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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
Programa de Pós-Graduação em Biologia
e Biotecnologia de Microorganismos
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO
E ANTIOXIDANTE DAS PLANTAS
Cassia alata e Cajanus cajan
Dissertação de Mestrado
Tatiane Rocha Cardozo
Ilhéus – Bahia - Brasil
2010
Livros Grátis
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
Programa de Pós-Graduação em Biologia
e Biotecnologia de Microorganismos
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO E
ANTIOXIDANTE DAS PLANTAS Cassia alata e
Cajanus cajan
Dissertação
apresentada
ao
Programa de Pós–Graduação em Biologia e
Biotecnologia de micro-organismos da
Universidade Estadual de Santa Cruz,
como requisito parcial para a obtenção do
grau de Mestre em Biologia e Biotecnologia
de microorganismos.
Tatiane Rocha Cardozo
Orientadora: Prof. Dra. Cristina Pungartnik
Co-Orientador: Prof. Dr. Martin Brendel
Ilhéus – Bahia - Brasil
2010
ii
Tatiane Rocha Cardozo
DISSERTAÇÃO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO E
ANTIOXIDANTE DAS PLANTAS Cassia alata e
Cajanus cajan
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós–Graduação em
Biologia e Biotecnologia de microorganismos
da
Universidade
Estadual de Santa Cruz, como
requisito parcial para a obtenção do
grau de Mestre em Biologia e
Biotecnologia de microorganismos.
BANCA EXAMINADORA
Aprovado 24 de fevereiro 2010
Dr. Rafael Roehrs
Dr. João Carlos Teixeira Dias
UFSM
UESC
Dra. Roueda Abou Said
Dra. Cristina Pungartnik
UESC
UESC- orientadora
Ilhéus – Bahia- Brasil
2010
iii
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Fungos do
Centro de Biotecnologia e Genética desta Universidade (UESC)
além da colaboração com o laboratório de Genotoxicidade, Instituto
Royal do Centro de Biotecnologia (GENOTOX) da Universidade
Federal do Rio grande do Sul (UFRGS).
Este projeto foi financiado pela Fundação de Amparo a
Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) e Conselho Nacional de
Pesquisa e Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq).
iv
FICHA Catalográfica
Universidade Estadual de Santa Cruz - UESC
Cardozo, Tatiane Rocha
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO E ANTIOXIDANTE
DAS PLANTAS Cassia alata e Cajanus cajan / Tatiane Rocha Cardozo –
Ilhéus, 2010.
Dissertação (Mestrado) Universidade Estadual de Santa Cruz, Programa de
Pós–Graduação em Biologia e Biotecnologia de micro-organismos.
Orientadora: Prof. Dra. Cristina Pungartnik
Co-Orientador: Prof. Dr. Martin Brendel
1. Cassia alata 2. Cajanus Cajan 3. Genotóxico 4. Plantas medicinais
5. Antioxidante.
v
Meu Senhor...
...Ajuda-me a dizer a verdade diante dos fortes
e a não dizer mentiras para ganhar o aplauso dos débeis.
Se me dás fortuna, não me tires a razão.
Se me dás êxito, não me tires a humildade.
Se me dás humildade, não me tires a dignidade.
Ajuda-me sempre a ver a outra face da medalha,não me deixes culpar de
traição a outrem por não pensar como eu.
Ensina-me a querer aos outros como a mim mesmo.
Não me deixes cair no orgulho se triunfo, nem no desespero se fracasso.
Mas antes recorda-me que o fracasso é a experiencia que precede o triunfo.
Ensina-me que perdoar é um sinal de grandeza e que a vingança é um sinal
de baixeza.
Se me tiras o êxito, deixa-me forças para aprender com o fracasso.
Se eu ofender a alguém, dá-me energia para pedir desculpas se alguém me
ofender,
dá-me energia para perdoar
Senhor...se eu me esquecer de ti,
nunca te esqueças de mi!
Mahatma Gandhi
vi
Dedicatória
Aos meus filhos Nychollas e Giulia
meus grandes amores
Aos meus pais Avelino e Rosa por tudo, meus
grandes mestres,
Ensinaram-me muito além da ciência, ensinaram-me
o verdadeiro amor
Obrigado pelo apoio incondicional
vii
Agradecimentos Especiais
O sentimento de gratidão ajuda e vermos que sozinhos não somos nada, e que compartilhar as
conquistas é mais saboroso. Por isso eu não poderia de deixar de agradecer a tantas pessoas que
fizeram parte de minha vida nesta trajetória, ou de alguma forma, estiveram presentes seja em
pensamento ou diretamente, nesta pequena etapa de minha vida, onde foi possível finalizar este
trabalho.
Ao meu Deus por ter me dado a oportunidade de estar neste caminho e
aprender com as dificuldades,
Por ter me dado forças, quando eu desisti;
Por ter me dado paz nos meus momentos de tormenta;
Por ter me dado esperança, nos momentos de desespero;
Por ter me dado amigos verdadeiros quando eu mais precisei
Agradeço de coração a muitas pessoas especiais que trilharam em meu caminho,
algumas ficam e outras vão, mas mesmo longe sempre levo em meu coração... (puxa até
rimou!)
Em especial a minha família. Meus amados Pais, que agüentam minhas loucuras e
principalmente a minha ausência, por todas as oportunidades.
A toda minha família e que trago no coração, minha tias, meus primos, minha dinda,
por sua força em especial tia Leofrida por suas orações. E todos os familiares que estão
em minha vida, sempre me apoiando, muito obrigado por tudo.
Aos meus tios Ruth e Adair que sempre, desde muito cedo, me incentivaram a estudar,
e meus queridos primos que também sempre estiveram em coração e em minhas lutas.
viii
Também queria agradecer ao meu primo Anderson, pelo teu carinho de irmão, e nossas
conversas alem deste plano.
Minha eterna “ex-orientadora”, Dra. Vera Vargas por todos os ensinamentos que tive
com você. Obrigado pela amizade e carinho ao longo de todos estes anos, sempre
mostrando bondade e caráter acima de tudo, um grande exemplo de profissional e ser
humano, uma pessoa sempre disposta a ajudar. Obrigado por tudo.
A turma do laboratório de Mutagênese Ambiental da FEPAM, pessoas que levo em
meu coração.
A Dra. Roueda Said, em especial pela sua gentileza e valiosos ensinamentos neste
curto tempo, mas que foram preciosos para a finalização deste trabalho, mas acima de
tudo, pela sua pessoa generosa e iluminada.
Minha grande amiga Dra. Márcia Moreira, uma pessoa iluminada sempre disposta a
ajudar a todos principalmente os animais... Um grande exemplo pra mim, minha irmã,
um ser humano de luz .
A minha amiga de coração Dra. Tatiana Pereira, amiga pra todas as horas te adoro e
obrigado por tudo, por tantas palavras amigas e ensinamentos e mesmo longe espero
estar sempre perto.
Minha antiga, mas sempre presente amiga Dra. Letícia Neves por seu apoio em todos
os momentos e tuas palavras de sabedoria.
ix
Minhas amigas Biol. Raquel Oliveira e Dra. Simone Salamone vocês sempre serão uma
voz amiga, que tenho saudade. Dra. Camila Both por sua confiança e amizade.
Ao prof. Dr. Jose Luis Bezerra pela oportunidade dos seus preciosos ensinamentos e
sempre com um sorriso no rosto e amizade no coração;
A Dra. Edna Dora, por suas aulas tão agradáveis e por sua pessoa tão iluminada, sua
serenidade.
Vocês Edna e Bezerra foram e sempre serão grandes mestres para mim, exemplos de
grandeza e humildade. (Só por vocês valeu apena vir de tão longe) Obrigado por tudo!
Aos meus irmãos de coração Bianca Cintra Gomes (Bi) e Samuelzinho, Samuel
Carvalho! E suas famílias tão especiais. Vocês dois, meus parceiros companheiros de
viagem... em todas as horas...
Adoro vocês do fundo da alma! Vou levar vocês para sempre no coração, pessoas tão
iluminadas e especiais! Agradeço do fundo do coração por tudo que vocês fizeram!e por
Deus ter colocado vocês em minha vida.
Ao centro Messiânico – Johrei Center de Ilhéus, que me receberam com muito carinho,
principalmente na pessoa da Ministra Meire, com sua luz divina e palavras de
sabedoria.
Ao Centro Espírita Lar de Jesus de Porto Alegre, pelo apoio em orações,
principalmente ao Diretor da Casa Sr. Jose que sempre com suas sabias palavras e
carinho.
Ao Grupo de estudos Holístico- Centro Luxor de PoA , aos amigos Marion, Daniel ,
Marcelo e Carla, Clair e Letícia por sua valiosas orações e carinho.
x
Enfim ao meu companheiro Dr. Mirco Solé pelo apoio e amizade e por ter ficado com a
Giulia aos finais de semana enquanto eu vinha para o laboratório e tantas outras
loucuras que me ensinaram muito, mas principalmente por te me trazido a Ilhéus,
afinal aqui fiz grandes amizades . Muito obrigado por tudo.
Também não poderia deixar de agradecer aqueles amigos que sempre estiveram em meu
lado, fies e companheiros, me aceitando do jeito que sou por sua infinita bondade estes
animaizinhos que tem tanto a nos ensinar... Amos vocês BIBI, BINDI e POPO.
E novamente obrigada infinitamente! A todos os amigos que trago no coração!
xi
Agradecimentos
A UESC e ao Programa de Pós-graduação de Biologia e Biotecnologia de Microrganismos pela
oportunidade;
A FAPESB pela concessão da bolsa de mestrado;
Aos meus orientadores Dra. Cristina Pungartnik e Dr. Martin Brendel, pelo convite em trabalhar
com vocês e oportunidade.
Ao grupo do laboratório GENOTOX ROYAL da UFRGS que me receberam muito bem, obrigado por
tudo mesmo, Miriam, Jaqueline, Izabel, Dinara, Márcia e ao Prof. Dr. João Antonio Pegas
Henriques em especial por ótimos conselhos.
Meus sinceros Agradecimentos a Banca Examinadora, Dra. Roueda Said, Dr. João Dias e Dr.
Rafael Roehrs pelas importantes contribuições na melhoria e finalização deste trabalhos.
A Dra. Aline Silva pela amizade e ótimos conselhos, pelo apoio em todas as horas. À Dra. Ana Paula
T. Uetanabaro pela amizade, ensinamentos e pela gentileza do dia a dia obrigado mesmo pela força e
a Dra. Raquel Rezende e Dra. Carla Romano pelo apoio aos nossos projetos pela disponibilidade
sempre.
A minha querida amiga a Dra. Maisa por nossas conversas incansáveis, pela amizade verdadeira e
banhos de cachoeira gelado!
Aos meus colegas do Laboratório de Fungos, pelo dia a dia, das semanas de lavagem e as brincadeiras
do final do dia. A Rebeca, Givaldo, Gabi, Samuel, Neide, Sonia, Diego, Aninha, valeu a parceria. Em
especial a minha colega Ingrid, tantas conversas obrigado pela amizade e carinho.
xii
A todos os meus colegas do PPGBBM pelo companheirismo, Adriane, Cintia e Tercia, em especial
minha queridas amigas Gilvia e Renata e Flamélia companheiras sempre ali para ouvir, obrigado.
.
Em especial a Gilvia grande amiga um ser iluminado que tive a honra de conhecer, obrigado por tudo.
Aos meninos do PPGGBM, pois, queridos amigos e companheiros também nos momento de
descontração, beijão pra vocês Pedrinho, Lucas, Leo... Aos meus amigos dos outros laboratórios,
sempre tão queridos Andre, Juliano, Gileno,Tiago valeu a descontração nos corredores, a todos
A minha querida amiga Cristiane Souza que mais que uma técnica, foi sempre uma pessoa prestativa
comigo, uma amigona, valeu querida.
Aos funcionários da Gerlab e também do centro de Biotecnologia! Principalmente Katinha.
Ao pessoal de todos os laboratórios do Centro de Biotecnologia, pelo convívio o “Bom dia” mais um
dia para a chibata! Em especial Fabiana e Heliana que sempre tão queridas comigo! As meninas Dai,
Sarinha, Marla, Dani e a todas, valeu mesmo o apoio. Aos meus vizinhos de laboratório do lab. de
Biotecnologia de Micro-organimos, Bianca, Ricardo, Ana e a todos valeu a troca de sais, e as
conversas descontraídas.
A Cacilda (Cacá) que foi sempre uma pessoa maravilhosa e fazendo sua comidinha tão boa, as
meninas do café e o tio Sandro do bar, sempre tão gentis.
Ao NBCGB aos professores que nos cederam às salas, aos funcionários! Muito obrigado mesmo! Em
especial ao Duca que sempre me socorreu com estas maquininhas e a Janete, sempre querida e
disposta. A secretaria, Rose por sua dedicação e paciência e acima de tudo por sua gentileza mesmo
em dias estressantes, muito obrigado.
xiii
Ao pessoal da consultoria e trabalhos em campo, valeu às conversas descontraídas e as emoções de
andar no mato a noite e ver os tamanduás! Também aos ex-colegas de inglês Iuri e Deyna, valeu as
conversas e a amizade. Aos amigos recentes que fiz nesta cidade a Natacha, pela amizade sincera.
Aos professores Martin Alvarez, Ana Schilling, Márcia Rocca, Daniela Talora, Erminda, Helena
Costa, Romari , Alexandre S. , Marcio Costa, Fabio F. e tantos outros a qual me receberem tão bem
nesta terrinha, muito obrigado.
E a todos aqueles que contribuíram de alguma forma,
Perdoem-me... se esqueci de citar alguém , mas sintam-se agradecidos!
MUITO OBRIGADO DE CORAÇÃO A TODOS...
xiv
SUMARIO
LISTA DE FIGURA
xx
LISTA DE TABELAS
xxii
LISTAS DE ABREVIATURAS
xxiii
I - RESUMO
xxiv
II - ABSTRACT
xxvi
1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA
1.1
2
PLANTAS MEDICINAIS E SEU USO TRADICIONAL
4
Conceitos e legislação aplicados as plantas medicinais
1.2
FAMILIA FABACEAE ( LEGUMINOSAE)
8
1.2.1. A PLANTA Cassia alata
8
Nomes e origem;
Composição química;
Uso medicinal tradicional;
Atividade
antibacteriana,
antifúngica,
antiinflamatória
e
antioxidante de extratos e compostos isolados da C. alata;
1.2.2. A PLANTA Cajanus cajan
13
Nomes e origem;
Composição química;
Uso medicinal tradicional;
Atividade antioxidante e outras aplicações
1.3. POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE PRINCÍPIOS ATIVOS
16
1.3.1
17
ESTRESSE OXIDATIVO E DEFESAS ANTIOXIDANTES
RADICAIS LIVRES;
Espécies reativas de Oxigênio (ERO);
Estresse oxidativo;
Lipoperoxidação;
Doenças associadas aos radicais livres;
Antioxidante.
1.3.2. SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTES ENZIMÁTICOS
E NÃO ENZIMÁTICOS
23
Defesas antioxidantes enzimáticos;
Enzima Superóxido Dismutase (SOD);
Enzima Catalase (CAT);
Enzima Ascorbato Peroxidase (APX);
Glutationa peroxidase (GPx)
Defesas antioxidantes não enzimáticos:
Glutationa (GSH) e Glutationa Redutase (GR);
Vitaminas;
Ubiquinonas
1.4
AVALIAÇÃO DOS PRINCÍPIOS ATIVOS DE ORIGEM EM
PLANTAS
1.4.1
ENSAIOS BIOLÓGICOS
1.4.2 ENSAIOS BIOLÓGICOS UTILIZANDO O ORGANISMO
PROCARIOTO
Salmonella
typhimurium:
O
TESTE
SALMONELLA/MICROSSOMA
1.4.3
ENSAIOS BIOLÓGICOS UTILIZANDO O ORGANISMO
29
30
34
37
EUCARIOTO Saccharomyces cerevisiae
41
2. OBJETIVOS
43
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 MATERIAL VEGETAL: PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS
DAS PLANTAS
3.2 MEIOS DE CULTURA, SOLUÇÕES E TAMPÕES
3.3 Atividade antioxidante usando levedura
SACCHAROMYCES CEREVISIAE
3.4 Avaliação de seguridade via ensaio de genotoxicidade e
Mutagenicidade
3.4.1 Avaliação da Atividade Mutagênica e citotóxica - Teste
de Ames - Bactéria SALMONELLA TYPHIMURIUM
xviii
3.4.2 Avaliação da MUTAGENICIDADE E genotoxicidade
com Levedura SACCHAROMYCES CEREVISIAE – XV185-14c
4. RESULTADOS
59
4.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE COM
Saccharomyces cerevisiae
4.1.2 Experimentos de Sobrevivência e Avaliação do
Potencial Antioxidante com Saccharomyces cerevisiae
4.2
AVALIAÇÃO
DA
ATIVIDADE
MUTAGÊNICA
E
GENOTÓXICA
4.2.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MUTAGÊNICA PELO
ENSASIO Salmonella/microssoma – Teste de Ames
4.2.2
AVALIAÇÃO
DA
ATIVIDADE
GENOTOXICA
E
ANTIGENOTOXICA COM Saccharomyces cerevisiae XV
5. DISCUSSAO
78
6. CONCLUSÃO
92
7. PERSPECTIVAS
95
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
97
9. ANEXOS
121
Ensaio atividade antimutagênica utilizando o teste de Ames com
extrato da Cassia alata
xix
LISTA DE FIGURA
Introdução
Figura 1: Naples Dioscurides, manuscrito de Dioscurides ''De Matéria Medica'',1480.
