Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol
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Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação em Genética Kleison da Costa Merlo Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através dos testes de metáfase in vitro e in vivo Recife 2012 Kleison da Costa Merlo Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através dos testes de metáfase in vitro e in vivo Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Genética da Universidade Federal de Pernambuco como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestre em Genética. Orientadora: Dra. Neide Santos Coorientadora: Dra. Maria Eliane Bezerra de Mélo Recife 2012 i Catalogação na fonte Elaine Barroso CRB 1728 Merlo, Kleison da Costa Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através dos testes de metáfase in vitro e in vivo/ Kleison da Costa Merlo– Recife: O Autor, 2012. 66 folhas : il., fig., tab. Orientadora: Neide Santos Coorientadora: Maria Eliane Bezerra de Mélo Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas, Genética, 2012. Inclui bibliografia 1. Mutagênese 2. Formocresol 3. Genotoxicidade I. Santos, Neide (orientadora) II. Mélo, Maria Eliane Bezerra de (coorientadora) III. Título 572.838 CDD (22.ed.) UFPE/CCB- 2013- 062 Kleison da Costa Merlo Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através dos testes de metáfase in vitro e in vivo Aprovado em ___/___/____ Banca Examinadora: ____________________________________________ Dra. Neide Santos (Orientadora) Universidade Federal de Pernambuco – Recife-PE ____________________________________________ Dra. Maria Eliane Bezerra de Mélo (Coorientadora) Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/FIOCRUZ – Recife-PE ____________________________________________ Dra. Mônica Lúcia Adam Universidade Federal de Pernambuco – Vitória de Santo Antão-PE ____________________________________________ Dra. Ana Christina Brasileiro Vidal Universidade Federal de Pernambuco – Recife-PE ____________________________________________ Dra. Ivone Antonia de Souza Universidade Federal de Pernambuco – Recife-PE Recife 2012 ii Dedico esse trabalho a todas as pessoas que, de uma forma ou de outra, foram importantes para a sua conclusão. iii Agradecimentos Ao CNPq pelo apoio financeiro. Ao PPGG, CPqAM/FIOCRUZ e ao Laboratório de Genética e Citogenética Animal UFPE, por toda infra estrutura, material e equipamentos disponibilizados, sem os quais o desenvolvimento desse trabalho não seria possível. À minha orientadora Neide Santos, por toda assistência e interesse prestados durante a execução de todos os experimentos e análises e pelo seu acolhimento, afeto e paciência. À minha coorientadora Maria Eliane Bezerra de Mélo (Chefinha), por todo seu carinho e atenção demonstrados desde quando ainda usava fraldas na graduação até o presente momento. À minha amiga, companheira, namorada e futura esposa, Jamilka por tudo que é e representa em minha vida. À minha mãe, pelo seu amor incondicional. Ao meu pai, pelo exemplo de determinação e aos meus irmãos por sempre estarem ao meu lado. Aos meus companheiros de laboratório que com sua amizade e energia tornaram os dias de trabalho mais agradáveis e intensos, em especial Renato Torres de Lira e Camila Muniz, os quais efetivamente meteram a mão na massa. Aos meus amigos e colegas de Mestrado, em especial Larrisa Mélo e Diego Hollanda. Aos professores e funcionários do Departamento de Genética da UFPE e CPqAM. A Deus, por sua benção e preces atendidas. iv “Viver é desenhar sem borracha”. Millôr Fernandes (1923-2012) v Resumo O formocresol, principal droga utilizada em pulpotomias, tem um longo e bem sucedido histórico de uso clínico. Contudo, sua segurança tem sido questionada devido a possíveis efeitos genotóxicos, mutagênicos e carcinogênicos, relacionados à presença do formaldeído em sua composição. Resultados de estudos sobre a genotoxicidade do formocresol são bastante inconsistentes, logo, uma avaliação mais aprofundada sobre seu potencial genotóxico se faz relevante, uma vez que é uma droga mundialmente utilizada. Nesse trabalho foram investigados os potenciais efeitos genotóxicos do formocresol através de ensaios citogenéticos in vitro e in vivo (teste de metáfase). Nos ensaios in vitro, as preparações cromossômicas foram obtidas de cultura de linfócitos, onde após 24 horas de incubação, 50 µl das diluições do formocresol (1:50, 1:100, 1:200, 1:500, 1:1000) foram adicionados, sendo as preparações citológicas realizadas após 48 e 72 horas. Para o controle negativo foram realizadas culturas sem adição de qualquer droga. Nos ensaios in vivo, camundongos Swiss webster foram inoculados com as mesmas diluições na proporção de 0,1 ml/10 g, sendo utilizado como controle positivo a ciclofosfamida (25 mg/kg) e como negativo a glicerina/água (1:1). Para análise estatística foi aplicado o teste do qui-quadrado ao nível de 5%. Em culturas de 48 e 72 horas, comparando-se as dosagens de 1:50 e 1:100 com o controle negativo foi constatado haver diferença significativa, o que não observou-se para as outras diluições. Ao comparar-se a diluição de 1:50 em machos e a diluição de 1:200 em fêmeas com o controle negativo houve diferença significativa, o que não foi observado para as outras diluições. Sob as condições experimentais empregadas nesse estudo, o formocresol revelou-se genotóxico nas diluições mais concentradas, contrariando alguns trabalhos que apontam para sua não genotoxicidade. Entretanto, a dose final de formaldeído presente nessas diluições parece ser superior àquela geralmente empregada em pulpotomias. Isso demonstra que o uso displicente do formocresol parece ser o principal responsável pelos efeitos genotóxicos relatados na literatura. Palavras-chave: Formocresol; genotoxicidade; teste de metáfase. vi Abstract Formocresol, the main substance used in pulpotomies, has a long and successful historical of clinical use. Although, its safety has been questioned because of possible genotoxic, mutagenic and carcinogenic effects, related to the presence of formaldehyde on its composition. Results from studies about formocresol genotoxicity are quite inconsistent, so a deep evaluation about its genotoxic potential is important, once this medicament is widely used. The potential genotoxic effects of formocresol were investigated employing in vitro and in vivo cytogenetic assays (chromosomal aberration test). On in vitro assays chromosomal preparations were provided from lymphocyte cultures, where after 24 hours of incubation, 50 µl from formocresol dilutions (1:50, 1:100, 1:200, 1:500, 1:1000) were added, with the cytological preparations done after 48 and 72 hours. The negative control cultures were done without adding any drug. On in vivo assays Swiss webster mice were inoculated with the same dilutions using the proportion of 0,1 ml/10 g body weight, and for positive control was used cyclophosphamide (25 mg/kg) and as negative control glycerine/water (1:1). The statistical analysis was performed using chi-square test at 5% level. On 48 and 72 hours culture comparing the 1:50 and 1:100 dosages with the negative control was observed significant difference, the same was not observed with the other dilutions. Comparing 1:50 dilution of male and 1:200 dilution of female with the negative control any significant difference was observed, the same did not happen with the other dilutions. Under the experimental conditions employed in this study, formocresol revealed its genotoxicity in the more concentrated dilutions, confronting some studies that point to its non-genotoxicity. However, the final dosage of formaldehyde present in these dilutions seems to be higher than those generally used in pulpotomies. It shows that the incorrect use of formocresol is the main responsible for the genotoxic effects reported in the literature. Keywords: Formocresol; genotoxicity; chromosomal aberration test. vii Lista de Ilustrações Figura 1 Aspecto macroscópico do tecido pulpar radicular normal observado após extração da polpa coronária durante a realização da pulpotomia. 4 Figura 2 Frasco de formocresol (MOYCO®). 7 Figura 3 Esquema descritivo das etapas da metabolização e destino biológico do formaldeído. 9 Figura 4 Tipos de ACs encontradas após coloração convencional. 21 Figura 5 Fluxograma do teste de metáfase em linfócitos de sangue 29 periférico humano. Figura 6 Fluxograma teste de metáfase em células de medula óssea de 32 camundongos. Figura 7 Metáfases de linfócitos de sangue periférico humano. 34 Figura 8 Metáfases de células de medula óssea de camundongos. 38 viii Lista de Tabelas Tabela 1 Concentrações de formaldeído associadas a alguns efeitos relatados. 12 Tabela 2 Efeito das diferentes diluições de formocresol sobre cromossomos de linfócitos de sangue periférico humano em culturas de 48 horas (após 24 horas de exposição à droga). 35 Tabela 3 Efeito das diferentes diluições de formocresol sobre cromossomos de linfócitos de sangue periférico humano em cultura de 72 horas (após 48 horas de exposição à droga). 36 Tabela 4 Número total de alguns tipos de ACs observadas após utilização de diluições de formocresol e classificadas de acordo com os grupos cromossômicos em culturas de 48 horas. 37 Tabela 5 Número total de alguns tipos de ACs observadas após utilização de diluições de formocresol e classificadas de acordo com os grupos cromossômicos em culturas de 72 horas. 37 Tabela 6 Efeito das diferentes diluições de formocresol sobre cromossomos de células de medula óssea de camundongos machos após 24 horas de exposição à droga. 39 Tabela 7 Efeito das diferentes diluições de formocresol sobre cromossomos de células de medula óssea de camundongos fêmeas após 24 horas de exposição à droga. 40 ix Lista de Abreviaturas, Siglas e Símbolos ACs Aberrações cromossômicas CPA Ciclofosfamida FAD Fragmento acêntrico duplo FAS Fragmento acêntrico simples FDH Formaldeído desidrogenase FISH Hibridização in situ fluorescente GCRM Gap isocromatídico GCRT Gap cromatídico IP Intraperitoneal IARC Agência Internacional de Pesquisa em Câncer ICPEMC Comissão Internacional para Proteção Contra Mutágenos e Carcinógenos Ambientais QCRM Quebra isocromatídica QCRT Quebra cromatídica RONs Regiões organizadoras do nucléolo SFCs Sítios frágeis comuns SFRs Sítios frágeis raros SFs Sítios frágeis x Sumário Resumo vi Abstract vii Lista de Ilustrações viii Lista de Tabelas ix Lista de Abreviaturas, Siglas e Símbolos x 1. Introdução 1 2. Revisão da Literatura 3 2.1 Tratamento endodôntico 3 2.2 Formocresol 4 2.2.1 Considerações iniciais 4 2.2.2 Composição, mecanismo de ação e efeitos adversos 5 7 2.3 Formaldeído 2.3.1 Considerações iniciais 7 2.3.2 Farmacocinética e metabolização 8 2.3.3 Efeitos tóxicos 10 2.4. Mudanças no material genético 12 2.5 Mecanismos de reparo 14 2.6 Relação entre mutagenicidade e carcinogenicidade 16 2.7 Monitoramento biológico na aferição da genotoxicidade 17 2.7.1 Ensaios citogenéticos 17 2.7.2 Teste de metáfase 18 2.7.2.1 Princípios do ensaio 19 2.7.2.2 Classificação das aberrações cromossômicas estruturais 20 2.7.2.3 Distribuição e origem das aberrações cromossômicas 22 2.7.2.4 Variações individuais e limiar de indução ao dano citogenético 23 2.7.2.5 Teste de metáfase in vitro e in vivo 24 3. Objetivos 26 4. Material e Métodos 27 4.1 Seleção das diluições da substância teste 27 4.2 Ensaios in vitro 27 xi 4.2.1 Critério de seleção dos voluntários 27 4.2.2 Procedimento: Teste de metáfase em linfócitos de sangue 28 periférico humano 30 4.3 Ensaios in vivo 4.3.1 Animais experimentais 30 4.3.2 Procedimento: teste de metáfase em células de medula óssea de 30 camundongos 32 4.4 Análise microscópica 4.4.1 Análises in vitro 33 4.4.2 Análises in vivo 33 4.5 Análise estatística 33 5. Resultados 34 6. Discussão 41 7. Conclusões 49 8. Bibliografia 50 9. Anexos 60 10. Currículo Lattes atualizado (correspondente ao período do curso) 64 xii 1. Introdução Várias substâncias e materiais são empregados na terapia endodôntica convencional. Por entrarem em contato íntimo com os tecidos é importante que sejam biocompatíveis e não apresentem efeitos danosos. O formocresol tem um longo e bem sucedido histórico de uso clínico em pulpotomias, sendo considerado o medicamento de escolha nesse tipo de procedimento. A despeito de ser mundialmente utilizado, a segurança quanto ao uso do formocresol tem sido questionada por conta de possíveis efeitos deletérios, como: citotoxicidade, genotoxicidade, mutagenicidade e carcinogenicidade. Tais efeitos se devem principalmente à presença do formaldeído (componente primário do formocresol), um agente tóxico comprovadamente carcinogênico para humanos segundo várias agências e órgãos especializados. Há uma grande divergência entre vários autores sobre o potencial mutagênico e/ou genotóxico do formocresol. Apesar da existência de resultados positivos quanto à genotoxicidade do formocresol, alguns autores acham pouco provável que a pequena quantidade de formaldeído, associada ao uso do formocresol, seja capaz de produzir quaisquer danos genotóxicos, uma vez que o consumo diário estimado de formaldeído é bastante superior. O formaldeído é comumente integrado ao organismo humano através da alimentação, água e ar, além de ser um produto do metabolismo celular normal humano. Apesar de haver um número considerável de trabalhos avaliando a genotoxicidade e/ou mutagenicidade do formocresol e do formaldeído, não há trabalhos quanto à indução diferencial de aberrações cromossômicas causadas pelo formocresol entre cromossomos de células humanas. Sabe-se que mudanças no genoma não ocorrem de maneira aleatória e que algumas regiões são mais susceptíveis a sofrerem alterações. Logo, essa avaliação se faz relevante. Além disso, não há registros de estudos sobre a toxicidade genética do formocresol levando-se em consideração possíveis diferenças entre os sexos. Devese considerar que diferenças na absorção, metabolismo, clearance e hormônios sexuais podem ser responsáveis por divergências nos resultados toxicológicos entre fêmeas e machos, por isso é importante avaliar ambos os sexos. 