estudo do papel de grânulos de rna e de
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ESTUDO DO PAPEL DE GRÂNULOS DE RNA E DE EXOSSOMOS NA INTERAÇÃO PATÓGENO-HOSPEDEIRO PROJETO APRESENTADO À FUNDAÇÃO ARAUCÁRIA – EDITAL PRONEX ROTEIRO DESCRITIVO 1 – Sobre o Núcleo de Excelência a- Descrição do Núcleo e sua origem: O Núcleo é formado por pesquisadores do Instituto Carlos Chagas (FiocruzParaná), pesquisadores da Universidade Estadual de Londrina (UEL) e pesquisadores da Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR). Na verdade parte deste Núcleo já esteve organizado em outro projeto do Pronex promovido pela Fundação Araucária e parte do Núcleo colabora intensamente desde 2005 e integra o Núcleo de Células Tronco e Terapia Celular sediado no Paraná. Participam ainda do Núcleo, na qualidade de colaboradores, um pesquisador da Embrapa e dois pesquisadores do Uruguai (vinculados ao Instituto Pasteur de Montevidéu e ao Instituto Clemente Estabile), todos vinculados a atividades de análise bioinformática. É importante mencionar que os projetos acima referenciados propiciaram um forte vínculo entre alguns dos pesquisadores do ICC e os pesquisadores da UEL e da PUCPR, que perduram desde então que podem, através deste projeto, aumentar de intensidade. O foco do Núcleo proposto ao PRONEX é o estudo da interação patógenohospedeiro usando modelos experimentais bem estabelecidos em nossas instituições, os patógenos Trypanosoma cruzi e vírus da dengue e os modelos biológicos de células tronco e células dendriticas. O estudo da interação patógeno-hospedeiro será feito através da análise de exossomos e de grânulos de RNA, seu papel na imuno-modulação e seu papel na regulação da expressão gênica tanto dos patógenos como das células hospedeiras. Esta é uma abordagem original e moderna , e conhecimentos fundamentais serão adquiridos através deste projeto, propiciando uma excelente oportunidade e ambiência para a formação de recursos humanos qualificados. a- Adequação da equipe: A equipe é adequada pela qualidade de sua formação profissional (como facilmente comprovado pelos curricula em anexo) e a multi-disciplinaridade requerida dentro da área de Ciências Biológicas. Tanto é assim que a equipe domina a grande plêiade de técnicas que serão utilizadas, como comprovado pela própria produtividade científica dos diferentes componentes do Núcleo. Os membros do Núcleo são pesquisadores ativos e produtivos e todos com bastante experiência no desenvolvimento de projetos de pesquisa (como constatado abaixo pela descrição dos projetos da equipe nos últimos três anos). A equipe é formada por: Nome Função Instituição http://lattes.cnpq.br/ Samuel Goldenberg Coordenador ICC e IBMP 6917479410354653 Alejandro Correa Pesquisador ICC 0502314179930901 Alexandra Senegaglia Pesquisador PUC-PR 5130849139417489 Bruno Dallagiovanna Pesquisador ICC 5038843270685960 Carmen Rebelatto Pesquisador PUC-PR 9258812501826236 Claudia N. Duarte dos Santos Pesquisador ICC 4598537010242642 Fabiola Barbieri Holetz Pesquisador ICC 6996846049865794 Juliano Bordignon Pesquisador ICC 4831386727923397 Lysangela Ronalte Alves Pesquisador ICC 2213128430343323 Marco Augusto Stimamiglio Pesquisador ICC 2641327012811390 Maurilio José Soares Pesquisador ICC 1880268584104636 Nilson Zanchin Pesquisador ICC 4325584779249968 Phileno Pinge Filho Pesquisador UEL 1339724757657824 Sueli F. Yamada-Ogatta Pesquisador UEL 1783272660304122 Francisco Pereira Lobo Colaborador Embrapa 9614758933055047 Hugo Naya Colaborador Estrangeiro José Sotelo-Silveira Colaborador Alessandra Melo de Aguiar Tecnologista Inst. Pasteur Montevideu Inst. Clemente Estable, Uruguai ICC Guilherme Silveira Doutorando ICC 0631237520300349 Pryscilla Fanini Wowk Pós-Doutoranda ICC 3170471417515903 Sharon de Toledo Martins Doutoranda ICC 4000443506010803 Cryscielli Kuligoski Técnica ICC/IBMP 4570976955280649 Giovanny A.C. A. Mazzarotto Tecnologista ICC 4491426793431771 Estrangeiro 8168088417330193 b- Descrição da infra-estrutura disponível A maior parte das atividades experimentais serão realizadas no Instituto Carlos Chagas. O ICC ocupa uma área de 2500 m2 no campus do Tecpar da Cidade Industrial de Curitiba com perspectiva de expansão da área para quase 4 mil metros quadrados até o final de 2012 com a reforma de áreas internas e a construção de um grande laboratório de experimentação animal (500m2), um almoxarifado central e reforma de áreas internas de expansão. O ICC é dotado de moderna e excelente infra-estrutura envolvendo cinco laboratórios para cultivo de bactérias, fungos e leveduras, parasitas, vírus e células tronco (incluindo um área para transformação com lentivírus), um laboratório de nível de segurança biológica 3 (NB3), duas salas de equipamentos comuns (com centrífugas refrigeradas, ultra-centrífugas, ultra-freezers, máquinas de PCR convencional e em tempo real), equipamentos de fotodocumentação, cromatógrafos, microscópios de fluorescência e invertidos com câmeras de alta resolução, micromanipulador de células e um microscópio confocal. Recentemente foi aprovado pelo programa CT-Infra apresentado pela Fiocruz a aquisição de um microscópio eletrônico. O ICC possui ainda três plataformas tecnológicas, uma para citometria de fluxo (consistindo de um citômetro FACS Aria II e um citômetro FACS Canto II), uma para seqüenciamento de ácidos nucléicos (consistindo de um seqüenciador SoLID IV) e uma plataforma de espectrometria de massas (Orbitrap LQ). O ICC conta ainda com excelente infra-estrutura para processamento e armazenamento de dados e investimentos deverão ser feitos pela Fiocruz ao longo de 2012 para aperfeiçoamento de tecnologias da informação em geral. Somando-se à infraestrutura em equipamentos, o ICC conta com infra-estrutura em termos de técnicos e tecnologistas para dar o importante suporte para as atividades de pesquisa (preparo de materiais, confecção de meios, operação de equipamentos das plataformas, preparação de células e de antisoros policlonais e monoclonais). O Laboratório de Biologia Molecular de Microrganismos, lotado no Departamento de Microbiologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Londrina, possui 45m2 e conta com os seguintes equipamentos: Microscópio de luz, Fluxo laminar, Incubadora com agitação, Microcentrífuga, Centrifuga refrigerada, Estufa bacteriológica, Balança analítica, Termociclador, Fontes de eletroforese, Sistema de fotodocumentação de géis de agarose e poliacrilamida, Sistema de transferência de géis de poliacrilamida, Máquina de gelo, pH metro, Autoclave, Universal Microplate Reader ELx 800, Estufa incubadora de CO2, Computadores, Geladeiras e Freezers (-20 e -80 oC). Ainda estão disponíveis no CCB, Ultracentrífuga, Sistema de água ultrapura, Sistema de eletroforese em campo de pulsos alternados, Microscópio eletrônico de transmissão e Biotério de criação e manipulação que serão úteis no desenvolvimento do projeto. O Laboratório de Imunopatologia Experimental do CCB da UEL (LIE-CCB-UEL) é coordenado pelo Dr. Phileno Pinge Filho. O LIE-CCB-UEL possui 45 m2 de área construída disponibilizará os seguintes equipamentos: Estufa de cultivo celular,cabine de Fluxo laminar, Microscópio invertido, 2 refrigeradores, 2 congeladores, Balança analítica, estufa de secagem de material, forno para esterilização de vidraria, 2 computadores de mesa, 2 Microscópios binoculares, Luminômetro para placas, Centrífuga de tubos com capacidade para 1,5 e 15 ml, não refrigerada, centrífuga para capilares indicadores de hematócrito e destilador de água de bancada. O Núcleo de Cardiomioplastia Celular é formado pelo Laboratório Experimental de Cultivo Celular, onde são desenvolvidos os projetos de pesquisa básica e pré-clínica, pelo Laboratório de Cirurgia Experimental e pelo Laboratório do Núcleo de Cardiomioplastia Celular, onde estão sendo desenvolvidos os projetos clínicos. O Laboratório do Núcleo de Cardiomioplastia Celular está localizado no segundo andar do Laboratório de Engenharia e Transplante Celular no Parque Tecnológico do campus da Pontifícia Universidade Católica do Paraná. Este espaço conta com um sistema de ar condicionado filtrado, câmara-fria e núcleo de limpeza e esterilização, obedecendo a todas as normas preconizadas na RDC 210 de Boas Práticas para a Fabricação de Produtos Biológicos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária e as normas internacionais para o cultivo e expansão de células destinadas ao transplante em seres humanos. O laboratório possui uma área de 67,61m² que está dividida da seguinte maneira: 01 sala de recepção do material; 01 sala de preparo de materiais (classe 100.000); 02 salas de cultivo celular (classe 10.000); 01 almoxarifado e 01 sala administrativa. O laboratório conta com os seguintes equipamentos: 02 fluxos laminares, 02 incubadoras de CO 2, 03 microscópios, 02 centrífugas refrigeradas, 02 refrigeradores, 02 freezeres, rede de CO2, 01 container para armazenamento de amostras congeladas, 02 balanças, 01 banho-maria, 01 estufa bacteriológica, 01 pHmetro, 01 citômetro de fluxo e 01 microscópio de imunofluorescência. O Centro de Tecnologia Celular tem uma área de 148,22m² com uma estrutura de 04 salas de cultivo celular (classe 10.000), sendo que cada sala contem 02 estufas de CO 2, 01 fluxo laminar e 01 microscópio; 02 salas de preparo de materiais (classe 100.000), 01 sala de congelamento de amostras, 01 entrada para paramentação, 01 saída para desparamentação, 01 almoxarifado, 01 sala administrativa e 01 sala de apoio e 01 central de esterilização. A Unidade de Bioinformática do Instituto Pasteur de Montevideo (IPM) administra conjuntamente com o Grupo de Simulações Biomoleculares do IPM um cluster BULL de 80 nodos para cálculo. Conta com 15 computadores de escritório, espaço físico adequado, acesso à rede CLARA, capacidade de armazenamento e suporte de informação centralizado. O software utilizado é de acesso livre, contando com licenças de suítes de edição gráfica. Para o presente projeto se disponibilizarão 15.000 horas nodo/mês em média. O Laboratório de Neurobiologia Celular y Molecular do Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable possui uma área de 30 m². Sistema de hibridação para Microarranjos Agilent. Equipamentos de PCR em Tempo Real. Facilidades para microscopia e análises de estrutura celular como: Microscópio Confocal FV300 Olympus, Microscópio Eletrônico Jeol e Fuji Bas-FLA5000 High Resolution Imager. Para a análise do transcriptoma e resultados de seqüenciamento em larga escala se dispõe de processadores Tetra Quad com 32 GB de memória e 10 TB de Hard Drive. c- Listagem dos projetos de pesquisa desenvolvidos pela equipe nos últimos 3 anos (agência, vigência, recursos e resultados obtidos) - Vírus da dengue: caracterização genética, identificação de assinaturas moleculares de virulência e resposta do hospedeiro humano à infecção, CNPq, Proc. 558369/2008-1, Edital PNPD, R$36.000,00, resp. Samuel Goldenberg. Esse projeto teve como objetivo buscar uma maior compreensão da patogênese da dengue através do estudo da interação entre o vírus e seu hospedeiro mamífero. Para tanto foram utilizadas diferentes abordagens como a caracterização genética de diferentes isolados virais através de sequenciamento nucleotídico, estudo da resposta do hospedeiro à infecção em modelos in vivo (modelos murinos) e ex vivo (culturas primárias de células humanas) e desenvolvimento de ferramentas de genética reversa (clones infeccioso e replicons) para avaliar o papel de mutações pontuais ou em conjunto na virulência de determinadas cepas virais. Essa abordagem permitiu que identificássemos a circulação de diferentes genótipos de DENV-3 no Brasil, com importantes diferenças em termos de patogênese, que podem estar relacionadas a uma inibição da via de sinalização do IFN-tipo I pelo genótipo III, que se mostrou mais virulento. - Análise epigenética de células tronco mesenquimais da medula óssea na indução adipogênica, CNPq, Proc. 573520/2008-9, Edital Terapia Celular, R$174.000,00, resp. Samuel Goldenberg. Investigamos o perfil epigenético que caracteriza a diferenciação adipogênica de célulastronco adultas. Investigamos o efeito da acetilação de histonas no processo de diferenciação adipogênica de CTMs utilizando o inibidor de histona desacetilases tricostatina A (TSA). As análises mostraram que o tratamento com TSA interfere na expressão gênica, na diferenciação adipogênica e no crescimento celular. O tratamento parece ter efeito intrínseco à amostra biológica (doador), mas de modo geral levou à diminuição da diferenciação adipogênica. A análise da arquitetura nuclear pela presença de determinadas modificações em histonas através de imunomarcações em CTMs-MO induzidas à adipogênese mostrou que há diminuição de H3K4 metilada em células diferenciadas em comparação às células que estão iniciando o processo de diferenciação - INCT para Diagnóstico em Saúde Pública, CNPq, Proc. 573791/2008-2, Edital INCT, R$ 4.792.361,91, Resp. Samuel Goldenberg. O projeto está em andamento e busca desenvolver novos reagentes e novas plataformas para o diagnóstico das doenças de diagnóstico compulsório nas transfusões. As instituições envolvidas são, FIOCRUZ, IBMP, UFPR, UTFPR, UFSC, UFRGS, Tecpar. - Análise ribonômica e caracterização de complexos mRNP em Trypanosoma cruzi, CNPq, Proc. 403484/2008-1, Edital Encomendas Papes/FIOCRUZ Papes V, R$ 60.000,00, Resp. Samuel Goldenberg. Os resultados obtidos levaram ao isolamento dos complexos mRNA-proteínas (mRNPs) associados aos P-bodies bem como complexos mRNPs não associados a estas estruturas. Caracterizamos proteínas de mRNPs e mRNAs associados aos P-bodies a o outros complexos mRNP utilizando micro-arranjo de DNA e sequenciamento de última geração. Entre as proteínas de mRNP evidenciadas, caracterizamos uma proteína de ligação a RNA com motivo de dedo de zinco CCCH e os resultados indicam que dependendo do estado fisiológico da célula diferentes mRNAs encontram-se associados a esta proteína. O conjunto dos resultados mostra que a mobilização de mRNAs para os grânulos de RNA na forma de mRNPs é extremamente dinâmico, respondendo rapidamente às alterações de meio a que o parasita é submetido, portanto indicando que mRNPs não são partículas estáticas para mera estocagem e degradação de mRNAs mas que devem participar do fluxo e