5
Figura 2: Foto da flor da Cassia alata (foto de H. Joseph).
8
Figura 3: Foto do feijão da Cajanus cajan (www. Tropicalforages.html).
13
Figura 4: Foto da flor do Cajanus cajan (foto de Andre Benedito).
14
Figura 5: Fonte geradoras de EROs (modificado de Younger, Healthier Skin, 1998).
20
Figura 6: Formação de radicais livres e mecanismos antioxidantes biológicos.
Fonte: http://quimica.fe.usp.br/global/ca8/radica.htm
21
Figura 7: Esquema representativo dos mecanismos de defesa e fontes de EROS
(Bioquímica 2005).
24
Figura 8: Foto placa de petry com Colônia de bactéria S. typhimurium
34
Figura 9: Foto das células em divisão da levedura S. cerevisiae (foto Dennis Kukel,
2004).
37
Figura 10: Crescimento celular da levedura S. cerevisiae (Adaptado de FUGE e
WERNER,1997).
39
Material e Métodos
Figura 11: Representação esquemática da seqüência do teste em gota ou teste de
sobrevivência.
52
Figura 12: Representação esquemática do teste de Ames (modificado pelo autor,
baseado em MARON & AMES, 1983; MORTELMANS &
ZEIGER, 2000).
55
Figura 13: Representação esquemática do teste de mutagênese e antimutagênese
utilizando a linhagem XV da levedura S. cerevisiae
57
Resultados
Figura 14: Foto das placas do Ensaio em Gota- sensibilidade das linhagens XV 18514c, XS 2316, By10.000, W303 e N123 frente ao extrato aquoso de C.
alata das folhas extrato galhos (adicionado ao meio de cultura em
xx
60
concentrações de B- 50 mg/mL, C- 100 mg/mL e D- 200 mg/mL
Figura 15: Foto das placas, Teste em Gota- sensibilidade das linhagens XV 185-14c,
XS 2316, By10.000, W303 e N123 frente ao peróxido de hidrogênio. Acontrole sem peróxido de hidrogênio; B- com adição de peróxido de
hidrogênio a 1mM; C- peróxido de hidrogênio a 2mM e D- peróxido de
hidrogênio a 4mM.
61
Figura 16: Diferentes linhagens de S. cerevisiae incubadas com 30mg/mL do extrato
aquoso da planta Cassia alata (folha A,B,C e galho D,E F) e frente ao
H2O2 em diferentes concentrações, (3 amostras de 3 experimentos
independentes); ■ com pré-tratamento do extrato ; □ sem pré-tratamento.
64
65
Figura 17: Diferentes linhagens de S. cerevisiae incubadas com 30mg/mL do extrato
aquoso da planta Cassia alata (folha A,B,C e galho D,E F) e frente ao
H2O2 em diferentes concentrações, (3 amostras de 3 experimentos
independentes); ■ com pré-tratamento do extrato ; □ sem pré-tratamento.
Figura 18: Diferentes linhagens de S. cerevisiae incubadas com 30mg/mL do extrato
aquoso da planta Cassia alata (folha A,B,C e galho D,E,F) e frente ao
H2O2 em diferentes concentrações, (3 amostras de 3 experimentos
independentes); ■ com pré-tratamento do extrato ; □ sem pré- tratamento.
66
Figura 19:. Diferentes linhagens de S. cerevisiae incubadas com 30mg/mL do extrato
aquoso da planta Cassia alata (folha A,B,C e galho D,E,F) e frente ao
H2O2 em diferentes concentrações, (3 amostras de 3 experimentos
independentes); ■ com pré-tratamento do extrato ; □ sem pré-tratamento.
67
Figura 20 Diferentes linhagens de S. cerevisiae incubadas com 30mg/mL do extrato
aquoso da planta Cassia alata (folha A,B,C e galho D,E,F) e frente ao
H2O2 em diferentes concentrações, (3 amostras de 3 experimentos
independentes); ■ pré-tratamento com extrato ; □ sem pré-tratamento.
68
Figura 21: Citotoxicidade do extrato de Cajanus cajan; linhagem de S. cerevisiae
(WT), WT s/t : sem tratamento do extrato; WT c/t: com tratamento do
extrato nas dosagens (50mg/mL, 40mg/mL, 30mg/mL, 15mg/mL,
10mg/mL,
5mg/mL)
frente
ao
peróxido
de
hidrogênio
(Controle,2,3,4,5,6,7mM); ensaios e triplicata de 3experimentos
independentes.
70
xxi
LISTA DE TABELAS
Material e métodos
Tabela 1: Linhagens da bactéria S. typhimurium utilizadas neste trabalho
48
(MARON & AMES, 1973).
Tabela 2: Linhagens de S. cerevisiae utilizadas neste estudo
53
Resultados
Tabela 3: Avaliação da Atividade mutagênica do extrato de C. alata (folha) sem
72
metabolização (-S9).
Tabela 4: Avaliação da Atividade mutagênica do extrato de C. alata (folha) com
72
metabolização (+S9).
Tabela 5: Avaliação da Atividade mutagênica do extrato de C. alata (galho) sem
73
metabolização (-S9).
Tabela 6: Avaliação da Atividade mutagênica do extrato de C. alata (galho) com
74
metabolização (+ S9).
Tabela 7: Avaliação da Atividade mutagênica do extrato de C cajan sem
75
metabolização (-S9).
Tabela 8: Avaliação da Atividade mutagênica do extrato de C cajan sem
76
metabolização (+S9).
Tabela 9: Efeito do pré-tratamento com extrato da Cassia alata (folha) e (galho),
frente ao H2O2 nas linhagens de S. cerevisiae XS
xxii
77
LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
1
O2
oxigênio singlete
APCI-MS. espectrometria de massa
APX
ascorbato peroxidase
APX
Enzima Ascorbato Peroxidase
CAT
Cd
Cu
DC
ERO
Fe
GPX
(GSH)
catalases
cadmo
cobre
dicotiledônea
Espécies reativas de Oxigênio
ferro
glutationa peroxidase
Glutationa
GR
glutationa redutase
H2O2
Hg
HO2●
HOCL
HPLC-UV
(peróxido de hidrogênio)
mercurio
radical hidroperóxido
ácido hipocloro
cromatografia líquida de alto desempenho acoplada a luz
ultravioleta
manganês
níquel
Oxido nítrico
radical óxido nítrico
radical dióxido de nitrogênio
MOLECULA DE OXIGENIO
ânion superóxido
Ozônio
radical hidroxila
radical peroxinitrito
chumbo
o radical alcoxil
o radical peroxil
superóxido dismutase
zinco
Mn
Ni
NO
NO●
NO2●
O2
O2
O3
OH●
ONOO
Pb
RO
ROO
SOD
Zn
WTs
xxiii
Universidade Estadual de Santa Cruz
Dissertação, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre
em Biologia e Biotecnologia de microorganismos.
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO E ANTIOXIDANTE DAS
PLANTAS Cassia alata E Cajanus cajan
CARDOZO, T. R.; PUNGARTNIK C.;BRENDEL, M.
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito mutagênico, genotóxico e
antioxidante, de duas espécies de plantas da família das Fabaceae Cassia
alata e Cajanus cajan, conhecidas por sua atividade medicinal. Investigou-se a
ação do efeito dos extratos aquoso de Cassia alata (folhas e galhos) e o extrato
metanólico das folhas do Cajanus cajan, no potencial de induzirem mutação e
citotoxicidade ou atuarem como pro-oxidantes, contra danos induzidos ao DNA,
utilizando levedura S. cerevisiae deficientes e proficientes em mecanismos de
defesa
antioxidante,
(sod1∆,
sod2∆,yap1∆,
cat1∆,
ctt1∆,
sod1∆/ctt1∆,
sod1∆/cat1∆, cat1∆ ctt1∆, WT, N123, XV and W303) usadas para comparar a
ação de agentes que atuem no sistema redox da célula, e linhagem haplóide
para avaliar o perfil mutagênico e antimutagênico dos extratos; e a mutagênese
e
citotoxicidade
com
Salmonella
typhimurium
no
ensaio
Salmonella/microssoma. As concentrações dos extratos nas dosagens maiores
as plantas mostraram efeito citotóxico. Os extratos da Cassia alata mostraram
efeito protetor em células pré-tratadas com extrato em linhagens de S.
cerevisiae deficientes em sistemas antioxidantes, reduzindo o efeito da
peroxidação induzida pela ação do peróxido de hidrogênio. O extrato de C.
cajan também mostrou efeito protetor em células pré-tratadas para a linhagem
selvagem em dosagens menores. Nos ensaios com a linhagem haplóide XV, o
extrato de C. alata diminui a taxa de mutagênese induzida pelo peróxido e
melhorou a sobrevivência. No teste Ames o extrato de C. alata não induziu
mutação para as linhagens TA98, TA1535, TA98 e TA100, em ensaios sem e
com metabolização hepática, e o extrato de C. cajan somente mostrou
atividade positiva para mutagênese nas linhagens TA97 e TA1535 sem
metabolização hepática. Com estes dados pode-se concluir que os extratos
xxiv
possuem propriedades antioxidantes que podem estar relacionadas aos seus
metabólitos como flavonóides e polifenóis que estejam agindo e interagindo
como protetores de danos oxidativos as moléculas e ao DNA.
Palavra chave: Teste Ames, Salmonella/microssoma, Salmonella typhimurium,
Saccharomyces cerevisiae, plantas medicinais, mutagenecidade
xxv
Universidade Estadual de Santa Cruz
Dissertação, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre
em Biologia e Biotecnologia de microorganismos.
EVALUATION OF THE GENOTOXIC AND ANTIOXIDANT POTENTIAL OF
THE PLANTS Cassia alata AND Cajanus cajan
CARDOZO, T. R.; PUNGARTNIK C.;BRENDEL, M.
ABSTRACT
The present study evaluated the antioxidant, cytotoxic and mutagenic properties
of Cassia alata and Cajanus cajan, both belonging to the Fabaceae family. We
analyzed aqueous extracts of C. alata (branches and leaves) and metanolic
extracts of Cajanus cajan. The potential mutagenic and recombinogenic effects
and cytotoxic and antioxidative properties were tested by using Saccharomyces
cerevisiae strains proficient and deficient in antioxidant defenses, sod1∆,
sod2∆, yap1∆, cat1∆, ctt1∆, sod1∆/ctt1∆, sod1∆/cat1∆, cat1∆ ctt1∆, WT, N123,
XV and W303, when exposed to H2O2 [Ø,2,3,4,5,6,7 mM ]. We also analyzed
the mutagenic activity using the Salmonella typhimurium assay TA100 ,TA98,
TA 1535 and TA97a strains. Results showed that the extract of C. alata in
strains haploid S. cerevisiae had a protective effect against H2O2, as the double
mutants sod1∆ ctt1∆ and sod1∆ cat1∆ were more sensitive when compared to
the respective WT. This suggested a role in plant oxidative stress responses. C.
cajan showed cytotoxic effects in highest dose and antioxidant effects. It was
also shown that none of the aqueous fractions was mutagenic in Salmonella
typhimurium strains TA98, TA100, TA 1535 and TA 97, with or without
metabolic activation; although both in highest dose had cytotoxic effects.
Cajanus cajan extracts showed mutagenic effects in strains TA 97a and
TA1535 in highest doses without metabolic activation. The nature of the
protective effect of these extracts may result from their antioxidant activity and
by stimulating DNA repair as observed in genotoxic assays. In conclusion, the
extracts showed excellent antioxidant effects against H2O2-induced oxidative
DNA damage, which could be correlated with various antioxidant compounds
xxvi
present in the plant, molecules like flavonoids and polyphonies which could be
involved in these effects.
Key works: Ames Test, Salmonella/microssoma, Salmonella typhimurium,
Saccharomyces cerevisiae, medicinal plants, mutagenicity
xxvii
INTRODUÇÃO
1
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1. INTRODUÇÃO
Desde os primórdios dos tempos a sociedade humana tem se utilizado das
plantas para diferentes propósitos, sendo um deles o uso terapêutico. Ao longo dos
tempos, a informação do potencial das plantas como fonte alternativa para diversos
fins têm sido passada por gerações (SIMÕES, 1999).
No Brasil, a utilização das plantas medicinais teve influência dos povos
indígenas e dos primeiros colonizadores do continente (SIMÕES, 1999, LOPES et
al., 2000).
Visando
o
desenvolvimento
de
novos
fármacos
(antibacterianos,
antifúngicos e anticarcinogênico) advindo de plantas, pesquisas buscam isolar e
purificar os compostos responsáveis pelas atividades terapêuticas (LOPES et al.,
2000; MACIEL et al.,2002). A partir desta identificação, há a possibilidade de que
estes compostos sirvam como modelo para o desenvolvimento de novas moléculas
(FARNSWORTH et al., 1985; CALIXTO et al., 2000; MACIEL et al., 2002;
ELISABETSKY et al., 2003; BUTLER, 2004).
A busca por novos compostos pelas indústrias vem da necessidade de
descobrir substâncias mais eficientes para o combate a um numero de diferentes
doenças ou de amenizar os efeitos colaterais observados na substância primária
(VORAVUTHIKUNCHAI et al., 2005).
Devido à grande biodiversidade de espécies de plantas e biomas, ainda
pouco se sabe sobre o aspecto fitoquímico e o potencial farmacológico das espécies
botânicas do Brasil. (LOPES et al., 2000), Mais de 100.000 espécies vegetais estão
catalogadas, mas somente 8% dessas plantas foram estudadas quanto as suas
propriedades químicas e terapêuticas (ALVES et al., 2000; SUZUKI et al., 2002).
A utilização de plantas medicinais no Brasil tem aumentado, no entanto
informações sobre seus mecanismos farmacológicos ainda é escassa, e o fato das
florestas ou biomas estarem continuamente sendo devastados coloca em risco estes
conhecimentos (SCHULTES, 1962).
Tem se verificado o potencial dos metabólitos ou princípios ativos como
flavonóides, polifenoís, fenóis, antraquinonas, ácidos fenólicos, carotenóides,
taninos, alcalóides e sua aplicabilidade para atividades antimicrobianas, antifúngica
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1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
e antioxidante (SCALBERT,1991; HANASAKI et al.,1994; CAO et al., 1997;
ARUOMA ,1998, 2003; CAI et al., 2004; CUSHNIE et al., 2005).
A ação antimutagênica destes compostos, metabolitos também são
reportados que podem atuar como protetores de danos celulares, diminuindo a
freqüência de danos moleculares e aumentando a eficiência dos mecanismos de
reparo do DNA, (MARON & AMES, 1983; BEUDOT et al.,1998; MANN, 2002; KRISETHERTON et al., 2002; SURH & FERGUSON, 2003); assim como o potencial
anticarcinogênico (GOGGELMANN, et at., 1986; MACGREGOR & WILSON,1988;
CRAGG & NEWMAN, 1999; LIAO et al., 2004).
Mesmo plantas que apresentam substâncias tóxicas em seus constituintes,
podem ter potencial benéfico ou protetor aos danos moleculares, a depender da
dose
(antimutagênico-antigenotóxico)
(MACGREGOR
&
FRIEDMAN,
1977;
MACGREGOR, 1984; 1986; MACGREGOR et al., 1989; YEN & CHEN, 1995).
Vários modelos têm sido propostos para avaliar a atividade biológica de
uma substância teste. Ensaios biológicos in vitro foram incorporados junto aos
modelos in vivo utilizados nos ensaios toxicológicos.
Estes ensaios in vitro
possibilitaram uma primeira perspectiva das amostras em curto período de tempo,
fornecendo os primeiros indícios da potencialidade dos compostos ou princípios
ativos (NISBET et al., 1997; HOUGHTON, 2000).
Ensaios genotóxicos e mutagênicos utilizando diferentes organismos
(procariotos, como as bactérias, e eucariotos, como as leveduras) têm auxiliado a
elucidar o potencial carcinogênico e citotóxico das substâncias, efeito dose-resposta
(MARON & AMES, 1983; MOODY et al., 1999; MORTELMANS & ZEIGER, 2000;
HARTMANN et al., 2001; HARTMANN et al., 2003).
O presente estudo objetivou analisar a atividade mutagênica, citotóxica,
genotóxica e antioxidante das plantas medicinais Cassia alata e Cajanus cajan.,
Estas plantas, utilizadas para o tratamento de várias enfermidades e também para
finalidades alimentícias, como o caso do Cajanus cajan.