1 Entre uma ampla variedade de testes utilizados para a avaliação da segurança de medicamentos, a pesquisa genotoxicológica na indústria farmacêutica apresenta destaque, servindo como instrumento de avaliação sobre os possíveis efeitos danosos advindos da ação dos compostos químicos sobre o organismo. A Comissão Internacional de Proteção Contra Mutágenos e Carcinógenos Ambientais (ICPEMC) reforça a necessidade de se avaliar as possíveis ações mutagênicas induzidas por compostos químicos, presentes em nosso meio, em virtude da correlação existente entre mutagenicidade e carcinogenicidade. Entre a diversidade dos testes mutagênicos existe uma característica e um objetivo comum entre eles, que é a possibilidade de extrapolação dos resultados para o homem. Dentre os ensaios genotóxicos mais utilizados está o teste de metáfase. Esse ensaio se baseia na detecção de alterações cromossômicas em células metafásicas. Através dele não só é possível determinar se uma determinada substância é ou não clastogênica (genotóxica), como também identificar os tipos de danos causados. Mesmo não sendo considerada medida de carcinogenicidade, a toxicidade genética está frequentemente associada ao surgimento e desenvolvimento do câncer, visto que, há uma íntima correlação entre danos cromossômicos e o aparecimento de tumores em roedores e no homem. Mediante a potencialidade indutora de mutação por substâncias químicas, a estreita correlação existente entre mutação e câncer, bem como a inconsistência dos resultados de estudos sobre a genotoxicidade do formocresol, uma avaliação mais aprofundada sobre seu potencial genotóxico se faz relevante, uma vez que é uma droga mundialmente utilizada no âmbito odontológico. O aprofundamento nessa linha de investigação visa à prevenção e o controle, em termos de saúde pública, dos possíveis riscos da exposição humana ao formocresol, bem como apontar novos caminhos e soluções para essa problemática. 2 2. Revisão da Literatura 2.1 Tratamento endodôntico Embora a educação e a preservação em relação à saúde bucal sejam prioritárias na odontologia contemporânea, a cárie dentária mostra-se como um problema ainda desfavorecidas, muito frequente acometendo dentre principalmente pessoas crianças socioeconomicamente de países em desenvolvimento. Dentre as principais causas da cárie estão: consumo de alimentos ricos em açúcar entre as refeições, pobreza, fatores culturais, étnicos, assistência irregular aos serviços de saúde e higiene bucal deficiente (Rosenblatt e Zarzar, 2003). A odontologia atual é direcionada para a manutenção dos dentes decíduos na arcada até a idade da queda fisiológica que acontece após os seis anos de idade (Rosenblatt e Zarzar, 2003). Esses cuidados visam à preservação de funções essenciais para o desenvolvimento da criança como mastigação, fonação e estética (Assed et al., 2008). Dentre os procedimentos terapêuticos mais empregados para manutenção de dentes decíduos, destaca-se a pulpotomia. Trata-se de uma técnica conservadora de terapia pulpar de fundamental importância para evitar a perda prematura de dentes por traumas ou cáries (Castro, 2005). É um procedimento realizado para remover tecido pulpar inflamado ou infectado da porção coronária, mas deixando a polpa radicular vital. O tecido pulpar remanescente deve ser protegido com um material capeador que preserve sua vitalidade, estimulando o processo de reparo e formação de tecido mineralizado sobre o mesmo, mantendo o tecido pulpar radicular com estrutura e função normais (Assed e Silva, 2008). A pulpotomia pode ser realizada tanto em dentes decíduos quanto em dentes permanentes que apresentem vitalidade pulpar, sendo esta uma condição indispensável para a realização desse procedimento. Sua indicação clínica depende basicamente do estado patológico pulpar, onde o diagnóstico dessa condição é realizado através da anamnese, do exame radiográfico e do aspecto clínico do tecido pulpar (Assed e Silva, 2008) (Figura 1). 3 Figura 1 - Aspecto macroscópico do tecido pulpar radicular normal observado após extração da polpa coronária durante a realização da pulpotomia (Fonte: Assed e Silva, 2008). Mesmo sendo um procedimento realizado rotineiramente na prática clínica, o tratamento endodôntico de dentes decíduos é um assunto ainda muito controverso, pois há uma discordância em relação à técnica e aos materiais ideais para esse tratamento (Aeinehchi et al., 2007; Fornetti et al., 2009). Muitas universidades e profissionais ainda utilizam métodos ultrapassados que se baseiam no comportamento da criança, preconizando o uso de técnicas fáceis e rápidas, ao invés de optar pelo que é melhor para a saúde do paciente (Kramer et al., 2000; Assed et al., 2008). Nenhum dos materiais que são utilizados atualmente em pulpotomias preenche todos os requisitos preconizados como ideais, que são: ser bactericida, não causar dano à polpa e estruturas relacionadas, favorecer à cicatrização da polpa radicular e não interferir no processo fisiológico de reabsorção (Castro, 2005). 2.2 Formocresol 2.2.1 Considerações iniciais O uso do formocresol como medicamento pulpar foi introduzido por Buckley em 1904, mas foi primeiramente empregado em pulpotomias por Sweet em 1930, onde foi observado índice de sucesso de 98%. Desde então, tem sido largamente 4 utilizado como droga de escolha para a realização de pulpotomias em dentes decíduos (dentes de leite) (King et al., 2002; Hunter e Hunter, 2003; Peng et al., 2006; Miura et al., 2010). Dentre os fatores para seu aparente sucesso estão a fácil execução, a alta disponibilidade e o baixo custo (Rosenblatt e Zarzar, 2003). A técnica da pulpotomia com formocresol pouco mudou desde que Berger (1965) recomendou o uso do formocresol durante 5 minutos em única exposição. As duas únicas mudanças foram a retirada do formocresol das pastas pulpares e seu uso na forma diluída em 1:5 (King et al., 2002). Alguns autores comprovaram que a diluição de 1:5 do formocresol é tão efetiva quanto à fórmula original de Buckley, possuindo as mesmas propriedades bactericidas e de fixação tecidual, sendo menos tóxica e agressiva aos tecidos pulpares e circunvizinhos (Burnett e Walker, 2002; Rivera et al., 2003). 2.2.2 Composição, mecanismo de ação e efeitos adversos A fórmula original do formocresol de Buckley apresentava a seguinte composição: 19% de formaldeído, 35% de cresol, 15% de glicerina e água (Buckley, 1904). A glicerina atenua o poder irritante do formaldeído, além de ser o veículo para o medicamento. O cresol possui o mesmo poder atenuante da glicerina, apresentando ainda propriedades antissépticas (Fernandes et al., 2003). Acredita-se que o cresol potencialize o poder bactericida do formaldeído por dissolver barreiras naturais do tecido, permitindo que ele penetre mais profundamente nos canais radiculares (Ranly e Garcia-Godoy, 1991). O formaldeído interage quimicamente com as proteínas celulares provocando trombose e consequente isquemia. Essa ação leva à precipitação proteica, ocasionando destruição das bactérias por coagulação (Fernandes et al., 2003; Assed et al., 2008). A reação mais comum é com o radical amino dos grupos dos aminoácidos. A solidificação das proteínas é acompanhada pela formação de ligações inter e intra-moleculares. Em geral, as reações entre o formaldeído e as proteínas são reversíveis e os produtos da reação são instáveis. Esse processo de fixação do tecido radicular limita sua autólise (Assed et al., 2008). Apesar do grande sucesso clínico e radiográfico com índices de até 98% (Fernandes et al., 2003; Assed et al., 2008), algumas reações adversas relacionadas 5 ao seu uso têm sido relatadas. Defeitos no esmalte no dente sucessor, difusão sistêmica e nos tecidos adjacentes, alterações pulpares destrutivas e irreversíveis, bem como alterações inflamatórias nos tecidos periapicais, incluindo folículos dentários, são alguns dos efeitos adversos relatados por alguns autores (Zarzar et al., 2003; Castro, 2005). Somado a isso, Hunter (2003) verificou esfoliação dentária precoce, devido ao uso do formocresol em pulpotomias de dentes decíduos. Além disso, os resultados dos estudos onde o formocresol apresentou sucesso ignoram reações histopatológicas desfavoráveis, tais como reação inflamatória severa (ElMeligy et al., 2001) e citotoxicidade (Hill et al., 1991), comuns ao seu uso. O sucesso do formocresol está mais relacionado à sua ação bactericida e às suas propriedades de fixação do que à sua capacidade de promover a cicatrização, uma vez que após sua utilização não ocorre reparação pulpar. Além disso, ocorre a permanência de um processo inflamatório na zona pulpar abaixo do tecido que entrou em contato com o fármaco. A ausência de reparo e a persistência da inflamação são características de materiais não biocompatíveis (Fernandes et al., 2003; Funteas et al., 2003). Há também suficientes evidências histológicas de que o formocresol cause áreas de atrofia e fibrose em molares de ratos (Salako et al., 2003). Existem também vários trabalhos com questionamentos controversos relacionados à citotoxicidade, genotoxicidade, mutagenicidade e carcinogenicidade do formocresol (Figura 2). De uma forma geral, atribuem-se todos os efeitos danosos advindos do emprego do formocresol ao principal constituinte de sua formulação, o formaldeído. A Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (IARC) classificou o formaldeído como carcinogênico para humanos. Existem agora evidências suficientes de que ele cause câncer nasofaríngeo, limitada evidência para câncer nasal e dos seios paranasais e forte, mas não suficiente evidências, para leucemias (IARC, 2006). 6 Figura 2 - Frasco de formocresol (MOYCO®). No invólucro a informação “to cause cancer” é um alerta do fabricante quanto aos riscos da utilização do produto (Fonte: Assed e Silva, 2008). . 2.3 Formaldeído 2.3.1 Considerações iniciais O formaldeído, cujo nome oficial é metanal, é o aldeído mais simples e mais utilizado, de fórmula molecular CH2O. Trata-se de um gás incolor de odor característico, produzido mundialmente em larga escala através da oxidação catalítica do metanol, ultrapassando a produção de 21 milhões de toneladas anuais (IARC, 2006). O formaldeído é amplamente utilizado desde 1900 para aplicações industriais diversas, principalmente na produção de resinas e de intermediários químicos, que corresponde a cerca de 80% de seu uso. As resinas são empregadas na fabricação de produtos como plásticos, fibras sintéticas, produtos oriundos do papel e no acabamento têxtil. Outros usos do formaldeído incluem: preservação de amostras 7 biológicas, agente antimicrobiano, fumigante agrícola, fabricação de xampus, desodorantes e produtores de limpeza (National Toxicology Program, 2010). 2.3.2 Farmacocinética e metabolização O formaldeído é rapidamente absorvido, metabolizado e excretado, possuindo um tempo de meia-vida em torno de 1 minuto em ratos. Em ratos expostos a formaldeído radiomarcado foi observado que 40% dele foi eliminado como dióxido de carbono, enquanto 17% foi eliminado na urina e 5% nas fezes. Contudo, cerca de 35% a 39% permaneceu nos tecidos (IARC, 2006). Apesar de haver certa variação nas etapas do metabolismo do formaldeído entre várias espécies, elas são as mesmas entre mamíferos (Pandey et al., 2000). A conversão do formaldeído a formato (ácido fórmico) é principalmente realizada pela formaldeído desidrogenase (FDH)/complexo 3 álcool desidrogenase e pela SFormilglutationa Hidrolase (tendo glutationa e NAD+ como cofatores), mas existem outros sistemas enzimáticos capazes de realizar o mesmo processo (Teng et al., 2001). A FDH está presente em quase todos os tecidos, especialmente no fígado e eritrócitos, sendo bastante eficiente sobre o formaldeído endógeno e exógeno (Committee on Spacecraft Exposure Guidelines, Committee on Toxicology, National Research Council, 2006). Inicialmente o formaldeído se liga a glutationa reduzida dando origem a Hidroximetilglutationa, esta sofre oxidação pela FDH dependente de NAD+, sendo então convertida em S-Formilglutationa, que finalmente será transformada em formato pela S-Formilglutationa Hidrolase (Figura 3). O formato pode então ser metabolizado em dióxido de carbono e água. O formato pode também ser excretado como sal na urina ou entrar no pool metabólico de um carbono, onde pode ser incorporado como grupo metil dentro do RNA, DNA e proteínas (Thrasher e Kiliburn, 2001). O formaldeído pode também reagir diretamente com macromoléculas como o DNA e proteínas, formando ligações-cruzadas (Committee on Spacecraft Exposure Guidelines, Committee on Toxicology, National Research Council, 2006). 8 Figura 3 - Esquema descritivo das etapas da metabolização e destino biológico do formaldeído (Fonte: Committee on Spacecraft Exposure Guidelines, Committee on Toxicology, National Research Council, 2006). Apesar de ser considerado um poluente ambiental, o formaldeído é um intermediário metabólico essencial encontrado em todas as células humanas e animais. É produzido endogenamente pela quebra da serina, glicina, metionina e colina (Restani e Galli, 1991; IARC, 2006) e pode ser produzido pela metabolização de muitos agentes xenobióticos. O formaldeído funciona como intermediário celular metabólico na biossíntese de purinas, timidina e vários aminoácidos (ATSDR, 1999). Sua concentração endógena no sangue é de aproximadamente 2-3 mg/L em ratos, macacos e humanos (Heck e Casanova, 2004; IARC, 2006; Zhang et al., 2009). 