Imunomodulação de Macrófagos M1 e M2 por tratamento in vitro por

Ciências da Saúde-Medicina-4.01.00.00-6
Imunomodulação de Macrófagos M1 e M2 por tratamento in vitro por G-CSF.
Manoel Carlos Matos Santos1, Juliana Fraga Vasconcelos2.
1. Estudante de Ciências da Saúde; Bolsista PIBIC/Fapesb* [email protected]
2. Professora da escola de Ciência da Saúde-UNIFACS
Palavras Chave: G-CSF; Polarização de macrófagos; Galectina 3.
Introdução
Os macrófagos são células fundamentais na manutenção de uma resposta imune ideal, para isso deve eliminar corpos
estranhos com mínima lesão tecidual. Nos tecidos, os macrófagos são maturados e ativados em determinados fenótipos
a depender do estímulo para adquirir função especializada. Uma dicotomia foi proposta para a ativação dos macrófagos:
via clássica vs via alternativa, M1 e M2 respectivamente. O G-CSF é um fator de crescimento produzido por tecidos
diferentes, que tem a capacidade de estimular a sobrevivência, a proliferação, diferenciação e função de precursores de
neutrófilos e neutrófilos maduros. Os macrófagos têm um papel central na inflamação crônica, de modo geral e participa
ativamente no remodelamento tecidual observado em corações chagásicos crônicos, tendo o nosso grupo demonstrado
sua ação na promoção da redução da inflamação e fibrose cardíaca, bem como redução da resposta imune. A população
M1 é caracterizada como pró-inflamatória, proporcionando lesão tecidual, enquanto a população M2 está implicada no
reparo tecidual, com perfil anti-inflamatório. Nesse trabalho induzimos in vitro a polarização de macrófagos no fenótipo
M1 e M2 a fim de investigar a capacidade do G-CSF em modular essas subpopulações macrofágicas, de maneira que a
elucidação dos mecanismos de ação do G-CSF sobre os macrófagos abre a possibilidade da modulação da resposta
imune na doença de Chagas, promovendo benefícios ao paciente que não dispões de muitas ferramentas para seu
tratamento.
Metodologia
Coleta e cutura de macrófagos – Camundongos C57BI/6 foram estimulados com tioglicolato, induzidos a inflamação
peritoneal para obtenção de macrófagos. As células foram contadas em câmara de Neubauer, sendo plaqueadas 106
células/poço, em placas de 24 poços, em meio RPMI suplementado. Após adesão dos macrófagos e lavagem dos poços,
foi adicionado 1 mL de meio RPMI suplementado por poço, alguns foram estimulados com LPS (500 ng/mL) e IFN-y (5
ng/mL) – M1 e os M2 foram estimulados com IL-4 (20 ng/mL) e IL-13 (20 ng/mL). Alguns poços foram também incubados
com G-CSF em diferentes concentrações. Quantificação das citocinas e do NO – Realizada no sobrenadante da
cultura de macrófagos, sendo as citocinas quantificadas por meio do ELISA sanduíche usando kits Duoset (R&D
Systems) para cada citocina, enquanto o NO foi quantificado a partir da concentração de nitrito através da reação de
Griess. Análise da expressão gênica por PCR - O RNA foi extraído com TriZol®Reagent e quantificados por
espectofotometria. Foi utilizado um kit de transcrição reversa para a síntese de cDNA por PCR, sendo procedida pela
análise da expressão gênica de IL-10, TNF, Arg1 e MRC1. Marcação de galectina-3 – Foram plaqueados 5x106
macrófagos/poço, em placas de 6 poços, em meio RPMI suplementado, sendo alguns poços tratados com G-CSF (50
ng/mL e 100 ng/mL). Foram utilizados anticorpos anti-galectina3 e anti-CD11b, associado com DAPI para marcação dos
núcleos.
Resultados e Discussão
Para avaliar a polarização dos macrófagos M1 foi analisada a produção de NO em sobrenadante de cultura estimulada
com LPS e IFN e como era de se esperar, macrófagos M1 produziram maior quantidade de NO. De maneira
estatisticamente significativa, o tratamento com G-CSF reduziu a produção de NO em macrófagos M1. Também houve
um incremento significativo da produção de IL-4 após a incubação com G-CSF, apesar da menor proporção também foi
observado aumento de IL-13 e IL-10 nessas mesmas condições de cultura. A produção de TNF que se encontrava
aumentada no sobrenadante da cultura de macrófagos estimulados com LPS e IFN, foi reduzida nos poços onde houve
adição de G-CSF. OTNF induz a expressão do óxido nítrico sintetase e com isso, aumento de NO. Apesar da redução na
produção de TNF, não houve diferença significativa na expressão gênica do TNF entre os grupos.
Nos grupos estimulados com IL-4 e IL-13 (M2), foi avaliada a expressão de fenótipo M2 por PCR, não havendo diferença
na expressão de IL-10, Arg1 e MRC1.
A adição de G-CSF em cultura de macrófagos M1 proporcionou a redução na expressão de galectina3, avaliado por
imunofluorescência. A galectina3 está associada com ativação de macrófago e o tratamento com G-CSF causou a
redução da expressão in vitro.
Conclusões
O G-CSF é uma citocina com potencial promissor para induzir a tolerância da célula T e modular ativação de macrófagos
em condições patológicas. Nosso trabalho demonstrou que o G-CSF foi capaz de reduzir a ativação M1 em macrófagos
pela observação da redução do TNF e do NO. Avaliamos a expressão gênica de marcadores de macrófagos M1 e M2,
ARG1 e MRC1, e não observamos diferença significativa entre os grupos. A galectina3 é uma possível molécula
indicadora de fibrose e com concentração aumentada na cardiopatia chagásica crônica. As principais fontes da
galectina3 são macrófagos e fibroblastos e através da marcação por imunofluorescência foi possível observar uma maior
produção de galectina3 nos poços não tratados com G-CSF.
Dessa maneira validamos a hipótese inicial através da demonstração que o G-CSF é capaz de modular a resposta
imune, principalmente reduzindo o perfil pro-inflamatório (M1) e aumentando parcialmente o perfil anti-inflamatório (M2).
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12ª Jornada UNIFACS Iniciação Cientifica - JUIC