Exemplifica-se
a
importância
de
estudos
com
plantas
medicinais
envolvendo a etnobotânica e a aplicabilidade em ensaios biológicos, como
ferramenta na análise para a segurança de seu uso como um fitoterápico. Verifica-se
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Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
dessa forma, a importância dos estudos sobre os riscos e benefícios do uso das
plantas medicinais e suas futuras aplicações.
1.1 PLANTAS MEDICINAIS E SEU USO TRADICIONAL
Uma das primeiras descrições da utilização das plantas com fins medicinais
vêm do primeiro tratado médico egípcio, o famoso papiro desde os tempos de
Ramsés II, da XVIII dinastia, descoberto, decifrado e publicado em 1873 pelo
egiptólogo alemão Georg Ebers (VILELA, 1977).
Em 1895, Harshberger conceituou o termo etnobotânica como sendo o
estudo de plantas usadas por povos primitivos e aborígines, veio a acrescentar o
conhecimento e a importância das plantas nas diferentes culturas. Este conceito veio
a ser ampliado por JAIN et al.(1991) e MING et al.(2002), abrangendo os aspectos
da relação do ser humano com as plantas, seu uso material, uso cultural como
símbolos de culto, folclore, tabus e plantas sagradas ( Figura 1).
Um dos trabalhos a relatar a utilização de espécies de plantas por antigas
civilizações foi o estudo de MONTELLANO (1975). Este autor reporta a utilização da
espécie Cassia alata por povos Astecas, evidenciando a utilização das plantas como
medicamento fitoterápico desde os primórdios das primeiras civilizações das
Américas. Também foi descrita a utilização da Cassia alata e Cajanus cajan ao
longo dos séculos na medicina tradicional chinesa e indiana (CHOPRA et
al.,1986;KIM et al., 1994).
O conhecimento popular de plantas medicinais tem sido consolidado
através de diferentes literaturas (PESSINI et al., 2003). No século XX, o
conhecimento das farmacopéias tradicionais como fonte de tratamentos acessíveis e
eficientes impulsionou a farmacognosia (ELVIN-LEWIS, 2001).
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1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
FIGURA 1: Naples Dioscurides, manuscrito de Dioscurides ''De Matéria Medica'‘, 1480
(Dioskurides: codex neapolitanus: Napoli, Biblioteca nazionale)
A farmacognosia abrange uma larga série de estudos envolvendo princípios
biologicamente ativos obtidos a partir de plantas, fungos ou outros animais, incluindo
o uso etnobotânico, até o isolamento de princípios ativos. Procura-se a elucidação
da estrutura dos princípios ativos, e seus mecanismos de ação de biologicamente
ativos. Conceitua-se Farmacognosia como "o estudo das matérias-primas e
substâncias com propriedades terapêuticas obtidas de vegetais, animais ou por
fermentação a partir de microrganismos“ onde Cordell (1993) resume a
Farmacognosia numa simples frase, "O estudo dos produtos naturais biologicamente
ativos" (CORDELL, 1993).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (WHO), cerca de 60-80% da
população dos países em desenvolvimento, utiliza de plantas como alternativa de
tratamento para cuidar de sua saúde, devido à pobreza e falta de acesso à medicina
alopática (WHO, 2006).
Além do uso pela medicina tradicional, as propriedades terapêuticas das
plantas medicinais também despertam interesse entre as indústrias farmacêuticas.
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1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Segundo dados do Departamento de Comércio Exterior, em 1998 o Brasil
tornou-se um bom fornecedor de matéria prima exportando mais de 2.842 toneladas
de plantas medicinais, sendo os estados do Paraná, São Paulo, Bahia. Maranhão,
Amazonas, Pará e Mato Grosso os maiores exportadores, para diferentes países
europeus, asiáticos e EUA. A indústria de produtos fitoterápicos tem apresentado,
em geral, um crescimento anual de 25% em seus lucros (FETROW & AVILA, 2000).
Além disso, o desenvolvimento de um fitoterápico pode ser obtido com custos
menores que um fármaco sintético (YUNES et al., 2001).
Nos EUA, por exemplo, aproximadamente 25% das prescrições contêm
compostos originados de plantas (YAMADA, 1998). Em Cuba, a rica flora do país
permite vasta tradição no uso de fitoterápicos (VIZOSO et al., 2002). Na Alemanha
vem mantendo sua posição como um dos s maiores mercados mundiais de drogas
de origem vegetal (FETROW & AVILA, 2000).
No Brasil em 2000 as vendas de fitoterápicos aumentaram 15%, em
comparação a 4% dos medicamentos sintéticos (IBAMA, 2003).
Conceitos e legislação aplicados as plantas medicinais
Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), órgão
regulamentador e responsável pela normatização dos medicamentos fitoterápicos no
Brasil definiu-se como fitoterápico “todo medicamento tecnicamente obtido e
elaborado, empregando-se exclusivamente matérias-primas vegetais com finalidade
profilática, curativa ou para fins de diagnóstico, com benefício para o usuário”.
(ANVISA, 1995).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) caracterizou como planta
medicinal, sendo “todo e qualquer vegetal que possui, em um ou mais órgãos,
substâncias que podem ser utilizadas com fins terapêuticos ou que sejam
precursores de fármacos semi-sintéticos. Fitofármaco seria a substância ativa,
isolada de matérias-primas vegetais ou mesmo, mistura de substâncias ativas de
origem vegetal (SCHENKEL et al.,2000).
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1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Esta diferença entre fitoterápico e planta medicinal é caracterizada pelo
conhecimento da eficácia e dos riscos do seu uso, assim como pela reprodutibilidade
e constância de sua qualidade (SCHENKEL et al.,2000).
No Brasil, a legislação vem sendo modificada em relação aos
medicamentos fitoterápicos. A Portaria n. 6 de 1995, estabeleceu normas e diretrizes
para a regulamentação destes medicamentos para as indústrias. Em 2004, uma
nova portaria intensificou os requisitos para a seguridade destes fitos medicamentos
(ANVISA 2004).
O reconhecimento da farmacopéia tradicional, como alternativa de
tratamento acessível e eficiente, comparado aos tratamentos com medicamentos
alopáticos, tornou a sociedade consumidora mais exigente e até mesmo consciente
de que, em muitos casos, os medicamentos alopáticos são de alguma forma
baseados em produtos naturais ou derivados de diferentes espécies vegetais (
VEIGA et al., 1997).
Neste sentido, 50 % das novas moléculas introduzidas no mercado
farmacêutico, entre 1981 e 2000, foram oriundas de produtos naturais, ou análogos
(NEWMAN et al., 2000).
Mundialmente 11% dos 252 medicamentos considerados essenciais pela
OMS são derivados exclusivamente de plantas (RATES, 2001), sendo de grande
valia estudos com plantas medicinais e a identificação de substâncias bioativas, para
a saúde pública.
A organização Internacional de Conservação da Natureza, a International
Union for Conservation of Nature and Natural Resourses (IUCN) e a World Wide
Found for Nature (WWF) divulgou que cerca de sessenta mil espécies de plantas
superiores estarão extintas, até a metade desse século.
Fato que demonstra que muitas dessas espécies vegetais poderão ser
perdidas antes mesmo de terem suas propriedades químicas e biológicas estudadas
(ETKIN, 1998).
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1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.2 FAMILIA FABACEAE ( LEGUMINOSAE)
No Brasil, a maior parte das espécies da família Fabaceae é conhecida por
ser utilizada com finalidade terapêutica e como alimento. Desse modo, há uma
crescente necessidade de mais estudos fitoquímicos com essas espécies (DAVID &
SANTOS, 2003). As plantas Cassia alata e Cajanus cajan pertencem a família
Fabaceae, que possui distribuição cosmopolita, e possui 3 subfamílias, 650 gêneros,
e aproximadamente 1800 espécies, representando uma das maiores famílias das
Angiospermas e uma das principais no sentido econômico, sendo que no Brasil há
registro de 200 gêneros e 1500 espécies ( IRWIN, 1964; SILVA, 1976; BASTOS,
1996).
1.2.1. A PLANTA Cassia alata
A planta Cassia alata utilizada neste estudo pode ser caracterizada
segundo alguns aspectos referentes a sua nomenclatura e origem, bem como sua
utilização na medicina popular e sua características referentes ao seus compostos
ativos e suas aplicabilidades em diferentes estudos.
FIGURA 2. Foto da flor da Cassia alata (fotógrafo H. Joseph).
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1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
NOMES E ORIGEM
A Cassia alata descrita por Linneus em 1780, (Linn) também conhecida
pelo sinônimo cientifico Senna alata (L.) Roxb. (Fig. 2) pertence a família Fabaceae,
subfamília Caesalpinioideae. Nativa da América Central é originária e cultivada
desde os Estados Unidos da América até a Argentina (IRWIN & BARNEBY, 1982).
Introduzida em diversos países tropicais, estabeleceu-se com sucesso, possuindo
mais de 500 espécies descritas (JOLY, 2002). Conhecida popularmente como
candelabro, fedegoso, fedegoso gigante, sene ou mata pasto, está distribuída em
todo o território brasileiro (JOLY, 2002).
COMPOSIÇÃO QUIMICA
HAUPTMANN
&
NAZARIÔ,
em
1950
foram
uns
dos
primeiros
pesquisadores a avaliar o extrato metanólico e aquoso das folhas da espécie Cassia
alata, relataram a predominância de antraquinonas e o metabólito Rhein. Os
compostos químicos predominantes em diferentes partes dessa plantas são as
antraquinonas e flavonóides, bem com alcalóides, lecitinas, saponinas, glicosídeos e
estrogênios (VILLAROYA & BERNAL-SANTOS 1976; SMITH et. al. 1979;
LEEUWENBERG, 1987;CLEMENT et al., 2007).
O óleo essencial das folhas da C. alata, quando submetido a cromatografia
gasosa (GC/MS) possui diferentes componentes: 23.0% linalol, 8.6% borneol, 9.3%
também chamado de álcool bornílico, penta decanol e 5.9% de α-terpineol
(AGNANIET et al., 2005). As substâncias rhein e Aloe-emodina, camferol, quecertina
também foram reportadas nos trabalhos de MORIYAMA (2001, 2003) e FERNAND
et al.
(2008), estes compostos estão representados a sua formulação química
abaixo
.
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1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Rhein
Aloe-emodina
FERNAND et al., (2008), isolaram compostos menores como cássia
xantonas, dalbergia e 2,6-dimetox benzoquinona por cromatografia líquida de alto
desempenho acoplada a luz ultravioleta (HPLC-UV) e espectrometria de massa
APCI- MS
USO MEDICINAL TRADICIONAL
Diferentes autores reportam a sua utilização para tratar diversas
enfermidades (SINGH, 1986). Suas folhas são usadas para tratar problemas no
sistema digestório como, constipação, problemas hepáticos (GIRÓN et al., 1991;
CLEMENT et al., 2007), e tratar infecções estomacais (GIRÓN et al., 1991;
MAGASSOUBA et al., 2007). Também são utilizadas para casos de dermatites
micóticas
e
herpéticas
(GUPTA
&
SINGH,
1991;
GIRÓN
et
al.,
1991,
LONGUEFOSSE & NOSSIN, 1996; AJIBESIN et al., 2008), para combater Malária
(GIRÓN et al., 1991), além de ser utilizado como anti-séptico e contra problemas de
diabete (HENNEBELLE et al. 2009), como tônico (KIRTIKAR & BASU, 1975).
Atualmente, existem diferentes patentes registradas para extratos da
Cassia alata por pesquisadores americanos e europeus, para aplicabilidades
cosméticas, antifúngicas e antibacterianas, sendo utilizadas partes diferentes da
planta para o isolamento de compostos ativos como camferol, o a que vêm fortalecer
estudos mais aplicados com plantas no intuito de verificar diferentes utilizações na
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indústria farmacêutica e cosmética (WAKABAYASHI et al., 2002 ; BARDEY et al.,
2004). Essas substâncias são de interesse para a indústria farmacêutica dada sua
atividade antiinflamatória e antifúngica (PALANICHAMY & NAGARAJAN, 1990).
ATIVIDADE ANTIBACTERIANA, ANTIFÚNGICA, ANTIINFLAMATÓRIA E
ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS E COMPOSTOS ISOLADOS DA C. alata
Vêm sendo relatado por alguns autores o potencial antifúngico e
antibacteriano (IBRAHIM & OSMAN, 1995; RANGANATHAN & BALAJEE, 2000;
SOMCHIT et al., 2003; CHOMNAWANG et al., 2005). A atividade de antraquinonas,
em especial Aloe-emodina foi relatado a eficácia como antifúngico para dermatófitos
(Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes e Epidermophyton floccosum)
por FUZELLIER et al., (1982) e PALANICHAMY et al. (1990).
ALI-EMMANUEL et al., (2003) testou a eficiência dos extratos nas lesões
crônicas e agudas de dermatofitose bovina (Dermatophilus congolensis), utilizando
extratos etanólicos das folhas junto com as folhas de Lantana camara e Mitracarpus
scaber no tratamento das lesões. Os resultados mostraram diminuição das lesões
severas e a erradicação total das lesões menos graves.
ALI et al.(1999) analisaram a eficiência dos extratos metanólico e extratos
hexânicos, em inibir o crescimento de dez
microorganismos (Bacillus cereus,
Corynebacterium diptheriae, Escherichia coli, Shigella sonii, Proteus mirabilis,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Shigella boydii., Staphylococcus
aureus, Staphylococcus pyogenes) e verificaram em seu trabalho que o extrato
metanólico foi mais eficiente, inibindo 100% o crescimento do Staphylococcus
pyogenes e Corynebacterium diptheriae.
KHAN et al., (2001), analisaram a atividade antimicrobiana de vários
extratos da planta (flores, folha, casca do caule e casca da raiz) em 28 microorganismos (Bacillus cereus, B. coagulans, B. megaterium, B. subtilis, Lactobacillus
casei, Micrococcus luteus, M. roseus, Staphylococcus albus, S. aureus, S.
epidermidis, Streptococcus faecalis, S. pneumoniae, S. mutans, Agrobacterium
tumefaciens, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes,
Escherichia coli,
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1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Proteus mirabilis, P. vulgaris,
Pseudômonas aeruginosa, Salmonella typhi, S. typhymurium, Serratia marcescens e
Trichomonas vaginalis), mostrando mais eficiência nos extratos das folhas e casca
no teste de difusão em disco.
Entretanto, IBRAHIM & OSMAN (1995) e PALANICHAMY et al., (1990)
utilizando extratos etanólicos das folhas desta planta, não verificaram inibição do
crescimento de bactérias (Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus ATCC
25922, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli (entopatogênica) , Escherichia
coli ATCC
25923, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae);
leveduras (Candida
albicans, Cryptococcus
neoformans, Rhodotorula rubra), e
fungos (Fusarium solani, Aspergillus niger, Cladosporium werneckii e Penicillium
sp.). Foi verificada a ação fungicida para dermatófitos (Trichophyton mentagrophytes
var. interdigitale, Trichophyton rubrum,
Microsporum
canis
e Mcrosporum
gypseum).
MORIYAMA et al., (2003) avaliaram a atividade antiinflamatória dos
extratos das folhas de C. alata utilizando ensaios com células de ratos Wistar. Em
seus estudos observaram a inibição da entrada da concanavalina A, 5-lipooxigenase
e (COX-1 e COX-2), mostrando que o extrato inibe a coagulação plaquetária.
PANICHAYUPAKARANANT & KAEWSUWAN (2004) também acharam
9,99) nos extratos das folhas e flores de C. alata, utilizando
atividade oxidante (ED
50
o ensaio de DPPH.
SUGIHARA et al., (1999) mostraram
que o camferol, um
metabólito secundário, possui alta atividade antioxidante. Desta forma, devido à
concentração de camferol ser maior na C. alata torna-se promissora a utilização
desses extratos em doenças relacionadas aos danos vasculares.
Para outras espécies do gênero Cassia (C. occidentalis, C. fistula, C.
sophera, C. italica e C. pumila) também foram relatadas atividade ansiolítica (ALI et
al., 1997) além de antiinflamatória e hepato-protetora (JAFRI et al., 1999).
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1.2.2. A PLANTA Cajanus cajan
A planta Cajanus cajan também está caracterizada segundo alguns
aspectos referentes a sua nomenclatura e origem, a utilização na medicina popular e
alimentícia, seus compostos ativos e suas aplicabilidades em diferentes estudos.
FIGURA 3 : Foto do feijão de Cajanus cajan (www. tropicalforages)
NOMES E ORIGEM
A espécie Cajanus cajan (L.) Millsp1900, (Fig. 3 A e B e Fig. 4) também é
conhecida por seus sinônimos Cajanus bicolour (DC), Cajanus indicus (Spreng),
Cajanus flavus (DC) e Cytisus cajan (L.) [basionimia]. Ela é conhecida popularmente
como guando, feijão-andu, andu, feijão guandu, guandeiro (Brasil), quinchoncho
(Venezuela), frijol de árbol (México) ou Cumandái (Paraguai).