9 2.3.3 Ocorrência e efeitos tóxicos O formaldeído pode ocorrer como resultado de processos ocasionados pelo homem ou de forma natural, podendo ser medido em baixas concentrações em quase todos os ambientes. A concentração de formaldeído em ambiente externos de áreas remotas é geralmente abaixo de 0,001 mg/m 3 e em torno de 0,02 mg/m3 em áreas urbanas. No ar interno das residências sua concentração está normalmente entre 0,02-0,06 mg/m3 (IARC, 2006). Em ambientes externos é um subproduto comum da combustão de materiais orgânicos (oriundos de automóveis, queimadas e usinas), sendo também formado pela quebra de hidrocarbonetos poluentes presentes no ar. Em ambientes internos sua presença se faz pela eliminação de gases de alguns materiais como tecidos, produtos oriundos de madeira e tintas, e por fontes de combustão como fogões a gás ou a lenha, cigarros e através do preparo de alimentos. Ele também pode ser formado através de reações secundárias de outros poluentes (como o metano), principalmente na presença de altas temperaturas e/ou químicos oxidantes (National Toxicology Program, 2010). A exposição alimentar também é relevante, pois o formaldeído é naturalmente encontrado em produtos de origem animal, frutas, vegetais, além de ser empregado como aditivo nos alimentos (Restani e Galli, 1991). O formaldeído é eventualmente detectado em água potável, mas em baixas concentrações (1-3 µg por litro) (Committee on Spacecraft Exposure Guidelines, Committee on Toxicology, National Research Council, 2006). A maioria do formaldeído liberado para o ambiente é rapidamente degradada e a exposição humana por fontes ambientais provavelmente se dá quando há uma fonte contínua presente (IARC, 2006). A exposição ocupacional ocorre em uma ampla variedade de ocupações e indústrias. Profissionais como embalsamadores, patologistas, dentistas, bem como trabalhadores de fábricas de tecidos, resina, borracha, plástico, móveis, papel, fibras de vidro e de produção de formaldeído, se submetem a variados níveis de exposição pelo formaldeído e, desta forma, possuem um maior risco de sofrerem com os efeitos tóxicos dessa substância (IARC, 2006; National Toxicology Program, 2010). 10 Vários efeitos tóxicos causados pela exposição ao formaldeído têm sido relatados. A concentração na qual muitos dos efeitos tóxicos são observados varia amplamente entre os indivíduos e são dependentes da forma de contato (Tabela 1). Os sintomas mais comuns incluem irritação no ponto de contato através da inalação (trato respiratório superior e olhos), exposição oral (boca e trato gastrointestinal) e dérmica (pele e olhos). Outros sintomas são: dermatite de contato alérgica, anormalidades histopatológicas (hiperplasia, metaplasia e displasia) da mucosa nasal, asma ocupacional, redução da função pulmonar, desordens neurofisiológicas (alterações do humor, perda de memória e apetite, insônia, náuseas e fadiga), alterações no número de células sanguíneas e de parâmetros imunológicos (National Toxicology Program, 2010). Sintomas são raros em concentrações menores que 0,5 ppm, porém já foram relatados em concentrações menores ou iguais a 0,1 ppm (IARC, 2006). Existem também relatos de ingestão de formaldeído de maneira acidental, homicida e suicida que, em resumo, causou problemas respiratórios, cardíacos, gastrointestinais, metabólicos, renais, neurológicos e a morte, em alguns casos (Burkhart et al., 1990). A toxicidade do formaldeído parece acontecer quando os mecanismos de detoxicação tornam-se saturados devido à alta exposição (Heck et al., 1990). Dessa forma, seu átomo de carbonila (altamente eletrofílico) reage rapidamente com sítios núcleofílicos das membranas celulares do tecido afetado, exercendo seus efeitos nos grupos amino das proteínas e no DNA (Heck et al., 1990; ATSDR, 1999). 11 Tabela 1 - Concentrações de formaldeído associadas a alguns efeitos colaterais. Efeitos Relatados Concentração do formaldeído (ppm) Efeitos neurofisiológicos 0,05 - 1,05 Limiar olfativo 0,05 - 1,00 Irritação ocular 0,05 - 2,00 Irritação do trato respiratório superior 0,1 - 25,0 Trato respiratório inferior e efeitos 5,0 - 30,0 pulmonares Edema pulmonar, inflamação e 50 - 100 pneumonia ≥ 100 Morte Fonte: National Toxicology Program (2010) 2.4. Mudanças no material genético A informação genética dos seres humanos, bem como na maioria dos organismos, é estocada na forma de moléculas de DNA. A informação presente no DNA deve ser estável (Denamur e Matic, 2006), capaz de resistir a mudanças (Hegde et al., 2008), ser fielmente replicada e transmitida às células filhas sem modificações (Schofield e Hsieh, 2003). Quaisquer alterações nessas propriedades podem levar à formação de mutações, que podem ser definidas como alterações permanentes na sequência de bases do DNA (Stratton et al., 2009; Jacobs e Schär, 2012). Apesar da existência de mecanismos que visam manter a integridade informacional e estrutural dos genomas, sem alterações no conteúdo do DNA, a célula perderia um componente essencial no processo evolutivo. As mutações representam uma fonte primária de variabilidade, onde novas informações podem ser adicionadas, possibilitando o surgimento de novas variantes e espécies através da seleção natural (Desai e Fisher, 2007; Stich et al., 2010). As mutações podem afetar indivíduos de uma população de diferentes formas. Em populações bem estabelecidas, a grande maioria das mutações são neutras ou deletérias e, nesse último caso, causam transtorno ou doença em 12 diversas espécies. Também acontecem mutações benéficas, que apesar de raras, são responsáveis por adaptações de longo termo que podem alterar drasticamente a diversidade genética em determinadas populações (Denamur e Matic, 2006; Desai e Fisher, 2007; Stich et al., 2010). As mutações podem ser oriundas de danos na estrutura do DNA ou de erros em sua replicação. Esses eventos podem ter origem exógena ou endógena (Natarajan, 2002; Greenman et al., 2007). As mutações espontâneas (origem endógena) ocorrem por falhas do próprio metabolismo celular envolvendo erros na incorporação de bases, danos causados pela hidrólise do DNA e ação de radicais livres provenientes da respiração (Hegde et al., 2008). Mutações induzidas (origem exógena) são causadas pelos chamados agentes mutagênicos (mutágenos), que podem ser físicos (raios ultravioleta, raios X), químicos (agentes alquilantes, análogos de bases, aflatoxinas) ou biológicos (alguns vírus) (Greenman et al., 2007; Stratton et al., 2009). Os agentes mutagênicos, em geral, atuam diretamente sobre o DNA, alterando uma base qualquer ou incorporando-se ao mesmo (Hegde et al., 2008). A principal consequência das mutações são mudanças na qualidade e quantidade de seus produtos gênicos, que são, em sua grande maioria, proteínas. Essas mutações modificam a estrutura e estabilidade (Ode et al., 2007), a função (Yamada et al., 2006), as interações proteína-proteína (Jones et al., 2007), bem como a expressão e a localização subcelular das proteínas (Krumbholz et al., 2006). As mutações podem afetar tanto células germinativas quanto células somáticas. Caso a linhagem germinativa seja afetada, as mutações poderão ser transmitidas à prole, assim teremos a herdabilidade dessas alterações (GarciaSagredo, 2008). Em síndromes de câncer familiar, mutações em células germinativas predispõem a transformação maligna e frequentemente resultam no desenvolvimento precoce da doença (Sluiter e Van Rensburg, 2011). Caso atinjam outras células do corpo (células somáticas), processos neoplásicos poderão se desenvolver (Carlo e Croce, 2008). Enquanto as células germinativas devem ser protegidas contra altas taxas de mutação para manter as espécies, as células somáticas devem ser protegidas para resguardar o indivíduo (Hegde et al., 2008). As mutações presentes em células cancerígenas podem ser classificadas de acordo com sua importância no desenvolvimento do processo maligno. Mutações 13 “condutoras” são aquelas que conferem vantagens de proliferação e crescimento para as células que as carregam e são positivamente selecionadas durante a evolução do câncer. Fazem parte do grupo de genes conhecidos como "genes do câncer“. As mutações remanescentes são “passageiras” e não conferem vantagem de crescimento celular, mas estavam presentes em um ancestral da célula cancerosa, quando esta adquiriu um dos seus condutores (Greenman et al., 2007; Stratton et al., 2009). Além das mutações, o material genético pode sofrer uma série de mudanças que podem ser subdivididas em alterações cromossômicas estruturais e numéricas. Essas mudanças incluem inserções ou deleções de pequenos ou grandes segmentos de DNA; rearranjos, onde o DNA sofre quebras e reunião a outros segmentos do genoma; aumento no número de cópias de duas, normalmente presentes em diploides, para muitas centenas de cópias (amplificação gênica); e também redução do número de cópias, que pode resultar na ausência de determinada sequência no genoma (Stratton et al., 2009). 2.5 Mecanismos de reparo A descoberta dos tipos de mutações e a íntima relação delas com várias doenças humanas indicam a importância de manter a taxa de mutações no mais baixo patamar (Bull e Wilke, 2008; Stich et al., 2010). Entretanto, no crescimento e multiplicação normal de uma célula, a ocorrência de mutações têm frequência regular (Greenman et al., 2007). O DNA de células normais é constantemente agredido. Estima-se que o DNA de cada célula sofra ao menos 10.000 lesões todos os dias (Jacobs e Schär, 2012). Entretanto, a maioria delas é corrigida (Greenman et al., 2007; Stratton et al., 2009). Para evitar ou diminuir a ocorrência de mutações, as células desenvolveram uma série de processos, genericamente denominados de mecanismos de reparo, capazes de identificar e corrigir danos causados à estrutura do DNA. Esses processos são capazes de remover lesões ou auxiliar a célula a tolerá-las (Balajee e Bohr, 2000; Batty e Wood, 2000; Jacobs e Schär, 2012). Esses mecanismos constituem sistemas de defesa extremamente eficientes que garantem a estabilidade do genoma e, consequentemente, a própria existência 14 da célula e/ou do organismo (Bernstein et al., 2002; Rouse e Jackson, 2002; Hegde et al., 2008). Muito raramente os processos de manutenção falham, permitindo que uma pequena fração das lesões diárias que o DNA sofre seja convertida em mutações (Hegde et al., 2008). Além disso, a própria replicação possui uma baixa taxa de erro intrínseco (Stratton et al., 2009). Apesar de raros, erros nos sistemas de reparo podem ser extremamente danosos. Um grande número de evidências indica que o primeiro passo para a geração do câncer, envolve mutações em células somáticas, muitas vezes geradas por falhas na ação de sistemas de reparo (Batty e Wood, 2000; Bernstein et al., 2002; Sarasin, 2003). Uma célula poderá responder de vários modos após sofrer uma lesão no DNA: a) não restaurar os danos e morrer; b) reparar precisamente a sequência original de bases e sobreviver; c) restaurar os danos, mas alterar a sequência original de bases, gerando com isto mutações que serão fixadas durante a replicação e serão transmitidas às células filhas após a divisão celular (Jacobs e Schär, 2012). Logo, a presença de sistemas de reparo, embora essencial para a sobrevivência da célula, pode ser responsável pela geração e fixação de mutações no genoma (Natarajan e Boei, 2003). Além do câncer, alterações no genoma estão relacionadas a outros efeitos na saúde humana como abortos, anormalidades congênitas em recém-nascidos, distúrbios metabólicos, infertilidade e várias síndromes. Estima-se que 0,6% dos neonatos possuam alterações numéricas e/ou estruturais, e que mais de 50% dos abortos espontâneos carreguem alterações cromossômicas (Natarajan e Boei, 2003). Muitas doenças humanas de caráter recessivo como ataxia telangiectasia, anemia de Fanconi, xeroderma pigmentoso, síndrome de Bloom são ocasionadas por deficiências em algum dos sistemas de reparo do DNA (Natarajan, 2002; GarciaSagredo, 2008). As células desses pacientes são mais susceptíveis a danos em seu DNA e apresentam elevados níveis de mutações, sendo sensíveis a mutágenos específicos. Dessa forma, esses pacientes possuem maiores chances de desenvolver tipos específicos de câncer, de acordo com o sistema de reparo afetado (Jacobs e Schär, 2012). 15 2.6 Relação entre mutagenicidade e carcinogenicidade A mutação em um gene pode levar à inativação de uma proteína crucial, resultando na morte da célula e perda da mutação. Muito raramente, a mutação dará origem a um gene com função melhorada ou nova (Desai e Fisher, 2007). Neste caso, organismos carregando a mutação terão uma vantagem e o gene mutado poderá, eventualmente, substituir o gene original na população através da seleção natural (Denamur e Matic, 2006; Stich et al.,2010). Processo semelhante acontece nas células cancerígenas. Ocasionalmente uma única célula adquire um conjunto suficiente de mutações vantajosas que faz com ela se prolifere de maneira autônoma, invada tecidos e sofra metástase (Stratton et al. 2009). Esse conjunto de manifestações patológicas é consequência direta de danos nos mecanismos de regulação do ciclo celular (Pinto e Felzenszwalb, 2003; Jacobs e Schär, 2012). Uma simples mudança genética muito raramente será suficiente para o desenvolvimento de um tumor maligno. A maioria das evidências indica tratar-se de um processo múltiplo de alterações sequenciais em vários genes (Carlo e Croce, 2008). Os danos ao DNA são dessa forma acumulados e após um determinado número de alterações, entre cinco e sete, a célula torne-se neoplásica (Pinto e Felzenszwalb, 2003; Sarasin, 2003). Todos os cânceres surgem a partir de mudanças que ocorreram na sequência de DNA das células (Weir et al., 2004; Stratton et al., 2009). Alterações genéticas que ativam proto-oncogenes ou inativam genes supressores tumorais são a chave da progressão de um tecido normal para um maligno (Kopnin, 2000; Sherr, 2004). Essas alterações são geralmente eventos somáticos, contudo mutações na linhagem germinativa podem predispor a pessoa a um câncer hereditário ou familiar. Alterações nos genes de microRNA também têm sido apontados como importantes no desenvolvimento do câncer (Carlo e Croce, 2008). As razões que levam à perda do controle do ciclo celular são complexas e multifatoriais. Dentre as quais estão predisposições genéticas e a ação de agentes externos. A exposição à mutágenos desempenha um importante papel na perda do controle do ciclo celular e na iniciação de processos neoplásicos (Freita et al., 2005), 16 uma vez que a mutagenicidade e a carcinogenicidade apresentam muitos aspectos em comum (Ames, 1979, 2001; Ames e Gold, 1989; Azevedo et al., 2003). Agentes carcinogênicos são geralmente mutagênicos, tais como substâncias presentes no fumo, raios-X, raios ultravioletas, entre outros. Compostos químicos reconhecidamente cancerígenos são, em sua maioria, positivos quando testados em ensaios que medem a mutagenicidade, como o teste de Ames, enquanto que, drogas reconhecidamente não cancerígenas, em geral, não são mutagênicas (Ames, 1979; Ames e Gold, 1989; Cairns, 2002; Loeb et al., 2003; Sarasin, 2003). Através dos avanços alcançados pelas pesquisas de como carcinógenos químicos levam ao surgimento de células neoplásicas, novos caminhos para a prevenção e tratamento do câncer foram encontrados, bem como confirmaram que lesões no DNA estão intimamente relacionadas com o desenvolvimento de câncer (Ames e Gold, 1991; Hagmar et al., 1998; Natarajan, 2002; Valko et al., 2004; Freita et al., 2005; Ribeiro et al., 2006; Garcia-Sagredo, 2008; Salazar et al., 2009). 