ImmunoLISA - Enzipharma diagnóstica

P
isotipos (IgG, IgM, IgA) contra o HIV 1&2 e principalmente na
detecção de HIV-1 subtipo O.
Este teste é para o uso profissional como auxiliar no diagnóstico
de anticorpos para o vírus 1&2 da Imunodeficiência Humana.
2. Materiais Fornecidos
1)

ImmunoLISA
HIV 1&2
Código: 80532004 Versão: 532/P5 Formato: 1 x 96 testes
1. Explicação do Teste
O HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana) é reconhecido como
agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
(AIDS). O vírus é transmitido por contato sexual, exposição ao
sangue contaminado, certos fluídos ou tecidos do corpo, e da
mãe para o feto ou para o recém-nascido durante a fase perinatal.
Esta técnica para diagnóstico clínico relacionado ao HIV é a
detecção de anticorpos para HIV 1&2 em soro ou plasma humano
por imunoensaio. Entre os métodos imunológicos existentes, os
formatos ELISA e imunocromatográfico (rápido) estão disponíveis
para detectar anticorpos para HIV. Peptídeos sintéticos e
antígenos recombinantes que definem os determinantes
antigênicos das proteínas do HIV têm amplas aplicações no
procedimento ELISA para detecção de anticorpos anti-HIV no
soro.
Recentemente, o uso do sistema conjugado enzimático - antígeno
recombinante para sensibilização de microplaca
com antígeno recombinante aumentou significativamente
a
sensibilidade quanto a especificidade comparando-se ao Kit
ELISA no mercado com base nos peptídeos sintéticos.
Pesquisadores da Orgenics construíram os genes do HIV 1&2
para a expressão de antígenos recombinantes em sistemas de
bactéria como E. coli e enfocaram as proteínas HIV 1&2,
definitivamente imunogênicas. Com base na análise por Western
Blot relatou-se que os principais antígenos imuno-reativos destas
proteínas têm HIV-1 gp41, p24 e HIV-2 gp36.
O ImmunoLisa HIV 1&2 contém uma microplaca pré-sensibilizada
com antígenos recombinantes HIV 1&2 (gp41 incluindo subtipo-O,
p24, gp36) em sua cavidade. Durante a primeira incubação, o
anti-HIV no soro do paciente é ligado aos antígenos
recombinantes HIV 1&2. Seguindo esta incubação, todo o
material não ligado é removido por aspiração e lavagem. O
conjugado enzimático - antígeno recombinante HIV 1&2 (gp41,
p24, gp36) liga-se ao anti-HIV 1&2, formando um “sanduíche”.
Seguindo esta incubação, os materiais não ligados são removidos
por aspiração e lavagem.
A atividade enzimática residual encontrada nas cavidades será
diretamente proporcional à concentração de anti-HIV 1&2 no soro
do paciente e evidenciada pela incubação da fase sólida com
uma solução cromogênica (TMB- tetrametilbenzidina) em um
tampão de substrato.
A leitura colorimétrica será realizada utilizando-se um
espectrofotômetro a 450 nm.
O teste ImmunoLisa HIV 1&2 é ume teste ELISA em duplo
sanduíche para a detecção qualitativa de anticorpos de todos os
Microplaca sensibilizada: 1 placa com 96 cavidades,
sensibilizadas com antígenos recombinantes HIV-1 gp41
(incluindo subtipo O), p24, HIV-2 gp36. Manter as cavidades
não utilizadas à temperatura entre 2 - 8ºC na embalagem de
alumínio fornecida e devidamente lacrada.
2) Controle Negativo: 1 frasco (1,0 mL) de soro humano
normal. Conservante: Azida sódica
3) Controle Positivo: 1 frasco (1,0 mL) de soro humano anti-HIV
positivo. Conservante: Azida sódica
4) Diluente da Amostra: 1 frasco (20 mL) de tampão fosfato,
soro bovino e estabilizante. Pronto para uso.
Conservante: Azida de sódica.
5) Conjugado Enzimático (101x concentrado): 1 frasco (0.2 mL)
de antígeno recombinante HIV-1 gp41 (incluindo subtipo O),
p24, HIV-2 gp36 conjugado à peroxidase (HRPO) em
Tampão Fosfato Salina, BSA (Albumina Bovina Sérica) e
estabilizantes.
Conservante: Proclin 300 (0,05%).
6) Diluente de Conjugado: 1 frasco (20 mL) de Tampão Fosfato
Salina, BSA (Albumina Bovina Sérica) e estabilizantes.
Conservante: Thimerosal (0.01%).
Nota: Antes do uso, preparar uma mistura de 1 parte de
conjugado concentrado enzimático para 100 partes de
diluente conjugado. Utilizar dentro de 2 horas da preparação.
7) Solução de lavagem (20x concentrada): 1 frasco (50 ml) de
PBS-Tween 20.
Conservante: Proclin 300 (0,05%).
Nota: Antes do uso, completar o conteúdo de um frasco com
1000 mL de água destilada. Na presença de cristais
indissolúveis, ressuspender a solução mantendo o frasco à
temperatura de 37ºC por alguns minutos.
