correlação dos tipos celulares e sexo com a

Correlação dos tipos celulares e sexo com a atividade funcional de fagócitos
DIVULGAÇÃO
TÉCNICA
sanguíneos em emas cativas
Rhea americana
Linnaeus (Rheiformes, Rheidae).
CORRELAÇÃO DOS TIPOS CELULARES E SEXO COM A ATIVIDADE FUNCIONAL DE FAGÓCITOS
SANGUÍNEOS EM EMAS CATIVAS RHEA AMERICANA LINNAEUS (RHEIFORMES, RHEIDAE)
L.C.T. Rodrigues1, L.G. Vieira 2, C.A. Busnardo2, L.T.O. Fernandes3,
G.S. Leal1, E.L. França1, A.C.H. França3, P.L. da Silva 2
Centro Universitário do Planalto de Araxá, Instituto de Ciências da Saúde. Av. Amazonas, 777, CEP 38180000, Araxá, MG, Brasil. E-mail: [email protected]
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RESUMO
As doenças infecciosas principalmente as bacterianas têm ocasionado impacto na
população de emas Rhea americana (Linnaeus, 1758) em cativeiro. Os fagócitos sanguíneos
apresentam importante papel em várias infecções bacterianas, sendo a fagocitose um dos
principais mecanismos de defesa do organismo para as bactérias. O presente trabalho teve
por objetivo analisar a atividade funcional de fagócitos do sangue de ema para Escherichia
coli e correlacionar os tipos celulares e o sexo. Coletaram-se 20 amostras de sangüíneas,
sendo 10 fêmeas e 10 machos. As células foram separadas em mononucleares (MN) e
polimorfonucleares (PMN) pelo método de gradiente de densidade por ficoll-Paque, seguida por sedimentação por Dextran. A fagocitose e atividade microbicida para E. coli
foram avaliadas pelo método de alaranjado de acridina. Observou-se que os fagócitos MN
e PMN do sangue de ema apresentaram atividade fagocítária. O índice microbicida também foi similar entre os tipos celulares. Não houve diferença da atividade fagocitária e
microbicida entre os sexos. As células mononucleares e polimorfonucleares presentes no
sangue de ema, independentemente do sexo e tipos celulares do animal apresentam atividade fagocítica e microbicida para E. coli.
PALAVRAS-CHAVE: Fagocitose, microbicida, aves, Escherichia coli.
ABSTRACT
CORRELATION OF THE CELLULAR TYPES AND SEX WITH THE FUNCTIONAL
ACTIVITY OF BLOODING PHAGOCYTES OF CAPTIVE RHEAS RHEA AMERICANA
LINNAEUS (RHEIFORMES, RHEIDAE). The infectious disseases mainly the bacterial
ones have caused impact in the population of captive rheas Rhea americana (Linnaeus,
1758) in captivity. The blood fagocytes present important function in some bacterial
infections, being fagocytes one of the main mechanisms of defense of the organism for the
bacteria. This work has the aim to analyze the functional activity of phagocytes of rhea’s
blood to Escherichia coli and correlate the cellular types and sex. There were collected 20
samples of peripheral blood, 11 female and 9 male. The blood cells, according to the nucleus’
morphologic, were separated in mononuclear (MN) and polymorphonuclear (PMN) by
the gradient method of density by filcoll-Paque, followed by sedimentation by Dextran.
The phagocytes and the microbicidal activity were valued by the Acridine Orange method.
Noticed that phagocytes MN and PMN of the Rhea’s blood have a phagocyte activity to E.
Coli. There was also similar between the phagocytes types (MN and PMN). There was no
difference in the phagocytes and microbicidal activity between the sexes. The mononuclears
and polymorphonuclears blood cells, of both sex and type of this animal present phagocytes
and microbicidal activity for E. coli.
KEY WORDS: Phagocytes, mycrobicidal, birds, Escherichia coli.
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Universidade Federal de Uberlândia, Faculdade de Medicina Veterinária, Uberlândia, MG, Brasil.
Companhia Brasileira de Metalurgia e Mineração, Centro de Desenvolvimento Ambiental, Araxá, MG, Brasil.
Biológico, São Paulo, v.69, n.1, p.1-4, jan./jun., 2007
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L.C.T. Rodrigues et al.
A exploração comercial da ema (Rhea americana) tem
sido considerada como uma forma alternativa de pecuária eficiente, ambientalmente correta e sustentável. Com
a criação de aves domésticas de origem exótica, várias
doenças têm surgido, principalmente as bacterianas,
capazes de ocasionar impactos na população destes
animais em cativeiros (FOWLER & CUBAS, 2001).