2.7 Monitoramento biológico na aferição da genotoxicidade 2.7.1 Ensaios citogenéticos Desde os anos 60, ensaios citogenéticos têm sido utilizados na avaliação de agentes potencialmente mutagênicos e carcinogênicos. A aferição da genotoxicidade de agentes químicos, físicos e biológicos é essencial no estudo dos potenciais riscos quando da exposição das populações humanas. Através dos testes genotoxicológicos, pode-se avaliar a capacidade de determinadas substâncias em causarem ou não um dano direto ou indireto ao DNA em experimentos in vivo e in vitro, que empregam tanto sistemas eucariotos quanto procariotos (Chai et al., 2004). A análise citogenética das aberrações cromossômicas é considerada um dos métodos primários na avaliação da mutagênese induzida em mamíferos, sendo internacionalmente aceita como parte da bateria de testes recomendada para a avaliação do potencial genotóxico e registro de novos produtos químicos que entram anualmente no mercado mundial (Natarajan, 2002; Cimino, 2006). Além disso, os mesmos testes usados na toxicologia genética são utilizados no diagnóstico de 17 síndromes de instabilidade cromossômicas como anemia de Fanconi, xeroderma pigmentoso, ataxia telangiectasia, síndrome de Bloom, dentre outras (GarciaSagredo, 2008). A Toxicologia citogenética também é empregada no monitoramento ambiental e ecológico e nos riscos no ambiente de trabalho (Tucker e Preston, 1996). A descoberta de que alguns agentes poderiam gerar mutações em humanos e outras espécies, enfatizou a importância da realização de ensaios genotoxicológicos sobre sua segurança. Muitos estudos demonstram claramente que a ocorrência de um alto índice de aberrações cromossômicas está associada a um maior risco de desenvolvimento de neoplasias em humanos e animais experimentais (Norppa et al., 2006). Além do câncer, malformações em neonatos, abortos espontâneos, infertilidade, distúrbios fisiológicos e algumas síndromes estão diretamente relacionados à ocorrência de mutações. Compreender a relação entre exposição e indução de alterações cromossômicas se faz importante quando se considera o risco de efeitos adversos para seres humanos (Nishimura et al., 2008). 2.7.2 Teste de metáfase Dentre os ensaios mais utilizados na toxicologia genética, destaca-se o teste de metáfase, também conhecido como teste de aberrações cromossômicas, realizado em células de mamíferos. É um teste simples e sensível que é empregado na avaliação dos riscos genotóxicos de diversos compostos, podendo ser realizado in vitro e in vivo. Apesar de existir variabilidade nas repostas individuais, células humanas são úteis para avaliação da segurança no uso de substâncias em humanos, fornecendo uma estimativa dessa resposta (Nishimura et al., 2008). O teste de metáfase é considerado um eficiente ensaio biomarcador de efeitos iniciais empregado na predição do câncer (Garcia-Sagredo, 2008). Muitos estudos têm dado suporte à hipótese de que a ocorrência de mudanças cromossômicas em linfócitos de sangue periférico representam relevantes eventos na carcinogênese e podem servir de alicerce para avaliação do risco de câncer (Hagmar et al., 2004; Boffetta et al., 2007). 18 O principal objetivo do teste de metáfase é a identificação de aberrações cromossômicas (ACs) visíveis na estrutura dos cromossomos. A maioria das lesões encontradas é letal para as células, devido à perda de informação genética vital ou por razões mecânicas, as quais impedem que elas sobrevivam a um novo ciclo celular. Entretanto, tais lesões são quase sempre acompanhadas de outras alterações nem sempre visíveis pela citogenética convencional e menos prejudiciais, como translocações e pequenas deleções, que são estáveis e podem ser compatíveis com a divisão celular normal, desempenhando um importante papel no risco genético para as gerações futuras (Garcia-Sagredo, 2008). Essas translocações e pequenas deleções só podem ser analisadas e avaliadas com precisão empregando-se outras técnicas de identificação cromossômica como o bandeamento GTG e a hibridização in situ fluorescente (FISH) (Natarajan, 2002; Garcia-Sagredo, 2008). Alterações cromossômicas numéricas (aneuploidia) também podem ser avaliadas no teste, porém deve-se ter cautela durante a análise. O tratamento hipotônico e a fixação fragilizam as células em metáfase, frequentemente ocasionando perdas cromossômicas aleatórias durante a preparação das lâminas, que podem ser interpretadas erroneamente (Tucker e Preston, 1996; OECD, 1997a). 2.7.2.1 Princípios do ensaio Como o estágio de metáfase representa uma pequena fração do ciclo celular, as culturas ou animais experimentais devem ser tratados, poucas horas antes da colheita do material, com um inibidor do fuso mitótico, que pode ser colchicina ou colcemid (derivado sintético menos tóxico). Dessa forma, a migração cromossômica é impedida e as células que atingem o estágio de metáfase durante o período de exposição permanecem nesse estágio. O acúmulo de células em metáfase é fundamental para a análise, pois apenas nesse momento os cromossomos apresentam-se individualizados e bem definidos (Takahashi, 2003). Um segundo procedimento é a realização do choque hipotônico proposta por Hsu em 1952 que foi essencial para avanços nos estudos citogenéticos (Natarajan, 2002). Através da exposição das células a uma solução hipotônica de cloreto de potássio (KCl), expande-se o volume celular espalhando os cromossomos metafásicos dentro do citoplasma. Essa técnica propicia lâminas de preparações 19 onde os cromossomos permanecem em plano único, permitindo uma boa análise e identificação individual (Garcia-Sagredo, 2008). Além disso, algumas células podem deixar o ciclo celular normal durante a fase G1 e entrar numa fase não proliferativa ou fase G 0. Isso pode acontecer devido a condições adversas ou porque a célula atingiu um determinado estado de diferenciação, como acontece com os linfócitos periféricos. O uso de tipos celulares em G0 para realização de culturas requer a adição de um mitógeno (um agente que estimula a mitose), como a fitohemaglutinina, para que as células voltem ao ciclo celular normal (Garcia-Sagredo, 2008). 2.7.2.2 Classificação das aberrações cromossômicas estruturais As ACs podem ser classificadas em dois grupos: cromossômicas e cromatídicas. As ACs cromossômicas afetam ambas as cromátides, enquanto que as ACs cromatídicas afetam apenas uma cromátide do cromossomo (OECD, 1997a) (Figura 4). Alguns exemplos de ACs que podem ser encontradas através do teste de metáfase são: 1. Tipos cromatídicos: Gap cromatídico - é uma região não corada ou uma descontinuidade com comprimento menor ou igual à largura da cromátide, que ocorre em apenas um dos braços cromossômicos. Quebra cromatídica - é uma região não corada ou uma descontinuidade com comprimento maior que a largura da cromátide, que ocorre em apenas um dos braços cromossômicos. 2. Tipos cromossômicos: Gap isocromático ou cromossômico - é uma região não corada ou uma descontinuidade com comprimento menor ou igual à largura da cromátide, que ocorre em ambos os braços cromossômicos em posições idênticas. Quebra isocromática ou cromossômica - é uma região não corada ou uma descontinuidade com comprimento maior que a largura da cromátide, que ocorre em ambos os braços cromossômicos em posições idênticas. 20 3. Rearranjos cromossômicos: Dicêntrico – cromossomo caracterizado pela presença de dois centrômeros bem definidos formados pela quebra de dois cromossomos e posterior união dos segmentos que contenham a região centromérica. Gera fragmento nem sempre visível. Cromossomo em anel – cromossomo resultante da quebra das regiões terminais com posterior fusão das extremidades. Em geral, os fragmentos são perdidos. Figura 4 - Tipos de ACs encontradas após coloração convencional (Fonte: adaptado de Rooney, 2001). Algumas ACs podem ser rapidamente identificadas, enquanto outras necessitam de uma análise mais cautelosa para se evitar um erro de interpretação (Garcia-Sagredo, 2008). As principais dificuldades encontradas são em relação às seguintes alterações (Dean e Danford, 1984): 21 Falsos dicêntricos – Quando há uma sobreposição entre os braços cromossômicos, pode-se confundir essa conformação com um segundo centrômero. Essa conformação é geralmente diferenciada por um ponto de coloração mais escura na região da sobreposição. Gap isocromatídico ou cromossômico – contrições secundárias de cromossomos de algumas espécies podem, às vezes, ser confundidas com gaps isocromatídicos por apresentam uma pequena região não corada em ambos os braços em posições idênticas. Associação dos satélites – em humanos, as regiões organizadoras do nucléolo (RONs) são encontradas nos cromossomos acrocêntricos 13, 14, 15, 21 e 22. Frequentemente, ocorre uma associação dessas regiões de dois ou mais cromossomos acrocêntricos, que podem gerar erros de interpretação. 2.7.2.3 Distribuição e origem das aberrações cromossômicas Existem estudos que questionam a hipótese de que ACs ocorram de maneira aleatória no genoma. Um recente trabalho revelou haver heterogeneidade entre os cromossomos envolvidos em ACs em células primárias de hamster chinês empregando-se bandeamento GTG. Regiões centroméricas, ancorando sequências teloméricas intersticiais, tendem a se agregar durante a interfase formando cromocentros. Essa característica juntamente com a natureza repetitiva das sequências de DNA dessas regiões permite uma maior interação entre as quebras induzidas (Natarajan e Boei, 2003). Através da utilização de sondas específicas para braços cromossômicos foram observadas diferenças no envolvimento dos braços p e q do cromossomo X na formação de ACs em células de hamster chinês após exposição aos raios-X. Enquanto o braço p é essencialmente formado por eucromatina, o braço q é heterocromático. O DNA repetitivo da heterocromatina torna essa região mais vulnerável à ocorrência de rearranjos (Xiao, 1999), constatação essa que pode estar relacionada à replicação tardia dessa região, à associação somática dos cromossomos e à sua composição de bases (Natarajan, 2002). Regiões de eucromatina não só são mais resistentes à ocorrência de ACs, como também 22 parecem se restituírem (religação na posição original) mais rapidamente após sofrerem lesões (Slijepcevic e Natarajan, 1994). O tratamento de células com agentes genotóxicos pode resultar em uma ou mais lesões não reparadas na dupla fita do DNA. A consequência final dessas lesões é a formação de quebras nos cromossomos, que podem ser religadas corretamente restaurando a forma original (restituição), religadas de maneira incorreta ou ainda não serem religadas. Esses dois últimos casos podem ser visualizados e identificados como ACs nas preparações cromossômicas (Natarajan e Boei, 2003). 2.7.2.4 Variações individuais e limiar de indução aos danos citogenéticos Pacientes portadores de algumas doenças genéticas, como xeroderma pigmentoso e anemia de Fanconi, apresentam uma instabilidade cromossômica aumentada por possuírem sistemas de reparo deficientes (Natarajan, 2002). Entretanto, a aplicação de testes citogenéticos em células de pacientes saudáveis demonstrou uma ampla variação nas frequências de ACs encontradas. As respostas individuais também variaram quando as amostras foram expostas a agentes genotóxicos. Aparentemente alguns indivíduos são mais sensíveis e/ou suas respostas a agentes genotóxicos são mais exageradas (Garcia-Sagredo, 2008). Variações nos índices de ACs entre indivíduos podem ser resultado de características adquiridas e herdadas (Norppa, 2001). Não são completamente compreendidos os motivos pelos quais pacientes saudáveis, sem exposição conhecida ao fumo e a outros carcinógenos ocupacionais, possam apresentar altos índices de ACs e, consequentemente, um maior risco em desenvolver câncer (Bonassi et al., 2000). Polimorfismos genéticos, principalmente de genes envolvidos com os sistemas de reparo do DNA, podem ter um importante papel na susceptibilidade individual aos danos cromossômicos. Além disso, variações entre importantes parâmetros podem ocorrer entre linfócitos de diferentes doadores como: número de linfócitos presentes na amostra, diferenças na resposta à fitohemaglutinina, qualidade e quantidade no nível de reparo do DNA danificado e no metabolismo de 23 químicos, o que pode contribuir para essas diferenças individuais constatadas (Stephan e Pressl, 1999). Durante muitos anos acreditou-se que não havia um limiar para indução do dano genético, pois este aparentemente segue um padrão de efeito linear, onde quanto maior a dose, maior o dano ocasionado. Entretanto, Speit et al. (2000b) demonstraram que agentes genotóxicos devem apresentar limiares de indução por três motivos: 1. Pequenas doses do agente podem não alcançar o DNA, pois existem eficientes mecanismos de eliminação nas células. 