funcionalidade dos mRNAs na célula. - Caracterização funcional de complexos mRNP em Trypanosoma cruzi e seu papel na modulação da expressão gênica do parasita, Proc. 478516/2010-0, Edital MCT/CNPq 14/2010 - Universal - Faixa C, R$140.000,00, Resp. Samuel Goldenberg. Projeto em andamento e visa caracterizar, utilizando análise proteômica e sequenciamento de ácidos nucleicos em larga escala, proteínas e RNAs associados em complexos mRNP . - Caracterização funcional de complexos mRNP em Trypanosoma cruzi e seu papel na modulação da expressão gênica, Proc. 301730/2011-3, Edital Produtividade em Pesquisa - PQ – 2011, Nível 1A R$ 168.000,00, Resp. Samuel Goldenberg. Solicitação de bolsa de produtividade récem aprovada e com inicio em março de 2012. Visa estudar os componentes proteico e de ácidos nucleicos de mRNPs de T.cruzi. - Estabelecimento de uma metodologia de indução da diferenciação de células tronco adultas à cardiomiócitos através do método de cultivo com meio condicionado por explantes cardíacos humanos para utilização em terapia celular cardíaca, CNPq, EDITAL - MCT/CNPq 14/2009 - Universal / Edital MCT/CNPq 14/2009 – Universal, R$ 27.000,00, Resp. Alejandro Correa Resultados: Foram identificados vários componentes solúveis presentes no meio condicionado de explantes cardíacos de coração humano, utilizando arranjos de anticorpos e 2DGel/espectrometria de massas. As células tronco adultas quando colocadas a crescer na presença do meio condicionado aumentaram a taxa de proliferação e expressaram marcadores típicos de cardiomiócitos. - Isolamento, caracterização, ativação e diferenciação em linhagens mesenquimais de pericitos cardíacos humanos, CNPq, Edital Encomendas Papes/FIOCRUZ - Papes V, R$ 40.000,00, Resp. Alejandro Correa Resultados: Foi isolada uma população de células do músculo cardíaco humano positivas para Fosfatase Alcalina, possivelmente pericitos. Estas células mostraram características imunofenotípicas de células tronco mesenquimais e foram capazes de diferenciar nas três linhagens mesodérmicas (adipócitos, osteoblastos e condrócitos). A diferenciação desta população positiva para a Fosfatase Alcalina é mais eficiente que das células-tronco mesenquimais da medula ou tecido adiposo, pelo menos do ponto de vista molecular. - Estabelecimento de uma metodologia de indução da diferenciação de células tronco adultas à cardiomiócitos através do método de cultivo com meio condicionado e com matriz tecidual para utilização em terapia celular cardíaca, Fundação Araucária, Projeto de Pesquisa para o SUS: Gestão Compartilhada em Saúde PPSUS – 2008/2009. Chamada de Projetos 08/2009, R$ 49.786,54, Resp. Alejandro Correa. Resultados: Foi padronizado um protocolo para isolamento de matriz extracelular de coração humano. Neste projeto estão sendo cultivadas células tronco adultas em meio condicionado de explantes cardíacos de coração humano em combinação com a matriz extracelular. Os resultados estão sendo analisados. - Efeito das proteínas 1 e 2 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (IGFBP-1 e 2) sobre a atividade de células-tronco mesenquimais, CNPq, EDITAL MCT/CNPq N º 14/2010 – Universal, R$ 15.000,00, Resp. Marco A. Stimamiglio. Trata-se de projeto em desenvolvimento que tem como objetivos analisar funcionalmente o papel das proteínas IGFBP-1 e 2 nos processos de proliferação, citoproteção e diferenciação de células-tronco mesenquimais. Resultados preliminares indicam a possível modulação da proliferação das células-tronco através da adição de concentrações crescentes das proteínas IGFBP avaliadas. Por outro lado, não foram observadas até o momento diferenças na indução da morte celular nos cultivos de células-tronco sob o estímulo destas proteínas. - Efeito das proteínas IGFBP-1 e 2 sobre a atividade de células-tronco mesenquimais, Fundação Araucária, Chamada de Projetos n º 14/2009 – Programa de Apoio à Pesquisa Básica e Aplicada, R$ 20.000,00, Resp. Marco A. Stimamiglio. Trata-se de projeto em desenvolvimento, iniciado em julho de 2010, que tem como objetivos analisar funcionalmente o papel do microambiente tecidual cardíaco e das proteínas IGFBP-1 e 2, presentes neste microambiente, na indução da diferenciação cardiomiogênica de célulastronco mesenquimais humanas. Resultados preliminares indicam a necessidade da associação de outras proteínas encontradas no meio condicionado pelo cultivo de explantes cardíacos para a indução da pré-diferenciação destas células-tronco - Imunobiologia farmacêutica na fase aguda da doença de chagas experimental: papel dos eicosanóides, Fundação Araucária (Vigência 20072009, R$ R$ 27.561,00), Resp. Phileno Pinge Filho. Neste projeto demonstramos que a ciclooxigenase e a 5-lipoxigenase estão envolvidas no controle da carga parasitária e contribuem para o desenvolvimento do estresse oxidativo de eritrócitos que ocorre na fase aguda da infecção por Trypanosoma cruzi. - Impacto da biodisponibilidade de óxido nítrico por AINES-NO sobre os níveis de citocinas pró-inflamatórias na cardiopatia chagásica experimental. CNPq (2009-2010, R$ 20.000,00). Resp. Phileno Pinge Filho. Neste projeto demonstramos que a 5-lipoxigenase participa da produção de citocinas, óxido nítico e expressão da óxido nítrico sintase (iNOS) no tecido cardíaco na fase aguda da infecção por T. cruzi. - Mecanismos de infecção por formas tripomastigotas metacíclicas do Trypanosoma cruzi: participação da enzima óxido nítrico sintase constitutiva (cNOS) e dos eicosanóides, Auxílio Financeiro da Fundação Araucária (2009, R$ 37.775,00) Resp. Dr. Phileno Pinge Filho. - Mecanismos de ativação e invasão de fagócitos mononucleares pelo protozoário Trypanosoma cruzi: relações entre eicosanóides, óxido nítrico e cAMP, Auxílio Financeiro do CNPq, Edital Universal (2012, R$ 17.800,00), Resp. Phileno Pinge Filho. - Interação de células dendríticas humanas e vírus da dengue: papel do interferon tipo I e da maturação celular. Edital MCT/CNPq 14/2009 - Universal / Edital MCT/CNPq 14/2009 - Universal - Faixa A – R$ 14.000,00, Resp. Juliano Bordignon. Neste projeto foi demonstrado que cepas de DENV3 genótipo III são capazes de inibir a ativação da via de IFN tipo I o que possibilita sua maior replicação em células dendríticas (mdDCs), bem como, maior produção de citocinas inflamatórias. Adicionalmente, demonstrouse que a ativação de mdDCs após a infecção protege as células da apoptose. - Produção, caracterização e aplicabilidade de anticorpos monoclonais contra cepas de vírus dengue-1, -2 e -3 circulantes no Brasil. Chamada de Projetos 08/2010 Programa de Pesquisa para o SUS: Gestão Compartilhada em Saúde PPSUS – 2008/2009 – R$ 49.500,00, Reps. Juliano Bordignon. Foram desenvolvidos hibridomas secretores de anticorpos monoclonais contra cepas de DENV-1, -2 e -3 circulantes no Brasil. No momento estes anticorpos estão sendo caracterizados e avaliados quanto sua utilidade para o desenvolvimento de testes imunoenzimático para diagnósitco da dengue. - Identificação da atividade anti-dengue e anti-inflamatória de oleos essências. Chamada de Projetos 14/2009 Programa de Apoio a Pesquisa Básica e Aplicada. RS 15.900,00, Resp. Juliano Bordignon. Neste projeto foi desenvolvido um teste ELISA in situ para triagem da atividade anti-dengue de substâncias isoladas de óleos essencias. A concentração segura dos compostos citral e timol foram determinadas por ensaios de MTT/vermelho neutro, e no momento, esta sendo avaliada a atividade anti-dengue dos mesmos pelo teste de ELISA in situ. - Identificação e Produção de Marcadores Celulares de Endocitose e Exocitose em Trypanosoma cruzi (Euglenozoa: Kinetoplastea). CNPq, Edital Universal CNPq MCT / CNPq 14/2010 (Processo 471928/2010-0 ), Recursos: R$25.000,00 (Edital Universal, faixa B), Vigência: 01/10/2010 a 01/10/2012 Resp.: Maurilio José Soares Resultados obtidos, Artigo publicado no tema: Barboza NR, Cardoso J, Lima CVP, Soares MJ, Gradia DF, Hangai NS, Bahia MT, Lana M, Krieger MA, Sá RG. Expression profile and subcellular localization of HslV, the proteasome related protease from Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology, 130: 171-177, 2012. - Programa Institucional de Iniciação Científica (PIBIC), Fundação Araucária Convênio Protocolo 18602 Vigência: 01/09/2011 , Valor: R$ 36.000 Resp. Bruno Dallagiovanna Resultados: Dez bolsas de iniciação científica, em andamento. - Caracterização de redes pós-transcricionais de regulação gênica em Trypanosoma cruzi, CNPq Edital Universal 473828/2009-0, R$ 20.000 , 03/08/2009- 2011, Resp. Bruno Dallagiovanna Resultados: Foram identificados os membros da família de proteínas RRM em T. cruzi. Caracterizamos funcionalmente a proteína TcRBP40 específica de T. cruzi identificando a rede gênica regulada por ela. - Mecanismos da regulação pós-transcricionais da auto-renovação em célulastronco mesenquimais humanas. Análise funcional das proteínas Pumilio2 e DZIP1, Edital MCT/CNPq/CT-Saúde/MS/SCTIE/DECIT nº 17/2008 - Terapia Celular, Valor: R$ 100.000, 09/2008 – 2010, Resp. Bruno Dallagiovanna Resultados: Foram identificadas as redes gênicas reguladas por Pumilio2 e DZIP1 e seu papel no controle da proliferação celular e da diferenciação de MSCs . - Identificação e caracterização funcional de RNAs associados aos homólogos de PABP (PABP1-3) em Leishmania, Edital Universal CNPq 14/2009 – Faixa A Processo número 474052/2009-5, Valor aprovado: R$ 20.000,00, Resp. Fabíola Barbieri Holetz Foi possível identificar grupos distintos de mRNAs que se associam às diferentes PABPs. Verificamos diferenças significativas nos mRNAs que se associam a proteína PABP1 daqueles que estão associados as proteínas PABP2 e 3 e não observamos diferenças entre os mRNAs associados as proteínas PABP2 e 3. A proteína PABP1 está associada aos RNAs que codificam, em sua maioria, proteínas ribossomais, enquanto as proteínas PABP2 e 3 associamse preferencialmente a RNAs que codificam proteínas ligadoras de DNA, entre elas as histonas e proteína de ligação a minicírculos, além das proteínas enolase, RBP 5 e Hsp70 Estes dados corroboram a participação da proteína PABP1 no processo de tradução, e a participação das proteínas PABP2 e 3 no transporte de mRNAs do núcleo ao citoplasma. - Identificação e caracterização funcional de mRNAs associados aos fatores eIF4E1-6 de iniciação da traduação em Trypanosoma brucei, FACEPE Processo APQ-0090-2.13/09, R$ 33.000,00, 2009-2011, Resp. Fabíola Barbieri Holetz. Identificamos diferenças significativas nos RNAs que se associam aos fatores de início de tradução em T. brucei, corroborando resultados prévios do grupo, onde se sugere a existência de dois complexos de iniciação da tradução em tripanosomatídeos: um deles formado pelos fatores eIF4E3 e eIF4G4, e o outro formado pelos fatores eIF4E4 e eIF4G3, além das demais proteínas envolvidas no início deste processo. - Expressão e Análise Molecular e Funcional de Proteínas Relacionadas a Doenças Genéticas – Agência financiadora: CNPq (479779/2010-4), vigência 12/2010-11/2012. Valor R$ 35.000,00. Responsável: Nilson Zanchin Resultados obtidos: Caracterização funcional das proteínas humanas NIP7 e FTSJ3 . - Investigação dos Mecanismos de Síntese e Regulação da Função de Ribossomos Associados a Doenças Genéticas e Proliferação Celular - Agência financiadora: CNPq (473551/2008-0), vigência 01/2009-12/2010. Valor R$ 30.160,00. Responsável: Nilson Zanchin Resultados obtidos: Caracterização funcional das proteínas SBDS, Septinas e ISG95 humanas e do exossomo de RNA de Archaea. - Análise Funcional de Proteínas Envolvidas em Síntese de Ribossomos e Associadas a Doenças Genéticas - Agência financiadora: CNPq, 309215/20110, edital produtividade em pesquisa nível 1C, vigência Março 2012-Fevereiro 2016, valor R$ 105.600,00. Responsável: Nilson Zanchin Resultados obtidos: Caracterização funcional das proteínas SBDS e SPP1 humanas e do exossomo de RNA de Archaea. - Estudo da Estrutura de Proteínas Componentes e Reguladoras do Exossomo de Archaea e de Levedura. Modalidade “Projeto Temático”. Agência financiadora FAPESP 2010/51842-3 – FAPESP valor R$, 480.000,00, vigência 01/01/2011 a 31/12/2014. Responsável, Carla Columbano de Oliveira, pesquisador participante: Nilson I. T. Zanchin. Resultados obtidos: Caracterização funcional do exossomo de RNA de Archaea e de levedura. - The NIP7 protein is required for accurate pre-rRNA processing in human cells. Agencia FAPESP - 2011/00309-6 - Vigência, 01/03/11 a 31/08/11. Valor R$ 5. 