seleccionar
convenientemente o promotor a usar para a expressão na levedura do gene humano e
dê a sua opinião sobre a selecção realizada.
c2) Indique os objectivos visados com a introdução das outras 2 referidas regiões
codificantes no vector.
4) Os genes humanos seleccionados para expressão na levedura serão amplificados por
PCR a partir de cDNA extraído de células de doentes com CML.
Refira-se à técnica a usar, explicitando os aspectos principais a ter em consideração
na sua utilização com sucesso.
a) uma vez construído o plasmídeo recombinado por Engenharia Genética, diga que
passos e técnicas há que usar para testar o envolvimento do gene humano no aumento
da resistência da levedura a IM e esclarecer o seu eventual envolvimento na
resistência a novos fármacos alternativos ao IM, como é o caso do nilotinib e
desatinib.
b) Suponha que pretende testar, por recurso a mutagénese dirigida, se determinadas
alterações pontuais (ao nível de um determinado nucleótido, com repercussões na
sequência de aminoácidos da proteína codificada) na sequência do gene humano em
questão podem conduzir a um aumento de resistência a IM, envolvendo essa
proteína. Diga como procederia.