2. Muitos organismos possuem mecanismos eficazes que os protegem de possíveis danos causados por espécies reativas do oxigênio. 3. Os mecanismos de reparo são capazes de corrigir danos causados por agentes genotóxicos em baixas concentrações. 2.7.2.5 Teste de metáfase in vitro versus in vivo No teste de metáfase in vitro, as células empregadas são selecionadas a partir de sua habilidade de crescimento em meio de cultura, estabilidade do cariótipo, número cromossômico, diversidade cromossômica e frequência de alterações espontâneas (OECD, 1997a). Vários tipos celulares podem ser usados na realização das culturas, porém os linfócitos humanos de sangue periférico são as células mais utilizadas, pois são facilmente obtidos através de punção venosa, crescem rapidamente em meio de cultura e fornecem um grande número de metáfases (Tucker e Preston, 1996). As principais vantagens dos testes in vitro são a possibilidade de testar rapidamente os efeitos de um suspeito agente mutágeno e de empregar dosagens bastante superiores aos níveis usuais, que não seriam possíveis em testes in vivo. A principal desvantagem dos ensaios in vitro é que não se conhece os efeitos dos metabólitos das substâncias testadas (Garcia-Sagredo, 2008). Além disso, a maioria dos mutágenos e carcinógenos é biologicamente inativa, necessitando ser biotransformada em suas formas eletrofílicas finais para se tornarem metabólitos genotóxicos. Na maioria das culturas celulares a atividade oxidativa é muito baixa, 24 impedindo ou minimizando a geração de metabólitos reativos. Para solucionar esse problema pode ser introduzido homogenato de tecidos de mamíferos livres de células que apresentem altas concentrações de enzimas microssomais. A preparação mais comumente empregada com essa finalidade é a fração S9 obtida a partir de tecido de fígado de rato (Ribeiro, 2003). Vale ressaltar que os testes genotóxicos in vitro apresentam maior sensibilidade que os testes in vivo, o que pode superestimar os resultados obtidos se extrapolados para situações in vivo (Garcia-Sagredo, 2008). A experimentação animal, além de permitir a compreensão de diversos processos fisiológicos e patológicos (Ferreira et al., 2005), é mais realista e adequada na avaliação da segurança de substâncias que possam ser danosas ao homem. Os animais experimentais mais comumente empregados em pesquisas são roedores, destacando-se os camundongos (Meyer, 2003), os quais são frequentemente usados para quantificação e caracterização das respostas de mamíferos a diversos estímulos, como radiação ionizante e químicos (Tucker et al., 1999). Dentre as razões para seu grande uso estão a praticidade em sua criação, manutenção e manuseio em relação a outros animais, e o bom conhecimento de sua fisiologia, a qual se assemelha à humana (Meyer, 2003). A principal vantagem do teste de metáfase in vivo é a possibilidade de avaliação dos possíveis efeitos genotóxicos das drogas testadas sob a influência de vários processos orgânicos como metabolização, farmacocinética e processos de reparo do DNA, normalmente prejudicados em experimentos in vitro (OECD, 1997b). Dentre as principais desvantagens, estão o alto custo na criação e manutenção dos animais sob condições extremamente controladas em biotérios autorizados. Além disso, apenas pessoas bem treinadas e qualificadas devem manusear os animais durante os experimentos (Takahashi, 2003). Grandes esforços têm sido feitos na otimização das pesquisas in vivo, como a diminuição no uso de animais, aprimoramento experimental/estatístico, busca por alternativas que os substituam, bem como o uso de procedimentos mais humanos para minimizar a dor e o desconforto causados aos animais (Madden et al., 2012). 25 3. Objetivos 3.1 Geral Investigar potenciais efeitos genotóxicos ocasionados pela exposição ao fármaco formocresol através de ensaios citogenéticos in vitro e in vivo. 3.2 Específicos 1. Detectar possíveis efeitos genotóxicos induzidos pelo fármaco formocresol através do teste de metáfase em linfócitos de sangue periférico humano. 2. Investigar possíveis diferenças quanto à frequência de ACs induzidas pelas diluições do formocresol em culturas de linfócitos de sangue periférico humano após exposição durante 24 e 48 horas. 3. Analisar possíveis variações quanto à frequência de ACs de acordo com os grupos cromossômicos em linfócitos de sangue periférico humano. 4. Detectar possíveis efeitos genotóxicos induzidos pelo fármaco formocresol através do teste de metáfase em células de medula óssea de camundongos de ambos os sexos. 5. Analisar possíveis variações quanto à frequência de ACs em células de medula óssea de camundongos de acordo com o sexo. 6. Averiguar quais os tipos de ACs mais frequentemente induzidas pela exposição ao formocresol nos ensaios in vitro e in vivo. 7. Analisar, à luz dos resultados, os potenciais riscos, em termos de genotoxicidade, da exposição das populações humanas ao fármaco formocresol. 26 4. Material e Métodos 4.1 Seleção das diluições da substância teste Como droga teste foi usado o medicamento endodôntico formocresol (Biodinâmica Química e Farmacêutica®). A partir de experimentos pilotos in vitro e in vivo foram selecionadas cinco diluições a serem empregadas: 1:50, 1:100, 1:200, 1:500 e 1:1000. Nos experimentos in vitro, cada cultura da droga teste recebeu 50 µl da diluição apropriada, enquanto que, nos experimentos in vivo, os animais foram inoculados via intraperitoneal (IP) com as diferentes diluições de formocresol de acordo com o peso do animal na proporção de 0,1 ml/10 g. Como solvente para a realização das diluições de formocresol foi utilizado glicerina: água destilada estéril na proporção de 1:1. 4.2 Ensaios in vitro 4.2.1 Critério de seleção dos voluntários Para a realização dos experimentos in vitro, foram coletadas amostras de sangue de quatro indivíduos saudáveis, de ambos os sexos (três homens e uma mulher) com idades entre 24 e 27 anos, após preenchimento do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 1), seguindo os seguintes critérios de inclusão: a) sem uso de medicamentos; b) não fumantes; c) sem ingestão de bebidas alcoólicas durante ao menos sete dias; d) sem exposição à radiação terapêutica e/ou diagnóstica, sem vacinação viral e sem consumo de drogas ilícitas nos últimos seis meses. Esse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco (CCS/UFPE) – Registro do SISNEP FR – 340306, CAAE – 0210.0.172.000-10 e Registro CEP/CCS/UFPE No 209/10 (Anexo 2). 27 4.2.2 Procedimento: teste de metáfase em linfócitos de sangue periférico humano As amostras de sangue (aproximadamente 15 ml) foram coletadas (sistema de coleta à vácuo) através de punção venosa, com material estéril e descartável, por profissionais qualificados e mantidas em tubos heparinizados. Logo em seguida, foram realizadas as culturas segundo o método de Moorhead et al. (1960) modificado pelo Laboratório de Genética e Citogenética Animal do Departamento de Genética da UFPE. Para realização das culturas (Figura 5) foram adicionados 0,5 ml de sangue total, 4 ml do meio RPMI 1690 (GIBCO®), 1 ml de soro fetal bovino inativado a 60ºC (CULTILAB®) e 0,2 ml de fitohemaglutinina (1 mg/ml) (SIGMA®) em tubos estéreis, os quais foram mantidos em estufa a 37ºC durante 24 horas. Após esse período, os tubos receberam 50 µl da diluição de formocresol (esterilizadas por filtração), sendo cada diluição realizada em duplicata. Como controle negativo foram realizadas culturas sem adição do formocresol, sob as mesmas condições experimentais das culturas da substância teste. Dois tempos experimentais foram empregados nesse estudo, onde culturas tiveram duração total de 48 e 72 horas. Dessa forma, as preparações citológicas foram realizadas 24 e 48 horas após exposição ao formocresol, respectivamente. Após 46 e 70 horas de cultivo, foi adicionado 0,1 ml de colchicinha a 0,0016% (SIGMA®) aos tubos de cultura, os quais foram devolvidos a estufa onde permaneceram por mais duas horas. Após esse período, os tubos foram centrifugados a 1800 rpm durante seis minutos (padrão mantido nas centrifugações seguintes). O sobrenadante foi descartado, adicionou-se KCl (0,075 M) aquecido a 37ºC até completar-se 8 ml da marcação do tubo de cultura e homogeneizou-se bem o material. Os tubos foram mantidos em banho-maria a 37ºC durante 15 minutos para a efetiva realização do choque hipotônico. Terminado o processo, uma nova centrifugação foi realizada. O sobrenadante foi desprezado, suspendeu-se o pellet e adicionou-se lentamente o fixador metanol:ácido acético (3:1), evitando-se a formação de agregados celulares. O material foi mais uma vez homogeneizado e, posteriormente, mantido em temperatura ambiente durante 20 minutos. Após esse período, novo processo de fixação foi realizado assim como descrito anteriormente. 28 O processo de centrifugação e fixação foi realizado até a obtenção de uma amostra limpa e transparente, alcançado geralmente após três etapas. Para a confecção das lâminas, após a última fixação, o pellet foi ressuspendido em 0,5 ou 1,0 ml de fixador recém-preparado. Duas gotas desse material foram gotejadas nas extremidades das lâminas, previamente limpas e identificadas, mantidas sobre suporte em banho-maria à 60ºC sem contato com a superfície da água. As lâminas foram mantidas na temperatura ambiente e após, no mínimo 24 horas, as lâminas foram coradas com solução de Giemsa 3,33% diluído em tampão fosfato (Na2HPO4, 0,06 M e KH2OP4, 0,06 M, pH 6,8) durante 10 minutos. Figura 5 - Fluxograma do teste de metáfase em linfócitos de sangue periférico humano. 29 4.3 Ensaios in vivo 4.3.1 Animais experimentais Nos ensaios in vivo foi utilizado no estudo um total de 100 camundongos (50 machos e 50 fêmeas) albinos Swiss webster adultos jovens saudáveis, com peso entre 30 e 38 g, fornecidos pelo biotério de criação do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães -FIOCRUZ. Os espécimes foram mantidos numa temperatura ambiente aproximada de 22ºC com ciclos alternados de iluminação (12 horas no claro e 12 horas no escuro). Ração e água foram fornecidos à vontade (ad libitum) aos animais e estes foram acompanhados por profissionais capacitados. O referido estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/FIOCRUZ), registrada sob o protocolo de número P-465/08, licenciado sob Nº L-054/08, válido até 30/06/2012 (Anexo 3). 4.3.2 Procedimento: teste de metáfase em células de medula óssea de camundongos Antes da experimentação, os camundongos passaram por um período de 72 horas no biotério de experimentação para aclimatização ao novo ambiente. Após esse período, todos os animais do grupo experimental foram devidamente pesados para cálculo da dose a ser aplicada. Após a pesagem, os animais foram marcados com pincéis atóxicos de várias cores para posterior identificação e colocados em gaiolas pequenas com capacidade máxima de cinco indivíduos. Cinco ensaios foram realizados por sexo, um para cada diluição de formocresol testada. Dez animais foram utilizados de um mesmo sexo por tratamento, onde seis foram inoculados com a droga teste (diluições de formocresol), dois com a ciclofosfamida (CPA - SIGMA®) na dose de 25 mg/kg (controle positivo) e dois com glicerina:água destilada estéril (1:1) de acordo com a proporção 0,1 ml/10 g (controle negativo) (Figura 6). Os animais dos grupos controle positivo e negativo foram inoculados via IP. Utilizou-se para isso seringas descartáveis de insulina/tuberculina estéreis. 30 Após 22 horas da primeira inoculação, todos os camundongos do grupo teste e grupos controle receberam via IP colchicina 1% (SIGMA®) de acordo com o peso animal (0,1 ml/10 g). Completadas 24 horas, os camundongos foram eutanasiados por deslocamento cervical de acordo com a técnica adequada de imobilização. Em seguida, os fêmures foram extirpados, dissecados e tiveram suas epífises proximais cortadas para melhor extração da medula óssea. Com auxílio de uma seringa com agulha, foi injetado 1 ml de solução isotônica de NaCl (0,9%) no canal medular, extraindo assim a medula óssea de ambos os fêmures dentro de um tubo de centrífuga com fundo cônico contendo 2 ml de NaCl (0,9%). A suspensão de células foi então homogeneizada várias vezes, até apresentar um aspecto límpido. O material foi centrifugado a 1000 rpm durante 10 minutos. Após a centrifugação, foi retirado o sobrenadante deixando cerca de 0,5 ml no tubo junto com o pellet. Adicionou-se então 4 ml de KCl (0,075 M) refrigerado a ±5ºC para realização do choque hipotônico. Após a homogeneização, o material ficou em repouso a temperatura ambiente por 25 minutos. Terminado esse tempo, o material foi centrifugado a 1000 rpm durante cinco minutos (padrão mantido nas centrifugações seguintes). Retirou-se o sobrenadante deixando cerca de 0,5 ml no tubo junto com o pellet o qual foi ressuspendido. Na fixação adicionou-se lentamente o fixador metanol:ácido acético (3:1), evitando-se a formação de agregados celulares. O material foi mais uma vez homogeneizado e levado à centrífuga. O processo de centrifugação e fixação foi realizado até a obtenção de uma amostra limpa e transparente, alcançado geralmente após três etapas. Para a confecção das lâminas, após a última fixação, o pellet foi ressuspendido em 0,5 ou 1,0 ml de fixador recém-preparado. Entre duas a três gotas desse material foram gotejadas (±50 cm de distância) em lâminas previamente limpas. As lâminas empregadas estavam imersas em água destilada estéril refrigerada a ±5ºC, permitindo a formação de uma “lâmina de água” na superfície do vidro, facilitando o espalhamento celular. Após esse processo, a face oposta das lâminas foram passadas rapidamente em chama de lamparina à álcool durante alguns segundos, identificadas e deixadas à secar a temperatura ambiente. Após, no mínimo 24 horas, as lâminas foram coradas segundo a seguinte bateria: a) sete minutos em cuba contendo solução de Giemsa a 10% diluída em água destilada; b) três lavagens rápidas em cuba contendo acetona; c) três lavagens rápidas em cuba 31 contendo acetona/xilol (1:1); d) 20 minutos em cuba contendo xilol; e) secagem em temperatura ambiente. Figura 6 - Fluxograma teste de metáfase em células de medula óssea de camundongos. 