259,29. Responsável: Nilson Zanchin Resultados obtidos: publicação de artigo na revista Nucleic Acids Research. - Investigação dos Mecanismos de Síntese e Regulação da Função de Ribossomos Associados a Doenças Genéticas e Proliferação Celular. Agência financiadora: CNPq 304578/2008-8, edital produtividade em pesquisa nível 1D. vigência Março 2008-Fevereiro 2011, valor R$ 79.200,00. Resultados obtidos: Caracterização funcional das proteínas SBDS, Septinas e ISG95 humanas e do exossomo de RNA de Archaea. - Caracterização funcional de proteínas envolvidas no controle da expressão gênica. Auxílio individual regular (FAPESP 06/02083-7), coordenador, vigência: 01/08/2006 – 29/02/2009. Valor R$ R$ 222.471,25 e US$ 57.160,00. Responsável: Nilson Zanchin Resultados obtidos: Caracterização funcional das proteínas humanas NIP7, FTSJ3, SBDS, Septinas e ISG95 humanas e do exossomo de RNA de Archaea. - Vigilância e caracterização molecular e sorológica de arbovirus circulantes na Argentina, Brasil, Paraguai, Uruguai e Venezuela, CAPES, R$150.000,00 (bolsas de longa duração, cooperação internacional), Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. - Desenvolvimento de testes imunoenzimáticos utilizando antígenos recombinantes para detecção de patógenos virais visando certificação sanitária de camundongos SPF. CNPq Edital Universal 2011, R$85.500,00, Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. Resultados: Desenvolvimento de uma série de imunobiológicos para rápido diagnóstico de patógenos virais comuns em camundongos de biotério, visando certificação sanitária dos mesmos. - Caracterização molecular de hantavírus e seus potenciais reservatórios: Desenvolvimento de insumos e contribuições para programas de vigilância epidemiológica no Estado do Paraná. PPSUS-Fundação Araucária, R$ 99.945,00, Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. Resultados: identificação precisa de áreas de risco para os seres humanos, e na implementação de estratégias de controle desta zoonose no estado. Ademais, aumentará a nossa compreensão sobre os aspectos básicos da biologia desses agentes, contribuindo para a melhoria das técnicas de diagnóstico, e proporcionarão informações úteis para a concepção de vacinas e antivirais. - Desenvolvimento e validação de insumos para diagnóstico e monitoramento de arboviroses no Brasil, Secretaria de Vigilância em Saúde/Ministério da Saúde, R$ 158.000,00, Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. Resultados: Desenvolvimento de insumos para o diagnóstico sorológico de febre amarela, Chikungunya e Encefalite de Saint Louis em amostras humanas. - Produção de reagentes para kits de diagnóstico sorológico humano de IgM e IgG para hantavirose, CGLAB/ Ministério da Saúde, R$ 134.000,00, Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. Resultados: Produção e distribuição de kits HANTEC EIA para o diagnóstico de infecções agudas e convalescentes por hantavírus em humanos. Manutenção dos Laboratórios de Referência da Fiocruz integrantes da Rede Nacional de Laboratórios de Vigilância Ambiental em Saúde, CGLAB – Ministério da Saúde, R$ 107.619,66, Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. - Resultados: Prestar serviço de referência no diagnóstico de infecções por hantavirus em amostras humanas e de roedores reservatórios - Vigilância e caracterização molecular e sorológica de arbovirus circulantes na Argentina, Brasil, Paraguai, Uruguai e Venezuela, CAPES, R$150.000,00 (bolsas de longa duração, cooperação internacional), Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. - Hantaviroses e Arenaviroses no Brasil: Desenvolvimento de insumos para o diagnóstico rápido em roedores silvestres através da plataforma de cromatografia de fluxo lateral, PROBIO II – Banco Mundial, R$355.400,00, Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. Resultados: Desenvolvimento de insumos para o diagnóstico sorológico rápido de hanta e arenavirus em roedores silvestres através da tecnologia de cromatografia de fluxo lateral. - Interação vírus dengue e hospedeiro: busca por marcadores moleculares de virulência e análise da resposta imune antiviral nos hospedeiros vertebrados e invertebrados, PROCAD-CNPq, R$333.513,21, Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. Resultados: Estudo da interação entre os vírus da dengue e o hospedeiro vertebrado e invertebrado, o papel dos componentes salivares do mosquito nessa interação, bem como mapear mutações no genoma viral envolvidas nas diferenças de estimulação da resposta imune. - Candida spp. isoladas de mucosa bucal de pacientes portadores de HIV: determinação dos fatores de virulência, formação de biofilme e sensibilidade aos antifúngicos, PPSUS – 2008/2009 Fundação Araucária, R$ 81.291,85, Resp. Sueli Fumie Yamada Ogatta. Resultados:Neste projeto foram isoladas 123 leveduras do gênero Candida que foram caracterizadas quanto à sensibilidade aos antifúngicos fluconazol e nistatina, e à expressão de fatores de virulência. Esses isolados foram utilizados para seleção de substâncias de origem natural quanto a atividade antifúngica, principalmente antibiofilme. Os resultados geraram uma dissertação de mestrado e dois trabalhos que serão submetidos para publicação. - Phytomonas serpens: caracterização do gene que codifica proteina P ribossomal e sua participação na reatividade antigênica com Trypanosoma cruzi. Programa de Apoio à Pesquisa Básica e Aplicada, Fundação Araucária, R$ 24.896,00, Resp. Sueli Fumie Yamada Ogatta. Resultados: Os resultados parciais deste projeto permitiram a caracterização do gene que codifica a proteína P ribossomal de Phytomonas serpens. O uso de células-tronco mesenquimais autólogas da medula óssea no tratamento de lesões da cartilagem articular. Nº 461/2010/14939 financiado pela Fundação Araucária. Resp. Alexandra Cristina Senegaglia. Valor: R$ 17.567,86. - Resultados: O projeto encontra-se na sua fase inicial, até o momento foram validadas as técnicas e selecionados os candidatos em potencial para participar do ensaio clínico. Ainda este ano pretendemos realizar os isolamento/expansão das células mesenquimais da medula óssea dos pacientes e proceder com as infusões. - Avaliação da interface osso/implante em mandíbula de miniporcos irradiados e o uso de células tronco na osseointegração. Nº 461/2010/15658 financiado pela Fundação Araucária. Resp.: Carmen Lúcia Kuniyoshi Rebelatto Valor: R$ 19.861,00. Resultados: Neste estudo foi realizada a padronização do isolamento e cultivo das célulastronco mesenquimais de miniporcos BR-1. Esta primeira parte do estudo “Characterization and in vitro differentiation of mesenchymal stem cells derived from bone marrow of Brazilian minipig. A protocol for basic research and tissue engineering” foi submetida para publicação no periódico International Journal of oral Science. Serão realizadas as análises histológicas dos implantes dentários dos animais que receberam transplante de células-tronco e será avaliado a influência destas células na osteointegração. 2 – Sobre o Coordenador e Pesquisadores Principais a- Experiência e competência comprovada e compatíveis com o Projeto; O coordenador da proposta é pesquisador 1A do CNPq desde 1988 e tem ampla experiência na coordenação de projetos tendo coordenado projetos individuais nas diferentes agências de fomento do país (CNPq , PADCT e FINEP), agências de fomento regionais (FAPERJ e Fundação Araucária), foi “Pesquisador do nosso Estado” (FAPERJ), coordenou projetos individuais Internacionais (Organização Mundial da Saúde, três projetos incluindo um Research Strengthening Grant), coordenou projetos de cooperação internacional (CAPES-COFECUB, CABIO-CBAB, DAAD, Amsud, PasteurFiocruz, Fiocruz-CNRS, Fiocruz-Inserm), coordenou projetos em rede nacionais em rede destacando-se dois projetos do Pronex (um nacional no primeiro edital do CNPq e outro pela Fundação Araucária), um projeto da rede Genoma Nacional do CNPq e atualmente coordena o INCT Para Diagóstico em Saúde Pública, um dos dois INCTs instalados no Estado do Paraná. Os pesquisadores principais também têm experiência comprovada como pode ser observado pelo grande número de publicações, orientações e captação de recursos, sendo alguns bolsistas de produtividade do CNPq (Claudia Nunes Duarte dos Santos, Bruno Dallagiovanna, Maurilio José Soares, Nilson Zanchin). b- Vínculo dos pesquisadores: Os pesquisadores são tanto vinculados à Fiocruz, seja como servidores do Sistema Jurídico Único (Samuel Goldenberg, Claudia Nunes Duarte dos Santos, Bruno Dallagiovanna, Alejandro Correa, Juliano Bordignon, Maurilio José Soares), servidores terceirizados da Fiocruz (Fabiola Barbieri Holetz) ou servidores récem concursados aguardando posse (Nilson Zanchin, Lysangela Ronalte Alves e Marco Augusto Stimamiglio). Dois pesquisadores principais são professores da Universidade Estadual de Londrina (Sueli Fumie YamadaOgatta e Phileno Pinge Filho), dois pesquisadores são professores da PUCPR (Carmem Rebelatto, Alexandra Senegaglia) e os pesquisadores colaboradores são servidores da Embrapa (Francisco Lobo), Instituto Pasteur de Montevideu (Hugo Naya) e Instituto Clemente Estable do Uruguai (Jose Sotello-Silveira). c- Qualidade e regularidade da produção científica Os pesquisadores principais apresentam em seus curricula publicações regulares em periódicos de impacto reconhecido. Várias destas publicações envolvem as principais técnicas que serão utilizadas para o desenvolvimento do presente projeto e os modelos experimentais aqui utilizados (Trypanosoma cruzi, vírus dengue, células dendriticas, células tronco) d- Experiência prévia na formação de pesquisadores: A capacidade dos pesquisadores participantes desta proposta em formar recursos humanos é inconteste haja vista o grande número de dissertações e teses orientadas, além de orientações de iniciação científica e pós-doutorado. É importante mencionar que o projeto descrito nesta proposta tem um grande potencial para a formação de recursos humanos, dando continuidade a este importante processo. e- Experiência de intercâmbio com instituições e pesquisadores do Brasil e de outros países Vários dos pesquisadores participantes desta proposta participaram de projetos e redes de cooperação internacional e algumas destas cooperações ainda estão em vigência, notadamente com pesquisadores do Instituto Pasteur de Montevidéu. É nosso objetivo buscarmos fonte de financiamento com a Universidade de Lund na Suécia em vista de estreitarmos colaboração para o estudo de microRNAs e seqüenciamento envolvendo a plataforma Ilumina. O coordenador da presente proposta coordenou vários projetos de cooperação internacional, organizou cursos internacionais e congressos e workshops envolvendo a participação de pesquisadores de outros países. 3 – Sobre a Equipe Técnica e de apoio: a- Qualificação dos técnicos de apoio Os técnicos são bem treinados e conhecem bem a rotina do trabalho. Grande parte dos técnicos tem curso superior e três tecnologistas (todos com pósgraduação) ocupam-se da operação e manutenção dos equipamentos mais sofisticados (os citômetros Facs Aria e Canto, o seqüenciador SoLID IV e o espectrômetro de massas Orbitrap funcionam como plataformas tecnológicas e têm técnicos que auxiliam na sua operação) . É importante ressaltar que como a maior parte das técnicas estão bem estabelecidas, as mesmas são de domínio do pessoal técnico. b- Nível e fonte de financiamento dos estudantes e estagiários Os estudantes e estagiários são financiados com bolsas do CNPq, CAPES, Fundação Araucária e Fundação Oswaldo Cruz. Tanto o ICC como a UEL e a PUCPR têm cursos de pós-graduação e atividades de PIBIC em suas respectivas sedes e por consequência disponibilidade de bolsas. c- Perfil de pessoal a ser eventualmente recrutado para o Núcleo O pessoal a ser recrutado são estudantes nos diferentes níveis (iniciação científica, pós-graduação e pós-doutorado) e o recrutamento será feito de acordo com a dinâmica do projeto. Vale ressaltar que já existe o envolvimento de estudantes e estagiários no projeto, mas em vista da riqueza e da potencialidade desta proposta outros ingressos realizar-se-ão ao longo dos 36 meses de execução. 4- Sobre o conteúdo do projeto: PROJETO: ESTUDO DO PAPEL DE GRÂNULOS DE RNA E DE EXOSSOMOS NA INTERAÇÃO PATÓGENO-HOSPEDEIRO a- Coerência temática, foco e articulação das atividades propostas As atividades de pesquisa propostas serão centradas nos modelos biológicos já utilizados pela equipe nos seus estudos mas novas perguntas serão abordadas neste projeto. O Trypanosoma cruzi tem sido estudado pela equipe há quase 30 anos (mais de 85 publicações), havendo o interesse no estudo dos mecanismos de diferenciação deste parasita e nos mecanismos de regulação da expressão gênica. Mais recentemente foram realizados estudos relativos à caracterização de grânulos de RNA e proteínas associadas na modulação da expressão gênica em T. cruzi. Os conhecimentos adquiridos com os estudos de grânulos de RNA e a percepção da ubiquidade desses grânulos na regulação da expressão gênica em eucariotos leva-nos ao estudo dos mesmos em células tronco, outro importante modelo de estudo por membros da equipe. A proposta aqui apresentada é bastante original pois embora existam vários relatos na literatura sobre grânulos de RNA, nada existe sobre os mesmos nas células tronco e de que maneira regulam o programa de diferenciação destas células. De maneira análoga, estudos com vírus dengue (mais de 15 publicações) demonstram a proficiência da equipe com este modelo biológico e um dos aspectos originais desta proposta é a realização de estudos referentes à presença e papel de grânulos de RNA utilizando este modelo biológico. Atividades de pesquisa envolvendo exossomos são um componente novo nas atividades da equipe, mas resultados preliminares já levaram ao estabelecimento da metodologia para isolamento e análise dos exossomos (o projeto de tese da doutoranda Sharon Martins Toledo trata do estudo de exossomos em células dendriticas infectadas e não infectadas com vírus dengue). O conjunto de atividades, estudos de caracterização biológica e funcional de grânulos de RNA e de exossomos em células tronco e células dendriticas, infectadas ou não com os patógenos T.cruzi e vírus dengue, permitirá a geração de novos conhecimentos para a melhor compreensão dos mecanismos de patogênese e de regulação da expressão gênica nos modelos estudados. b- Estado atual de conhecimentos no domínio da pesquisa 1 - Grânulos de RNA Nas células eucarióticas, a regulação da expressão gênica ocorre em diferentes níveis e os mecanismos pós-transcricionais têm um papel crucial no desenvolvimento, diferenciação e sinalização celular. A biogênese e a funcionalidade de uma determinada molécula de RNA mensageiro (mRNA) depende da ação de um conjunto de proteínas ligadoras de RNA (RNA binding proteins) que participam de todas as etapas de processamento do transcrito desde o capeamento, passando pelo splicing, a poliadenilação, a exportação nuclear, a associação com ribossomos e em última etapa a degradação. Proteínas específicas ligam-se às moléculas de mRNA e a dinâmica da interação está diretamente associada à funcionalidade dos mRNAs na célula. A combinação única de fatores que acompanham um mRNA específico, bem como suas posições relativas neste transcrito, determinam o destino deste mRNA no citoplasma, ou seja, tradução, estocagem para posterior tradução ou degradação (Moore, 2005). Em células de mamíferos, os RNAs que não estão sendo traduzidos, ou aqueles que estão destinados para a degradação, são compartimentalizados em estruturas citoplasmáticas distintas denominadas genericamente de “Grânulos de RNA” que podem ser classificados em Processing bodies (P-bodies) e grânulos de estresse (GS), em função da presença de proteínas específicas, e têm papel fundamental na regulação póstranscricional da expressão gênica. Os grânulos de estresse e P-bodies são estruturas citoplasmáticas dinâmicas que participam ativamente no metabolismo de RNA determinando o destino de mRNAs não envolvidos na maquinaria de tradução, seja mantendo-os estabilizados, seja levando-os às vias de degradação. Estas partículas por serem espacialmente e