Dentro da
classificação botânica está inserida na família Fabaceae (alt. Leguminosae)
subfamília Faboideae, tribo Phaseoleae subtribo Cajaninae, gênero Cajanus.
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Originaria da África do Sul, está bem distribuída no território brasileiro, e
pode ser encontrada também em outros países como Argentina, México, China,
Cuba, Haiti, Índia, Malásia e Peru (SALUNKHE et al.,1986). Possui ampla adaptação
a diferentes ambientes. São espécies arbustivas, com flores amarelas ou amareloavermelhadas, folhas trifoliadas, preferindo os climas quentes e úmidos, resistente à
seca e ao frio (NENE et al., 1990).
FIGURA 4: Foto da flor do Cajanus cajan (André Benedito)
COMPOSIÇÂO QUIMICA
LIN et al., (1990) e DUKER-ESHUN et al., (2002) avaliaram os constituintes
químicos da planta Cajanus cajan, mostrando que é constituída principalmente por
compostos polifenólicos, especialmente flavonóides, confirmado posteriormente por
ZU et al., (2006) e luteína e epigenina (FU et al., 2006, 2008).
USO MEDICINAL TRADICIONAL
Esta planta é utilizada na medicina popular para o tratamento de diabetes,
disenteria, hepatite e como antipirético (NENE et al., 1990; GROVER, et al., 2002),
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1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
contra afta e malária (LI et al., 2001) e em casos de doenças cardiovasculares
(GHOSH & BISWAS, 1973).
Esta planta também usada na alimentação humana, sendo nestes casos
utilizado os grãos, que são fonte protéica, de cálcio, ferro, manganês e fósforo.Na
alimentação animal onde é utilizada, é chamada de verde picado, fenação, silagem
e pastejo, e também usada como adubo devido a sua capacidade de fixar o
nitrogênio (SEIFFERT & THIAGO, 1983).
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E OUTRAS APLICAÇÕES
RAO et al., (2000), experimento, avaliaram fatores em respostas ao
estresse oxidativo em plantas de C. cajan expostas às altas concentrações dos
metais zinco (Zn) e níquel (Ni), e verificaram que os íons dos metais induziram a
altas concentrações enzimáticas de superóxido dismutase, alterando concentrações
enzimáticas processos metabólicos, mas mostrando
que a planta possui
constituintes com capacidade antioxidantes, que a protegeram dos danos oxidativos
pelo estresse causado por estes metais.
Anteriormente RAO & SRESTY, (2000) verificaram as alterações das ultraestruturas das células, com a mobilização e translocação de suas reservas devido a
exposição aos metais.
WU et al., (2009) analisaram o potencial antioxidante dos extratos aquoso e
etanólico das folhas e diferentes frações de flavonóides (ácido cajaninstilbene,
pinostrobine, vitexine e orientine) com ensaio DPPH (ensaio fotocolorimétrico - 2,2difenil-1-picril-hidrazila) mostraram alta atividade antioxidante para as frações ácido
cajaninstilbene e orientine.
As frações etanólicas foram mais eficientes para análise de flavonóides
totais. ESPOSITO AVELLA et al., (1991) submeteu
ratos hiperglicêmicos ao
tratamento com extrato aquoso de folhas e obteve diminuição dos níveis de glicose.
Constatado posteriormente por AMALRAJ & IGNACIMUTHU (1998).
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1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.3. POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE PRINCÍPIOS ATIVOS
A biotecnologia é baseada na busca e descoberta de recursos biológicos
industrialmente exploráveis, que tem em seu ápice o desenvolvimento de um
produto comercial ou processo industrial (BULL et al., 2000).
Avanços científicos e tecnológicos nos últimos anos, desencadeados pelos
avanços em biologia molecular, genômica e bioinformática, vem proporcionando a
exploração de recursos biológicos (BRUGGEMAN et al.,1998; BULL et al., 2000).
Na biotecnologia as forças indutoras de desenvolvimento são a demanda
econômica, direcionada pela indústria, políticas nacionais e internacionais, e a
promessa de desenvolvimento industrial sustentável e utilização de recursos
renováveis, ‘tecnologia limpa’ (BULL et al., 1998).
Visando a prospecção e a validação terapêutica de novas substâncias que
potencialmente possam colaborar no tratamento de doenças, estudos vêm sendo
realizados na perspectiva de achar novos compostos mais eficientes, e transformar
estas novas descobertas (moléculas) em um produto aplicável e com a possibilidade
de sua patente (FARNSWORTH et al., 1985).
A identificação dos constituintes químicos de uma planta medicinal constitui
um passo indispensável para a compreensão do mecanismo de ação do princípio
ativo. Aproveitado o conhecimento empírico da medicina popular, na escolha de
plantas, que possam ter compostos promissores, estes conhecimentos vêm sendo
um ótimo indicativo de espécies de plantas com potentes bio-ativos (ELISABETSKY,
2001; HOLETZ et al., 2002).
Atualmente vêm se investigando antioxidantes naturais, como agentes
protetores contra diversas doenças, principalmente a neurodegenerativas (MACHLIN
et al., 1987; YEN et al., 1995; RICE-EVANS et al., 2001).
As enzimas ou compostos antioxidante produzidos pelas plantas atuam
como agentes protetores celulares e representam um importante papel contra
espécies reativas de oxigênio (MACHLIN et al., 1987; CAI et al., 2004; BAYLIAK et
al., 2006).
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1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.3.1 ESTRESSE OXIDATIVO E DEFESAS ANTIOXIDANTES
RADICAIS LIVRES
Para tentar compreender o potencial antioxidante das plantas, precisamos
resgatar alguns conceitos e entendimentos dos radicais livres. Que são moléculas
produzidas continuamente endogenamente durante os processos metabólicos e
estão muito relacionados ao mecanismo de envelhecimento celular (HARMAN,
1995).
Em organismos aeróbicos a produção de radicais livres podem ocorrer em
diferentes etapas do metabolismo e principalmente durante a transferência de
elétrons no processo de respiração intracelular,mais precisamente na mitocôndria
(HALLIWEL & GUTTERIDGE, 2000).
Os radicais livres são moléculas orgânicas e inorgânicas, molecular mente
são átomos que contêm um ou mais par de elétrons que não estão emparelhados na
última camada quântica eletrônica. Este fato de existir uma única molécula
desemparelhada, classifica–o sendo um radical livre, que lhe confere alta reatividade
química, como agente oxidante pela tendência em adquirir o segundo elétron para
estabilizar o seu ultimo orbital (HALLIWELL et al., 1995)
ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (ERO)
Apesar do oxigênio (O2) ser uma molécula extremamente importante na
manutenção da vida e do metabolismo celular, 95% transforma-se em energia e 5%
e transforma em espécies reativas de oxigênio (HALLIWELL, 2002). Devido à
molécula de O2 ser altamente reativa, pode formar compostos quimicamente reativos
as ERO.
As ERO são moléculas altamente instáveis e atuam na transferência de
elétrons em várias reações bioquímicas, onde estão incluídos o: ânion superóxido
(O2●-); o radical hidroxila (OH●); o radical hidroperóxido (HO2●); o radical óxido nítrico
17
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
(NO●); e o radical dióxido de nitrogênio (NO2●); o radical alcoxil (RO); o radical
peroxil (ROO); o radical peroxinitrito (ONOO) (JAMIESON et al., 1994).
O ácido hipocloroso (HOCL), o oxigênio singlete (1O2), peróxido de
hidrogênio (H2O2) e o ozônio (O3) não são considerados radicais livres. O H2O2 não
possui elétrons desemparelhados na ultima camada, mas por participar da reação
que produz OH● e H2O2 mesmo não sendo um radical livre, atua como um
intermediário de reativos de oxigênio (HALLIWELL, 2001).
O H2O2 pode migrar para áreas importantes da célula, alterando a
conformação bioquímica (IZAWA et al., 1995), também está envolvido na resposta
inflamatória, sendo produzido extracelularmente como parte da resposta imunitária
inata, através da dismutação do anion superóxido, produzido via enzimática pela
enzima NADPH oxidase (HALLIWELL, 2001).
Em decorrência da desestabilização na ultima camada de elétrons do
oxigênio (O2), formando desta maneira, radicais O2●- ; H2O2 e OH● inseridos na
ativação de endonucleases podem gerar lesões em ácidos nucléicos bem como
alterando as proteínas (HALLIWELL, 2001).
Existem espécies reativas de nitrogênio (ERN) que participam da estrutura
dos radicais livres como oxido nítrico (NO) (CANTERLE, 2005). O radical peroxil é
um peróxido orgânico e reage com biomoléculas igualmente como o radical ٠OH,
pode ser formado pela decomposição de peróxidos orgânicos (ROOH) (HALLIWELL,
2001).
A difusão do radical OH●, está relacionada diretamente com seu tempo de
reação, onde é facilmente formado a partir do H2O2, pela reação de Fenton,
considerado altamente reativo em sistemas biológicos (FRIDOVICH, 1998). Um
sistema contendo H2O2 e um sal de Fe (II) é capaz de oxidar diversas moléculas
orgânicas, tendo sido o pesquisador Henry Fenton, o primeiro a notar seu
comportamento frente à amostras de ácido tartárico.
A oxidação de moléculas orgânicas pelo sistema de Fenton, onde diversas
espécies oxidantes, entre elas estão envolvidas, principalmente o radical hidroxil,
conforme a equação 1:
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Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A reação de Fenton ocorre quando o radical hidroxil é formado no momento
que H2O2, reage com os íons de ferro (Fe) e cobre (Cu). Atuando paralelamente à
reação de Fenton, traços de Fe (III) podem reagir com peróxido de hidrogênio
especialmente se estiverem ligados a certos quelantes, embora esta seja uma
reação mais lenta que aquela com Fe(II), conforme a equação 2:
Na reação de Haber-Weiss, os íons de metais podem catalisar a reação
entre o H2O2, e os superóxidos (SCHNEIDER et al., 2004).
ESTRESSE OXIDATIVO
O estresse oxidativo termo utilizado genericamente para associar estresse
celular devido a geração excessiva de ERO em decorrência de algum desequilíbrio
no sistema celular (CYRNE et al., 2003).
E existências de diferentes fontes de ERO advêm de diferentes meios,
sendo estes endógenos ou exógenos (Fig. 5). Nas células também pode ocorrer a
produção de espécies reativas de oxigênio nos diferentes compartimentos celulares
como mitocôndrias, reticulo endoplasmático, membrana plasmática, citosol e
peroxissomos (ARUOMA, 1999).
As ERO podem induzir danos nas biomoléculas, em ácidos graxos
insaturados podem ocorrer a lipoperoxidação levando a quebra da cadeia carbônica
e formação de aldeídos (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1990), sendo que as
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Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
proteínas podem sofrer oxidação e agregação protéica, e quebra de cadeias nos
aminoácidos (HOFFMANN & MENEGHINI, 1979).
Na mitocôndria a formação de ERO pode alterar o complexo I - NADHubiquinona e o complexo III - citocromo c, devido à perda natural de um elétron que
ocorre nos complexos I e III da cadeia respiratória e no reticulo endoplasmático liso,
quando ocorre a biotransformação de xenobióticos e a metabolização de compostos
endógenos onde temos a formação das ERO (GRALLA & KOSMAN, 1992).
A cadeia respiratória é a maior fonte de geração das ERO, estando a
molécula do DNA mitocondrial (DNAmt) vulnerável aos danos mediados por estas
moléculas, sendo a mitocôndria relacionada à carcinogênese devido ao seu papel na
sinalização para o processo de apoptose através da geração de ERO (BIRCHMACHIN, 2006).
FIGURA 5: Fontes geradoras das ERO (modificado de VAN DER HAGEN et al. 1993).
LIPOPEROXIDAÇÃO
Os componentes celulares estão continuamente expostos a diferentes
ERO, sendo a membrana celular a mais afetada pela peroxidação lipídica, onde
ocorre a alteração estrutural da membrana, afetando sua permeabilidade, alterando
as trocas iônicas e a liberação das organelas, e ocorrendo a formação de produtos
20
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
citotóxicos que podem ocasionar a morte celular.
A peroxidação lipídica é o
processo através do qual as ERO agridem os ácidos graxos poliinsaturados dos
fosfolipídeos das membranas das células, desintegrando-as e permitindo, desta
feita, a entrada dessas espécies nas estruturas intracelulares (HALLIWELL &
GUTTERIDGE, 1989).
A fosfolipase, ativada pelas espécies tóxicas desintegra os fosfolipídeos,
liberando os ácidos graxos não saturados resultando a ruptura das membranas
celulares (bombas NA/K e Ca/Mg) e ate mutações do DNA (HALLIWELL &
GUTTERIDGE, 1989).
Os peróxidos lipídicos possuem poder de ação maior do que as outras
espécies tóxicas primárias de O2 (O2· -, H2O2, OH·, O2), atingindo facilmente alvos
mais distantes. A lipoperoxidação deve ter também, um papel muito importante na
proliferação celular, especialmente em células tumorais. Há autores que sugerem
que os produtos da lipoperoxidação estão envolvidos no controle da divisão celular,
sendo que a peroxidação de lipídeos está inversamente relacionada com o
crescimento tumoral (GONZALEZ, 1992).
O ferro é liberado na peroxidação lipídica da membrana e como
conseqüência ocorre hemólise, como mostra a FIGURA 6 (COMPORTI, 2002).
FIGURA 6: Formação de radicais livres e mecanismos antioxidantes biológicos.
Fonte: http://quimica.fe.usp.br/global/ca8/radica.htm
21
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
A
lipoperoxidação
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
também
esta
associada
a
mecanismos
de
envelhecimento celular e a doenças como câncer, o radical hidroxila é
freqüentemente reconhecido como a espécie iniciadora da peroxidação lipídica
(GUTTERIDGE, 1988).
DOENÇAS ASSOCIADAS AOS RADICAIS LIVRES
Sabemos que alguns metais pesados também podem ocasionar estresse,
dito que sua presença proporciona maior numero de espécies reativas de oxigênio
(O2, H2O2 e OH) a qual afetam vários processos celulares, bem como o
funcionamento da membrana celular (FOYER & LELANDAIS, 1996).
Os metais como, por exemplo, Cd, Pb, Hg, Cu, Zn e Ni em altas
concentrações podem afetar o crescimento e o seu desenvolvimento nas plantas
(WOOLHOUSE, 1983).
Assim com o estresse oxidativo, a peroxidação lipídica é causada
inicialmente pelo radical hidrogênio, causando danos nas para macromoléculas,
alterando seus receptores de membrana (HALLIWEL, 2001).
Este desequilíbrio na produção e nos sistemas de defesa contra as ERO
estão entre os fatores que predispõe a ocorrência de diversas patologias como
doenças cardiovasculares, artrite reumatóide, hipertensão, arteriosclerose, lesão por
isquemia, doenças pulmonares como asma e fibrose, lesão hepática (alcoolismo),
lesão renal, diabetes Mellitus, Síndrome de Down e doenças neurodegenerativas
como Parkinson, envelhecimento celular, aumento da expressão e replicação do HIV
e câncer (CROSS et al., 1987;LEE et al., 2002, ).
Lesões teciduais associadas a sangramentos podem liberar hemoglobina e
ferro, que também podem estar favorecendo reações oxirredutoras, como tumores e
artrite reumatóide (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1990).
Apesar das ERO estarem relacionadas a diversas doenças, sua formação
às vezes serve como defesa contra infecções, em presença de bactérias ocorre o
estimulo das células, mais precisamente dos neutrófilos para produzirem espécies
reativas para combater os microorganismos (HATHERILL et al., 1991).
22
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
ANTIOXIDANTE
O termo antioxidante é utilizado para definir o conjunto sistemas
enzimáticos ou não enzimáticos que protegem as macromoléculas, estruturas
celulares, previne a oxidação dos ácidos nucléicos e lipídios e inibem a peroxidação
lipídica. Os antioxidantes podem ser naturais, presentes no organismo e compostos
sintéticos com atividade antioxidante (HALLIWELL, 2001).
1.3.2. SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTES ENZIMÁTICOS E NÃO
ENZIMÁTICOS
As ERO podem desencadear processos degenerativos para as células,
sendo o papel dos antioxidantes é neutralizar este efeito através de algumas
enzimas (HALLIWELL, 2001). As existências de mecanismos de defesa, sistemas
antioxidantes são responsáveis pela regulação e a modulação dos níveis adequados
de defesa contra as espécies reativas de oxigênio (PACKER et al., 1999).
Em geral, a resposta ao estresse é caracterizada pela expressão de vários
genes que são induzidos, por sinais das alterações como estresse osmótico e
estresse oxidativo. Quando ocorre estresse oxidativo a nível celular, são enviados
sinais para sítios específicos de genes que codificam a regulação das enzimas
antioxidante, aumentando a sua produção, e a proteção celular. (SCHULLER et al.,
1994).
Os sistemas de reparo agem como defesa de forma ordenada para tentar
manter a integridade celular, acionando mecanismos que tentam prever, interceptar
e reparar os danos causados pela formação de ERO. A existência de diferentes vias
de reparo são especificas para cada tipo de dano (FRIEDBERG et al., 1995).
