isolamento de bactérias láticas com potencial

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS LÁTICAS COM POTENCIAL
BACTERIOCINOGÊNICO A PARTIR DE LEITE DE CABRA DO CARIRI
PARAIBANO
LILIANE A. SILVA1; ANNIE E. S. RAPOSO2; ERICKA O. SILVEIRA3; JOSÉ H. P. L. NETO4;
HAÍSSA R. CARDARELLI5. Programa de Pós Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos
Universidade Federal da Paraíba – UFPB, Cidade Universitária, CEP 58051-900, João Pessoa, Paraíba,
Brasil.
Resumo
Bactérias láticas podem produzir substâncias antimicrobianas como as bacteriocinas
capazes de inibir a multiplicação de bactérias patogênicas veiculadas por alimentos e
apresentam potencial como bioconservantes em alimentos. Objetivou-se isolar bactérias
láticas bacteriocinogênicas a partir de leite de cabra cru. Dezoito amostras de leite de
cabra cru foram coletadas diretamente de animais de dezoito sítios localizados no Cariri
Paraibano e procedeu-se ao isolamento das bactérias láticas e verificação da atividade
antagonística por plaqueamento em superfície em MRS em diferentes combinações
tempo/temperatura 25°C, 30°C e 35°C/ 48-72h em anaerobiose e 30°C e 37°C/48-72h
tanto em anaerobiose quanto em aerobiose. Colônias isoladas Gram positivas e catalase
negativas foram selecionadas para verificação da atividade antagonística frente a
diferentes microrganismos indicadores usando o método spot on the lawn adaptado.
Apenas uma colônia isolada em anaerobiose a 25°C/72h apresentou atividade
antagonística frente a cepas de Listeria monocytogenes. As técnicas empregadas para o
isolamento de bactérias láticas e detecção da atividade bacteriocinogênica empregados
demonstraram ser viáveis e adequadas para o estudo proposto e trabalhos futuros
caracterizarão melhor o potencial da cepa isolada para aplicação como bioconservante
em alimentos.
Palavras- chave: isolamento de bactérias láticas, bacteriocinas, bioconservantes.
Abstract
Lactic acid bacteria can produce antimicrobial substances such as bacteriocins, able to
inhibit the growth of foodborne pathogenic bacteria and applicable as food
biopreservatives. This study aimed to isolate bacteriocinogenic lactic acid bacteria from
raw goat milk. Eighteen samples of raw goat milk producers were collected directly
1
Mestranda em Ciência e Tecnologia de Alimentos UFPB, João Pessoa-PB.
[email protected]
2
Discente em Engenharia de Alimentos PIVIC/UFPB, João Pessoa-PB.
3
Mestranda em Ciência e Tecnologia de Alimentos UFPB, João Pessoa-PB.
4
Discente em Engenharia de Alimentos PIBITI/UFPB, João Pessoa-PB.
5
Docente do DTA/CTDR/UFPB, João Pessoa –PB.
from animals from small farms located in the Cariri’s region of Paraíba and proceeded
to the isolation of lactic acid bacteria and verification of antagonistic activity by plating
on MRS surface at different time and temperature combinations: 25°C, 30°C and 35°C
anaerobically for 48 to 72 hours and 30°C, 37°C for 48 to 72 hours, both in aerobiosis
and in anaerobiosis. Gram positive and catalase-negative isolated colonies were selected
and the antagonistic activity against different indicator microorganisms using the “spot
on the lawn” with modifications. Only one colony anaerobically isolated at 25°C/72h
showed antagonistic activity against strains of Listeria monocytogenes. The techniques
applied for the isolation of lactic acid bacteria and detection of bacteriocin activity
proved to be feasible and suitable for the proposed study and future work will better
characterize the potential of the isolated strain for application as biopreservative in food.
Keywords: isolation of lactic acid bacteria, bacteriocins, biopreservatives.
Introdução
As bactérias láticas (LAB) são amplamente utilizadas pelas indústrias de
alimentos na fabricação de produtos fermentados e como ferramentas para a segurança
de alimentos. Esses microrganismos produzem naturalmente várias substâncias com
potencial antimicrobiano, tais como ácidos orgânicos, CO2, peróxido de hidrogênio e
bacteriocinas (MORAES et al., 2010). Bacteriocinas são peptídios ou proteínas
antimicrobianas sintetizadas nos ribossomos das células bacterianas e liberadas no meio
extracelular que apresentam ação bactericida ou bacteriostática sobre microrganismos
taxonomicamente relacionados. Além disso, podem ser utilizadas como bioconservantes
de alimentos, pois não promovem alteração na qualidade sensorial do produto, sendo de
interesse crescente para a indústria de alimentos devido ao seu potencial de utilização
em substituição aos conservantes químicos (NASCIMENTO, et al., 2008).
Produzidas espontaneamente ou induzidas, as bacteriocinas podem inibir a
multiplicação de bactérias e uma gama de microrganismos, incluindo patógenos e
microorganismos deterioradores tais como Listeria monocytogenes, Bacillus cereus,
Staphylococcus aureus e Clostridium tyrobutyricum (GÁLVEZ et al., 2008). O objetivo
deste estudo foi detectar LAB bacteriocinogênicas de ocorrência natural no leite de
cabra produzido no Cariri Paraibano.