funcionalmente ligadas, apresentam semelhanças, por exemplo, ambas são induzidas por estresse e contém mRNAs não traduzidos provenientes da dissociação dos polissomos (Kedersha & Anderson, 2002; Sheth & Parker, 2003; Teixeira et al., 2005; Holetz et al., 2007). Entretanto, estes grânulos também diferem em vários aspectos, entre eles podemos ressaltar que somente os P-bodies são observados em células em fase exponencial de crescimento e em células não submetidas a estresse. Além disso, o estresse induzido pela fosforilação do fator de tradução eIF2α afeta somente a formação dos grânulos de estresse e não tem efeito sobre os P-bodies . De forma geral, os grânulos de estresse são definidos pela presença de fatores de iniciação da tradução enquanto os P-bodies são definidos pela presença de componentes da maquinaria de degradação. Vários estudos, utilizando diferentes modelos, como por exemplo, células de mamíferos, leveduras e protozoários, têm revelado que muitas proteínas e RNAs com funções celulares distintas estão integrados com os grânulos de RNA, indicando que as funções destas estruturas vão além da triagem de mRNAs entre a tradução e a degradação (Anderson & Kedersha, 2006; Anderson & Kedersha, 2007; Holetz et al., 2010). Resultados recentes e ainda não publicados por membros de nosso núcleo demonstraram que em células tronco adultas ocorre um aumento significativo de grânulos que contém a proteína TIA-1 (marcadora de grânulos de estresse), quando comparadas com as células diferenciadas, mesmo na ausência de estresse. Este dado é mais um indicativo da diversidade de atuação e da importância destas estruturas na modulação da expressão gênica, ressaltando a necessidade de se ampliar os estudos acerca da dinâmica de formação e da composição destes grânulos em diferentes tipos celulares, como também frente a diferentes situações biológicas enfrentadas pelas células. Adicionalmente, alguns estudos indicam que proteínas de grânulos RNA podem favorecer ou limitar uma infecção viral e que determinados vírus interagem com estas proteínas utilizando diferentes mecanismos para manipular a montagem destas estruturas na célula hospedeira (Li et al., 2002). Por exemplo, o vírus West Nile (WNV) codifica um RNA contendo uma estrutura em forma de stem-loop que interage com a proteína TIAR, uma proteína presente nos grânulos de estresse (Anderson & Kedersha, 2007; Li et al., 2002). Durante a infecção, TIAR é seqüestrada em grânulos de replicação viral e a montagem dos grânulos de RNA é inibida na célula hospedeira (Emara & Brinton, 2007). Neste mesmo estudo, foi demonstrada uma redução do número de P-bodies nas células infectadas com WNV e com o vírus da Dengue, sendo postulado que a interferência dos flavivírus na montagem dos grânulos de RNA beneficia a replicação viral por impedir a repressão traducional das proteínas da célula hospedeira, através da inibição da formação dos grânulos de estresse, e por proteger o RNA viral da degradação, através da redução do número de P-bodies . Em contraste com os flavivirus, o poliovirus e o SFV (Semliki Forest Virus) interagem com proteínas dos grânulos de estresse utilizando estas estruturas para favorecer a repressão traducional das proteínas celulares e a replicação viral (McInerney et al ., 2005). Estes estudos demonstraram que além das proteínas e RNAs virais, proteínas de defesa antiviral da célula hospedeira também se acumulam nestes grânulos. Mediante o exposto, fica evidente que os grânulos de RNA presentes nas células hospedeiras, não atuam somente no controle da degradação, estocagem ou tradução de seus próprios mRNAs, mas participam ativamente e seletivamente no mecanismo de defesa da célula frente a uma situação patológica. Com base nos dados publicados na literatura, pode-se especular que grânulos de RNA estejam envolvidos na modulação da resposta imunológica em virtude de uma infecção viral. Neste caso, não é novidade que existe uma extensa modulação de genes da célula hospedeira. Resultados recentes do nosso grupo demonstraram que a infecção do sistema nervoso central (SNC) de camundongos por cepas neuroadaptadas de DENV-1 induz a modulação de genes da imunidade inata com atividade antiviral estimuladas por IFN-I (ISGs). No entanto, esta resposta antiviral não é suficiente para conter a infecção, e os animais desenvolvem encefalite e morrem dentro de duas semanas. Os principais genes modulados são: genes da família OAS (Oligoadenilato sintetase, que funciona como uma RNAseL degradando RNA no citoplasma); família de genes de resistência a Mixovírus (Mx1 e 2), IFIT, Usp18, MHC-I e II (apresentação de antígenos), entre outros. Além dos genes com atividade antiviral observam-se também genes inflamatórios, como as quimiocinas quimioatrativas, Ccl4, Ccl5, Cxcl10, Ccl9, entre outros (Bordignon et. al., 2008). Da mesma forma, os experimentos realizados ex vivo utilizando células dendríticas derivadas de monócitos humanos (mdDCs), confirmaram a extensa modulação de genes da resposta antiviral estimulada por IFN-I, receptores de imunidade inata (toll like), e apresentação de antígenos. Alguns genes superexpressos na infecção por DENV-3 são: APOBEC, IFIT, OAS, MX, STAT1 e 2, CCL8, CXCL10, ISG15 e 20, HERC, e os suprimidos são: CD177, CCL3, CD180, CLEC6A (receptor envolvido na patogênese da dengue), entre outros (Silveira et al., 2011). Neste caso novamente foi observado que a superexpressão de genes com atividade antiviral não foi capaz de conter a infecção e o mecanismo de evasão viral por DENV-3 em mdDCs permanece desconhecido. Sabe-se que alguns flavivirus bloqueiam a sinalização por receptor de reconhecimento de padrão (PRRs), e desta forma, escapam do sistema imune. Recentemente, foram isoladas por um dos laboratórios do núcleo, duas cepas de DENV-3, uma do genótipo III e outra do V, apresentando comportamentos bastante distintos nestas células, o do genótipo III (mais patogênico) inibe a via de sinalização de IFN-I por impedir a fosforilação da STAT1, ao contrário do genótipo V, menos patogênico, que ativa a via, e modula a expressão de muitos genes, não se replicando de forma eficiente. Este exemplo corrobora os dados obtidos recentemente pelo grupo em camundongos nocaute para IFN-I, que mostram que a resposta de IFN-I é vital para o controle da infecção por dengue. No entanto, o que faz com que algumas cepas bloqueiem esta via ou ainda, ativem esta via, mas escapem da resposta por ela induzida, permanece obscuro, o que estimula a investigação do envolvimento de grânulos de RNA durante a resposta do hospedeiro. Embora existam estudos demonstrando a interação de proteínas e RNAs virais com proteínas de P-bodies e grânulos de estresse, nada se conhece acerca da dinâmica de formação e a composição destes grânulos em células de mamíferos infectadas com outros organismos patogênicos. Esta proposta científica é inédita e propomos investigar como os grânulos de RNA presentes nas células humanas poderiam modular a expressão gênica e interagir com moléculas virais, e proteínas celulares da resposta imune inata, influenciando o mecanismo de defesa das células frente a uma situação patológica. Neste estudo serão utilizadas como modelo células apresentadoras de antígenos (células dendríticas) e células tronco humanas infectadas com diferentes patógenos. A inclusão de células tronco deve-se ao fato de que a geração de conhecimento para a caracterização funcional de células tronco é primordial no avanço das pesquisas visando à aplicação terapêutica destas células. Os patógenos utilizados para a infecção das células serão o protozoário T. cruzi e o vírus da Dengue, como explicitado anteriormente. 2 – Exossomos Exossomos são pequenas vesículas contidas por membrana (30 a 100nm) e de origem endocítica que as células eucarióticas secretam no meio extracelular. Foram inicialmente descritas como vesículas para a eliminação de receptor de ferritina em reticulócitos (Harding et al., 1983) e só depois foram descritas de maneira mais ubiquitária. O exossomos são formados através de brotamento de endossomos tardios formando corpos multivesiculares (multivesicular bodies, MVB) e são liberados no meio após a fusão destes MVB com a membrana plasmática. Embora descritos inicialmente em reticulócitos, exossomos foram posteriormente descritos em linfócitos B (Raposo et. al., 1996), tendo um papel na apresentação de antígenos e consequentemente na indução de resposta de linfócitos T. Desde então, exossomos foram descritos em vários tipos celulares incluindo células tumorais (Taylor & Gercel-Taylor, 2011), células tronco mesenquimais (Lai et al., 2011, Huang et al., 2012), células endoteliais (Dignat-George & Boulanger, 2011) e também em diferentes fluidos biológicos como plasma, urina, saliva, líquido amniótico, etc (Simpson et. al., 2009). Além de mediarem a comunicação intercelular, os exossomos também estão envolvidos em enfermidades como câncer e doenças degenerativas (Ludwig & Giebel B, 2012). A composição protéica dos exossomos é variável de acordo com o tipo celular do qual se originam (Simpson et. al., 2009). No entanto, existe um núcleo de proteínas que são comuns a diferentes exossomos derivados de células dendríticas, linfócitos B e células epiteliais intestinais. Dentre essas proteínas comuns, estão aquelas associadas com a biogênese do exossomo, adesão celular e fusão de membranas (como anexinas e proteínas Rab), transdução de sinal, proteínas do citoesqueleto (como actina e tubulina). Os exossomos apresentam também um conteúdo enriquecido em colesterol, esfingomielina e GM3, que estão envolvidos na manutenção dos microdomínios lipídicos que são essenciais na interação entre as células (Février e Raposo, 2004; Li et al., 2006). As proteínas associadas à transdução de sinal mais comumente encontradas são as proteínas-quinase, proteínas G heterotriméricas, HSP70 e HSP90. Exossomos possuem ainda moléculas MHC classe I e tetraspaninas, sendo que os membros CD3, CD63, CD9, CD81 e CD82 são os mais encontradas nos exossomos. Acredita-se que essas tetraspaninas interajam com integrinas e MHC classe II, e ainda participem na ativação celular dos exossomos (Février e Raposo, 2004; Li et al., 2006). As proteínas que compõem os exossomos são selecionadas por uma série de proteínas que se ligam à ubiquitina, chamadas Vps (vacuolar protein sorting), que constituem o complexo proteíco ESCRT 0, I, II e III (Complexo endossomal de escolha protéica para o transporte) (Bishop, 2003; Vella et al., 2008). Uma característica dos exossomos é que eles podem ser transferidos entre diferentes tipos de células dendríticas e linfócitos B (Février e Raposo, 2004). Podem também estar associados à indução de respostas anti-tumorais. Exossomos derivados de células dendríticas sensibilizadas com peptídeos tumorais foram capazes de ativar respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas, levando à regressão de tumores em modelos animais. Essas observações levaram a estudos que tentam utilizar os exossomos como imunoterapia para tratamento do câncer (Azevedo, 2007; Mignot et al., 2006). Foi ainda demonstrado que os exossomos podem induzir tolerância imunológica. Células epiteliais intestinais secretam exossomos em condições inflamatórias, carregando MHC II na circulação. Esses exossomos, juntamente com as células T CD4+ regulatórias, essenciais para a indução e manutenção de tolerância periférica a antígenos do conteúdo intestinal (Li et al., 2006). As plaquetas também secretam exossomos ricos em CD63, e são provavelmente liberados no local da injúria vascular, podendo funcionar no ambiente direto de adesão plaquetária (Denzer et al., 2000). Recentemente foi descrito que os exossomos podem transferir proteínas entre células sem a necessidade de contato direto entre as mesmas, e gerar diferentes estímulos biológicos. Exossomos derivados de células dendríticas podem modular a imunidade de células T (Li et al., 2006), além de produzirem respostas anti-inflamatórias, resultando na diminuição de doenças auto-imunes em modelos animais (Bianco et al., 2007; Kim et al., 2007). Estudos demonstraram o papel dos exossomos no tráfego do vírus HIV (Loomis et al., 2006), bem como no tráfego de proteínas neurodegenerativas, como príon (Vella et al., 2007) e precursores mielóides (Rajendran et al., 2006). Esses dados recentes da literatura indicam que as células utilizam os exossomos para comunicação entre si em situações patológicas, fornecendo uma nova rota de comunicação celular e possivelmente de disseminação de um patógeno (Cho et al., 2005). 3- Células dendriticas As células dendríticas (DCs) foram isoladas na década de 1970 do baço de camundongos, apresentando uma morfologia semelhante a dêndritos neuronais e aderência ao vidro, assim como os macrófagos (Steinman e Cohn, 1973). Atualmente, estas células são conhecidas como as principais células apresentadoras de antígenos (APCs), realizando o mapeamento do ambiente em busca de antígenos estranhos, os quais quando encontrados são capturados, processados e apresentandos aos linfócitos. Desta forma, as DCs são fundamentais na ativação da resposta imune adaptativa (Banchereau et al., 2000). Além da ativação da resposta imune adaptativa, recentemente, outras funções têm sido atribuídas às DCs, como o controle da migração de linfócitos aos linfonodos (Moussin e Girard, 2011). As células dendríticas (DCs) formam uma população heterogênea de células que apresentam subtipos com diferenças no fenótipo de superfície, função e localização (Shortman e Naik, 2007). As células dendríticas respondem com plasticidade a diversos estímulos endógenos, como citocinas, mediadores inflamatórios, neuropeptídeos e hormônios. As modificações decorrentes de tais estímulos e a ampla distribuição pelos tecidos têm levado a uma classificação ainda mais complexa das DCs, que podem ser subdivididas com base em características fenotípicas, de migração, presença na inflamação, estágios de desenvolvimento, entre outros. Os estágios de desenvolvimento, por exemplo, fazem a distinção entre células denominadas pré-DCs, DCs imaturas e DCs ativadas (Steinman, 1991; Naik, 2008). As células plasmacitóides são exemplos de pré-DCs, pois precisam de estímulo (vírus, bactérias) para apresentar a forma e a função típicas de células dendríticas. Estas células têm como característica peculiar a capacidade de produzir grandes quantidades de interferons do tipo I (O’Keefe et al., 2002). Baseando-se nestes aspectos as DCs representam atualmente as células de escolha para estudos de patogênese de agentes infecciosos, resposta a vacinas, câncer e outras doenças imuno-mediadas (Kooten et al., 2011; Silveira et al., 2011; Hayden et al., 2009; Palucka et al., 2011). Adicionalmente, a imunoterapia baseada em células dendríticas vem ganhando importância, especialmente no desenvovlimento de vacinas anti-tumorais, aumentando a importância dessas células para a imunologia e a medicina (Hayden et al., 2009). 