O aumento dos níveis das ERO consiste na ativação de enzimas préexistentes e na indução da expressão de genes de proteção (COSTA & FERREIRA,
2001). As existências de sistemas de defesa podem ser caracterizadas por
enzimáticos e não enzimáticos (Fig. 7).
23
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
MECANISMO DE DEFESAS ANTIOXIDANTES
SISTEMAS ENZIMATICOS
(SOD, CAT, APx , GPx)
SISTEMAS NÃO ENZIMATICOS
( vitaminas, carotoneos, glutationa)
FIGURA 7: Esquema representativo dos mecanismos de defesa e fontes de EROS
(Bioquímica, 2005)
DEFESAS ANTIOXIDANTES ENZIMÁTICOS
O sistema de defesa antioxidante teve como um dos percussores o
entendimento da enzima SOD, por Fridovich na década de 60 (McCORD &
FRIDOVICH, 1969).
Para o funcionamento dos sistemas antioxidantes, são necessárias as
enzimas que atuam contra danos celulares, atuando como detoxificadora do agente
antes que ele cause lesão, sendo as enzimas superóxido dismutase (SOD),
catalases (CAT), ascorbato peroxidase (APX), e glutationa peroxidase (GPX)
responsáveis por este trabalho (MICHIELS et al., 1998).
24
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Enzima Superóxido Dismutase (SOD)
Uma metalo-enzima, que está diferenciada em diferentes tipos de
isoenzimas, presentes em muitos organismos e abundante em células aeróbicas. É
a primeira enzima requisitada para atuar no mecanismo de proteção – sistema
antioxidante (MCCORD & FRIDOVICH, 1969), onde os radicais superóxidos,
presentes em diferentes compartimentos celulares, são catalisados pelas enzimas
SOD que destrói os radicais O2●- convertendo-o em oxigênio e H2O2 .
As SOD estão representada por três classes: (Mn/SOD; Fe/SOD;
Cu/ZnSOD), as SODsCu/Zn são abundante no citosol de células eucariótas;
SODs/Mn com manganês são abundantes nas plantas, animais, bactérias e
leveduras; FeSOD encontrada em bactérias, algas, plantas superiores e na matriz
celular (MICHIELS et al., 1998).
Em células de levedura os mutantes de sod1 que são deficientes nesta
enzima, apresentam problemas de crescimento em condições aeróbias (que codifica
para a superóxido dismutase citossólica – Cu,Zn-SOD (SHINYASHIKI et al., 2000).
As mutantes SOD2 são hipersensíveis ao oxigênio e crescem mal ou não
crescem em fontes de carbono não fermentáveis, que codifica para Mn-SOD superóxido dismutase mitocondrial, uma molécula considerada sensor de oxigênio
em leveduras (KWAST et al., 1999).
O duplo mutante sod1 sod2, apresentam uma característica singular em
que os níveis de ferro são superiores ao encontrado para as linhagens selvagens em
condições aeróbias de crescimento (GRALLA & VALENTINE, 1991).
O dano induzido, por agentes oxidantes como o H2O2, por exemplo,
compara-se a sensibilidade de mutantes deficientes em enzimas como SODs e
CATs e GSHs e enzimas antioxidantes como as linhagens selvagens (WTs), que
possuem este tipo de defesa em seu gene, o resultado da viabilidade celular
mostrará o efeito da substância teste, como protetor, efeito antioxidante ou
genotóxico. (HENRIQUES et al., 2001).
25
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Enzima Catalase (CAT)
Está presente em organismos superiores. Em S. cerevisiae são estudados
os genes, isoenzimas conhecidas cat 1 e cat 2 têm a função de remover o H2O2,
através da β-oxidação de ácidos graxos, localizados nos peroxissomas e no citosol,
convertendo as moléculas em água (H2O) e oxigênio (O2) e sendo sua atividade
dependente diretamente do NADPH (COHEN et al.,1998; MICHIELS et al.,1998).
São eficientes, tem um papel de proteger contra danos oxidativos, as
leveduras mutantes ctt1 e cta1 são sensíveis ao estresse pelo peróxido de
hidrogênio, uma citosólica e outra perixossomal (GRALLA & KOSMAN, 1992), genes
induzidos por estresse a ctt1 codifica para catalase citosólica e UBI4, o qual codifica
para ubiquitina, são reprimidos por glicose, outros genes do mecanismo
antioxidantes são regulados por fatores de transcrição sensíveis à fonte de carbono
(WERNER-WASHBURNE et al., 1993).
Enzima Ascorbato Peroxidase (APX)
Uma hemeproteína que possui um papel fundamental na célula,
transformando a molécula do H2O2 em dehidroascorbato e água através da reação
do ascorbato (DIZDAROGLU, 1991).
Glutationa peroxidase (GPx)
Principal defesa contra o H2O2 transformando em água e oxigênio, além de
reduzir os alquilhidroperóxido e seus respectivos alcoóis, esta enzima é encontrada
nas mitocôndrias de mamíferos, sua ação é baseada na oxidação da glutationa
(GSH), sendo que a glutationa age em ciclos entre sua forma oxidada e sua forma
reduzida. Esta enzima não esta presente em bactérias e plantas superiores, a
atividade desta enzima pode ser promovida pela suplementação de dietas com
selênio, a presença do selênio na enzima selenocisteína atua como antioxidante
(HALLIWELL, 2001)
26
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
DEFESAS ANTIOXIDANTES NÃO ENZIMÁTICOS
São moléculas que atuam como protetora nas diferentes formas de ERO,
podendo agir como quelantes de metais, seqüestradora e estabilizadora, podendo
ainda ser hidrossolúveis e lipossolúveis. (LISOWSKY, 1993; MCCALL & FREI,
1999). Podemos caracterizar em diferentes compostos como: Vitamina C, vitamina
E, carotenóides, glutationa, tocoferóis, coenzima Q10, flavonóides naturais
(MCCALL & FREI, 1999).
Glutationa (GSH) e Glutationa Redutase (GR)
Um antioxidante não enzimático que atua nas moléculas de H2O2 e O2●▬;
através da reação do ciclo Halliwel–Asada, a glutationa peroxidase também retira o
H2O2 liberado na célula. O sistema de defesa na levedura Saccharomyces
cerevisiae, apresenta algumas enzimas que atuam diretamente no sistema de
defesa antioxidante como a enzima GHS, sendo o gene GSH1 que codifica a enzima
que atua diretamente na síntese do tri peptídeo glutationa e o GSH2 codifica a
glutationa sintetáse, tem como função proteger a célula de danos oxidativos
(LISOWSKY, 1993).
VITAMINAS
A vitamina C ou ácido ascórbico atua como quelante dos oxidantes,
produzidos na lipoperoxidação, encontrado em nosso organismo na forma de
ascorbato atua como agente redutor de metais em transição nos sítios ativos das
enzimas, o ascorbato sendo hidrossolúvel pode atuar contra a peroxidação de
lipídios de duas formas, no plasma sanguíneo agindo na prevenção da reação com
as ERO ou na restauração doando hidrogênio ao radical lipídio (ROSS et al., 1991;
McCALL& FREI, 1999).
27
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
As vitaminas A e E são caracterizadas por ser lipossolúveis, agem como
redutor de metais (Fe e Cu), neutralizam os efeitos das ERO, são consideradas
como co-fator de enzimas de reparação.
A Vitamina E é constituída por quatro tocotrienóis sendo α- tocoferol o mais
ativo eficiente inibidor da peroxidação de lipídios. Dentre os carotenóides o βcaroteno é a mais importante fonte de vitamina A, atuam no oxigênio singleto
desativando-os e também como seqüestradores de radicais peroxila, reduzindo a
oxidação do DNA e lipídios. O β- caroteno e o licopeno são os mais regeneradores
combatendo os radicais no interior da membrana (ROSS et al., 1991; McCALL&
FREI, 1999).
UBIQUINONAS
A coenzima Q10 é uma importante ubiquinona lipossolúvel, importantes
componente das mitocôndrias, atuam como antioxidantes (LAND & SWALLOW,
1970). Compostos lipofílicos atuam como redox do sistema de transporte de elétrons
na cadeia respiratória mitocondrial. As desidrogenasse oxidam os NADH e
transferem prótons e elétrons para a ubiquinonas, convertendo-as em sua forma
reduzida ubiquinol, que transfere elétrons para os citocromos. A ubiquinona atua
como antioxidante seqüestrando radicais livres (KARAGEUZYAN, 2005).
28
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.4 AVALIAÇÃO DOS PRINCÍPIOS ATIVOS DE ORIGEM EM PLANTAS
Algumas substâncias encontradas nas plantas, frutos e vegetais são
conhecidamente tóxicos como apiol, safrol, ligninas e alcalóides pirrolizidínicos, além
de terpenos e saponinas (RAVANEL et al.,1987; CAPASSO et al., 2000).
As plantas usadas como fitoterápicos carecem de um maior controle de
qualidade, uma vez que, seu potencial farmacológico pode ser desconhecido, como
o confrei (Symphytum officinale L.), tido como cicatrizante, mas possui propriedades
hepatotóxicas e carcinogênicas, pois possui alcalóide pirrolizidínico, substância
química não atropínica, produzida por determinadas plantas venenosas.
Podemos citar inúmeras espécies que são comprovadamente tóxicas como
o gênero Sinésio, jurubeba, (Solanum paniculatum L.), arnica (Arnica montana L.),
arruda (Ruta graveolens), cambará (Lantana camara L.) e ipeca (Cephaelis
ipecacuanha (Brot.) (SIMÕES, 1999; STICKEL et al., 2000).
Outra planta conhecida popularmente por “marcela” (A. satureoides) usada
no sul do Brasil para problemas digestivos VARGAS et. al, (1989) avaliaram sua
potencialidade mutagênica, e verificou que o extrato desta planta possui atividade
genotoxica pelo ensaio Salmonella/microssoma.
FERREIRA & VARGAS (1999) verificaram que os extratos de algumas
plantas usadas na medicina popular do Sul do Brasil apresentaram atividade
mutagênica.
Nesses
extratos
foram
encontrados
flavonóides,
taninos
e
antraquinonas. Na planta Aloe vera Lom., também foi observada atividade
mutagênica na linhagem TA1537, das três estudas (TA1537, TA98 e TA100).
Um estudo genotóxico com plantas nativas e tradicionais da áfrica do Sul,
escolhidas com base em conhecimentos etnobotânica da medicina tradicional,
descobriu através do método MARON & AMES (1983) atividade mutagênica para os
extratos de cinco plantas (Crinum macowanii, Diospyros whyteana, Catharanthus
roseus, Ziziphus mucronata, Combretum mkhzense) causando mutações nas
linhagens TA 98 e TA 100 em Salmonella typhimurium (ELGORASHI et al. ,2003).
MARQUES et al. (2003), analisaram o extrato hidroalcoólico das plantas
conhecidas como
“louro-de-cheiro” (Ocotea duckei), e yangambina, (Vattimo
lignana), atividade
mutagênica foi positiva para mutação nas linhagens TA97a,
29
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
TA100 e TA102. SANTOS et al., (2006), trabalharam com a planta, S. pseudoquina
que possui propriedade anti-ulcera gástrica. Os resultados mostraram que o extrato
induziu mutações gênicas e quebras no DNA e mutagenicidade positiva.
Os trabalhos citados demonstraram efeitos adversos de plantas utilizadas
na medicina popular, provenientes de diferentes localidades e características
etnobotânicas, sendo que muitos dessas apresentaram efeitos citotóxicos e
mutagênicos. Tenta avaliar com o emprego de diferentes metodologias, ensaios que
possam ajudar a ilucidar o potencial dos riscos e benefícios de princípios ativos
isolados, ouriundo de diferentes espécies de plantas bem como a caracterização
biológica dos seus efeitos colaterais, sejam intensificados para melhor entendimento
(ELBLING et al., 2005).
O aumento do consumo de algumas plantas e vegetais tem se dado devido
a descobertas sobre o seu potencial protetor para diferentes enfermidades (RICEEVANS et al., 1996, 1997, 2001).
Serão necessários muitos estudos sobre eficácia e segurança dos
compostos das plantas de modo que os benefícios do uso de novas moléculas
superem os efeitos colaterais. Sabendo-se que algumas substâncias promissoras
podem ser citotóxicas, portanto a avaliação do potencial genotóxico representa um
papel importante no desenvolvimento de novos fármacos (HARTMANN et al., 2001).
1.4.1 ENSAIOS BIOLÓGICOS
Os ensaios biológicos de toxicidade celular fornecem as primeiras
informações sobre a segurança dos novos compostos, sendo que a análise da
genotoxicidade deve ser realizada nos estágios iniciais do desenvolvimento de
novos fármacos (ELISABETSKY, 2001).
Com base nas pesquisas de genotoxicidade in vitro e in vivo as indústrias
farmacêuticas investem em novos agentes terapêuticos. Utilizando metodologias
para melhorar o potencial terapêutico e diminuir a toxicidade, modificando estruturas
ativas (SIMÕES, 1999).
30
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Ensaios biológicos têm sido empregados como ferramentas iniciais na
analise do potencial dos compostos, tais como: ensaio Salmonella/microssoma
(MARON et al.1983) ensaio genotóxico com S. cerevisiae; ensaio cometa, ensaio
com cultura de células de mamíferos V79, ensaio SOS cromoteste, testes do
micronúcleo ou aberrações cromossômicas (VAN GOETHEM et al., 1997).
Estes testes ajudam, a avaliar atividades existentes dos compostos, como
uma ferramenta preditiva do potencial antioxidante, genotóxica, citotóxica e
mutagênico dos compostos ou moléculas das plantas. O fato de ensaios in vitro e in
vivo nem sempre representarem a realidade de da assimilação de um composto e
suas vias diferentes vias de metabolização, quando comparada com a complexidade
do organismo do homem ao se expor a diferentes agente tóxicos (GOLD et al., 1998)
.
Os ensaios de genotoxicidade in vitro ou in vivo são ferramentas sensíveis
na detecção de substâncias potencialmente mutagênicas ou cancerígenas ou
xenobióticos (AMES et al., 1973a; 1973b; 1993; MARON & AMES, 1983).
Pesquisas relacionam os efeitos biológicos de infusões vegetais com,
mecanismos biológicos de proteção a mutagenicidade e a genotoxicidade a inibição
de marcadores bioquímicos, iniciadores e promotores de tumores, efeitos sobre as
enzimas, captação de metabólitos ativos de carcinógenos, e atividade antioxidante,
detectada por sua ação captadora de espécies reativas de oxigênio (KITCHIN &
AHMAD, 2003).
Sendo que as mutações gênicas atuam nas etapas da carcinogênese e
que os ensaios que detectam componentes genotóxicos permitem identificar
substâncias com risco potencial à saúde humana. Alguns ensaios mais específicos
utilizam organismos procariontes como um biomarcador de dano molecular.
(JIMÉNEZ et al., 2005)
Desde a década de 70 diversos estudos tem sido empregado utilizando o
teste de mutagenicidade com Salmonella typhimurium, também conhecido como
Salmonella/microssomo, ou Teste de Ames, é uma das metodologias mais utilizadas
atualmente para detectar substâncias genotóxicas (VARELLA et al., 2004), sendo
validado em larga escala por diversos laboratórios (MORTELMANS & ZEIGER,
2000; RIBEIRO et al., 2004).
Avalia substâncias com atividade citotóxica,
31
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
genotóxica, mutagênica e antimutagênica. Este ensaio utiliza as bactérias
Salmonella typhimurium geneticamente modificadas na avaliação do potencial dos
extratos das plantas ou ambientais de induzir mutações frente a diferentes linhagens
(AMES et al., 1973a, 1973b).
A
utilização
de
microorganismos
eucariotos,
como
a
levedura
Saccharomyces cerevisiae, são modelos consolidados para estudos genéticos e de
genotoxicidade (SCHULLER et al., 1994).
Este organismo que apresenta características fáceis de manutenção
possibilita uma investigação sistemática da expressão gênica, devido ao
seqüenciamento completo do seu genoma (cerca de 6000 genes) proporcionando
diversas informações sobre os mecanismos regulatórios, além de ser uma
ferramenta para a análise da expressão gênica (GOFFEAU et al., 1996).
Estudos que relacionam a utilização do modelo com levedura e com
estresse oxidativo, utilizando linhagens relacionadas aos danos oxidativos, são
capazes de detectar o aumento de oxidação, causado pelas ERO (CYRNE et. al.,
2003) e desencadear respostas dos sistemas de defesa antioxidante: o enzimático e
não-enzimático (SANTORO & THIELE, 1997; COSTA & FERREIRA, 2001).
Alguns conceitos são importantes como genotoxicidade, em que seu estudo
possibilita analise das alterações na base genética e considera-se mutagênica
quando há alteração na forma da estrutura físico-química do DNA, que difere de
alterações relacionadas com malformações, doenças congênitas, genéticas
degenerativas, envelhecimento celular e do corpo, e o câncer designadas
carcinogênica e teratogênica (SILVA et al., 2003).