4.4 Análise microscópica As lâminas foram analisadas em microscópio óptico com objetiva de imersão (100x) por diferentes membros da equipe, em teste cego. Para reduzir a variação entre os analisadores, cada um analisou o mesmo número de células de lâminas de um mesmo voluntário (certificando-se que as células não fossem contabilizadas duas vezes). 32 4.4.1 Análises in vitro Foram analisadas 100 metáfases por paciente/diluição em cada um dos tempos amostrais (48 e 72 horas), totalizando 400 metáfases por diluição/tempo experimental. As metáfases foram avaliadas quanto: a) presença de ACs; b) tipos de ACs: gap cromatídico (G.CRT), gap isocromatídico (G.CRM), quebra cromatídica (Q.CRT), quebra isocromatídica (Q.CRM), fragmento acêntrico simples (FAS), fragmento acêntrico duplo (FAD), cromossomo em anel (C. ANEL) e outras (dicêntrico, dicêntrico trirradial, troca externa simétrica, monocêntrico trirradial e figuras complexas); c) número de ACs; d) grupo cromossômico afetado pelas ACs. Apenas metáfases contendo 46±1 centrômeros foram avaliadas segundo os seguintes critérios: a) bom alinhamento das cromátides; b) cromossomos não sobrepostos; c) boa fixação e coloração. O mesmo procedimento de leitura foi empregado para os controles negativos de cada experimento. 4.4.2 Análises in vivo Foram analisadas 50 metáfases por animal/diluição para ambos os sexos, totalizando 300 metáfases por diluição/sexo. As metáfases foram avaliadas quanto: a) presença de ACs; b) tipos de ACs: G.CRT, G.CRM, Q.CRT, Q.CRM, FAS, FAD, C. ANEL e outras; c) número de ACs. Apenas metáfases contendo 40±1 centrômeros foram avaliadas segundo os seguintes critérios: a) bom alinhamento das cromátides; b) cromossomos não sobrepostos; c) boa fixação e coloração. O mesmo procedimento de leitura foi empregado para os controles positivos e negativos de cada experimento. 4.5 Análise estatística Para a análise comparativa entre as variáveis qualitativas foi aplicado o teste do qui-quadrado, para verificar a existência de diferenças entre os percentuais de ACs encontrados para as diluições de formocresol testadas quando comparados aos resultados obtidos dos grupos controles de cada experimento. Os softwares utilizados para a realização dos testes foram o Excel 2000 e o R v2.10.0. Todas as conclusões foram tomadas ao nível de significância de 5%. 33 5. Resultados Nos ensaios in vitro foram empregados dois tempos experimentais. Nas culturas de 48 horas foram observadas ACs em 12,75%, 7,50%, 2,75%, 3,75%, 1,00% e 2,75% das células analisadas para as diluições de 1:50, 1:100, 1:200, 1:500, 1:1000 e para o grupo controle, respectivamente (Tabela 2). Nas culturas de 72 horas foram observadas ACs em 11,75%, 9,50%, 5,00%, 4,75%, 5,00% e 3,00% para as mesmas diluições e grupo controle (Tabela 3). A figura 7 apresenta imagens de uma metáfase normal e de algumas ACs encontradas nas análises in vitro. Figura 7 - Metáfases de linfócitos de sangue periférico humano. a) metáfase normal; b) gap cromatídico; c) gap isocromatídico; d) quebra cromatídica; e) quebra isocromatídica; f) cromossomo em anel; g) troca simétrica entre dois cromossomos; h) dicêntrico i) dicêntrico trirradial; j) dicêntrico trirradial (seta preta) e gap cromatídico (seta vermelha). Na análise estatística das culturas de 48 horas, comparando-se as dosagens de 1:50 (p-valor = 0,0001) e 1:100 (p-valor = 0.003901) com o grupo controle foi constatado haver diferença significativa, o que não foi observado para as outras diluições. O mesmo ocorreu com as culturas de 72 horas, onde houve diferença significativa quando comparadas às dosagens de 1:50 (p-valor = 0,0001) e 1:100 (pvalor = 0.0002607) com o grupo controle. Para as outras diluições não houve diferença significativa em comparação ao controle. 34 Tabela 2 - Efeito das diferentes diluições de formocresol sobre cromossomos de linfócitos de sangue periférico humano em culturas de 48 horas (após 24 horas de exposição à droga). Dose Nº de células analisadas Células Normais (nº) (%) Células Alteradas (nº) (%) Número total de ACs Número e percentual dos tipos ACs em relação ao número total de ACs G. CRT (nº) (%) G. CRM Q. CRT (nº) (%) (nº) (%) Q. CRM (nº) (%) FAS FAD C.ANEL (nº) (%) (nº) (%) (nº) (%) OUTRAS (nº) (%) * 1:50 298 260 87,248 38 12,752 56 24 42,857 3 5,357 18 32,142 3 5,357 - - - - - - 8 14,285 * 1:100 400 370 92,50 30 7,50 32 17 53,125 2 11 34,375 2 6,25 - - - - - - - - 1:200 400 389 97,25 11 2,75 11 3 27,272 - - 7 63,636 1 9,090 - - - - - - - - 1:500 400 385 96,25 15 3,75 16 13 81,25 - - 2 12,50 1 6,25 - - - - - - - - 1:1000 400 396 4 1,00 4 4 100,00 - - - - - - - - - - - - - - Total 1898 1800 94,4496 98 5,5504 119 61 60,90 5 2,321 38 28,53 7 5,38 - - - - - - 8 2,857 Controle 400 389 15 6 40,00 1 6,666 26,666 2 13,333 1 6,666 - - - - 1 6,666 99,00 97,25 11 2,75 6,25 4 G. CRT = gap cromatídico; G. CRM = gap isocromatíco; Q. CRT = quebra cromatídica; Q. CRM = quebra isocromatíca; FAS = fragmentos acêntrico simples; FAD = fragmentos acêntrico duplo; C. ANEL = cromossomo em anel. 2 *Diferença significativa quando comparado ao controle negativo (p<0,05; x -teste). 35 Tabela 3 - Efeito das diferentes diluições de formocresol sobre cromossomos de linfócitos de sangue periférico humano em cultura de 72 horas (após 48 horas de exposição à droga). Dose Nº de células analisadas Células Normais (nº) (%) Células Alteradas (nº) (%) Número total de ACs Número e percentual dos tipos ACs em relação ao número total de ACs G. CRT (nº) (%) G. CRM (nº) (%) Q. CRT (nº) (%) Q. CRM FAS FAD C.ANEL (nº) (%) (nº) (%) (nº) (%) (nº) (%) * 1:50 400 353 88,25 47 11,75 56 25 44,642 7 12,50 16 28,571 4 7,142 - * 1:100 400 362 90,50 38 9,50 39 24 61,538 1 2,564 11 28,205 2 5,128 1 1:200 400 380 95,00 20 5,00 26 18 69,23 - 8 - - - - 1:500 400 381 95,25 19 4,75 23 9 39,13 3 13,043 10 43,478 - - - 1:1000 400 380 95,00 20 5,00 25 15 60,00 2 - - Total 2000 1856 92,80 144 7,20 169 91 54,908 13 7,221 52 31,804 6 2,454 1 Controle 400 388 97,00 12 14 10 71,428 1 3 - 3,00 - 8,00 7,142 7 30,77 28,00 - 21,428 - - - 1 1,785 1 1,785 2,564 - OUTRAS (nº) (%) 2 3,571 - - - - - - - - - - - - - - - - 1 4,347 - 1 4 - - - - 3 1,583 - - 0,512 2 1,157 1 0,357 - - - - - G. CRT = gap cromatídico; G. CRM = gap isocromatíco; Q. CRT = quebra cromatídica; Q. CRM = quebra isocromatíca; FAS = fragmentos acêntrico simples; FAD = fragmentos acêntrico duplo; C. ANEL = cromossomo em anel. 2 *Diferença significativa quando comparado ao controle negativo (p<0,05; x -teste). 36 Na classificação das ACs dos tipos G. CRT, G. CRM, Q. CRT e Q. CRM de acordo com os grupos cromossômicos, induzidas após o uso das diluições de formocresol, contabilizou-se 111 ACs nas culturas de 48 horas e 162 nas culturas de 72 horas. Nas culturas de 48 horas, as ACs se distribuíram nos seguintes grupos cromossômicos: A = 30, B = 19, C = 44, D = 11, E = 3, F = 2 e G = 2 (Tabela 4). Nas culturas de 72 horas: A = 58, B = 20, C = 61, D = 17, E = 5, F = 1 e G = 0 (Tabela 5). Tabela 4 - Número total de alguns tipos de ACs observadas após utilização de diluições de formocresol e classificadas de acordo com os grupos cromossômicos em culturas de 48 horas. A média de ACs por cromossomo foi realizada tomando o sexo masculino como base. Grupos G. CRT G. CRM Q. CRT Q. CRM Total A (1,2 e 3) 15 3 9 3 30 Média de ACs por cromossomo 5,0 B (4 e 5) 10 0 8 1 19 4,75 C (6-12, X) 24 2 15 3 44 2,93 D (13, 14 e 15) 8 0 3 0 11 1,83 E (16, 17 e 18) 0 0 3 0 3 0,5 F (19 e 20) 2 0 0 0 2 0,5 G (21, 22 e Y) Total 2 61 0 5 0 38 0 7 2 111 0,4 G. CRT = gap cromatídico; G. CRM = gap isocromatíco; Q. CRT = quebra cromatídica; Q. CRM = quebra isocromatíca. Tabela 5 - Número total de alguns tipos de ACs observadas após utilização de diluições de formocresol e classificadas de acordo com os grupos cromossômicos em culturas de 72 horas. A média de ACs por cromossomo foi realizada tomando o sexo masculino como base. Grupos G. CRT G. CRM Q. CRT Q. CRM Total A (1,2 e 3) 31 3 21 3 58 Média de ACs por cromossomo 9,66 B (4 e 5) 14 0 6 0 20 5,00 C (6-12, X) 36 8 15 2 61 4,06 D (13, 14 e 15) 7 2 8 0 17 2,83 E (16, 17 e 18) 3 0 1 1 5 0,83 F (19 e 20) 0 0 1 0 1 0,25 G (21, 22 e Y) Total 0 91 0 13 0 52 0 6 0 162 0 G. CRT = gap cromatídico; G. CRM = gap isocromatídico; Q. CRT = quebra cromatídica; Q. CRM = quebra isocromatíca. 37 Nas análises in vivo, os camundongos machos apresentaram ACs em 6,0%, 4,0%, 3,33%, 3,33% e 1,33% das células analisadas para as diluições de 1:50, 1:100, 1:200, 1:500 e 1:000, respectivamente. Nos controles positivo e negativo foram encontradas ACs em 40,33% e 2,00% das células analisadas (Tabela 6). Nos indivíduos fêmeas encontraram-se ACs em 4,00%, 3,33%, 2,66%, 4,33% e 2,66% das células após uso do formocresol nas mesmas diluições e 19,00% e 2,00% para os controles positivo e negativo, respectivamente (Tabela 7). A figura 8 apresenta imagens de uma metáfase normal e de algumas ACs encontradas nas análises in vivo. Figura 8 - Metáfases de células de medula óssea de camundongos. a) metáfase normal; b) gap cromatídico; c) quebra cromatídica; d) fragmento acêntrico simples. Em machos comparando-se a dosagem de 1:50 (p=0.02192) com o controle negativo houve diferença significativa, o que não foi observado para as outras diluições. Em fêmeas quando comparadas todas as diluições de formocresol com o controle negativo não houve diferença significativa. 38 Tabela 6 - Efeito das diferentes diluições de formocresol sobre cromossomos de células de medula óssea de camundongos machos após 24 horas de exposição à droga. Dose Nº de células analisadas Células Normais (nº) (%) Células Alteradas (nº) (%) Número total de ACs Número e percentual dos tipos ACs em relação ao número total de ACs G. CRT (nº) (%) G. CRM (nº) (%) Q. CRT (nº) (%) Q. CRM FAS (nº) (%) (nº) (%) FAD (nº) (%) C.ANEL (nº) (%) OUTRAS (nº) (%) 300 282 94,0 18 6,0 20 9 45,0 1 5,00 8 40,0 - - 1 5,00 - - 1 5,00 - - 1:100 300 288 96,0 12 4,0 12 10 83,33 1 8,33 1 8,33 - - - - - - - - - - 1:200 300 290 96,66 10 3,33 10 9 90,00 - - 1 10,00 - - - - - - - - - - 1:500 300 290 96,66 10 3,33 10 8 80,00 - - 2 20,00 - - - - - - - - - - 1:1000 300 296 98,66 4 1,33 4 3 75,00 - - - - - - - - - - 1 25,00 - - Total 1500 1446 96,40 54 3,60 56 39 74,666 2 2,66 12 15,66 - - 1 1,0 - - 2 6,0 - - Controle Positivo 300 179 59,66 121 40,33 272 100 36,764 5 1,838 101 37,132 4 1,47 40 14,705 11 4,044 4 1,47 7 2,573 Controle Negativo 300 294 98,00 - - - - - * 1:50 6 2,00 6 5 83,33 - 1 16,66 - - - - - - G. CRT = gap cromatídico; G. CRM = gap isocromatíco; Q. CRT = quebra cromatídica; Q. CRM = quebra isocromatíca; FAS = fragmentos acêntrico simples; FAD = fragmentos acêntrico duplo; C. ANEL = cromossomo em anel. 2 *Diferença significativa quando comparado ao controle negativo (p<0,05; x -teste). 39 Tabela 7 - Efeito das diferentes diluições de formocresol sobre cromossomos de células de medula óssea de camundongos fêmeas após 24 horas de exposição à droga. Dose Nº de células analisadas Células Normais (nº) (%) Células Alteradas (nº) (%) Número total de ACs Número e percentual dos tipos ACs em relação ao número total de ACs G. CRT (nº) (%) G. CRM (nº) (%) Q. CRT (nº) (%) Q. CRM (nº) (%) FAS (nº) (%) FAD C.ANEL OUTRAS (nº) (%) (nº) (%) (nº) (%) 1:50 300 288 96,00 12 4,00 12 8 66,66 - - 2 16,66 1 8,33 1 8,33 - - - - - - 1:100 300 290 96,66 10 3,33 10 6 60,0 - - 2 20,0 - - 2 20,0 - - - - - - 1:200 300 292 97,33 8 2,66 10 9 90,0 - - 1 10,0 - - - - - - - - - - 1:500 300 287 95,66 13 4,33 16 12 75,00 1 6,25 3 18,75 - - - - - - - - - - 1:1000 300 292 8 2,66 8 5 62,50 - - 3 37,50 - - - - - - - - - - Total 1500 1449 96,60 51 3,40 56 40 64,83 1 1,25 11 20,58 1 1,66 3 5,66 - - - - - - Controle Positivo 300 243 81,00 57 19,00 66 38 57,575 2 3,03 14 21,212 3 4,545 5 7,575 1 Controle Negativo 300 294 98,00 6 5 83,33 1 16,66 - - - - 97,33 6 2,00 - - - 1,51 1 - - 1,51 2 - - G. CRT = gap cromatídico; G. CRM = gap isocromatíco; Q. CRT = quebra cromatídica; Q. CRM = quebra isocromatíca; FAS = fragmentos acêntrico simples; FAD = fragmentos acêntrico duplo; C. ANEL = cromossomo em anel. 2 *Diferença significativa quando comparado ao controle negativo (p<0,05; x -teste). 