3.1 - Células dendriticas e dengue Na infecção pelo vírus da dengue, as células dendríticas (DC), mais especificamente as células de Langerhans da pele, representam o alvo primário da infecção pelo vírus (Wu et al., 2000). Foi demonstrado que DCs ativadas após a infecção pelo vírus dengue secretam fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interferon (IFN) tipo I (alfa/beta) e IFN-γ, além de expressarem marcadores de maturação como o HLA-DR, CD11b e CD83 (Libraty et al., 2001). Enquanto o IFN tipo I pode conter diretamente a disseminação viral (Umareddy et al., 2008), a produção de citocinas e a maturação das DCs são fundamentais para a estimulação de linfócitos T DENV-específicos. Deste modo, pode-se dizer que as DCs são responsáveis por iniciarem a resposta imune adaptativa contra o DENV, bem como, constituem a primeira linha de defesa contra a infecção (Wu et al., 2000; Navarro-Sánchez et al., 2005). Finalmente, diferenças na capacidade das DCs em controlar a infecção podem estar relacionadas com a variabilidade na patogenia da dengue (NavarroSanchez et al., 2005; Silveira et al., 2011). É importante mencionar que a resposta de DCs na infecção pelo DENV também podem contribuir para a febre hemorrágica. Foi demonstrado por Luplertlop e colaboradores (2006) que as DCs produzem metaloproteinases -9 e -2 (MMP-9 e MMP-2) após a infecção pelo DENV de forma dose-dependente. MMP-9 e MMP-2 aumentam a permeabilidade endotelial através da redução na expressão de PECAM-1 e VE-caderina, além da redistribuição das fibras de actina F (Luplertlop et al., 2006). Ainda mais, o número absoluto de células dendríticas plasmocitóides e mielóides mostrou-se reduzido no sangue periférico de indivíduos infectados com DENV em comparação aos controles saudáveis. Apesar disso, não foi observado diferenças significativas no número de DCs em pacientes com febre da dengue e febre hemorrágica da dengue. Além disso, a viremia não foi correlacionada com a severidade da doença, apesar de mostrar relação com a redução de DCs plasmocitóides e mielóides no sangue, isto é, quanto maior a viremia menor o numero de DCs, sugerindo um importante papel das DCs no controle inicial da viremia pelo DENV (De Carvalho et al., 2011). Finalmente, as DCs contribuem para a eliminação direta do vírus, ou ainda para a estimulação de linfócitos T e B DENV-específicos. Por outro lado, sabe-se que sub-produtos da infecção das DCs pelo DENV podem contribuir para a hemorragia observada na dengue hemorrágica. Desta modo, em virtude deste duplo papel na infecção pelo DENV, bem como, no seu importante papel na resposta imune inata e adaptativa, as DCs constituem em um importante modelo para estudo da patogenia da dengue. 3.2 – Células dendríticas e doença de Chagas A doença de Chagas, descoberta e descrita por Carlos Chagas há mais de 100 anos ainda é um grave problema de saúde pública afetando uma população superior a 10 milhões de indivíduos na America Latina. O primeiro mecanismo de resistência à infecção por T. cruzi é a fagocitose. As formas tripomastigotas metacíclicas replicam-se dentro dos macrófagos, e embora muitos parasitas acabem destruídos dentro dos vacúolos fagocíticos, as formas que evadem conseguem se multiplicar no citoplasma como amastigotas. Os macrófagos não ativados controlam a infecção se a razão parasitas/célula infectada for 5:1, no entanto os macrófagos são destruídos se forem infectados na razão 10:1 (Kress et al., 1975). Fatores associados à imunidade inata como citocinas, proteínas catiônicas, transferrinas e proteínas do sistema complemento são responsáveis pela lise do protozoário, resistência à infecção e redução da carga parasitária. Semelhante a resposta às infecções virais e de outros protozoários, a infecção por T. cruzi induz a expressão de interferons (IFN) e outras citocinas produzidas por fagócitos mononucleares e células natural killer (NK) (Hatcher & Kuhn, 1982). Os níveis de interferons sérico estão correlacionados com a atividade de células NK do baço durante a infecção por T. cruzi em modelo murino (James et al., 1982). Inoculação diária de interferons aumenta a resistência de camundongos infectados com T cruzi quando comparados aos animais inoculados com placebo. Estes achados sugerem que a atividade das células NK induzidas por IFN- é responsável pela resistência e sobrevivência dos animais infectados (Hatcher & Kuhn, 1981; Hatcher et al., 1981; Sanderson et al., 1977). No entanto, citocinas não afetam diretamente a viabilidade, motilidade, infectividade e virulência dos parasitas (James et al., 1982; Kierszenbaum & Sonnenfeld, 1982). A imunidade protetora à infecção por T cruzi parece ser dependente de linfócitos T CD4 e CD8 secretores de IFN- (de Alencar et al., 2009; Rodrigues et al., 2009). No entanto, a geração de células T CD8 parasita-específicas não é afetada na ausência de sinalização via IFN do tipo I (Bixby & Tarleton,, 2008; Martin et al., 2010). Por sua vez, o papel das células T reguladoras parece ser limitado na infecção por T cruzi (Sales et al., 2008). Vale ressaltar que os diferentes estágios de infecção, aguda e crônica, parecem estar sob diferente regulação de interações complexas entre o patógeno e as células hospedeiras, consequentemente, vários padrões de ativação de células do sistema imune influenciam a produção de citocinas e o equilíbrio parasita-hospedeiro (Goronzy & Weyand, 2009). A participação de células T CD4 (Th1) é essencial na resposta imune ao T. cruzi, uma vez que recrutam e ativam outras células da resposta imune, como macrófagos, células B, mastócitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos e os próprios linfócitos T CD8 (Sanderson & de Souza, 2009). Porém, a sobreposição de células produtoras de citocinas tanto do padrão Th1 quanto do padrão Th2 em ambos os estágios da progressão da infecção por T.cruzi demonstram não haver um padrão dominante de produção das mesmas (Zhang & Tarleton, 1996). Células dendríticas são reconhecidas como células apresentadoras de antígeno profissionais responsáveis pelo início da resposta imune devido à capacidade de reconhecer PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns) (Manickasingham et al., 2003). Porém, diferentes estudos demonstraram que a infecção por T. cruzi desencadeia mecanismos reguladores capazes de reduzir a resposta imune (Abrahamsohn & Coffman, 1995; Kierszenbaum et al., 1999; Tarleton, 1991). Em modelos murinos foi demonstrado que a infecção com T. cruzi regula negativamente a expressão de moléculas MHC de classe II e de moléculas coestimuladoras assim como prejudicam a capacidade de células T estimularem células dendríticas do baço (Alba Soto et al., 2003). Experimentos in vitro com tripomastigotas (forma infectiva do T.cruzi), vivos ou mortos por aquecimento, adicionados de LPS (lipopolissacarídeo) induzem propriedades tolerogênicas com produção de altos níveis de IL-10 e inibição da capacidade das células apresentadoras de antígenos em induzir linfoproliferação (Poncini et al., 2008; Poncini et al., 2010). Além disso, foi demonstrado que o aumento na produção de IL-10 pelas DCs é independente de TLR2 e envolve interações parasita-DC via TLR4 ainda não caracterizadas (Poncini et al., 2010). A produção de IL-10 na infecção com T. cruzi parece modular a função das DCs através de mecanismos que resultam em estimulação da resposta imune insuficiente para a erradicação do parasita. Desta forma, estratégias que reduzam esta modulação podem ser essenciais no desenvolvimento da imunidade protetora contra T. cruzi (Alba Soto et al., 2010). 4 - Células-Tronco Mesenquimais As células tronco mesenquimais (CTMs) são células indiferenciadas, auto-renováveis, com alta capacidade proliferativa e que podem diferenciar-se em linhagens celulares maduras como osteócitos, adipócitos e condrócitos (Dominici et. al., 2006). Estas células podem ser isoladas de diversos tecidos adultos, dentre eles a medula óssea e o tecido adiposo (Rebelatto et. al., 2008). Acredita-se que as CTMs presentes nos tecidos adultos sejam capazes de se diferenciar nas linhagens celulares de seu tecido de origem como forma de manutenção da integridade destes tecidos e órgãos (Verfaillie, 2002). Por outro lado, além de seu potencial de diferenciação celular, as CTMs atuam na homeostase tecidual através da secreção de fatores solúveis e da ação parácrina destes fatores sobre os constituintes teciduais (Singer & Caplan, 2011). Neste sentido, já foi demonstrado que as CTMs são capazes de efetivamente suprimir a proliferação clonal e a expansão de células T primadas (Di Nicola et. al., 2002), migrando para os sítios de inflamação e induzindo a regeneração tecidual (Singer & Caplan, 2011). Neste contexto, os efeitos parácrinos induzidos pelas CTMs podem ser divididos em: efeitos tróficos; imunomodulatórios; anti-cicatriciais; e quimioatraentes. Tais efeitos tróficos podem regular ações celulares antiapoptóticas (VEGF, HGF, IGF-1, TGFb, GM-CSF), proliferativas (SCF, LIF,IL6, M-CSF, SDF-1), de diferenciação (GM-CSF, SCF, HGF) e angiogênicas (bFGF, VEGF, PIGF, MCP-1, ECM) (Meirtelles et. al., 2009). A produção e secreção desta gama de moléculas bioativas fazem das CTMs ferramentas promissoras para o tratamento de diferentes enfermidades. Entretanto, os mecanismos utilizados pelas CTMs que promovem tais ações e, desta forma, mantém a homeostase tecidual ainda não são conhecidos (Di Nicola et. al., 2002). Neste sentido, tem sido descrito como um novo mecanismo de comunicação célula-célula a transferência de moléculas bioativas através de microvesículas, sendo este mecanismo um potencial efetor das ações biológicas características das CTMs (Morel et. al., 2004). O mecanismo de sinalização celular através da secreção de exossomos/microvesículas no microambiente extracelular, descrito em célulastronco, foi inicialmente relacionado às células-tronco embrionárias. Neste trabalho, Ratajczak e colaboradores demonstram o papel deste tipo de sinalização como indutor da reprogramação de progenitores hematopoiéticos através da transferência de mRNAs (Ratajczak et. al., 2006). Trabalhos mais recentes sugerem que alguns dos efeitos regenerativos induzidos pelas CTMs seriam mediados através da secreção de exossomos (Bruno et. al., 2009; Lai et. al., 2010). Neste contexto, foi demonstrado que microvesículas derivadas de CTMs humanas são capazes de estimular in vitro proliferação e maior resistência contra apoptose em células tubulares epiteliais. Quando administradas in vivo em camundongos SCID com lesão renal aguda, as microvesículas aceleram a recuperação funcional e morfológica do órgão afetado (Bruno et. al., 2009). Por outro lado, a análise proteômica do meio condicionado derivado do cultivo com CTMs revelou que os efeitos terapêuticos deste meio condicionado são, ao menos em parte, relacionados a ação de proteínas de membrana e intracelulares, possivelmente presentes nos exossomos derivados destas células (Sze et. al., 2007). Acredita-se que os exossomos derivados das CTMs poderiam redirecionar funções alteradas de células alvo durante processos de lesão tecidual, sugerindo que estas microvesículas bioativas poderiam servir como terapia alternativa não baseada em células e, assim, serem exploradas na medicina regenerativa para reparar tecidos lesionados (Camussi et. al., 2010). De qualquer forma, os mecanismos envolvidos na regeneração tecidual induzida pela administração de CTMs ou de seus exossomos permanecem obscuros. 5 – Panorama das questões propostas no projeto O projeto que propomos desenvolver visa estudar o papel de exossomos e de grânulos de RNA durante o processo de infecção de duas células alvo com patógenos diferentes, um vírus e um protozoário. Trata-se de um projeto original pois não há qualquer descrição na literatura do papel de exossomos secretados por células infectadas com o vírus dengue ou com T.cruzi no processo de infecção de outras células. Adicionalmente, não encontramos na literatura qualquer descrição do papel da infecção por estes patógenos na diferenciação de células tronco mesenquimais. Finalmente, é desconhecido se os exossomos normalmente secretados por células dendriticas têm sua composição alterada quando da infecção pelos patógenos estudados e como os exossomos de células infectadas se comparam aos exossomos normais de células tronco e células dendriticas. Na outra vertente, resta a ser determinado de que maneira são alterados e o papel de grânulos de RNA (sejam P-bodies ou grânulos de estresse) no processo de patogênese. Estes estudos serão realizados utilizando sequenciamento em massa de RNAs (RNAseq) e análise proteômica das proteínas constituintes dos exossomos e dos grânulos de RNA, permitindo a visão holística dos genes e vias metabólicas e de regulação envolvidas no processo de patogênese. 6 – Modelo experimentais de patógenos. Neste projeto propomos estudos com dois modelos experimentais de patógenos bem estabelecidos nas atividades de grande parte dos pesquisadores do Núcleo. As doenças causadas por estes patógenos são de alta relevância para a saúde pública (dengue e doença de Chagas) e os modelos são descritos abaixo. 