Materiais e métodos
Isolamento
Dezoito amostras de leite de cabra cru foram coletadas diretamente de animais
de dezoito sítios localizados na região do Cariri Paraibano (dez amostras de Monteiro,
seis amostras de Santo André e duas amostras de Gurjão). Diluições decimais a partir de
10 mL de cada amostra foram semeadas em ágar MRS. Para as amostras coletadas na
cidade de Monteiro, o isolamento das bactérias láticas com potencial bacteriocinogênico
foi realizado por plaqueamento de 0,1 mL de cada diluição em superfície e incubadas a
30°C e 37°C/ 48-72h tanto em anaerobiose e aerobiose. Já as diluições das amostras das
cidades de Santo André e Gurjão foram semeadas em superfície e incubadas a 25°C,
30°C e 35°C/ 48-72h em anaerobiose e também 1 mL de cada diluição em profundidade
nas mesmas condições de temperatura/tempo. A metodologia para o isolamento foi a
mesma adotada por Camargo (2011) e Moraes et al. (2010), com algumas adaptações.
As culturas puras Gram positivas e catalase negativas foram armazenadas sob
congelamento em caldo MRS contendo glicerol a 30% v/v.
Teste da atividade antagonística
Todas as culturas Gram positivas e catalase negativas isoladas em MRS, foram
testadas quanto à atividade antagonística frente aos microrganismos indicadores Listeria
monocytogenes Scott A, Listeria monocytogenes ATCC 7644, Listeria monocytogenes
711 (USP/Chiarini), Enterococcus faecium ATCC 19433, Staphylococcus aureus
ATCC 13565, Salmonella spp 29 (UFPB/ Farias), Escherichia coli (UFPB/CTDR)
usando a técnica descrita por Rosa et al. (2002) em conjunto com o método spot on the
lawn descrito por Van Reenen et al. (1998), com modificações.
Resultados e discussão
O método spot on the lawn é amplamente utilizado para detectar a natureza
proteica de substâncias antimicrobianas produzidas pelas LAB. Este método é vantajoso
na medida em que substâncias proteicas podem ser identificadas, mesmo em culturas
que produzam pequenos halos de inibição (MORAES et al.,2008). Usando esta técnica
com modificações, uma das vinte e quatro culturas isoladas e testadas, que apresentava
colônia pequena e leitosa, demonstrou apresentar potencial bacteriocinogênico, com
inibição frente à Listeria monocytogenes 711 (USP/Chiarini) e Listeria monocytogenes
ATCC 7644. As cepas que foram isoladas em aerobiose não apresentaram qualquer
indicação de inibição frente aos indicadores utilizados. A cepa produtora com atividade
antagonística (amostra coletada no município de Santo André) foi isolada em condições
de anaerobiose a 25°C/72h. Análises complementares necessárias para confirmar a
natureza proteica das substâncias produzidas, para identificar o espectro de ação frente a
outros microrganismos sensíveis, bem como identificar fatores que possam interferir na
atividade antimicrobiana serão realizados posteriormente.
Conclusão
As técnicas empregadas para o isolamento de bactérias láticas e detecção da
atividade bacteriocinogênica empregados demonstraram ser viáveis e adequadas para o
estudo proposto e trabalhos futuros caracterizarão melhor o potencial da cepa isolada
para aplicação como bioconservante em alimentos.
REFERÊNCIAS
CAMARGO, R. J. Ação de bacteriocinas de bactérias láticas no controle de Listeria
monocytogenes e no aumento da vida de prateleira de mortadela fatiada. Tese de
doutorado - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo. São
Paulo, 2011, 72 p.
GÁLVEZ, A.; LOPEZ, R. L.; ABRIOUEL, H.; VALDIVIA, E.; OMAR, N. B.;
Application of Bacteriocins in the Control of Foodborne Pathogenic and Spoilage
Bacteria. Critical Reviews in Biotechnology, v. 28, p. 125–152, 2008.
MORAES, P. M.; PERIN, L. M.; ORTOLANI, M. B. T.; YAMAZI, A. K.; VIÇOSA,
G. N.; NERO, L. A. Protocols for the isolation and detection of lactic acid bacteria with
bacteriocinogenic potential. Food Science and Technology, v.43, p.1320-1324 , 2010.
NASCIMENTO, M. S.; MORENO, I.; KUAYE, A. Y. Bacteriocinas em alimentos:
uma revisão. Brazilian Journal of Food Technology, v.11, n.2, p.120-127, 2008.
ROSA, C. M.; FRANCO, B. D. G. M.; MONTVILLE, T. J., CHIKINDAS, M. L
Purification and mechanistic action of a bacteriocin produced by a Brazilian sausage
isolated, Lactobacillus sake 2a. Journal Food Safety, v.22, p.39-54, 2002.
VAN REENEN, C. A.; DICKS, L. M. T.; CHIKINDAS, M. L. Isolation, purification
and partial characterization of plantaricin 423, a bacteriocin produced by Lactobacillus
plantarum. Journal of Applied Microbiology, v. 84, p. 1131-1137, 1998.