8) Substrato (101x concentrado): 1 frasco (0.2 ml) de
tetrametilbenzidina com tampão de citrato-fosfato e DMSO
(dimetilsufóxido).
9) Diluente de Substrato: 1 frasco (20ml) com tampão de
citrato-fosfato e peróxido de hidrogênio.
Nota: Antes do uso, preparar uma mistura de 1 parte de
concentrado substrato para 100 partes de diluente substrato
em um recipiente de vidro.
10) Solução bloqueadora: 1 frasco (20 ml) de ácido sulfúrico 1 N.
Pronto para uso.
11) Selo adesivo para placa
12) Instruções de uso
3. Precauções
Para obter resultados reprodutíveis, as seguintes regras devem
ser observadas :
1) Somente para uso diagnóstico in vitro.
2) Não misturar reagentes de lotes diferentes.
3) Utilizar recipiente de vidro totalmente limpo, isento de
contaminação por ions metálicos e ou substâncias oxidantes.
4) Utilizar luvas descartáveis durante o manuseio de material
potencialmente infectante e na realização do ensaio.
5) O cromógeno e a solução bloqueadora devem ser
manuseados com cuidado. Evitar contato com a pele, olhos
e membranas mucosas. Em caso de acidente enxaguar bem
a área afetada com água corrente.
4. Coleta de amostra e armazenamento
1)
2)
3)
4)
Coletar a amostra de sangue total utilizando anticoagulante
adequado.
Centrifugar o sangue total para obter amostra de plasma ou
de soro.
Se as amostras não são testadas imediatamente, podem ser
refrigeradas de 2 - 8ºC. Recomenda-se congelar as amostras
por períodos maiores que 3 dias. Trazer as amostras à
temperatura ambiente antes do uso.
Amostras contendo precipitados podem produzir resultados
inconsistentes. Tais amostras devem ser clarificadas antes
do ensaio.
5. Procedimento
1)
Preparar as tiras: 3 cavidades para o Controle Negativo, 2
cavidades para o Controle Positivo e cavidades para
amostras.
434/P7
1
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
11)
12)
13)
14)
Pipetar 100 µl de diluente da amostra em cada cavidade.
Adicionar 50 µl de Controle Negativo, Controle Positivo e
amostras nas cavidades correspondentes.
Cobrir a microplaca com selo adesivo e misturar bem no
agitador por vibração. A agitação é importante para obter
reprodutibilidade nos resultados.
Incubar as cavidades a 37ºC por 60 minutos.
Lavar as cavidades 5 vezes com 350 µl de solução para
lavagem diluída.
Aspirar todo o líquido das cavidades.
Pipetar 100 µl de conjugado enzimático diluído em cada
cavidade.
Cobrir a microplaca com selo adesivo.
Incubar as cavidades a 37ºC por 30 minutos.
Lavar as cavidades 5 vezes com 350 µl de solução para
lavagem diluída.
Aspirar todo o líquido das cavidades.
Pipetar 100 µl de solução substrato diluído em cada
cavidade.
Incubar as cavidades por 30 minutos à temperatura
ambiente.
Pipetar 100 µl de solução bloqueadora em cada cavidade.
Ler a absorbância das cavidades em um espectrofotômetro
bicromático a 450 nm com comprimento de onda de
referência a 620 nm. A leitura deve ser realizada dentro de 1
hora do término do ensaio.
6. Interpretação dos resultados
1) Validação do teste
Os valores individuais da absorbância para o soro controle são
utilizados para calcular o valor médio onde:
-0,010 ≤ A (neg.) ≤ 0,200
A (pos.) ≥ 1,000
Se um dos valores de absorbância do Controle Negativo estiver
fora da especificação, este valor pode ser desprezado.
Os valores de absorbância do Controle Positivo devem estar
conformes com a especificação.
Se estes valores não forem obtidos, o teste deverá ser repetido.
2) Avaliação
Calcular a absorbância média do controle negativo. Calcular o
valor “cut-off” acrecentando 0,300.
A (neg.) + 0,300 = valor “cut-off”
Com base nos critérios do teste, as amostras são classificadas da
seguinte forma :
Resultados do teste :
i. A (amostra) < “cut-off” = anti-HIV 1&2 negativo
ii. A (amostra) ≥ “cut-off” = anti-HIV 1&2 positivo
Amostras com resultado de teste maior ou igual ao valor “cut-off”
devem ser primeiramente retestadas em duplicata. Se na
repetição do teste, a absorbância média for novamente maior ou
igual ao valor “cut-off”, as amostras devem ser sempre verificadas
utilizando um teste confirmatório.
4)
Falhas ao adicionar amostras ao procedimento poderão
resultar em um teste falsamente negativo. Considerar a
repetição do teste quando houver suspeita clínica de
infecção.
8. Armazenamento e Estabilidade
1)
2)
Armazenar de 2 – 8ºC. Este kit permanecerá estável até a
data de validade impressa na embalagem e no rótulo de
cada material / reagente, se mantido fechado.