6.1 – Modelo experimental com vírus dengue. Duas cepas do vírus da dengue (DENV) sorotipo 3 foram isoladas por pesquisadores do Núcleo e serão utilizadas neste projeto. Uma foi denominada BR DENV/3/290-02 (GeneBank EF629369), proveniente de um paciente residente na cidade de Curitiba, que viajou para a cidade do Rio de Janeiro onde se infectou. O diagnóstico clínico desse paciente foi o de dengue clássica não fatal, durante uma epidemia em 2002 (LACEN, Curitiba-PR). A outra cepa foi isolada de um caso visceral ocorrido no Paraguai em 2007 (PAR DENV/3/5532-07). Essa cepa foi isolada de um caso fatal de febre da dengue aguda primária com complicações hepáticas e cardíacas na cidade de Lambaré, região metropolitana de Assunção, Paraguai, durante uma epidemia em 2007. Análises moleculares revelaram que ambas as cepas pertencem ao genótipo III do sorotipo 3, o que possibilita o uso dessas cepas em estudos de interação células dendriticas humanas – DENV, permitindo mimetizar a resposta do paciente frente a infecção por dengue 3 com diferentes casos clínicos. A comparação da sequência de aminoácidos na região codificadora do genoma das cepas DENV/3/290 e DENV/3/5532, revelou 12 substituições localizadas nas regiões estruturais e não estruturais e não foram observadas alterações na estrutura secundária da região 3' não traduzida do RNA das cepas em estudo. O primeiro alvo celular para a infecção pelo DENV são as DCs residentes da pele, células de Langherans (LC) e as células dendriticas dermais (DDC) (Navarro-Sánchez er al., 2005). Os resultados obtidos por Silveira e colaboradores (2011), demonstraram que a cepa DENV/3/5532 associada a um caso fatal de dengue, é capaz de infectar de maneira mais eficiente mdDCs (células dendriticas derivadas de monócitos), modula mais intensamente genes envolvidos na resposta imune inata, induz a uma maior apoptose e uma maior secreção de citocinas pró-inflamatórias. Esse conjunto de fatores pode ter contribuído para a miocardite, hepatite e morte por choque do paciente. Já foi demonstrado que a patogenia da dengue está associada com a carga viral (Libraty et al., 2002), onde foram detectados picos de viremia 100 a 1000 vezes maiores em paciente que desenvolveram febre hemorrágica da dengue em comparação aos pacientes que apresentaram febre da dengue (Vaughn et al., 2000). Corroborando os dados da literatura, a cepa DENV/3/5532 infectou mais eficientemente as mdDCs do que a cepa DENV/3/290, produzindo altos títulos de vírus no sobrenadante de cultura (Silveira et al., 2011). A infecção das mdDCs com a cepa DENV/3/5532 induziu uma maior produção de citocinas TNF- e IL-6 em comparação à infecção com a cepa DENV/3/290 em 72h pós-infecção; também foram observados elevados níveis de apoptose nas mdDCs infectadas com DENV/3/5532. A comparação entre cepas de DENV que apresentem diferentes casos clínicos podem ajudar a elucidar mecanismos implicados numa maior virulência de uma cepa em relação a outra e contribuir para o prognóstico de casos graves de dengue. 6.2 – Modelo experimental com Trypanosoma cruzi. Será utilizado o T.cruzi Dm28c. Trata-se de um clone bem caracterizado e isolado por pesquisadores do Núcleo (Contreras et. al., 1988), sendo hoje uma cepa de referência para trabalhos com o T.cruzi. As diferentes formas (epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas) serão obtidas por cultivo axênico (Contreras et al., 1985, Bonaldo et. al., 1988) ou então a partir de células Vero infectadas com tripomastigotas metacíclicos provenientes de meio axênico ou tripomastigotas isolados do sangue de animais infectados. c- Plano geral de trabalho: atividades a serem desenvolvidas, descrição dos experimentos e da metodologia, parâmetros de avaliação do desempenho Isolamento e cultura de células dendriticas derivadas de monócitos: Células dendriticas derivadas de monócitos (mdDCs) serão obtidas utilizandose sangue periférico (120 mL) de voluntários saudáveis, após consentimento informado, com a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da FIOCRUZ (número 514/09). Para tanto, células mononucleares serão separadas pela técnica de gradiente de densidade utilizando-se o reagente Lymphocyte Separation Medium (Lonza, Walkersville, USA), e destas, será isolada a população de células CD14+, utilizando-se o método de imuno-separação magnética por esferas revestidas com anticorpos anti- CD14 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), de acordo com as recomendações do fabricante. Estas células CD14+ serão cultivadas por 6-7 dias em meio RPMI 1640 contendo 100 ng/mL de Interleucina-4 (IL-4) e 50 ng/mL Fator Estimulante de Colônias de Monócitos e Granulócitos (GM-CSF; PeproTech, Rocky Hill, NJ), 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 IU/mL de Penicilina, 100 µg/mL Estreptomicina e 2 mM de LGlutamina (reagentes da marca Gibco-BRL, Grand Island, NY), sendo realizando uma troca de meio no dia 3- 4 de cultivo. Após este período, as culturas serão avaliadas para determinar o fenótipo de mdDCs utilizando-se a técnica de citometria de fluxo (FACS, Becton Dickson – BD). Para tanto, serão utilizados seis marcadores distintos: CD14, CD1a, CD11b, CD11c, CD209 e HLA-DR. As células dentríticas isoladas serão cultivadas sobre lamínulas em densidade de 4 x 105 células/cm2 em meio RPMI 1640. Parâmetros de avaliação do desempenho: Isolamento e cultivo de células dendriticas, análise e caracterização das células isoladas. Isolamento e cultura de células tronco de tecido adiposo: As células tronco adultas do tecido adiposo serão removidas de material excedente de cirurgia bariátrica. O material será coletado no Instituto de Medicina e Cirurgia do Paraná, em pacientes submetidos à cirurgia bariátrica, após consentimento livre e esclarecido dos doadores, com a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da FIOCRUZ (número 419/07). Logo após a retirada do tecido adiposo, este será lavado com solução salina para remover resíduos contaminantes e hemácias. Em seguida o material será digerido com 0,02 mg/mL de colagenase A (Roche Diagnostic) em meio HAM-F12 e meio de Dulbecco´s (DMEM-F12, GIBCO), contendo 2% de albumina bovina por 45 minutos a 37ºC. O tecido digerido será filtrado duas vezes com um filtro de 100μm e outro de 25μm de membrana de nylon, para eliminar os fragmentos não digeridos. Em seguida o material será centrifugado a 600 g por 10 minutos e as células que formam a fração vascular do estroma do tecido adiposo serão coletadas e as células vermelhas lisadas com um tampão contendo 155mmol/L de NH4CL, 20 mmol/L Tris pH 7,6, durante 5 minutos. As células estromais isoladas serão cultivadas sobre lamínulas em densidade de 2 x 104 células/cm2 em meio DMEM-F12 (1:1), suplementado com 5% de soro bovino fetal, 100μg/mL de ácido pantotênico, 100μmol/L de ácido ascórbico, 16μmol/L de biotina, 250 μg/mL de anfotericina, 5 μg/mL de estreptomicina e 5 U/mL de penicilina. Após 24 horas as células não aderentes serão removidas e o meio será trocado duas vezes por semana. Parâmetros de avaliação do desempenho: Isolamento de adipócitos, caracterização fenotípica das células e cultivo das mesmas. Indução de estresse celular por arsenito de sódio: Células dendriticas e células tronco serão tratadas com concentrações crescentes de arsenito de sódio (0,5 – 2 mM) por diferentes tempos de incubação (10 – 60 minutos). Com esta abordagem, esperamos estabelecer o melhor protocolo para a indução de estresse e verificar a presença e a dinâmica de formação dos grânulos de RNA nos diferentes tipos celulares. Parâmetros de avaliação do desempenho: Observação da formação de grânulos de RNA em resposta ao tratamento, estabelecimento do protocolo experimental. Infecção das células: Infecção com o protozoário T. cruzi: Células dendriticas e células tronco, previamente cultivadas sobre lamínulas em placas de 24 poços, serão infectadas com as formas tripomastigotas de T. cruzi provenientes de cultivo celular na proporção de dez parasitas por célula. Após quatro horas, as monocamadas serão lavadas com PBS para remoção dos parasitas não interiorizados e mantidas por 6, 12, 24, 48 e 72 horas em 500 l/poço de DMEM ou RPMI suplementado com SFB 10% a 37C e 5% de CO2. Serão realizados experimentos de infecção celular com e sem indução de estresse. Para a indução do estresse as células infectadas serão incubadas com arsenito de sódio nas condições pré-estabelecidas de acordo com o item anterior. Para se certificar de que a diminuição do número de células infectadas não tenha ocorrido pela lise da célula hospedeira, decorrente do ciclo de multiplicação intracelular, as monocamadas serão observadas em microscópio invertido para verificar a presença de tripomastigotas no sobrenadante. As lamínulas serão lavadas com PBS e processadas para os ensaios de imunofluorescência indireta. Infecção com o vírus da Dengue: Células dendriticas e células tronco, previamente cultivadas sobre lamínulas em placas de 24 poços, serão infectadas com os vírus DENV/3/290 e DENV/3/5532 (MOI = 5) por 2 horas a 37C e 5% de CO2. As células serão lavadas com meio fresco para remoção dos vírus não interiorizados e mantidas por 6, 12, 24, 48 e 72 horas em 500 l/poço de DMEM ou RPMI + SFB 10% a 37C e 5% de CO2. Nos tempos de incubação estabelecidos, serão retiradas alíquotas do sobrenadante das culturas para determinar a presença de citocinas e quimiocinas inflamatórias através da tecnologia CBA (Cytometric Bead Array) de acordo com instruções do fabricante. Serão realizados experimentos de infecção celular com e sem indução de estresse. Para a indução do estresse as células infectadas serão incubadas com arsenito de sódio nas condições pré-estabelecidas de acordo com o item anterior. As lamínulas serão lavadas com PBS e processadas para os ensaios de imunofluorescência indireta. Parâmetros de avaliação do desempenho: Estabelecimento da cinética de infecção com cada patógeno. Detecção das proteínas dos grânulos de RNA, de proteínas virais e de proteínas envolvidas com a resposta imune inata por ensaios de imunofluorescência indireta: Células dendriticas e células tronco previamente cultivadas em lamínulas, não infectadas ou infectadas com os diferentes patógenos e submetidas ou não ao estresse com arsenito de sódio, serão fixadas com paraformaldeído 4% em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente, permeabilizadas com Triton X-100 0,5% por 5 minutos, lavadas três vezes com PBS e incubadas com solução de bloqueio (PBS contendo 5% de soro fetal bovino e 1% de soro humano) por 1 hora em temperatura ambiente. Os anticorpos primários serão diluídos na solução de bloqueio e incubados com as células a 37ºC por 1 hora. As células serão lavadas 3 vezes por 10 minutos com PBS e incubadas com os anticorpos secundários conjugados aos fluoróforos Alexa 488 ou Alexa 546 e as etapas de incubação e lavagem serão repetidas. Os núcleos das células serão corados durante 15 minutos com DAPI, diluído em solução de bloqueio na concentração final de 1 µg/µl. Após esta etapa as lamínulas serão lavadas cinco vezes por 10 minutos e montadas sobre lâminas de vidro com 10 µL de n-propil-galato na concentração de 200 µg/ml. A fluorescência será observada em microscópio confocal. Os anticorpos primários utilizados para a detecção das proteínas dos grânulos de estresse e P-bodies serão anti-TIA1/TIAR e anti-Dcp1a, respectivamente. As proteínas virais serão detectadas com o uso dos anticorpos anti-NS3 e anti-flavivírus (4G2). A presença e/ou ausência das proteínas envolvidas com a resposta imune inata nos grânulos de RNA serão evidenciadas com o uso de anticorpos direcionados contra citocinas próinflamatórias (TNF- e IL-12) e antiinflamatórias (IL-10). Ensaios de coimunoprecipitação: Células dendriticas e células tronco não infectadas e infectadas com os diferentes patógenos serão lisadas em um mililitro de tampão de lise (KCl 100 mM; MgCl2 5 mM; Hepes 10 mM pH 7,0; NP-40 1% e inibidores de proteases) por 1 hora a 4°C sob agitação. As células serão centrifugadas a 2.000 g por 5 minutos a 4°C e o sobrenadante será incubado com proteína A/G Sepharose por 30 minutos a 4°C. A mistura será centrifugada nas mesmas condições acima e o sobrenadante será incubado com anti-TIA1/TIAR e com anti-Dcp1a por 1 hora a 4°C sob agitação. Após esta etapa será adicionada a resina de proteína A/G Sepharose e a mistura será incubada por 1 hora nas mesmas condições. A resina será coletada por centrifugação e lavada 5 vezes com tampão de lise. Para as análises do conteúdo protéico presente nas frações imunoprecipitadas com as proteínas dos grânulos de RNA, a resina será fervida por 5 minutos e as proteínas serão separadas em gel SDS-PAGE, transferidas para membrana de nitrocelulose e analisadas por Western blotting utilizando os anticorpos primários especificados no item anterior. Os RNAs presentes nos imunocomplexos serão purificados utilizando o kit RNeasy (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante e identificados através da técnica de RT-PCR, como descrito a seguir. Reação da transcriptase reversa seguida da reação da polimerase em cadeia (RT-PCR). Para verificar a presença de RNA viral e de RNAs celulares dos genes envolvidos na resposta imune inata (por exemplo, IFIT, Usp18, MHC-I e II, APOBEC, entre outros) os RNAs presentes nos imunocomplexos serão concentrados em microcon e submetidos à transcrição reversa para obtenção do cDNA correspondente, utilizando oligonucleotídeos degenerados, dNTPs (GE Healthcare) e transcriptase reversa M-MLV (Promega). As reações serão incubadas a 42 °C durante 60 minutos. Para as amplificações (PCRs) será utilizado 1/10 do cDNA obtido, oligonucleotídeos iniciadores específicos para cada gene, DNA polimerase Pfx Platinum® (Invitrogen) e condições de amplificação previamente padronizadas. Os produtos obtidos serão resolvidos em gel de agarose contendo brometo de etídio (Sigma) e visualizados em transiluminador UV. Obtenção de exossomos. O sobrenadante das culturas de células dendriticas, correspondente a 1x106 cel/mL, infectadas com T. cruzi ou com o vírus da dengue será coletado e centrifugado à 2500 X g por 5 minutos. Em seguida esse sobrenadante será filtrado em 0,22 mM e submetido a uma ultracentrifugação à 100.000 X g por 3 horas. O sedimento será ressuspenso PBS 1X e estocado à -80C até o momento do uso. Procedimento semelhante será utilizado para o isolamento de exossomos a partir de cultivos axênicos de T.cruzi. As células serão sedimentadas e o sobrenadante tratado. Avaliação da captura de exossomos por células dendríticas Uma alíquota contendo exossomos secretados por T. cruzi será processada com o reagente Alexa Fluor kit ULYSIS Alexa Fluor 594 de acordo com as recomendações do fabricante, a fim de promover a formação de um complexo exossoma - Alexa Fluor. Os exossomos marcados serão ressuspensos em PBS para posterior estimulação