A colibacilose é uma doença infecciosa que afeta
uma variedade de aves domésticas no qual a
Escherechia coli é o patógeno primário ou secundário
que pode ser diferenciado da micobacteriose por
microscopia ou cultura bacteriana (PORTER, 1998).
Vários estudos vêm demonstrando que os fagócitos
do sangue apresentam importante papel em várias
infecções bacterianas. A fagocitose é um dos principais mecanismos de defesa do organismo para as
bactérias (BABIOR, 1978; MUNDI et al., 1991; HONORIOFRANÇA et al., 1997). A investigação da atividade de
fagócitos in vitro pode ser realizada por meio de abordagem indireta medindo produtos do metabolismo
celular, bem como de forma direta verificando-se o
decréscimo da viabilidade de microorganismos em
ensaios fagocitários (HONORIO-FRANÇA et al., 1997).
Assim, visando maior compreensão dos processos de defesa para infecções relacionadas à
morfofisiologia celular, o presente trabalho teve por
objetivo analisar a atividade funcional de fagócitos
do sangue de ema para E. coli e correlacionar os tipos
celulares e o sexo.
Foram avaliadas amostras de sangue periférico de
20 emas (R. americana) adultas, sendo 10 machos e 10
fêmeas, procedentes do Centro de Desenvolvimento
Ambiental (CDA) da Companhia Brasileira de Metalurgia e Mineração (CBMM) no Laboratório de Pesquisas do Centro Universitário do Planalto de Araxá
(UNIARAXÁ), Município de Araxá, MG. Todos os
espécimes foram identificados individualmente com
colares plásticos numerados e microchips.
As amostras foram colhidas por meio de punção
da veia femoral e colocadas em tubos contendo
heparina, na proporção de 30 unidades de
anticoagulante por mL de sangue. Para realização dos
ensaios de fagocitose e atividade microbicida, as células foram separadas de acordo com a morfologia do
núcleo. O sangue foi centrifugado durante 40 minutos a 160 x g em gradiente de densidade com FicollPaque1 densidade 1.077g/L, o anel enriquecido de
fagócitos mononucleares foi retirado e reservado e o
restante do sangue foi submetido à sedimentação por
Dextran2 durante 30 minutos em estufa a 37º C para
separação das populações de polimorfonucleares
(mononucleares e polimorfonucleares). Após separação, as células foram lavadas duas vezes em meio de
cultura 1993. Realizou-se a contagem em câmara de
Neubauer com concentrações celulares ajustadas para
2 x 10 6 células por mL.
O inóculo foi preparado com cepa de E. coli provenientes de culturas isoladas de galinhas poedeiras
(Gallus gallus). A cepa bacteriana foi mantida em ágar
semi-sólido e estocada em temperatura ambiente com
ausência de luz. A partir desta cultura, 18 horas antes do ensaio foram feitos repiques em tubos contendo 8 mL de Trypic Soy Broth (TSB) e incubados em
estufa a 37º C. Após o crescimento, as bactérias foram
lavadas duas vezes em solução salina tamponada em
fosfato (PBS) e padronizou-se a correlação entre unidades formadoras de colônias bacterianas (UFC) e
densidade óptica (DO) em 1 x 10 7 UFC.mL - 1 ,
mensurada com espectrofotômetro4 a 540nm e DO =
0.1. Esta concentração de bactérias foi previamente
determinada em meio sólido Trypic Soy Agar (TSA)
pela contagem de UFC (ROSSI et al., 2004).
Volumes iguais de suspensão de E. coli (2 x 107
UFC.mL -1) e de suspensão de células (2 x 106 células.mL 1 – fagócitos mononucleares e heterófilos) foram misturados em tubos plásticos, não inferior a 0,5 mL. Foram submetidas à incubação prévia por 30 minutos
sob agitação a 37º C e centrifugadas por 10 minutos a
160 x g sob refrigeração a 4º C. O sobrenadante foi
descartado e o “botão” celular corado com 200 mL de
alaranjado de acridina (14,4 mg/mL), por 1 minuto.
A seguir, foi acrescentado seis mL de meio de cultura
199 refrigerado e centrifugado a 160 x g durante 7
minutos a 4º C. As células e as bactérias foram lavadas por duas vezes (160 x g por 7 minutos a 4º C), e
observadas em microscópio de fluorescência. Foram
avaliados 100 fagócitos verificando-se o número de
células que continham em seu interior no mínimo 3
bactérias, e o número de bactérias vivas ou mortas no
citoplasma dos fagócitos. Os índices de fagocitose e
microbicida foram obtidos a partir das seguintes relações:
- Índice de fagocitose = % número de células que contém bactérias
- Índice microbicida = {1- (n o de bactérias mortas/n o de
bactérias fagocitadas)}x100
A análise estatística da fagocitose e atividade
microbicida foi realizada através do teste MannWhitney (AYRES et al., 2004) para duas amostras independentes com significância menor que 0,05 (p < 0,05).