40 3,03 - 6. Discussão Nesse trabalho, para uma melhor análise do uso do formocresol, foram realizados ensaios citogenéticos empregando modelos in vitro e in vivo, assim como recomendado pelos órgãos regulatórios internacionais. Os ensaios in vivo nos fornecem algumas vantagens sobre ensaios in vitro, principalmente quando o processo de metabolização é considerado. Entretanto, o teste de metáfase utilizando cultura de linfócitos é considerado um método primário e eficaz na avaliação da mutagênese induzida em mamíferos e nos fornece uma estimativa da resposta humana, apesar de possíveis variações individuais (Garcia-Sagredo, 2008; Someya et al., 2008). Utilizando ambos os modelos, pode-se avaliar o comportamento do fármaco testado com e sem a participação de processos fisiológicos e averiguar a importância desses processos no que diz respeito à ocorrência de danos ao material genético. Nos experimentos in vitro observou-se que as diluições mais concentradas de 1:50 (percentual de formocresol em relação ao volume total da cultura - 0,01739%, que equivale a dose de 0,2052 mg de formaldeído, considerando o volume total da cultura em 5,75 ml e a concentração de formaldeído no formocresol aplicado em 19%, tendo como base a densidade de vapor do formaldeído igual a 1,08) e 1:100 (0,00869%, que corresponde a 0,1026 mg de formaldeído), para ambos os tempos de exposição, foram capazes de induzir ACs de maneira significativa quando comparadas ao grupo controle. Esses achados corroboram com resultados de estudos que apontam para a genotoxicidade e mutagenicidade do formocresol através de ensaios em cultura de células eucariotas e procariotas (Zarzar et al., 2003; Gahyva e Siqueira Júnior, 2005; Hagiwara et al., 2006; Nishimura et al., 2008; Leite et al., 2012). Hagiwara et al. (2006), através do teste de metáfase empregando células embrionárias de hamster sírio, e Nishimura et al. (2008), empregando o mesmo teste em células de polpa dentária humana, demonstraram que o formocresol mesmo em pequenas concentrações (0,003% / 330 µM) foi capaz de induzir ACs de maneira significativa em relação ao controle negativo. Isso demonstra que em determinadas situações não são necessárias altas dosagens para que o dano genotóxico ocorra. Gahyva e Siqueira Júnior (2005) avaliando a mutagenicidade do formocresol através 41 do SOS cromoteste em procariotos (indução de b-galactosidase em Escherichia coli) demonstraram que dentre as substâncias testadas, foi a única a apresentar efeitos citotóxicos e mutagênicos severos. Por outro lado, resultados negativos para a mutagenicidade e genotoxicidade do formocresol também foram obtidos por meios de outros ensaios citogenéticos, dentre eles o teste de Ames (Gahyva e Siqueira Júnior, 2005) e teste de cometa (Ribeiro et al., 2004, 2005; Da Silva et al., 2007; Ramos et al., 2008). Em relação ao ensaio do cometa, tais resultados podem estar associados com a ação do cresol que possui a habilidade de inibir a formação de espécies reativas do oxigênio, capazes de induzir extensivas quebras no DNA (Yeung et al., 2002). Outro importante fator responsável pelos resultados negativos se relaciona ao tipo de dano causado pelo formocresol chamados de ligações-cruzadas (DNA-DNA e DNA-proteína). Apesar de ser um dano ao material genético, esse tipo de lesão leva a uma redução na migração do DNA impedindo a obtenção de resultados positivos (Tice et al., 2000). Estudos avaliando a indução de ACs em pacientes submetidos a tratamento com formocresol também foram relatados. Zarzar et al. (2003) realizaram culturas de linfócitos de sangue periférico de crianças antes e após a realização de uma única pulpotomia. Concluíram que apesar do grupo tratado com formocresol apresentar um maior número de alterações cromossômicas quando comparado ao grupo controle, esta diferença não foi significativa diante dos testes estatísticos empregados. Entretanto, o formocresol foi genotóxico para um dos pacientes levantando questionamentos sobre a segurança em seu uso. Os autores correlacionaram essa exceção com a variabilidade genética presente em humanos, como relatado por Surrallés et al. (1998). Por outro lado, em estudo semelhante e recente, empregando um maior número de pacientes que necessitavam de tratamento em um ou dois dentes, Leite et al. (2012) demonstraram que houve diferença significativa comparando-se o grupo tratado ao grupo controle para todas as variáveis testadas. Entretanto, não houve diferença significativa comparando-se pacientes submetidos a uma ou duas pulpotomias. Os resultados obtidos em nosso estudo revelaram que a média do percentual de células com ACs (48 horas = 5,5504%; 72 horas = 7,2%) e do número total de ACs (48 horas = 23,80; 72 horas = 33,80) em culturas de 72 horas para todas as 42 diluições do formocresol foi superior quando comparado às culturas de 48 horas. Não foram encontrados dados na literatura empregando esse tipo de metodologia. Aparentemente, o maior tempo de exposição acarretou uma maior indução de ACs, possivelmente pela inexistência de uma metabolização eficiente in vitro, como ocorreria em um organismo vivo. Estima-se que o tempo de meia-vida do formaldeído exógeno em humanos seja de 1-1,5 minutos (Bhatt et al., 1988). Logo, sem ser metabolizado, o formaldeído exerceria seus efeitos prejudiciais sobre o DNA por mais tempo. Outro dado importante nesse estudo se refere à análise das frequências de ACs de acordo com os grupos cromossômicos após exposição pelas diluições do formocresol. No cariótipo humano os cromossomos são ordenados de forma decrescente aos pares e subdivididos em grupos da seguinte maneira: A) 1, 2 e 3; B) 4 e 5; C) 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e X; D) 13, 14 e 15; E) 16, 17 e 18; F) 19 e 20; G) 21, 22 e Y. Em ambos os tempos experimentais (48 e 72 horas), os três grupos cromossômicos onde proporcionalmente ocorreram o maior número de ACs foram o A, B e C. A média de ACs por cromossomo foi: A – 5,0, B – 4,75 e C – 2,93 (48 horas) e A – 9,66, B – 5,0 e C – 4,06 (72 horas). Não há nenhum estudo até o momento correlacionando a frequência de ACs (induzidas pelo formocresol) aos grupos cromossômicos. Células em cultura sob determinadas condições de estresse apresentam regiões no DNA mais sensíveis à formação de gaps e quebras, que podem ser visualizadas em cromossomos metafásicos após inibição parcial da síntese de DNA (Helmrich et al., 2006). Tais regiões são conhecidas como sítios frágeis (SFs) e, em geral, correspondem aos hotspots ou “pontos quentes” presentes no genoma. Os SFs foram inicialmente visualizados em células em cultura, de pacientes com retardo mental associado à síndrome do X frágil, sob condições de estresse (folatosensíveis) empregadas para induzir a expressão do sítio frágil X (FRAXA) (Glover et al., 2005). Os SFs podem ser classificados em sítios frágeis raros e comuns. Sítios frágeis raros (SFRs), como presente na síndrome do X frágil, são encontrados em poucos indivíduos (5%) e estão associados às mutações de expansão de repetições CGG ou AT (Sutherland et al., 1998). Sítios frágeis comuns (SFCs) são encontrados em todos os indivíduos, representando um componente estrutural cromossômico 43 normal. Apresentam regiões ricas em AT, porém são desprovidas de repetições satélite (Debatisse et al., 2012). Alguns grandes genes transcricionalmente ativos parecem localizar-se preferencialmente em regiões onde mais frequentemente se expressam SFCs (Helmrich et al., 2006). Aproximadamente 200 SFCs foram mapeados em linfócitos humanos, 22 deles foram analisados no nível molecular. Dentre os SFCs que apresentam frequência de quebras acima de 1,5% estão: FRA1B, FRA1I, FRA2C, FRA2D, FRA2H, FRA2I, FRA3B, FRA4C, FRA6E, FRA7K, FRA7H, FRA9B, FRA11F, FRA16D, FRAXB e FRAXC (Mrasek et al., 2010). FRA3B localizado no cromossomo 3 (3p14.2) é considerado o sítio mais frágil do genoma e pode ser induzido a formar quebras e gaps na maioria das células tratadas. Outros sítios frágeis altamente expressos em linfócitos são FRA6E (6q26), FRA7H (7q32.3), FRA16D (16q23) e FRAXB (Xp22.3) (Glover et al., 1984). Com exceção dos FRA16D, todos os outros SFCs com alta expressão de quebras relatados, localizam-se em cromossomos dos GRUPOS A, B ou C. Esses dados corroboram com os resultados obtidos em nosso estudo. Além disso, os grupos A, B e C contabilizam juntos 25 (em homens – XY) e 26 (em mulheres – XX) cromossomos que englobam mais da metade do conteúdo do material genético em humanos. Essa maior representabilidade do genoma pode também ter influenciado em uma maior indução de ACs dentro desses grupos, pois quanto maior a quantidade de DNA, maior o número de alvos para possíveis lesões. Soma-se ainda o fato, de que nem todas as ACs necessariamente irão ocorrer nos SFCs. Tais sítios são apenas alvos preferenciais e não exclusivos para ACs espontâneas ou induzidas, assim como observado nesse estudo pela presença de ACs em todos os grupos cromossômicos. A importância dos estudos sobre os SFCs se alicerça nas observações de que eles constituem alvos preferenciais para danos indutores de oncogenes em lesões pré-neoplásicas, sugerindo que a instabilidade dos SFCs dirige a oncogênese desde os estágios iniciais do processo (Bartkova et al., 2005; Tsantoulis et al., 2008). Através dos experimentos in vivo observou-se que em machos apenas a diluição mais concentrada de 1:50 (volume aproximado de formocresol injetado nos animais – 0,007 ml ou 7 µl, que equivale a dose de 1,436 mg de formaldeído, considerando a média de peso dos animais em 35 g e a concentração de 44 formaldeído no formocresol aplicado em 19%, tendo como base a densidade de vapor do formaldeído igual a 1,08) induziu ACs de maneira significativa quando comparado ao controle negativo. Poucos estudos empregando ensaios in vivo investigando a genotoxicidade sistêmica do formocresol são encontrados na literatura. Ramos et al. (2008), realizando o teste do micronúcleo em camundongos Swiss, obteve resultado positivo relativo ao uso do formocresol após injeção IP na diluição de 1:1000 na proporção de 0,1 ml/10g de peso animal. Estudos como o de Zarzar et al. (2003) e Leite et al (2012) também apontam para a distribuição do formocresol no organismo após pulpotomias, uma vez que as amostras de sangue periférico dos pacientes foram coletadas 24 horas após o uso da substância. Esses trabalhos ratificam os resultados obtidos através dos experimentos in vivo. Alguns estudos têm demonstrado que o formaldeído exerce seus efeitos sobre o DNA principalmente através da formação de ligações cruzadas DNAproteína e pela síntese desordenada de DNA (Hamaguch e Tsutsui, 2000; Heck e Casanova, 2004). Essas lesões bloqueiam a replicação podendo ser corrigidas completa ou incompletamente, e, nesse caso, podem levar a formação de mutações (Merk e Speit, 1998; Barker et al., 2005). A indução de ligações cruzadas DNAproteína pelo formaldeído está relacionada a efeitos sobre os cromossomos, como micronúcleos e troca de cromátides irmãs (Speit et al., 2000a). O formaldeído, mesmo sendo um composto tóxico, é naturalmente encontrado nos tecidos, células e fluidos corporais (Speit e Schmid, 2006). Entretanto, os mamíferos desenvolveram uma série de vias metabólicas capazes de combater e neutralizar os efeitos adversos dessa substância (Milnes, 2008). Conaway et al. (1996) descreveu em seu trabalho que o organismo possui um mecanismo protetor capaz de evitar a formação de ligações cruzadas DNA-proteína em concentrações inferiores a 10 mM ou 5 mg/ml de formaldeído. Logo, esse tipo de lesão não é esperado em exposições a baixas concentrações de formaldeído. Aparentemente, a dose final de formaldeído associada à aplicação da diluição de 1:50 foi suficientemente grande, ultrapassando a capacidade de detoxificação fisiológica em camundongos machos, ocasionando um aumento significativo no número de ACs em comparação às outras diluições e com o controle negativo. 45 Uma possível indução de ACs de maneira diferenciada entre os sexos foi investigada nos experimentos in vivo. Entretanto, não foram observadas grandes diferenças entre machos e fêmeas. Mesmo após a constatação de que houve indução de ACs de maneira significativa apenas em machos para a diluição de 1:50, comparando-se percentual de células com ACs e o número total de ACs entre machos e fêmeas, para todas as diluições, observa-se que os valores encontrados são bastante semelhantes entre si. A análise estatística não deve ser considerada o único fator determinante para validação dos testes de genotoxicidade. A relevância biológica dos resultados deve antes ser considerada (OECD, 1997b). Os tipos de ACs mais frequentemente induzidos nos ensaios in vitro e in vivo foram gaps cromatídicos e quebras cromatídicas. Resultados semelhantes foram encontrados nos trabalhos de Zarzar et al. (2003), Hagiwara et al. (2006), Nishimura et al. (2008), Someya et al. (2008) e Leite et al. (2012). Outros danos, também estiveram presentes nas análises, demonstrando que o formocresol é capaz de induzir uma série de tipos de ACs. O formaldeído é um químico altamente reativo, capaz de interagir com proteínas, DNA, RNA e outras macromoléculas (Feron et al., 1991). É um composto genotóxico de ação direta capaz de afetar várias etapas envolvidas no controle da expressão gênica, incluindo aqueles envolvidos com a síntese de DNA, no reparo e na regulação da proliferação celular (National Toxicology Program, 2010). Todas essas características podem ser apontadas como responsáveis pela variedade de ACs encontradas nesse estudo. De uma forma geral, poucos trabalhos são encontrados avaliando a segurança genética relativa ao uso do formocresol. Frequentemente, essa segurança é inferida através de estudos sobre a genotoxicidade, mutagenicidade e carcinogenicidade do formaldeído, que são muitas vezes divergentes entre si. Uma extensa revisão a respeito do formaldeído foi realizada há alguns anos pela IARC (2006). Segundo consta nesse documento, o formaldeído é considerado mutagênico em ensaios empregando bactéria, leveduras e Drosophila melanogaster; genotóxico para modelos empregando células de mamíferos e plantas; e carcinogênico para animais e humanos. O que não é ressaltado nesse estudo, entretanto, é que a reclassificação do formaldeído de “provável” para “conhecido carcinógeno humano” baseia-se na premissa de que, sob quaisquer que sejam as condições, essa 46 substância pode causar câncer em humanos. Logo, torna-se difícil inferir até que ponto o formocresol ou o formaldeído pode causar a indução de mutações e/ou câncer. Além dos questionamentos sobre a segurança do formocresol, seu emprego é ainda hoje bastante criticado por uma série de fatores. Ramos et al. (2008) discute que apesar do formocresol ser a droga de preferência nos procedimentos endodônticos de rotina, seu uso clínico e sua aplicação continua sendo arbitrária e sem cunho científico. Nenhuma das fórmulas do formocresol foi sequer padronizada e as doses são estabelecidas de maneira arbitrária. Tem sido demonstrado que a dose comumente aplicada do formocresol é muitas vezes superior a mínima requerida para executar seus efeitos (Hagiwara et al., 2006). Em estudo recente realizado nos EUA, foram entrevistados 