A mutagênese, no sentido evolutivo, possibilitou a variabilidade genética
das espécies. A mutação pode ocorrer de forma aleatória, causando alterações no
DNA, devido aos processos físico-químicos, e está continuamente ocorrendo nos
organismos vivos.
A mutação pode ser definida como uma alteração do genótipo, podendo
esta ser transmitida. Diversas proteínas estão implicadas em funções específicas e
fundamentais no organismo, a versão mutada das proteínas pode, por sua vez,
originar uma doença. Alterações do material genético denominam-se por mutantes.
32
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Porem nem sempre as mutações têm efeitos drásticos, pois podem
contribuir para a evolução do organismo que sintetiza a “nova” proteína. Estas
modificações quando são deletérias ao DNA, podem levar a desenvolver diferentes
doenças como câncer e arteriosclerose (MACGREGOR, 1986).
Mutação gênica pode ocorrer devido a fatores exógenos (ambiental) ou
endógenos (erro de replicação), alterando a molécula do DNA e conseqüentemente
podendo alterar o seu funcionamento, que estão constantemente sendo corrigidas
pelos mecanismos de reparo. Na mutação pontual ha alteração de um único par de
nucleotídeos por perda, ganho ou substituição. Na mutação ou rearranjo temos
genes que translocam, invertem da sua posição inicial ou são deletados. Mutação
cromossômica ocorre uma reorganização dos cromossomos, por translocação,
inversão, ou perda/ganho de parte dos cromossomos (CARRANO & NATARAJAN,
1988; SILVA et al., 2003).
O interesse na identificação de produtos naturais ou sintéticos que possam
ter propriedades antimutagênica ou anticarcinogênica tem aumentado, pois o
conhecimento de tais produtos pode ser útil como medida preventiva para o
tratamento no combate a vários males (WATTEMBERG, 1983; RAMEL et al, 1986).
33
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.4.2 ENSAIOS BIOLÓGICOS UTILIZANDO O ORGANISMO PROCARIOTO
Salmonella typhimurium: O TESTE SALMONELLA/MICROSSOMA
As
bactérias
(Fig.8)
organismos
são
unicelulares,
procariontes,
cujo
seu
material
genético não está envolto por uma
membrana nuclear. Sua parede
celular é uma estrutura complexa,
composta
proteínas,
bicamada
por
carboidratos
e
(peptideoglicana)
lipídica
(LEHNINGER,
1986).
FIGURA 8: Colônia de bactéria S. typhimurium
Os estudos de genotoxicidade e anti-genotoxicidade com plantas têm
crescido juntamente com o aumento da sua utilização de forma terapêutica. O
interesse em comprovar a eficácia, nas diversas finalidades farmacológicas de
diferentes plantas. Propondo a retomada da importância de se analisar suas
propriedades farmacológicas, e verificando a possibilidade de estarem causando
alterações no DNA (MARQUES et al. 2003;JIMÉNEZ et al., 2005).
O ensaio Salmonella/microssoma ou Teste de Ames foi desenvolvido por
Bruce Ames e colaboradores na década de 70, padronizado internacionalmente vem
a ajudar a responder estas questões sobre a potencialidade dos compostos
utilizados por nos (MORTELMANS & ZEIGER, 2000).
Utilizando a bactéria Salmonella typhimurium, modificada geneticamente,
este ensaio biológico avalia atividade mutagênica e antimutagênica de diferentes
substâncias puras, misturas complexas e amostras ambientais (MARON & AMES,
1983).
O teste de mutação reversa em Salmonella typhimurium – Teste de Ames
fornece a possibilidade de analisar se a substância teste induz mutações gênicas
34
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
(AMES et al., 1973; MARON & AMES 1983). Este ensaio Salmonella/microssoma
detecta compostos mutagênicos indiretos, que quando metabolizados, geram
compostos oxidados que são genotóxico (MORTELMANS & ZEIGER, 2000).
A maioria das linhagens bacterianas utilizadas no teste apresenta
características que as tornam mais sensíveis para detecção de mutações, sítios
específicos no DNA. Na presença de agentes mutagênicos, a bactéria reverte seu
caráter de auxotrofia para a síntese de histidina e passam a formar colônias em meio
desprovido desse aminoácido.
A habilidade de sintetizar histidina e de crescer no meio de cultura
específico indicam que a substância teste, provocou mutações nas bactérias,
considerada então mutagênica ou e genotóxica (MARON & AMES, 1983;
MORTELMANS & ZEIGER, 2000), e a especificidade de cada linhagem fornece
informações sobre os tipos de danos causados pelo agente mutagênico em teste
(AMES et al., 1973).
As cepas detectam mutações de ponto (ocasionadas pela substituição de
bases) ou de deslocamento do quadro de leitura (´frameshift`, mutações decorrentes
da adição ou deleção de um ou mais pares de bases).
As linhagens de S. typhimurium possuem modificações genéticas, como
mutação rfa (que elimina a parte polissacarídica da parede bacteriana, tornando as
bactérias que a possuem mais permeáveis e completamente não patogênicas);
mutação uvrB (deleção do gene responsável pelo reparo do DNA por excisão, o
aduto formado pela ligação da substância química com o DNA não é retirado por
este mecanismo de reparo intensificando o processo de mutagênese (AMES et al.,
1973) .
O plasmídeo pKM101, introduzido nas cepas utilizadas no teste, carreia o
gene que confere resistência à ampicilina. O pKM101 aumenta a susceptibilidade
das bactérias à mutagênese espontânea e a induzida por uma variedade de agentes
e pela luz ultravioleta, uma vez que aumenta a eficiência do sistema de reparo,
normalmente presente nas células bacterianas (MARON & AMES, 1983).
Apesar de semelhanças com sistema de mamíferos, as bactérias não
apresentam a maioria das enzimas envolvidas nos processos de biotransformação
que ocorrem nos mamíferos. Portanto, para que estes ensaios em procariotos sejam
35
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
preditivos, isto é, possam detectar substâncias potencialmente mutagênicas para o
homem, é importante que um sistema extrínseco de ativação metabólica (fração S9)
seja adicionado ao meio de incubação (ZEIGER, 1998).
A fração S9 é um homogeneizado de células fígado de rato liofilizado que
possuem enzimas do complexo citocromo P-450 retida do fígado. Utiliza-se a fração
S9 para a determinação da ocorrência de fenômenos como a indução ou inibição
enzimática por ação de xenobióticos (MARON & AMES, 1983; MORTELMANS &
ZEIGER, 2000).
36
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.4.3 ENSAIOS BIOLÓGICOS UTILIZANDO O ORGANISMO EUCARIOTO
Saccharomyces cerevisiae
A levedura é um micro-organismo
são
fungos
unicelulares,
pertencentes ao filo Ascomycete,
Reino Fungi. Apresentam as mais
variadas
aplicações
(panificação,
bebidas
industriais
alcoólicas,
suplementos alimentares, etc.) tendo
nos últimos anos vindo a ganhar um
forte papel como um sistema modelo
de excelência para o estudo de
FIGURA 9: Foto das células em divisão da
fenômenos biológicos (SHERMAN,
levedura S. cerevisiae. (foto Dennis Kukel, 2004)
2002).
Estes microrganismos possuem características importantes que incluem
rápido crescimento a capacidade de crescer em condições muito variáveis, a
facilidade de obter e isolar mutantes ou células transformantes, um genoma
seqüenciado e baixo custo associado à manutenção e crescimento destes
microrganismos quando comparando com outros modelos biológicos eucariotas
(SHERMAN, 2002; GOFFEAU et al., 1996).
A levedura Saccharomyces cerevisiae (Fig. 9) tem sido utilizada em
diferentes estudos como modelo, na elucidação para os diferentes mecanismos de
reparo do DNA, mecanismos de proteção celular, regulação do metabolismo e
expressão gênica devido a sua habilidade em adaptarem-se as mudanças (MARIS
et al., 2000; PUNGARTNIK et al., 2002).
A utilização como modelo biológico é devido à observação de que as células
possuem características típicas dos eucariotas superiores, onde a conservação de
mecanismos metabólicos e celulares existentes nos eucariotos mais complexos
possibilita a esta extrapolação (WINZELER et al., 1999; SHERMAN, 2002).
37
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A levedura é anaeróbica facultativa, sendo que fermenta glicose e frutose
em condições aeróbicas e anaeróbicas. Sendo a glicose fonte preferencial de
carbono, processo que se denomina repressão catabólica, onde vários genes e
proteínas são ativados para a mediação da glicose, que poderá reprimir os genes
que codificam enzimas do ciclo de Krebes, (cadeia respiratória (HALLIWELL &
GUTTERIDGE, 2000).
Na via anaeróbica temos a formação do etanol, na presença de oxigênio e
diminuição da glicose, os genes não serão reprimidos e o piruvato irá para a via
aeróbica, a direção do piruvato vai depender do metabolismo e das condições do
meio (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2000).
Em condições aeróbicas, o piruvato é descarboxilado e transformado a
Acetil-CoA que entra no ciclo de Krebs, sendo oxidada em H2O e CO2. Em meio
anaeróbio ou com baixos níveis de O2 as leveduras passam a realizar fermentação
alcoólica de forma a regenerar o NAD+, com libertação de CO2. Onde a glicose é
capaz de induzir mudanças drásticas no padrão de expressão gênica das leveduras.
A repressão por glicose (catabólica) acontece devido à ação de vias
sinalizadoras (via Rãs-cAMP- PKA), que estão sendo consideradas como sinalizador
transitório, causada pelas concentrações altas de glicose. Esta via é ativada durante
o período de adaptação da S. cerevisiae a uma nova fase de crescimento, onde a
expressão gênica sofre o ajuste e as células passam novamente para a via de
repressão de glicose (THEVELEIN, 1984; 1994).
As fases do ciclo celular da levedura S. cerevisiae apresentam fases
distintas do ponto de vista metabólico e cinético (Fig.10), a qual podem se
caracterizar por diferentes fases do seu ciclo celular e com respostas fisiológicas ,
sendo elas:
Fase “LAG”, - fase de adaptação fisiológica - alta taxa metabólica, mas a
célula ainda não está se dividindo, seu metabolismo está sintetizando enzimas e
coenzimas;
Fase “LOG” - fase exponencial, ou em que a maquinaria transcricional e
traducional está bastante ativa, o número de células aumenta exponencialmente,
com a energia da fermentação;
38
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Fase diáuxica – ao diminuir a disponibilidade de glicose no meio, ocorre a
desrepressão catabolica, fase de transição e as células são preparadas para o
metabolismo respiratório, também ocorre a parada na divisão celular. Após a divisão
celular é retomada, seria a fase pos-diáuxica onde a utilização do etanol como fonte
de carbono (FUGE et al., 1997).
Fase STAT - fase estacionária, se caracteriza quando todas as fontes de
carbono produzidas durante a fermentação são exauridas e as células são privadas
de nutrientes, ocorrendo um decréscimo no crescimento, ocorrendo progressiva
redução na transcrição e tradução. Trabalhos sugerem que na fase estacionarias as
células são mais resistentes a degradação enzimática, pois seriam mais
termotolerantes (PRINGLE et al.,1982; FUGE et al., 1997; LONGO et al.,1999).
FIGURA 10: Crescimento celular da levedura S. cerevisiae (Adaptado de Fuge e Werner, 1997).
Porém alguns padrões de controles das células de mamíferos em tipos de
estresse estejam mais relacionados com a linhagem S. pombe do que S.
cerevisiae.A levedura isogênica deficientes em mecanismos de defesa antioxidante
são usadas em estudos para comparar a ação de agentes (substâncias testes) que
atuem no sistema redox da célula (BRENNAN & SCHIESTL, 1998).
39
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
As linhagens de S. cerevisiae com a expressão para as catalases, como ctt
1 e cta 1, mostram–se ser mais sensíveis ao peróxido de hidrogênio (IZAWA et al.,
1996). A linhagem yap1 também correlacionada com as catalases estão
relacionadas com defesa contra oxidantes como o peróxido de hidrogênio,
pertencem a família AP-1. Células deficientes em yAP-1 são hipersensíveis à H2O2,
e oxidantes de tióis, e metais como Cd e Zn , a qual regulam a expressão de GSH1.
Células deficientes em yAP-2, tem fenótipo semelhante ao de células deficientes em
yAP-1, exceto sensibilidade para o Cd (WU & MOYE-ROWLEY, 1994).
Os ensaios com levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido de grande
valia, pois tem permitido avaliar compostos mutagênicos, complementando ensaios
de mutagenicidade realizados com a bactéria Salmonella typhimurium.
A levedura por possuir um sistema endógeno de ativação metabólica
(complexo enzimático citocromo P-450) e detoxificação, não necessita a adição, de
um sistema exógeno de ativação metabólica, apresentam uma variedade de
mecanismos de defesa antioxidante (MORENO et al., 1991;GRALLA et al., 1992).
Os tipos de mutação detectados pelas as linhagens de S. cerevisiae são:
Detecção de mutação induzida: Utiliza-se a linhagem haplóide XV 185-14c
de S. cerevisiae, que permite a detecção de mutação reversa, lócus específico:
reversões do alelo ocre lys1-1 (alteração no códon UAA de término de cadeia),
supressor do gene metionina a mutação para o locus lys1-1 é diferenciada de
acordo com SCHULLER et al., (1994); e o alelo missense his1-7 (códon alterado
codifica um aminoácido diferente), sua reversão resulta da mutação de somente um
lócus; a reversões pelo lócus hom3-10
detecta deslocamento do quadro de
leitura do DNA - Frameshift (FRIEDBERG et al.,1995);
Detecção do tipo de mutação por recombinação mitótica utiliza a linhagem
de S. cerevisiae diplóide XS 2316 que permite a detecção da recombinação
intragênica mitótica e recombinação por “crossing-over” dos lócus de mutação, - leu
(leucina) e + cyh (ciclohaximedina), sendo o resultando da reversão do lócus CYH2
(MACHIDA & NAKAI, 1980).
40
Objetivos
2. OBJETIVOS
¾ Este projeto visa a avaliar o potencial genotóxico, citotóxico, mutagênico
e antioxidante dos extratos das plantas Cassia alata e Cajanus cajan
¾ Verificar se os extratos possuem potencialidade para futuras aplicações
biotecnologicas, visando melhoramento da qualidade de vida.
¾ Objetivos específicos
¾ Avaliar a habilidade dos extratos em induzir ou diminuir a mutações
reversas nas diferentes linhagens utilizando um organismo procarionte a
bactéria Salmonella typhimurium com biomarcador
As linhagens empregadas neste estudo: TA 98, TA 100, TA 97 e
TA 1535 em ensaios com e sem metabolização hepática.
¾ Avaliar a resposta citotóxica e genotóxica utilizando organismo
eucarionte,
leveduras
Saccharomyces
cerevisiae
em
diferentes
linhagens;
¾ Para verificar o potencial antioxidante as linhagens deficientes e
proficientes em sistemas oxidantes: sod1∆, sod2∆, sod1∆sod2∆, cat1∆,
ctt1∆, yap1∆, sod1∆cat1∆ e cat1∆ctt1∆ e demais linhagens W303,
XS2316, XV185-14c, N123, BY10000.
42
MATERIAL
E
MÉTODOS
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5. MATERIAL E MÉTODOS
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. MATERIAL VEGETAL: PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS DAS PLANTAS
As plantas foram coletadas na região de Ilhéus nas imediações próximas
a Universidade Estadual de Santa Cruz – BA, no período de abril de 2008. As
plantas foram separadas em suas respectivas partes folhas e galho
e
armazenadas.
Preparo do material vegetal
Para obtenção do extrato liofilizado, as plantas foram pesadas e
desidratadas, previamente rasuradas manualmente submetidas à maceração em
erlenmeyer. Foi adicionada água e aquecida a 80 oC e manteve-se sob agitação
mecânica por 20 minutos em chapa de aquecimento, com variação de
temperatura de ± 2 oC. Os extratos foram concentrados em aparelho de
evaporação rotatória (rota vapor).
Para a obtenção do extrato aquoso da planta Cassia alata foi necessário
5 gramas de folhas e 25 gramas de galhos para 250 mL de água. Para a planta
Cajanus cajan foram necessários 5,0 gramas do folhas e 250mL de etanol 70%
extrato etanólico das folhas, seguindo a metodologia descrita por HENNEBELLE
et al. (2000). O extrato após liofilizado foi dissolvido em com DMSO a Os extratos
foram feitos em colaboração com o discente de doutorado Samuel Saito do
laboratório de fungos da Universidade Estadual Santa Cruz – Bahia.
44
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5. MATERIAL E MÉTODOS
3.2. MEIOS DE CULTURA, SOLUÇÕES E TAMPÕES
Meios de cultura para levedura
Meio YEL
O meio líquido completo (YEL) foi utilizado no crescimento das células
de levedura. Em um frasco autoclavável, adicionou-se 1000 mL água destilada,
10 g/L de extrato de levedura ( Difco) ; 20 g/L de Bacto peptona ( Difco); 20 g/L
de dextrose (Synth); dissolveu-se e foi autoclavado por 20 minutos, e
conservados em temperatura ambiente.