de células dendriticas previamente diferenciados. Aproximadamente 2 x 105 células (células dendriticas) serão incubadas em cada câmara de uma lâmina (Lab-Tek Chamber Slide System, Nalge Nunc Internacional, Rochester, NY) contendo 300 L de meio RPMI suplementado. Estas células serão estimuladas com exossomos complexados ao Alexa Fluor durante 4 horas. Decorrido este período, a lâmina será lavada gentilmente com PBS, três vezes, para retirada de material excedente. Posteriormente, as culturas serão fotografadas em microscópio de fluorescência Nikon Eclipse E800 (Nikon Instruments Inc., Melville, NY). As imagens serão adquiridas com câmera digital Nikon DXM-1200 (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) conectada ao microscópio, para a avaliação da captura dos exossomos. Ensaios distintos serão realizados com células dendriticas (2 x 105), cultivadas em placas de 96 poços, fundo reto (Corning, NY, USA), em 200 L de meio RPMI suplementado, estimuladas com exossomos complexados ao Alexa Fluor durante 4 horas. Como controle negativo, células serão estimuladas com exossomos não marcados. Decorridas quatro horas de cultura, a placa será centrifugada a 400 x g, durante 10 minutos para retirada do sobrenadante. Posteriormente, as células aderentes serão removidas da placa com solução PBS gelada e transferidas para tubos utilizados na citometria de fluxo e centrifugadas a 400 x g durante 10 minutos para remoção do PBS, sendo em seguida, marcadas com o anticorpo monoclonal contra CD11c, CD86 e HLADR. Serão adquiridos 25.000 eventos por amostra para a realização da análise. Inicialmente, as células serão selecionadas através dos parâmetros de tamanho (FSC) e granularidade (SSC), e na população selecionada, será analisada a porcentagem de células com dupla marcação positiva: para a molécula CD11c e para Alexa Flúor com intuito de se determinar a porcentagem de células que capturarão os exossomos, bem como se a captura dos exossomos é capaz de induzir a maturação das DCs (CD86 e HLA-DR). Cultivo de células dendríticas para avaliação da resposta inata. Células dendriticas previamente diferenciados a partir de PBMC em placas de cultura de 48 poços (Corning; NY, USA) contendo meio RPMI suplementado, e incubadas a 37ºC, com atmosfera de 5% de CO2 serão estimuladas com exossomos secretados por T. cruzi, tendo como controle negativo células cultivadas apenas com meio de cultura. Decorridas 12, 24 e 48 horas de estimulação, os sobrenadantes serão coletados e armazenados a – 70ºC para posterior dosagem de citocinas. As células cultivadas também serão avaliadas por citometria de fluxo para determinação da expressão da molécula coestimuladora CD86 e da molécula de classe-II HLA-DR. Serão adquiridas 5.000 células dentro da população CD11c por amostra. Co-cultivo de células apresentadoras de antígeno estimuladas com exossomos provenientes de T. cruzi e linfócitos TCD4+ ou CD8+ Avaliação da proliferação celular - Linfócitos TCD4+ ou TCD8+ (ou células não aderentes), com concentrações celulares previamente determinadas, serão ressuspensos em 1 mL de PBS para cada 106 células, e acrescidas de 1 mL de uma solução CFSE (5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl Ester) (Invitrogen, Molecular Probes) a 2,5 M. As células serão incubadas ao abrigo da luz, durante 5 minutos a temperatura ambiente, sob agitação periódica. A reação de incorporação de CFSE será interrompida com a adição de 5% de SBF. Proceder-se-á a lavagem com 10 mL de PBS, seguida de centrifugação a 400 x g, a 4C, durante 10 minutos. Após novo procedimento de lavagem, as células serão ressuspensas em meio RPMI suplementado com 10% de plasma autólogo, penicilina (100U/mL), estreptomicina (100 g/mL), gentamicina (10 g/mL) e polimixina B (30 g/mL). A viabilidade e a concentração celular serão novamente determinadas em câmara de Neubauer com Azul de Trypan. Aproximadamente 1 x 105 células dendriticas e estimuladas com exossomos secretados por T. cruzi, serão co-cultivados com 5 x 105 linfócitos TCD4+ ou TCD8+ previamente marcados com CFSE, em placas de cultura de 96 poços (Corning; NY, USA) contendo meio RPMI suplementado e incubadas a 37ºC, com atmosfera de 5% de CO2. Como controle da fluorescência da marcação com CFSE também serão realizadas co-culturas com linfócitos não marcados. Como controle negativo, as células serão cultivadas apenas em presença de meio de cultura, e como controle positivo, as células serão estimuladas com PHA (1%) (Gibco, Grand Island, NY. As culturas serão mantidas durante 5 a 7 dias. Decorrido o período de cultura, as células serão transferidas para tubos de poliestireno (Falcon, BD, USA). Adicionar-se-á 100 L de EDTA 2 mM, e após homogeneização, as células serão incubadas durante 10 minutos, à temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Posteriormente, serão adicionados 4 mL de solução PBS acrescida de 0,5% de BSA e 0,1% de azida sódica (PBSWash), e as células serão centrifugadas a 400 x g, durante 10 minutos, a 4C. O sedimento celular será ressuspenso em 100 L de PBS-Wash (PBS-W) , e no mesmo dia, proceder-se-á à marcação celular com anticorpos monoclonais específicos para os receptores de superfície celular e posterior análise da proliferação celular por citometria de fluxo (50.000 eventos adquiridos). Inicialmente, os linfócitos serão selecionados através dos parâmetros de tamanho (FSC) e granularidade (SSC). Em seguida, dentro da população selecionada, correspondente aos linfócitos, será avaliada a porcentagem de células positivas para os receptores CD4 ou CD8. A avaliação da capacidade de proliferação das células estimuladas será obtida através da análise de histogramas das populações positivas para CD4 ou CD8. Células que apresentarem grande intensidade da marcação com CFSE corresponderão às células que não proliferarão após cultivo. Células com diminuição na intensidade de marcação para CFSE corresponderão às células que proliferarão após estimulação. Os resultados serão expressos pela porcentagem das células que proliferaram. Determinação da freqüência de células produtoras de citocinas - 5 Aproximadamente 1 x 10 células dendriticas previamente diferenciados a partir de PBMC e estimulados com exossomos secretados por T. cruzi, serão cocultivados com 5 x 105 linfócitos TCD4+ ou TCD8+, em placas de cultura de 96 poços (Corning; NY, USA) contendo meio RPMI suplementado e incubadas a 37ºC, com atmosfera de 5% de CO2. As culturas deverão ser realizadas em triplicata para obtenção de número suficiente de células para a análise. Como controle negativo, as células serão cultivadas apenas em presença de meio de cultura, e como controle positivo, as células serão estimuladas com PHA (1%). Decorridos 24 e 48 horas de cultura, o transporte de proteínas para vesículas intracelulares será abolido com a adição de 10 g/mL de Brefeldina A (Sigma, St Louis, USA). As células permanecerão em cultura por mais 4 horas e, em seguida, serão centrifugadas a 400 x g, durante 10 minutos, a 4C. Os sobrenadantes serão coletados e armazenados a –70ºC para posterior dosagem de citocinas secretadas. A marcação dos receptores CD4 e CD8, assim como de citocinas intracitoplasmáticas IFN-, IL-4, IL-10, IL-17 e Foxp3, será realizada de acordo com Sathler-Avelar [74]. A aquisição das amostras será realizada no citômetro de fluxo, FACS Canto II (Becton & Dickinson), e a análise realizada no programa Cell Quest a partir de 50.000 eventos adquiridos. Avaliação da produção de citocinas. A detecção de citocinas IFN-, IL-10, TNF-, IL-5, IL-17, IL-12p70 nos sobrenadantes das culturas será realizada por ensaio imunoenzimático (ELISA) ou por CBA (Cytometric Bead Array). Utilizaremos o Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit (Becton & Dickinson), que quantifica a concentração de IFN-, TNF-, IL-17, IL-10, IL-6, IL-4 e IL-2. A leitura do ensaio será realizada no citômetro de fluxo (BD FACS Canto II) de acordo com as recomendações do fabricante. A análise dos dados será realizada utilizando-se software específico denominado FCAP Array (Becton & Dickinson), por meio da obtenção de curvas de calibração obtidas com os padrões de citocinas do kit. Após a construção das curvas, a concentração das amostras será determinada em pg/mL, a partir dos valores obtidos na leitura referentes à Intensidade Média de Fluorescência (MFI). Extração do RNA total. O RNA total das células dendriticas, cultivadas na presença ou na ausência de exossomos provenientes de T. cruzi será extraído utilizando-se o kit RNeasy, sendo estocado a –80ºC, até o momento de uso Quantificação e avaliação da integridade das amostras de RNA. A quantificação do RNA total bem como a integridade do mesmo será verificada por eletroforese capilar utilizando o equipamento Bioanalyzer (Agilent). Análise da expressão gênica relativa por PCR em tempo real. A partir do RNA mensageiro serão obtidas amostras de cDNA para realização da PCR em tempo real (Real Time – PCR). A quantificação de cDNA será realizada em espectrofotômetro (NanoDrop, Thermo Fisher Scientific, USA) a partir de uma solução de cDNA (50 ng/L) em um volume de 100 L. Serão realizados ensaios para amplificação dos genes constitutivos GAPDH (Glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase) e HuPO (human ribosomal protein) e para os genes de interesse, relacionados à resposta imune. As reações serão realizadas no aparelho AB 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Em paralelo, serão realizadas amplificações de genes constitutivos utilizados para a normalização dos dados de expressão gênica. Os dados serão normalizados de acordo com a expressão dos genes GAPDH e HuPO de cada amostra, utilizando o método do Ct (cycle threshold) e a equação 2-CT [75]. Sequenciamento em massa dos RNAs isolados dos exossomos. Para o sequenciamento das amostras provenientes do isolamento dos exossomos ou amostras tratadas com essas vesículas, utilizaremos 100 ng do RNA purificado. Os RNAs serão fragmentados com a utilização de 1 U de RNase III por 5 minutos à 37 ºC para obtenção de fragmentos de 150 a 250 nucleotídeos. Após a incubação a reação será parada com a adição de água RNase free e as amostras serão imediatamente acondicionadas em gelo. A purificação dos RNAs é feita com o kit RiboMinusTM Concentration Module (Invitrogen) de acordo com as recomendações do fabricante. Após a purificação, será feita uma reação de hibridização por 16 horas à 16 ºC, na qual um adaptador é ligado na extremidade 3’. O adaptador é utilizado como oligonucleotídeo iniciador numa reação de transcrição reversa para a síntese de uma fita de cDNA. A fita simples de cDNA será purificada com o kit MinElute PCR purification kit (Qiagen) de acordo com as recomendações do fabricante. Após a purificação, o cDNA fita simples será submetido a uma eletroforese em gel de acrilamida 6% (NovexR – Invitrogen) por 25 minutos à 180 V. O gel será então corado com SYBR Gold por 5 minutos e posteriormente os fragmentos de 150 a 250 nucleotídeos serão excisados do gel. Para a obtenção da biblioteca de cDNA a amplificação será feita a partir da banda cortada do gel, sendo que, nesse momento cada amostra recebe dois adaptadores (P1 e P2), sendo que o P1 é específico e único que funciona como um código de barras que identifica cada amostra. Após a amplificação do cDNA este será purificado com o kit PureLinkTM PCR Micro kit (Invitrogen) de acordo com as recomendações do fabricante. O tamanho e a concentração das amostras serão analisados no equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer com o kit DNA 1000. A PCR em emulsão (ePCR) tem como objetivo a amplificação clonal dos fragmentos de DNA modificados e sua ligação às esferas (beads) de sequenciamento pelo adaptador P1. A escala de preparação da PCR em emulsão (ePCR) será a full scale que gera entre 400 e 500 milhões de esferas. Para a reação de ePCR, o cDNA obtido cada amostra será misturado gerando uma biblioteca que contém até 16 amostras diferentes, cada uma individualizada pelo adaptador que confere o código de barras (P1). Essa biblioteca será diluída para duas titulações, 0,5 e 1,0 pM, para cada biblioteca. Assim sendo, serão feitas duas ePCRs para cada biblioteca, permitindo selecionar qual titulação produz melhores resultados, tanto no que se refere à quantidade de esferas quanto à qualidade da sequência. Após a ePCR, as esferas passam por um processo de enriquecimento para maximizar a quantidade de esferas P2 positivos, ou seja, que possuem fragmentos de DNA completos contendo os adaptadores P1, interno e P2. Desse modo as esferas sem produtos de PCR serão eliminadas. A contagem final de esferas após o enriquecimento será feita em câmara de Neubauer e encaminhadas para o sequenciamento. As lâminas utilizadas pelo sequenciador SOLiD apresentam as configurações full (1 poço), quad (4 poços) e octeto (8 poços). A configuração quad permite um número máximo de 60 milhões de esferas. O tempo total de sequenciamento é de aproximadamente sete dias, sendo que no primeiro dia será sequenciado adaptador código de barras e nos últimos 6 dias o fragmento de 50 pb referente ás amostras. As análises das sequências geradas pelo sequenciador SOLiD serão realizadas com base no mapeamento das sequências obtidas no genoma de referência utilizando-se o programa CLC Genomics WorkbenchTM. Identificação do conteúdo protéico dos exossomos. As proteínas que compões os exossomos serão solubilizadas em tampão de desnaturação (uréia 6 M / tiouréia 2 M em HEPES 10 mM (pH 8,0)). Em seguida será adicionado 1 μg (1 μl) de DTT para 50 μg de proteína por 30 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente adiciona-se 5 μg (1 μl) de iodoacetamida (IAA) para 50 μg de proteína e incuba-se por 20 minutos à temperatura ambiente, seguido de diluição das amostras com 4 volumes de tampão de digestão. Para obtenção dos peptídeos, adiciona-se 1 μg (0,5 μl) tripsina e incuba-se durante a noite a temperatura ambiente, a reação é interrompida por acidificação a pH menor que 2,5 com 100% de TFA (concentração final 0,5% TFA). Os peptídeos são purificados usando C18-StageTips previamente equilibrados em tampão A. Os peptídeos são lavados em tampão A e posteriormente eluídos em tampão B. Após a secagem das amostras as mesmas são ressuspensas em solução A e analisadas no espectrômetro de massas de acordo com