Nos últimos anos tem crescido muito o interesse pela
criação de ratitas, como emas e avestruzes. Na realidade, pode ser o surgimento de uma nova indústria. As
granjas de criação comercial destas aves estão despertando o interesse de novos criadores e se tornando uma
grande alternativa zootécnica (BLAKE, 1996). Várias são
as doenças que podem causar impacto na população,
no entanto, pouco se conhece sobre os mecanismos de
defesa destes animais. A ema apresenta quantidade significativa de células sanguíneas, porém, as características funcionais destas ainda não são totalmente compreendidas (FOWLER & CUBAS , 2001).
Biológico, São Paulo, v.69, n.1, p.1-4, jan./jun., 2007
Correlação dos tipos celulares e sexo com a atividade funcional de fagócitos
sanguíneos em emas cativas Rhea americana Linnaeus (Rheiformes, Rheidae).
Nas aves os monócitos, macrófagos, heterófilos e
linfócitos constituem os componentes celulares das
respostas imunológicas. Os monócitos possuem capacidade de fagocitar partículas estranhas, mas pouca habilidade regulatória (POWELL , 1987; MORGULIS,
2002) Os macrófagos são considerados a primeira linha de defesa contra os agentes infecciosos sendo
fundamentais na regulação da resposta imunológica
tanto natural quanto específica (QURESHI, 1998). Juntamente com os heterófilos, os monócitos e macrófagos
participam da fase aguda da inflamação. Os linfócitos
são os responsáveis pela imunidade, produzindo
anticorpos que ajudam os fagócitos (monócitos,
macrófagos e heterófilos) a reconhecerem os antígenos
(MORGULIS, 2002). Neste experimento, observou-se que
tanto os fagócitos mononucleares (MN) como os
polimorfonucleares (PMN) do sangue de ema de ambos os sexos são capazes de fagocitar a E. coli. O índice de fagocitose para as células mononucleares foi de
72,2%, e para os fagócitos PMN foi de 70,6% (Fig. 1).
CARDOSO et al. (2003) em estudo hematológico de
aves inoculadas com Salmonella gallinarum, verficaram
que os monócitos, eosinófilos e basófilos não apresentaram alterações em seus números relativos durante o experimento, não havendo diferença estatisticamente significativa entre os grupos. Neste experimento também não houve diferenças estatísticas entre
os tipos celulares e entre os sexos (p > 0,05) para atividade fagocitária e microbicida para E. coli (Fig. 2).
A fagocitose de bactérias induz a ativação do aumento respiratório e aumento de reativos do oxigênio
em fagócitos (GORTER et al., 1987; FERRANTE et al., 1989;
HONORIO-FRANÇA,1998). A participação de radicais livres gerados pelo metabolismo oxidativo do oxigênio é
um fenômeno extremamente importante durante as
respostas imunológicas, reações inflamatórias e
peroxidação de lipídeos (AMES et al., 1993). Neste trabalho, avaliando a atividade microbicida dos fagócitos
do sangue de ema, observamos que as célulasMN apresentam índices bactericidas de 68% e as células PMN de
65% (Fig. 2). Não houve diferenças estatísticas entre os
tipos celulares e entre os sexos (p > 0,05). A atividade
bactericida dos fagócitos sanguíneos de R. americana
pode estar relacionada à liberação do ânion superóxido,
uma vez que a exposição de E. coli a esses metabólitos
ativos pode determinar a morte da bactéria, devido à
alteração em nível de DNA (ASAD et al., 1994). Esta atividade microbicida pode representar um mecanismo
importante de proteção natural de emas às infecções.
Deve ser considerado o número de microrganismos,
com os quais a ema entra em contato no processo de
manejo em cativeiro. É possível que esta atividade funcional dos fagócitos presentes no sangue de ema, se
estenda a outros patógenos, além da E. coli e que possa
ser um mecanismo importante de defesa do animal,
principalmente aqueles que vivem em criadouros.
Fig. 1 - Índice de fagocitose (%) das células mononucleares
(MN) e polimorfonucleares (PMN) do sangue de ema (Rhea
americana), n = 20. (p > 0,05).
Fig. 2 - Índice microbicida (%) das células mononucleares
(MN) e polimorfonucleares (PMN) do sangue de ema (Rhea
americana), n = 20. (p > 0,05).
As células mononucleares e polimorfonucleares
presentes no sangue de ema (R. americana), independentemente do sexo e tipos celulares do animal apresentam atividade fagocítica e microbicida para E. coli.
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Recebido em 8/4/07
Aceito em 31/5/07
Biológico, São Paulo, v.69, n.1, p.1-4, jan./jun., 2007