Meio YEPD
O meio YEPD, meio completo solidificado, utilizado no plaqueamento
para a determinação do número de células viáveis de levedura, nos testes de
sobrevivência. Foi utilizado para análise da genotoxicidade ou teste em gota.
Verteu-se 25-30 mL deste meio em placas de Petri. Para a confecção do meio foi
necessário água destilada, 10 g/L de extrato de levedura ( Difco) ; 20 g/L de
Bacto peptona ( Difco); 20 g/L de dextrose (Synth); 20 g/L de Bactor-Ágar (Difco),
após da homogeneização foi autoclavado por 20 minutos.
Meio Sintético (SC)
Para o meio sintético completo (SC) foi necessários o suplemento de
aminoácidos, diferenciado para cada linhagem. O meio SC foi composto de 1,7
g/L Base nitrogenada para leveduras sem aminoácidos e sem sulfato de amônia
(Difco) ; 5 g/L Sulfato de amônia (Synth); 20 g/L Dextrose (Synth); 0,04 g/L
Glutationa reduzida ;Hemisulfato de adenina (Sigma); 0,02 g/L L-Histidina
(Sigma); L-Leucina (Sigma); 0,03 g/L L-Lisina(Sigma); 0,04 g/L L-Triptofanio
(Sigma); 0,02 g/L Uracil (Sigma) .
Meio seletivo
Meio sintético completo os quais foram omitidos os seguintes
aminoácidos: Para a linhagem XV185-14c foram necessárias a omissão de
aminoácidos (SC-histidina, SC-lisina e SC-homoserina) segundo AUSUBEL et al.
(1989).
45
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5. MATERIAL E MÉTODOS
Solução Salina
As células de levedura foram lavadas, ressuspendidas e diluídas em
solução salina 0,9%. Acrescentou-se cloreto de sódio 0,9 gramas (NaCl) a 100mL
de água destilada, e a solução foi autoclavada e mantida em temperatura
ambiente.
Meio Sulfato de Amônia 5%
Foi adicionado a 300 mL de água destilada 15 gramas de sulfato de
amônia (Nuclear) autoclavado por 15 minutos e mantido em refrigeração.
Meio Base nitrogenada de aminoácidos 0,17%
Para a solução concentrada ou solução estoque de 10X, foi necessário
5,1g de YNB, (Yest Nitrogen Base, Difco) diluídos em 300 mL de água destilada e
autoclados por 15 minutos e mantidos em refrigeração.
Meios de cultura para Bactéria
Foram seguidos segundo a metodologia descrita por MORTELMAN &
ZEIGER (2000).
3.3. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE USANDO LEVEDURA Saccharomyces
cerevisiae
Para os ensaios de análise da atividade antioxidante e genotóxica foram
utilizadas as linhagens de S. cerevisiae proficientes e deficientes em sistema de
defesa antioxidante (sod1∆, sod2∆, WT, cat1∆, ctt1∆, yap1∆, sod1∆ cat1∆, sod1 ∆
ctt1∆, SOD (WT)) e demais linhagens XS2316, XV185-14c, W303, N123,
BY10000, conforme descrito na Tabela 1.
CONDIÇÕES DE CRESCIMENTO DAS LINHAGENS DE S. cerevisiae.
Os experimentos foram realizados com as células em fase estacionária
de crescimento. As colônias foram crescidas em frasco de Erlenmeyer contendo
46
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5. MATERIAL E MÉTODOS
30 mL de meio YEL e colocadas para crescer em ‘shaker’ (incubadora com
agitação orbital) a 180 rpm (rotação por minuto). As cepas ficaram sob agitação
por um período de 48 horas a uma temperatura de 30 graus Celsius até atingir a
concentração de 2-4 x108 células/mL e fase estacionária padrão, quando então as
colônias foram selecionadas a partir de colônias isoladas.
As células foram colocadas em um tubo falcon de 15 mL e centrifugadas
a 5000 rpm por 3 min e lavadas com NaCl a 0,9% por três vezes. Ao final, o pellet
foi ressuspendido com 5,0 mL de NaCl a 0,9%. Uma alíquota de 1,0 mL desta
suspensão celular foi colocada juntamente com o extrato da planta em diferentes
concentrações, em um volume final de 1500 μL.
Nos experimentos, as células de diferentes linhagens foram submetidas
a um pré-tratamento que consiste colocar as cepas crescidas (fase estacionária)
em tratamento com extratos das respectivas plantas, incubados por 3 h a 30 ºC
sob agitação de 180 rpm.
47
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5. MATERIAL E MÉTODOS
TABELA 1. linhagens de S. cerevisiae com seus respectivos genótipos utilizadas
nos testes para avaliação da citotoxicidade e genotoxicidade das plantas Cassia
alata e Cajanus cajan
Linhagens
Genótipo
Origem
Edith Gralla
EG103(SOD-WT)
MATa leu2D0his3-D1trp1-289ura3-52
Edith Gralla
EG118(sod1∆)
Como EG103, exceto sod1::URA3
sod2 ∆
Como EG103, exceto sod2::TRP1
cta1 ∆
MAT leu2, arg1, ura3,trp1,Ctt1::Pcta
ctt1 ∆
Como EG103, exceto ctt1::TRP1
EG213(sod1∆ctt1∆)
Como EG103, exceto sod1::URA3 e ctt1::TRP1
Edith Gralla
Edith Gralla
Edith Gralla
Edith Gralla
Edith Gralla
sod1 ∆ cat1∆
MAT leu2, arg1, ura3,trp1, sod1::URA3Cta1-2, ctt1-1
Yap 1∆
MATa, ade2-1, try1-1, can1-100,leu2-3,112,his311,ura3,yap1::TRP!
cat1∆ ctt1∆
MAT leu2, arg1, ura3,trp1,Cta1-2, ctt1-1
Edith Gralla
Edith Gralla
MATa ade2-2 arg4-17 his1-7 lys1-1 trp5-48 hom3-10
Von Borstel
MATa/MATα ADE6/ade6leu1-1/leu1-12 trp5-48/TRP5;
CYH2/cyh2 MET13/met 13;LYS5/lys5-1 his1-1 /his1-1
Machida I.
XV 185-14c
XS2316
Morgan er al 1997
W303
(MATa, ade2-1,try1-1,can1-100,leu2-3,112,his3-11,ura3)
N123
MATa his1-7 gsh1-leaky
BY10000
supE44 hsdR17
Martin Brendel
EUROSCARF
48
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5. MATERIAL E MÉTODOS
CONDIÇÕES DE CRESCIMENTO DAS LINHAGENS DE S. cerevisiae.
Os experimentos foram realizados com as células em fase estacionária
de crescimento. As colônias foram crescidas em frasco de Erlenmeyer contendo
30 mL de meio YEL e colocadas para crescer em ‘shaker’ (incubadora com
agitação orbital) a 180 rpm (rotação por minuto). As cepas ficaram sob agitação
por um período de 48 horas a uma temperatura de 30 graus Celsius até atingir a
concentração de 2-4 x108 células/mL e fase estacionária padrão, quando então as
colônias foram selecionadas a partir de colônias isoladas.
As células foram colocadas em um tubo falcon de 15 mL e centrifugadas
a 5000 rpm por 3 min e lavadas com NaCl a 0,9% por três vezes. Ao final, o pellet
foi ressuspendido com 5,0 mL de NaCl a 0,9%. Uma alíquota de 1,0 mL desta
suspensão celular foi colocada juntamente com o extrato da planta em diferentes
concentrações, em um volume final de 1500 μL.
Nos experimentos, as células de diferentes linhagens foram submetidas
a um pré-tratamento que consiste colocar as cepas crescidas (fase estacionária)
em tratamento com extratos das respectivas plantas, incubados por 3 h a 30 ºC
sob agitação de 180 rpm.
Experimentos de sensibilidade (teste em Gota)
Inicialmente foram realizados diferentes ensaios de sensibilidade com
diferentes linhagens S. cerevisiae para verificar a resistência das cepas frente ao
peróxido de hidrogênio em diferentes moralidades.
Após foram realizados ensaios com os extratos para verificar a
existência de citotoxicidade junto às diferentes linhagens de S. cerevisiae, frentes
a diferentes concentrações do extrato.
Primeiramente foi realizado Teste em Gota com as linhagens de S.
cerevisiae BY 10.000, W303, N123, XS 2316 e XV185 14c linhagens selvagens,
em fase estacionária.
49
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5. MATERIAL E MÉTODOS
Ensaio A- O extrato aquoso da planta C. alata tanto para as folhas como
para os galhos foram adicionado ao meio YEPD mais ágar e posteriormente
plaqueado e após sua solidificação, as linhagens foram diluídas e colocadas 5ul
das cepas em seqüência serial de diluição em cada quadrado, e crescidas por
dois dias em estufa a 30 °C, com este tipo de ensaio foi possível verificar se os
extratos da planta eram potencialmente tóxico para as linhagens de levedura (Fig.
14).
Ensaio B- Foram adicionadas ao meio liquido YEPD + ágar ,
inicialmente em quatro diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio. Este
ensaio teve a finalidade de estabelecer a concentração tóxica para as linhagens,
estabelecendo desta forma, o seu limite de resistência ao peróxido de hidrogênio
(Fig. 15).
Ensaio C- Foram adicionadas ao meio liquido YEPD + ágar o extrato
aquoso das folhas e também para os extrato dos galhos da planta Cassia alata
em diferentes concentrações. Estes extratos foram adicionados conjuntamente
ao meios com peróxido de hidrogênio, em diferentes concentrações. Os extratos
aquoso da planta C. alata também foram testados para diferentes concentrações.
Ensaio D- Foi estabelecido para neste ensaio, que as linhagens de
levedura crescida nas fase estacionaria seriam pré-tratadas com o extrato das
plantas em meio YEL, por um período de 3 horas metodologia descrita na figura
11 , e não mais adicionadas ao meio solido YEPD mais ágar nas placas.
Foram realizados ensaios com concentrações do extrato da planta
Cassia alata tanto para extratos aquoso de folhas como para os extratos aquoso
dos galhos a partir de 200mg/mL até 30mg/mL. Desta forma, estabeleceu-se que
para os ensaios de sobrevivência posteriores seria utilizada a concentração de
30mg de extratos da planta Cassia alata e posteriormente para extratos da planta
Cajanus cajan.
50
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5. MATERIAL E MÉTODOS
CONDIÇÃO DE EXPOSIÇÃO (CRÔNICA) DO EXTRATO.
Após o período de pré-tratamento do extrato da planta com a suspensão
celular, uma alíquota foi retirada do tubo falcon e colocada em um microtubo. Esta
suspensão celular foi diluída em 0,9 mL de NaCl 0,9% e 0,1 mL da suspensão
celular com o extrato da planta do pré-tratamento.
Em seqüência, a suspensão celular foi diluída nos tubos em uma
concentração de 10-7 a 10-3 células. Na planta C. alata as linhagens foram prétratadas com extrato tanto de folhas quanto de galhos a 30 mg/mL; no extrato
C.cajan
as linhagens foram pré-tratadas nas concentrações 50 mg,40 mg,30
mg,15 mg,10 mg, 3mg/mL.
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
Para avaliar a atividade antioxidante utilizaram-se as linhagens de S.
cerevisiae, verificando-se inicialmente pelo teste em gota a sensibilidade das
linhagens frente ao peróxido de hidrogênio.
Após a verificação da dosagem mais tóxica do peróxido de hidrogênio,
para as linhagens verificado através do crescimento da colônia no teste em gota,
as linhagens foram submetidas novamente ao ensaio para a verificação da
sobrevivência, diluídas e plaqueadas para através da contagem das unidades de
colônias por placa, estabeleces números referentes a porcentagem de
sobrevivência para linhagens tratadas e não tratadas com o extrato.
Procedimento do teste: As linhagens foram cultivadas em meios
sólidos, tanto para meios YEPD quanto meios SC. Foram acrescidos a estes
meios solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) em concentrações 2.0 mM, 3.0
mM, 4.0 mM, 5.0 mM, 6.0 mM e 7.0 mM, diluídos e distribuídos em
aproximadamente 25 mL do meio em placas de Petri, em que foram adicionadas
a suspensão celular a ser testada.
51
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5. MATERIAL E MÉTODOS
As células foram plaqueadas em meios sólidos específicos para
sobrevivência e mutagenicidade, acrescidos de peróxido de hidrogênio.
Determinou-se a sobrevivência através de semeadura em meio YEPD. Após 3
dias de crescimento em estufa a 30 oC, as colônias foram contadas manualmente
na lupa (Figura 11).
Teste em Gota – Teste Sensibilidade e Sobrevivência
extrato
Cultura em
crescimento
48h - 30ºC
Meio YEL
+
C-Cepas com pré
tratamento de
do extrato
placas com H2O2
Diluição serial - Céls.
10-7
10-6 10-5 10-4 10-3
cepas
A-Controle
B-Placas com H2O2
Préincubação
3 horas
2- Teste sobrevivência
Após a verificação da
sensibilidade.
Adicionado em cada
placa 100ul da
diluição 10-3 – resposta
(numero de
colônia/placa )
Incubar 30ºC por 48h
Contagem
das colônias
1-Teste em gota –
Verifica a
sensibilidade ou
toxicidade da
substância
Cada quadrado 5ul
de diferentes
diluições em placas
meio YEPD
A resposta se da pela
diferença do tamanho
da colônia
FIGURA 11: Representação esquemática da seqüência do teste em gota ou teste de
sobrevivência(Cardozo, 2010).
52
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5. MATERIAL E MÉTODOS
3.4 AVALIAÇÃO DE SEGURIDADE VIA ENSAIO DE GENOTOXICIDADE E
MUTAGENICIDADE
3.4.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MUTAGENICA E CITOTÓXICA - TESTE DE
AMES - BACTÉRIA Salmonella typhimurium
Para avaliação mutagênica e citotóxica foi utilizada a metodologia de Maron e
Ames (1983) e Mortelman & Zeiger (2000), sendo empregadas diferentes
linhagens de Salmonella typhimurium, com seus respectivos genótipos conforme
descrito na tabela 2.
TABELA 2: Linhagens da bactéria S. typhimurium utilizadas para avaliação mutagênica e
citotóxica das plantas das plantas Cassia alata e Cajanus cajan.
Tipo de dano
Linhagens
Alvo da mutação Genótipo
mutação his 1
TA 100
gene G46 - codifica o gene para a primeira enzima de sua
biossíntese- substituição da leucina (GAG/CTC) por
prolina(GGG/CCC)
detectado
Substituições de pares de
base, principalmente em
pares G-C
bio chlD uvrB gal, rfa, pKM101
mutação his 1
TA 98
gene D (hisD3052)- codifica o gene para histidinol
desidrogenase
bio chlD uvrB gal, rfa, pKM101
mutação his 1
TA 1535
geneG46 – codifica o gene para a primeira enzima de sua
biossíntese -substituição da leucina (GAG/CTC) por prolina(
GGG/CCC)
Deslocamento no quadro
de leitura principalmente em G-C
Substituições pares de
base principalmente
em G-C
bio chlD uvrB gal, rfa,
mutação his 1
TA 97a
mutação no gene hisD6610
bio chlD uvrB gal, rfa, pKM101
Deslocamento no quadro
de leitura –
principalmente em G-C
Fonte: MARON & AMES, 1983; MORTELMANS & ZEIGER, 2000
53
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5. MATERIAL E MÉTODOS
O ensaio seguiu as etapas:
1 - Crescimento das linhagens: as linhagens foram crescidas em tubos
erlenmeyer contendo 20 mL de meio NB, a cultura foi colocada para crescer em
Banho-Maria a 37 °C, com agitação de 100 rpm por 12 h até obter uma densidade
bacteriana de 1-2 x 109 células/mL. Após este processo, avaliou-se a densidade
das culturas utilizando espectrofotômetro – no comprimento de onda de 650 nm,
em que a absorbância da cultura deve estar entre 0,36 a 0,40.
2 - Teste de com pré-incubação: com e sem ativação metabólica (S9),
- Os extratos das plantas foram diluídos em diferentes concentrações
para cada planta e misturados a 0,1 mL de cultura de bactérias e 0,5 mL de
tampão fosfato pH 7,4 (ou 0,5 mL da mistura S9 em ensaios com ativação
metabólica) e incubadas por 20 min a 37 °C. Após o tempo de incubação,
adicionou-se 2 mL de ágar superfície (“top agar”) suplementado com traços de
histidina e biotina, sendo homogeneizados e plaqueados em meio mínimo.
3 - Analise dos resultados: depois da solidificação, as placas foram
incubadas por 48 horas a 37 °C, e posteriormente foi realizada a contagem do
número de colônias revertentes por placa, em contador manual, sendo o ensaio
realizado em triplicata, para cada linhagem, conforme representação esquemática
da figura 12.
Verificação da Toxicidade: Foi verificado a toxicidade da amostra, pelo
crescimento de fundo das colônias na placa teste, visualizado por microscópio
óptico, em aumento de 40x.