Estabilidade dos materiais / reagentes quando abertos:
Material /
reagente
Microplaca
revestida
Diluente da
Amostra
Conjugado
Enzimático
Controle
Negativo
Controle
Positivo
Solução
Substrato
(Trabalho)
Estado
Armazenamento
Estabilidade
Aberta
2 – 8ºC, lacrada
1 mês
Aberto
2 – 8ºC
3 meses
Aberto
2 – 8ºC
3 meses
Aberto
2 – 8ºC
3 meses
Aberto
2 – 8ºC
3 meses
4 horas
Diluente de
Substrato
Solução de
Lavagem
Solução de
Lavagem
(Trabalho)
Solução
bloqueadora
Aberto
Temperatura
ambiente,
recipiente fechado,
protegido da luz
2 – 8ºC
Aberta
2 – 8ºC
Diluída
1:20
Aberta
2 – 8ºC,
Temperatura
ambiente
Temperatura
ambiente
Diluído
1:101
Data de
validade
Data de
validade
3 meses
2 semanas
Data de
validade
9. Apresentação da Embalagem
96 Testes/ kit.
10. Características de Desempenho
O kit ImmunoLISA HIV 1&2 foi testado com amostras
clinicamente positivas e negativas testadas por um teste ELISA
comercial conhecido anti-HIV 1&2. Os resultados mostraram que
o ImmunoLISA HIV 1&2 é mais preciso que o kit comercial.
Referência
Método
Resultados
ELISA
Positivo
Comercia
Negativo
l
Resultados Totais
* Sensibilidade: 100%
* Especificidade: 99.8%
Immunolisa HIV1/2
Positivo
Negativo
187
0
1
511
188
Resultados
Totais
187
512
511
699
11. Precisão
7. Limitações e Interferências
1)
Os procedimentos do teste, precauções e interpretação de
resultados para este kit devem ser seguidos com atenção
durante sua realização.
2)
a)
b)
Amostras
Amostras contendo azida sódica não devem ser utilizadas.
Amostras pasteurizadas (no mínimo 10 horas a 60°C) podem
causar uma reatividade menor e portanto não devem ser
utilizadas.
Amostras inativadas pelo calor (1 hora a 56°C) não
prejudicam o teste.
Anticoagulantes como heparina, EDTA, e citrato não afetam
o resultado do teste.
Amostras hemolíticas devem ser centrifugadas antes do uso
para evitar interferência por constituintes celulares.
Fatores reumatóides podem causar reatividade elevada se
presentes nas amostras.
Amostras lipêmicas e ictéricas não interferem nos resultados
do teste.
c)
d)
e)
f)
g)
3)
Este kit detecta anticorpos para o vírus da Imunodeficiência
Humana no soro ou plasma humanos e portanto é útil como
um procedimento de triagem.
A precisão intra e interteste foram determinadas pelo teste de 10
replicatas de três amostras: uma negativa, uma positiva baixa e
uma positiva alta. O Coeficiente de Variação (%) do valor
negativo, positivo baixo e positivo alto foi de10% .
12. Bibliografia
1)
2)
3)
4)
5)
M.S. Saac, M.Holodniy, D.R. Kuritzhes, etc.: HIV viralload
markers in clinical practice. Nature Medicine, Volume 2,
Number 6, June 1996.
Eve M. Lackritz, M.D., Glen A. Satten, Ph.D, etc.: Estimated
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Screened Blood in the United States. Journal of Medicine,
Volume 333, Number 26.
Lee Ratner, William Haseltine, Roberto Patarca, etc.:
Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLVIII.
Nature VOL. 313, 24 January 1985.
V.S. Ivanov, Z.K. Suvorova, L.D. Tchikin, A.T. Kozhich and
V.T. Ivanov: Effective method for synthetic peptide
immobilization that increases the sensitivity and specificity of
ELISA procedures. Journal of Immunological Methods, 153
(1992) 229-233.
Mi Jin Sohn, Young Hae Chong, Ji Eun Chang, Young Ik
Lee: Over expression and simple purification of human
immunodeficiency virus-1 gag epitope derived from a
434/P7
2
recombinant antigen in E. coli and its use in ELISA. Journal
of Biotechnology 34 (1994) 149-155.
Produzido por:
ORGENICS LTD.
P.O.Box 360, Yavne
70650 - ISRAEL
Registro e Distribuição:
ORGENICS DO BRASIL LTDA.
Alameda dos Ubiatans, 257 - Planalto Paulista
04070-030 São Paulo - SP
CNPJ : 01.767.606/0001-10
Atendimento ao consumidor
SAC: (11) 5589-4622 FAX: (11) 5581-3279
e-mail: [email protected]
Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro"
Registro ANVISA nº 10348680047
Resp. Técnico : Wellington Staduto Braga da Silva
CRF-SP 13020
CONSERVAR ENTRE 2 - 8ºC
P.O.Box 360 Yavne 70650, Israel
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434/P7
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