92 dentistas pediátricos certificados sobre questões a respeito dos métodos por eles empregados para realização de pulpotomias. O formocresol foi o medicamento de escolha para 61% dos entrevistados, onde 28,3% empregavam a droga em sua mais alta concentração. Dentre os entrevistados que usavam formocresol, 73% disseram não ter preocupações (sobre, por exemplo, toxicidade, mutagenicidade ou carcinogenicidade do formocresol ou formaldeído) a respeito de suas escolhas (Yoon et al., 2008). Esse trabalho evidencia o despreparo e a falta de informação por parte dos profissionais que manipulam e expõem seus pacientes ao formocresol. O aparente sucesso relacionado ao uso do formocresol se baseia exclusivamente em estudos clínicos e radiográficos. Contudo, estudos histopatológicos demonstram se tratar de uma droga extremamente tóxica e não biocompatível. Tal observação seria mais que um bom motivo para o abandono em definitivo desse medicamento pulpar. Além disso, com o passar do tempo, são relatados o insucesso de pulpotomias consideradas bem sucedidas durante as etapas iniciais do tratamento com formocresol (Hunter, 2003; Assed e Silva, 2008). Os danos citogenéticos são cumulativos e a exposição contínua à mutágenos, quer sejam de ocorrência natural ou não, pode originar sérios riscos à saúde (Ramsey et al., 1995), dentre eles o câncer. Atenção redobrada deve ser dada no emprego de substâncias químicas, como o formocresol, em pulpotomias, pois se trata de um procedimento realizado, na grande maioria dos casos, em crianças que ainda estão em fase de desenvolvimento e crescimento, que inevitavelmente serão 47 expostas a outros agentes potencialmente genotóxicos durante suas vidas (Zarzar et al., 2003). Todos os relatos descritos acima reforçam a importância de estudos sobre a segurança genética no emprego do formocresol. Se muitos autores não veem motivos para a descontinuidade de seu uso, ao menos deveriam se preocupar e apontar medidas para efetivação do uso racional e padronizado desse medicamento. Muitas outras substâncias e metodologias existem e podem substituir ou servir como alternativas no tratamento endodôntico. Contudo, os fatores econômico e histórico parecem ser grandes empecilhos para a descontinuidade do uso do formocresol. 48 7. Conclusões 1. O fármaco pulpar formocresol é capaz de induzir ACs (danos genotóxicos) de maneira dose-dependente, tanto in vitro quanto in vivo. 2. O aumento no tempo de exposição ao formocresol é seguido de um aumento na quantidade de células com ACs e na quantidade de ACs por célula em cultura. 3. Através dos experimentos in vitro observa-se que as ACs oriundas da exposição ao formocresol ocorrem de maneira diferenciada entre os grupos cromossômicos, afetando preferencialmente cromossomos que apresentam regiões com alta expressão de SFCs. 4. Diferenças sexuais aparentemente não são capazes de induzir alterações no padrão de ocorrência de ACs entre camundongos machos e fêmeas. 5. Em ambos os ensaios citogenéticos, os tipos de ACs mais encontrados são gaps cromatídicos e quebras cromatídicas. 6. O uso indevido do formocresol parece ser o princípial responsável pelos efeitos genotóxicos relatados na literatura. 7. Estudos adicionais sob condições experimentais controladas e padronizadas devem ser realizados para uma mais ampla e eficiente avaliação genotóxica, mutagênica e carcinogênica do formocresol. A abordagem de novos parâmetros, emprego de outras metodologias, clareza de informações sobre o desenho experimental e sobre exposição somam a favor da resolução dos questionamentos a respeito da segurança no uso do formocresol. 8. A pesquisa e desenvolvimento de novas drogas e metodologias para aplicação em procedimentos endodônticos, em substituição ao formocresol, devem ser considerados, pois mesmo não havendo respostas definitivas a respeito da segurança do formocresol, é visível que esse fármaco está longe de preencher a todos os requisitos tidos como ideais para um medicamento pulpar. 49 8. Bibliografia Aeinehchi M, Dadvand S, Fayazi S and Bayat-Movahed S (2007) Randomized controlled trial of mineral trioxide aggregate and formocresol for pulpotomy in primary molar teeth. Int Endod J 40(4):261-267. Agency for Toxic Substances and Disease Registry – ATSDR (1999) Toxicological Profile for Formaldehyde, http://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/tp111.pdf (july 11, 2012) Ames BN (1979) Identifying environmental chemicals causing mutation and cancer. Science 204(4393):587-593. Ames BN (2001) DNA damage from micronutrient deficiencies is likely to be a major cause of cancer. Mutat Res 475:7-20. 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Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Convido o Sr.(a) ____________________________________________ a participar da pesquisa intitulada “Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através dos testes do micronúcleo e de metáfase in vitro e in vivo.” Durante a leitura deste documento fui informado que posso interromper para fazer quaisquer perguntas. Este estudo tem como objetivo principal avaliar possíveis alterações do DNA em células de adultos sadios cujas amostras sanguíneas serão expostas ao fármaco formocresol. A partir de diferentes dosagens da droga, será analisada as variações da resposta biológica em relação as doses empregadas. Essa pesquisa se faz necessária, pois o formocresol, além de ser mundialmente empregado no tratamento odontológico, carece de estudos mais aprofundados sobre seu potencial mutagênico, apesar de possuir em sua composição formaldeído, considerado um provável carcinógeno humano. Serão coletadas amostras de sangue (10 ml), por punção venosa, em seringas estéreis descartáveis contendo heparina sódica na concentração de 5000 U/ml, de voluntários saudáveis e não-fumantes, após assinatura deste termo. Será ainda realizada anamnese para verificar, além do estado geral de saúde, se nos últimos seis meses antes da coleta os voluntários foram expostos à radiação terapêutica, raio X diagnóstico, vacinação viral ou consumiram drogas ilícitas. Ao participar desta pesquisa, o indivíduo se expõe ao risco de desenvolver equimose (mancha roxa) no local da retirada de sangue e não será, em momento algum, exposto ao fármaco formocresol. Tenho consciência de que não receberei qualquer espécie de remuneração por minha participação neste projeto de pesquisa. 60 Ciente do projeto de pesquisa exposto acima, foi explicado ainda que tenho o direito de me recusar a participar , ou, se já houver concordado, posso desistir sem necessidade de explicação. As informações desta pesquisa são confidenciais e minha identidade será preservada, sem que meu nome apareça em nenhum documento de divulgação de resultados ou qualquer dado que possa me identificar. Nome do voluntário: _______________________________________________ Assinatura _____________________________________ Data ___/___/_____ Testemunha ___________________________________ Data ___/___/_____ Testemunha ___________________________________ Data ___/___/_____ A rogo de _____________________________________________,assino o presente termo __________________________________________________. _______________________________________________________ Kleison da Costa Merlo – Pesquisador responsável Departamento de Genética do Centro de Ciência de Saúde Fone: (81) 8821-1625 61 Anexo 2 - Autorização do Comitê de Ética em Pesquisa Envolvendo Seres Humanos do Centro de Ciências Humanas da Universidade Federal de Pernambuco (CEP/CCS-UFPE). 62 Anexo 3 - Autorização da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA-FIOCRUZ). 63 10. Curriculum vitae (Lattes) _________________________________________________________________________________ Kleison da Costa Merlo Curriculum Vitae _________________________________________________________________________________ Dados pessoais Nome Kleison da Costa Merlo Filiação Valdemar Merlo e Lúcia de Fátima Noberto da Costa Merlo Nascimento 12/06/1986 - Realeza/PR - Brasil Carteira de Identidade 13198386 SSP - MT - 21/05/1998 CPF 010.610.275-38 Formação acadêmica/titulação 2010 Mestrado em Programa de Pós-Graduação em Genética. Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, Recife, Brasil Título: Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através dos testes do micronúcleo e de metáfase in vitro e in vivo, Ano de obtenção: 2012 Orientador: Neide Santos Bolsista do(a): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico 2005 - 2009 Graduação em Biomedicina. Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, Recife, Brasil Título: Avaliação genotóxica do fármaco antiparasitário albendazol (ZENTEL®) através do teste de micronúcleo Orientador: Maria Eliane Bezerra de Mélo Atuação profissional 1. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães - CPQAM Vínculo institucional 2010 - Atual Vínculo: Mestrando , Enquadramento funcional: Mestrando , Carga horária: 40, Regime: Dedicação exclusiva Áreas de atuação 1. 2. Genética Mutagenese Prêmios e títulos 2012 "Menção Honrosa" na área de mutagênese para o trabalho intitulado "Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através do teste de metáfase in vitro", XIX ENGENE 2012 "Menção Honrosa" na área de mutagênese para o trabalho intitulado "Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através do teste de metáfase in vivo", XIX ENGENE 64 Produção em C, T & A _________________________________________________________________________________ Produção bibliográfica Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo) 1. MERLO, K. C., MUNIZ, C. B, DINIZ, G. T. N., MELO, M. E. B., SANTOS, N. Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através do teste de metáfase in vitro In: XIX Encontro de Genética do Nordeste, 2012, Juazeiro-Bahia. Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através do teste de metáfase in vitro. , 2012. 2. MELO, M. E. B., LIRA, R. T., DINIZ, G. T. N., SANTOS, N., MERLO, K. C. Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através do teste de metáfase in vivo In: XIX Encontro de Genética do Nordeste, 2012, Juazeiro-Bahia. Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através do teste de metáfase in vivo. , 2012. 3. Silva, E. R., SILVA, J. L., Silva, J. D., Silva, J. P. A., Silva, G. K. C., SILVA, N. N. L., MERLO, K. C., LAPENDA, T. L. S. Atenção Farmacêutica como Marketing em Farmácias e Drogarias In: IX Congresso Brasileiro de Farmácia, 2011, Olinda. IX Congresso Brasileiro de Farmácia. , 2011. 4. MELO, M. E. B., DINIZ, G. T. N., MERLO, K. C. Detection of chromosomal aberrations in mice bone marrow cells with evidences of consanguinity In: X congresso Brasileiro da Sociedade Brasileira de Mutagênese, Carcinogênese e Teratogênese Ambiental, 2011, São Pedro. X Congresso Brasileiro da SBMCTA. , 2011. 5. Silva, E. R., SILVA, J. L., Silva, J. D., Silva, J. P. A., Silva, G. K. C., SILVA, N. N. L., MERLO, K. C., LAPENDA, T. L. S. Importância da implantação da Atenção Farmacêutica no Brasil In: IX Congresso Brasileiro de Farmácia, 2011, Olinda. IX Congresso Brasileiro de Farmácia. , 2011. 6. SILVA, J. L., Silva, E. R., Silva, J. D., Silva, J. P. A., Moraes, J. P., MERLO, K. C., LAPENDA, T. L. S. Perfil do uso de anti-hipertensivos inibidores da enzima conversora de angiotensina em Unidade de Saúde Pública de Pernambuco In: IX Congresso Brasileiro de Farmácia, 2011, Olinda. IX Congresso Brasileiro de Farmácia. , 2011. Apresentação de trabalho e palestra 1. MERLO, K. C., MUNIZ, C. B, DINIZ, G. T. N., MELO, M. E. B., SANTOS, N. Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através do teste de metáfase in vitro, 2012. (Simpósio,Apresentação de Trabalho) 2. MELO, M. E. B., LIRA, R. T., DINIZ, G. T. N., SANTOS, N., MERLO, K. C. Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através do teste de metáfase in vivo, 2012. (Simpósio,Apresentação de Trabalho) 3. MERLO, K. C., MELO, M. E. B., SANTOS, N. Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através dos testes de metáfase in vitro e in vivo, 2011. (Outra,Apresentação de Trabalho) 65 Eventos Eventos Participação em eventos 1. Apresentação de Poster / Painel no(a) XIX Encontro de Genética do Nordeste, 2012. (Simpósio) Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através do teste de metáfase in vitro. 2. Apresentação de Poster / Painel no(a) XIX Encontro de Genética do Nordeste, 2012. (Simpósio) Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através do teste de metáfase in vivo. 3. Apresentação Oral no(a) I Jornada de Pós-graduação em Genética, 2011. (Outra) Investigação do potencial genotóxico do fármaco formocresol através dos testes de metáfase in vitro e in vivo. 4. I Seminário - Qualidade e Biossegurança em Pesquisa e Serviços de Saúde, 2011. (Seminário) . _________________________________________________________________________________ Totais de produção Produção bibliográfica Artigos completos publicados em periódico................................................. Trabalhos publicados em anais de eventos.................................................. Apresentações de trabalhos (Congresso).................................................... Apresentações de trabalhos (Simpósio)..................................................... Apresentações de trabalhos (Outra)........................................................ Eventos Participações em eventos (congresso)...................................................... Participações em eventos (seminário)...................................................... Participações em eventos (simpósio)....................................................... Participações em eventos (oficina)........................................................ Participações em eventos (encontro)....................................................... Participações em eventos (outra).......................................................... 1 9 3 2 3 3 1 4 1 1 10 66