as recomendações do fabricante. Clonagem, expressão e purificação de antígenos recombinantes. Os dados obtidos a partir do seqüenciamento massivo e das análises proteômicas permitirão evidenciar alvos de interesse para estudos individualizados. Para produção de antissoros e para caracterização funcional e estrutural das proteínas de interesse será necessária a produção de proteínas recombinantes. Inicialmente as proteínas de interesse serão analisadas quanto à complexidade estrutural e a escolha do sistema de expressão será feita conforme a necessidade de cada caso. Proteínas monoméricas ou domínios extracelulares e intracelulares de estrutura menos complexa poderão ser expressos em sistemas de Escherichia coli utilizando os vetores da série pET (Novagen) baseados na RNA polimerase do fago T7 (Studier et al., 1986). A produção de proteínas de membrana pode ser de particular importância para este projeto. Para expressão deste tipo de proteína primeiramente serão testadas as cepas de E. coli C41, C43 ou Lemo21(DE3) (Miroux & Walker 1996; Wagner et al., 2008) que foram selecionadas para produção de altos níveis de proteínas de membrana e para proteínas tóxicas. Para as proteínas complexas e para as proteínas cuja expressão não seja viável em E. coli, será usado o sistema de baculovírus e células de inseto modificado a partir do sistema “pFastBacDual” (Invitrogen). Este sistema permite expressar duas proteínas recombinantes simultaneamente, uma sob o promotor da proteína P10 e outra sob o promotor da polihedrina. As principais dificuldades deste sistema são, primeiro determinar a taxa de infecção das células de inseto pelo baculovírus recombinante e, segundo, determinar os níveis de expressão da proteína de interesse. Visando contornar a primeira dificuldade, clonamos a proteína GFP, a qual serve como gene marcador, sendo fácil de visualizar e quantificar o número de células infectadas em microscópio de fluorescência. Visando contornar a segunda dificuldade, as proteínas de interesse são clonadas em fusão com uma sequência de seis histidinas que servem tanto para detecção por immunoblotting como para purificação por cromatografia de afinidade. Assim, a etapa inicial de purificação será por cromatografia de afinidade a metal imobilizado. As etapas subsequentes de purificação serão definidas de acordo com a necessidade de cada caso, e a resolução das colunas cromatográficas seguindo uma ordem de prioridade de interação iônica, interação hidrofóbica e exclusão por tamanho. A sequencia das etapas cromatográficas seguirá a lógica utilizada em estudos anteriores (Smetana et al., 2006, Navarro et al., 2008). Produção de antisoros. As proteínas recombinantes de interesse serão utilizadas para a inoculação de camundongos, seguindo protocolos padrão, visando a produção de antissoros policlonais e monoclonais. Para a confecção de antissoros policlonais os animais (Balb/C) serão inoculados de 10 a 50 g/dose/animal em volume 1:1 com adjuvante hidróxido de alumínio (Alu-Gel-S; Serva Heidelberg, Germany). Serão realizadas de 4 a 6 doses por via intraperitoneal em intervalos de 7 a 15 dias entre as mesmas, sendo a última dose por via endovenosa. Três dias após a última dose os animais serão sacrificados e o soro coletado por punção cardíaca. Após a coagulação do sangue, o soro policlonal será separado por centrifugação (1500 g por 5 minuto), aliquotado e armazenado a -20C até sua análise. Para a confecção dos anticorpos monoclonais será utilizado o baço dos animais imunizados. O baço será dissociado entre duas lâminas de vidro, e os esplenócitos serão filtrados em membranas de nylon. Após a separação dos esplenócitos, será realizada a lise dos eritrócitos residuais com solução de cloreto de amônio (166 mM de NH4Cl, 9 M de EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) e 95 mM de NaHCO3 (Merck, Rio de Janeiro, Brasil) 5 minutos no gelo. As células serão lavadas duas vezes em PBS 1 X e fusionadas com o mieloma murino Ag8XP3653 com a utilização de polietilenoglicol (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 1:1 em meio RPMI sem SFB por 2 minutos. Após a fusão, as células serão lavadas duas vezes com PBS 1 X e plaqueadas na confluência de 2.5 x 106 células/mL em placas de 96 orifícios (100 L/orifício). Após 24h de cultivo será adicionado ao meio a droga de seleção dos hibridomas (esplenócitos + mieloma) Hipoxantina-Aminopterina-Timidina (HAT; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) e a seleção irá ocorrer por 12 dias com troca de metade do meio a cada 48 h. Após a seleção com meio HAT será adicionado o meio HipoxantinaTimidina (HT; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) por mais 4 dias, com trocas a cada 48h. Finalmente, o cultivo seguirá com meio RPMI + 20% de SFB, 100 UI/mL de penicilina, 100 g/mL de estreptomicina, 2.5 g/mL de anfotericina B, 2 mM de glutamina e 1 mM de piruvato de sódio (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). A triagem de clones positivos será realizada pela técnica de ELISA, assim como, a isotipagem dos clones positivos após diluição limitante (SBA Clonotyping HRP System, Southern Biotech, Birminghan, USA). Ensaios de microscopia eletrônica. Para os ensaios de microscopia eletrônica de transmissão, serão utilizados exossomos isolados e purificados bem como as células dendríticas e tronco não infectadas e infectadas com dengue ou T. cruzi. Após lavagem com PBS os exossomos ou células serão fixados uma solução de glutaraldeído 0,1% / paraformaldeído 2% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,2. Após incubação por 60 minutos à temperatura ambiente os parasitas serão lavados com tampão cacodilato 0,1 M, e submetidos a diversas etapas de desidratação em temperaturas e tempos variáveis: etanol 30% a 4ºC por 30 min; etanol 50% a -20ºC por 60 min; etanol 70% a -20ºC por 60 min; etanol 90% a 20ºC por 60 min; e por fim etanol 100% a -20ºC por 60 min. Em seguida, o material será infiltrado em solução de metanol 100% e resina Lowicryl MonoStep na proporção de 2:1 e o material incubado a -20ºC, por 16 horas. Em seguida, a proporção de metanol será diminuída, e seguiu-se incubação em solução metanol 100% e resina na proporção 1:1 a -20ºC por 16 horas. Após as etapas de infiltração, o material será emblocado em resina pura e submetido a incubação a -20ºC pelo período de 48 a 72 horas sob incidência de luz ultravioleta UVA (360 nm), para que ocorra a polimerização da resina. As amostras serão então cortadas em um em um ultramicrótomo Leica modelo M6, de modo a se obter cortes ultrafinos que foram coletados em grades de níquel. Para a marcação das grades com anticorpo de interesse, estas serão incubadas por 30 min em solução de cloreto de amônio 50 mM em PBS. Em seguida as grades serão incubadas por 30 min em solução de bloqueio para imunolocalização e incubadas por 1 hora nesta mesma solução contendo o anticorpo primário diluído 1:20. Após duas lavagens, o material será incubado por 1 hora com o anticorpo secundário anti IgG de coelho conjugado a partículas de ouro diluido 1:20. Em seguida as grades serão lavadas em solução de bloqueio para imunolocalização e em água destilada. Finalmente as grades serão contrastadas por 30 min com acetato de uranila (5% em água) e por 2 min em citrato de chumbo e então observadas no Microscópio Eletrônico de Transmissão JEOL modelo 1200EXII de 80 kV (Centro de Microscopia Eletrônica, UFPR). Análise estatística. Para as análises estatísticas serão empregados testes T não pareados, pareados não-paramétrico (teste de Wilcoxon) para comparações dentro do mesmo grupo, e o teste não pareado não-paramétrico (teste de Mann-Whitney) para comparação entre os diferentes grupos, de acordo com a necessidade. Os dados serão analisados no programa de computador PRISM (versão 4.0, GraphPad, San Diego, USA). Valores de p< 0,05 serão considerados significativos. d- Relação da pesquisa com trabalhos realizados anteriormente Trabalhos anteriores de grande parte do Núcleo foram centrados nos mecanismos de regulação da expressão gênica em T.cruzi, destacando-se o papel de grânulos de RNA na modulação pós-transcricional. Desta forma o estudo de grânulos de RNA, seja grânulos de estresse seja P-bodies, passou a ser um interesse da equipe em outros modelos de estudo no Núcleo (por exemplo, células tronco) e no processo de infecção de células de mamífero pelo T.cruzi. Dados preliminares indicam que células tronco apresentam um comportamento bastante peculiar no sentido em que grânulos de estresse são muito mais abundantes do que em células diferenciadas. Considerando o importante papel de grânulos de RNA na modulação pós-transcricional da expressão gênica é interessante determinar seu papel no processo de infecção. Assim, a comparação de um patógeno que utiliza a maquinaria celular (vírus dengue) e outro que utiliza sua própria maquinaria (T.cruzi) para a síntese protéica proverá novos dados para o nosso conhecimento do processo de patogênese na dengue e na doença de Chagas. Soma-se ainda o interesse de determinar o efeito espacial da ocupação do citoplasma por estes patógenos na geração de grânulos de RNA e consequentemente na modulação da expressão gênica celular. A análise ribonômica (sequenciamento dos RNAs) contidos nas células infectadas e não infectadas permitirá determinar se vias metabólicas específicas são afetadas pelo processo de patogênese. No caso da pesquisa envolvendo os exossomos, a pesquisa é nova para os componentes do Núcleo, mas os modelos biológicos por nós estudados prestam-se de maneira muito positiva para a compreensão do papel dos exossomos no processo de patogênese tanto da dengue como na doença de Chagas. Resultados preliminares permitiram estabelecer a metodologia para isolamento de exossomos de células dendriticas e assim a comparação de células infectadas e não infectadas abre novas perspectivas para a compreensão do papel de exossomos como mediadores do processo de infecção (teriam os exossomos um papel parácrino na infecção?). No caso particular do modelo dengue, esta questão é bastante estimulante em vista das diferenças biológicas das cepas que serão estudadas. Assim, a presente proposta é baseada essencialmente nos modelos de trabalho dos pesquisadores do Núcleo, mas trazendo novos aspectos e metodologias à pesquisa. É importante destacar que a maior parte dos aspectos abordados na pesquisa proposta são originais e não se tratam de simples contribuições aditivas a dados já existentes na literatura. e- Impactos ambientais, econômicos, tecnológicos e/ou de inovação avanços científicos, A presente proposta não apresenta qualquer impacto ambiental ou econômico (pelo menos a curto prazo). Todavia carrega embutida uma grande perspectiva de avanços científicos tanto para a compreensão dos processos de patogênese da dengue e do T.cruzi como na relação patógeno-hospedeiro. Há também o grande potencial de geração de novos conhecimentos sobre o papel de grânulos de RNA na modulação da expressão gênica de células de mamíferos infectadas com diferentes patógenos. Adicionalmente, a área que trata do estudo dos exossomos e seu papel na interação célula-célula no hospedeiro e na interação célula do hospedeiro-patógeno, será bastante enriquecida. É importante destacar que esta proposta apresenta um grande efeito multiplicador no tocante à formação de recursos humanos capacitados nas tecnologias de ponta da biologia moderna, e seu impacto regional não pode ser negligenciado em virtude da carência de grupos de pesquisa nas áreas de estudo no Estado do Paraná. f- Proposta orçamentária e justificativa A maior parte dos recursos solicitados refere-se a despesas de custeio, sejam materiais de consumo, sejam passagens e diárias para as atividades do Núcleo ou então serviços de terceiros para eventuais reparos nos equipamentos danificados e despesas acessórias de importação. A destinação da maior parte dos recursos para consumo é justificada em virtude do elevado custo dos reagentes e kits para sequenciamento e amplificação de ácidos nucleicos, anticorpos marcados para citometria e microscopia confocal e reagentes para análise proteômica, sendo que a maior parte destes reagentes será adquirida por importação direta. Assim, previmos gastos relativos às despesas acessórias de importação. Parte dos insumos será adquirida diretamente no mercado nacional, principalmente vidraria descartável para cultivo de células, ponteiras, tubos de centrifugação, meios de cultivo, soro fetal bovino de padrão cultura de tecidos, reagentes químicos diversos para o preparo de meios e soluções. A necessidade de equipamentos é importante e prioritária para a equipe da Universidade Estadual de Londrina, mais especificamente a aquisição de um citômetro de fluxo, o que permitiria que parte dos experimentos fosse executado diretamente in loco, e um PCR em tempo real (Real Time PCR) que permitiria que os trabalhos de quantificação de mRNAs específicos fossem feitos em Londrina, sem a necessidade de deslocamento dos pesquisadores até Maringá ou até Curitiba (que é o que ocorre atualmente).É importante ressaltar que estes dois equipamentos não existem na UEL e certamente beneficiariam outros grupos de pesquisa não associados diretamente ao Núcleo desta proposta ao Pronex. g- Cronograma detalhado de execução do projeto ATIVIDADE DESENVOLVIDA Isolamento de células dendriticas Isolamento e diferenciação de células tronco Infecção de células com T. cruzi Infecção de células com vírus dengue Caracterização de grânulos de RNA em células dendriticas Caracterização de grânulos de RNA em células tronco Isolamento de exossomos de células não infectadas Isolamento de exossomos de células infectadas Infecção de células nas presença de exossomos Sequenciamento dos RNAs extraídos de exossomos Análise proteômica (Orbitrap) dos exossomos Seleção dos genes de interesse e análise bioinformática Clonagem e expressão dos genes de interesse Produção de antisoros (policlonais e monoclonais) contra as proteínas de interesse Estudos de localização celular e ultra-estrutura por microscopia confocal de fluorescência e por microscopia de transmissão dos exossomos. *INICIO PREVISTO JULHO DE 2012 SEMESTRE* 1 2 3 4 5 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abrahamsohn IA, Coffman RL. 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