Controles positivos e negativos
As linhagens obedeceram a um padrão de mutação espontânea, em
condições diferenciadas para ausência de metabolização hepática (-S9) e
presença de fração metabólica de fígado de rato (+S9). Os valores referenciados
foram descritos em MORTELMANS & ZEIGER (2000).
54
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5. MATERIAL E MÉTODOS
Ensaio
Representação esquemática
Salmonella/microssoma – Teste de Ames MARON & AMES (1983).
3. Diferentes
diluições da
amostra
1. Amostra
Ensaios em
triplicata de 3
experimentos
independentes
filtragem
2. Cultura das cepas
Leitura 650nm
9. Analise
estatística
Programa
Salanal
A- Com metabolização
Hepática -fração S9
B- Sem metabolização
37 °C- overnight
Salmonella typhimurium
4. Ensaios
Controles
Positivo
Negativo
8. Contador
manual de
UFC
5. Sistema
de préincubação
20 min. a
37 °C
banho-maria
6. Plaquear: Amostra + Agar de superfície +
Cepas
7. BODIncubar por
48 horas
37° C
Índice de Mutagenicidade (IM) =
1 = CN
≤ 2 = Positivo
FIGURA 12: REPRESENTAÇÃO ESQUEMATICA DO TESTE DE AMES ( MODIFICADO POR
CARDOZO, 2010 BASEADO MARON & AMES, 1983; MORTELMANS & ZEIGER, 2000).
Doses e Solventes
Nos ensaios in vitro (Teste de Ames) os extratos aquoso da planta
Cássia alata folhas e galhos, foram diluídos a partir da solução mãe (SM) 90
mg/mL, em cinco concentrações iniciais.
As doses foram determinadas em estudos de triagem empregando-se a
linhagens TA98 e TA100, testando-se doses decrescentes obtidas a partir do
limite de solubilidade (maior concentração possível), com doses iniciais 8, 40,
100, 1000 e 5000 μg e após se estipulou dosagens de 1000, 2000, 3000, 4000 e
5000 μg/placa respectivamente.
Na planta Cajanus cajan, foi utilizado o extrato etanólico das frações das
folhas a qual foi liofilizadas e diluídas em DMSO. As diluições do extrato
inicialmente foram de 5, 80, 100, 150, 200 e 500 mg respectivamente, apos
55
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5. MATERIAL E MÉTODOS
estipulou-se dosagens de 5, 25, 50,100, 200 e 250mg/placa. O DMSO foi
adicionado aos controles negativos de nos experimentos, já que todos os
extratos, foram solubilizados nesse solvente, e seria importante avaliar se o
mesmo não estaria interferindo na promoção da mutação reversa.
3.4.2. AVALIAÇÃO DA MUTAGENICIDADE E GENOTOXICIDADE COM
LEVEDURA Saccharomyces cerevisiae – XV185-14C
No experimento foi utilizada a linhagem XV185-14c na fase estacionária
de crescimento para a detecção da mutação reversa:
Utilizou-se os extrato aquoso da planta Cassia alata, sendo extrato bruto
das folhas e extrato bruto dos galhos, no pré tratamento de 30 mg/mL com a
linhagem e para a visualização de colônias mutantes foi necessária a omissão
dos aminoácidos (LYS, HIS ou HOM) no meios sintético SC e incubadas por um
período de 7 dias a 30 ºC.
Para a detecção de mutação induzida, após o pré-tratamento de 3 horas,
sob agitação, as células juntamente com o extrato da planta foram diluídas
conforme a seqüência descrita na figura 10, e adicionada uma alíquota de 100 μL
nas placas com meio mínimo seletivo sólido, e incubado por um período de sete
dias a 30 °C. Todos estes experimentos foram feitos em triplicata para cada dose
testada, em 3 experimentos independentes. Na figura 13 está a representação
esquemática do ensaio de mutagênese com levedura.
56
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5. MATERIAL E MÉTODOS
– Teste Mutagenicidade e Antimutagenicidade
extrato
Solução
Diluição serial - Céls.
10-7
10-6 10-5
Prétratamento
3 horas
+
Cultura em
crescimento
48h - 30ºC
Meio YEL
Fase
estacionaria
10-4 10 -3
Meio celular
1-Controle da linhagem - placas
meio YAPD
0,9 ml de NaCl 0,9% +
0,1 ml solução celular
Após 5 -7 dias em
crescimento em
estufa a 30ºC
Contagem manual
2- Placas com tratamento de
H2O2 (concentração de 2mM a
7mM) - células de levedura sem
pré-tratamento do extrato da
planta
3- Placas com tratamento de
H2O2 (concentração 2mM a
7mM) - células de levedura com
pré-tratamento do extrato da
planta
Placas em Meio SC - especifico para
cada aminoácido
Ensaio Mutagênico
Ensaio antimutagênico
FIGURA 13. Representação esquemática do teste de Mutagênese e antimutagênese utilizando a
linhagem XV da levedura S. cerevisiae (Cardozo, 2010).
4.5. Análise estatística
Análise estatística para o Teste de Ames
Para os resultados obtidos foram calculados a razão de mutagenicidade
(RM) ou Índice mutagênico (IM) em cada dose analisada, em que calcula-se a
média do número de revertentes/colônias contadas em triplicata para cada dose
testada, dividido pela média do número de revertentes por placa do controle
negativo (reversões espontâneas), permitindo comparação de resultados entre
diferentes linhagens.
As amostras foram consideradas segundo o Índice de mutagenicidade:
57
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5. MATERIAL E MÉTODOS
POSITIVAS quando o resultado foi maior ou igual ou dobro em pelo menos uma
das doses testadas, quando houver uma relação dose resposta entre as
concentrações testadas e o número de revertentes induzidos; e NEGATIVA para
mutagenicidade quando o resultado no número de revertentes não induziu
aumento, e seu IM é menor ou igual a 2.
Os dados foram analisados utilizando o programa estatístico Salanal
elaborado pelo Dr. L. Myers do Research Triangle Institute, RTP, Carolina do
Norte, USA. O programa avaliou o efeito dose resposta do ensaio, em que o
cálculo da análise de variância (ANOVA – teste F) é obtido entre as médias do
número de revertentes nas diferentes doses testadas e o controle, seguido de
regressão linear. A potencia da amostra é expressa pela inclinação da parte
linear da curva dose resposta, no gráfico do programa.
Para formulação dos gráficos e estatísticas posteriores para o ensaios
com levedura, foram utilizados o programa Graph Pad Prism 4.
58
RESULTADOS
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
4. RESULTADOS
4.1.
AVALIAÇÃO
DA
ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE
COM
Saccharomyces
cerevisiae.
Ensaio de Sensibilidade /Teste em Gota
Foram realizados experimentos para verificar a sensibilidade da amostra, também
conhecido como Teste em Gota. Utilizando diferentes linhagens de Saccharomyces
cerevisiae, como indicador da citotoxicidade, foram testados extrato aquoso da planta
Cassia alata de folhas e de galhos, e extrato da Cajanus cajan.
XV
XS
By
10.000
W303
N123
A - Controle
B-Extrato de C. alata
(folhas) 50mg/mL
C- Extrato de C. alata
(folha)- 100mg/mL
D- Extrato de C. alata
(folha)- 200mg/mL
FIGURA 14: Foto das placas do Ensaio em Gota- sensibilidade das linhagens XV 185-14c, XS 2316,
By10.000, W303 e N123 frente ao extrato aquoso de C. alata das folhas extrato galhos (adicionado ao
meio de cultura em concentrações de B- 50 mg/mL, C- 100 mg/mL e D- 200 mg/mL
60
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
Na figura 14, mostra as figuras do Teste em gota, onde as .fotos tiradas com
câmera fotografica digital das placas de petri, após tempo de incubação. O ensaios,
com os extratos referentes a sensibilidade e citotoxicidade frente a cinco linhagens.
mostrou que o extrato não foi citotóxico para todas
as
linhagens testadas
inicialmente, de acordo com o tamanho visualizado para o crescimento da unidade
formadora de colônia, comparado ao controle.
Sendo igualmente observado para os extratos de galhos testados
posteriormente. Para o extrato etanolico da planta Cajanus cajan, liofilizado, neste
mesmo ensaio, foi observado citotoxicidade do extrato em concentrações de 50, 40 e
30 mg/mL.
A - Controle
B – 2 mM H2O2
C – 2 mM H2O2
D – 4 mM H2O2
FIGURA 15: Foto das placas, Teste em Gota- sensibilidade das linhagens XV 185-14c, XS 2316,
By10.000, W303 e N123 frente ao peróxido de hidrogênio. A- controle sem peróxido de hidrogênio; Bcom adição de peróxido de hidrogênio a 1mM; C- peróxido de hidrogênio a 2mM e D- peróxido de
hidrogênio a 4mM.
61
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
Os resultados da figura 15 demonstraram que a sensibilidade das linhagens
testadas inicialmente, frente ao peróxido de hidrogênio nas diferentes concentrações,
foram menos resistentes a partir da concentração de 4 mM do H2O2.
Este resultado foi analisado que através da visualização do tamanho das
colônias, sendo pela diminuição ou ausência das mesmas, estes dados possibilitaram
estipular concentrações de maior sensibilidade da linhagem frente ao peróxido de
hidrogênio.
Foram realizados ensaios com concentrações do extrato da planta Cassia
alata extrato bruto aquoso de folhas e extrato dos galhos, a partir de 200mg/mL até
30mg/mL. Estabeleceu-se que para os ensaios de sobrevivência posteriores seria
utilizada a concentração de 30mg/mL de extrato aquoso para a planta Cassia alata
tanto para o extrato de folhas quanto para o extrato de galhos.
Também foi estipulado que as linhagens seriam submetidas a um prétratamento com o extrato sob agitação por um período de 3 horas, metodologia
descrita na figura 11. Na segundo etapa foram feitos ensaios de sobrevivência a partir
das dosagens estabelecidas de 30mg/mL. Posteriormente também foi utilizado este
mesmo ensaio para o extrato etanolico liofilizado da planta Cajanus cajan.
62
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
4.1.2 Experimentos de Sobrevivência e Avaliação do Potencial Antioxidante com
Saccharomyces cerevisiae
Resultados para extrato aquoso de folhas e de galhos
da planta Cassia alata
As Figuras 16, 17, 18, 19 e 20, mostram os resultados dos experimentos nos
gráficos para as linhagens de S. cerevisiae proficientes e deficientes em sistemas
oxidante, pré- incubadas com 30 mg/mL do extrato aquoso de folhas e o extrato
aquoso dos galhos da planta Cassia alata, estipulado anteriormente no ensaio de
sensibilidade.
Foram observados que todas as linhagens mostraram atividade protetora
quando pré-tratadas com o extrato das folhas e galhos, comparada com as linhagens
sem tratamento.
As linhagens sod1∆ e sod2∆ gráficos representados na figura 16 mostraram
mais resistência frente ao peróxido de hidrogênio. Os duplo mutante da linhagem S.
cerevisiae, gráficos representados na figura 17 e 18 sod1∆ cta1∆ e sod1∆ ctt1∆ ,
também mostraram resistência quando expostas ao H2O2.
As linhagens cta1∆ e ctt1∆, gráficos mostrados na figura 17 mostraram mais
sensíveis frente ao H2O2., porem igualmente como nas outras linhagens mostraram
maios sobrevivência, após ao pré-tratamento das linhagens com ambos extratos de
folhas e extratos de galhos da C. alata.
Na figura 18 o gráfico para a linhagem yap1, mostrou sensibilidade bastante
significativa frente ao peróxido de hidrogênio, no ensaio sem pré-tratamento dos
extratos e maior efeito protetor quando a linhagem foi pré-tratadas com ambos os
extratos.
63
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
FOLHAS
GALHOS
A
D
sod1Δ
100
sobrevivência %
sobrevivencia %
100
sod1Δ
10
10
1
1
0
1
2
3
4
5
6
0
7
1
2
3
sod 2 Δ
B
E
sobrevivencia%
sobrevivência %
5
6
7
sod 2Δ
100
100
10
10
1
1
0
1
2
3
4
5
6
7
0
1
2
3
H2O2 [mM]
C
F
(WT)
5
6
7
( WT )
100
sobrevivencia%
10
1
4
H2O2[mM]
100
sobrevivencia%
4
H2O2[mM]
H2O2[mM]
0
1
2
3
4
5
6
7
10
1
0
H2O2[mM]
1
2
3
4
5
6
7
H2O2[mM]
Figura 16: Diferentes linhagens de S. cerevisiae incubadas com 30mg/mL do extrato aquoso da planta Cassia
alata (folha A,B,C e galho D,E F) e frente ao H2O2 em diferentes concentrações, (3 amostras de 3 experimentos
independentes); ■ com pré-tratamento do extrato ; □ sem pré-tratamento
64
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
FOLHAS
A
GALHOS
D
cta1Δ
sobrevivencia %
sobrevivência%
cta1Δ
100
100
10
1
10
1
0.1
0.1
0
1
2
3
4
5
6
7
0
1
2
3
B
E
ctt 1Δ
sobrevivnecia%
100
5
6
7
ctt 1Δ
100
10
10
1
1
0.1
0
1
2
3
4
5
6
7
0.1
H2O2[mM]
C
0
2
3
F
4
5
6
7
sod1Δ cta1Δ
sobrevivência%
100
10
1
0.1
1
sod1Δ cta1Δ
100
sobrevivência%
4
H2O2[mM]
H2O2 [mM]
0
1
2
3
4
5
6
7
10
1
0.1
0
H2O2 [mM]
1
2
3
4
5
6
7
H2O2[mM]
Figura 17: Diferentes linhagens de S. cerevisiae incubadas com 30mg/mL do extrato aquoso da planta Cassia
alata (folha A,B,C e galho D,E F) e frente ao H2O2 em diferentes concentrações, (3 amostras de 3 experimentos
independentes); ■ com pré-tratamento do extrato ; □ sem pré-tratamento
65
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
FOLHAS
A
GALHOS
D
SOD-(WT)
100
sobrevivência%
sobrevivência%
100
SOD ( WT)
10
10
1
1
0
1
2
3
4
5
6
0
7
1
2
B
5
6
7
sod1Δ ctt 1Δ
100
100
sobrevivência%
sobrevivência%
4
E
sod1Δ ctt1Δ
10
1
0
1
2
3
4
5
6
10
1
7
H2O2 [mM]
0
1
2
3
4
5
6
7
H2O2[mM]
yap1 Δ
F
yap1Δ
C
100
sobrevivência%
100
sobrevivência%
3
H2O2[mM]
H2O2 [mM]
10
10
1
1
0
1
2
3
4
H2O2[mM]
5
6
7
0.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
H2O2[mM]
Figura 18: Diferentes linhagens de S. cerevisiae incubadas com 30mg/mL do extrato aquoso da planta Cassia
alata (folha A,B,C e galho D,E,F) e frente ao H2O2 em diferentes concentrações, (3 amostras de 3 experimentos
independentes); ■ com pré-tratamento do extrato ; □ sem pré- tratamento
66
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
FOLHAS
A
GALHOS
D
BY 10.000
100
sobrevivência%
sobrevivência%
100
10
1
0.1
BY 10.000
0
1
2
3
4
5
6
10
1
0.1
7
0
1
2
H2O2 [mM]
B
3
4
5
6
7
H2O2[mM]
E
W 303
W 303
100
sobrevivência%
sobrevivência%
100
10
1
0.1
10
1
0.1
0
1
2
3
4
5
6
7
0
1
2
C
F
N 123
100
4
5
6
7
5
6
7
N123
100
sobrevivência%
sobrevivência%
3
H2O2[mM]
H2O2[mM]
10
1
0.1
0
1
2
3
4
5
6
7
10
1
0.1
H2O2 [mM]
0
1
2
3
4
H2O2 [mM]
Figura 19:. Diferentes linhagens de S. cerevisiae incubadas com 30mg/mL do extrato aquoso da planta Cassia
alata (folha A,B,C e galho D,E,F) e frente ao H2O2 em diferentes concentrações, (3 amostras de 3 experimentos
independentes); ■ com pré-tratamento do extrato ; □ sem pré-tratamento
67
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
FOLHAS
A
GALHOS
C
XS-2316
100
sobrevivência%
100
sobrevivência%
XS-2316
10
10
1
1
0
1
2
3
4
5
6
7
0
1
2
D
XV185-14c
5
6
7
5
6
7
XV185-14c
100
sobrevivência%
sobrevivência%
100
10
1
4
H2O2mM
H2O2 [mM]
B
3
0
1
2
3
4
5
6
7
10
1
0
H2O2[mM]
1
2
3
4
H2O2mM
Figura 20 Diferentes linhagens de S. cerevisiae incubadas com 30mg/mL do extrato aquoso da planta Cassia
alata (folha A,B,C e galho D,E,F) e frente ao H2O2 em diferentes concentrações, (3 amostras de 3 experimentos
independentes); ■ pré-tratamento com extrato ; □ sem pré-tratamento
68
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
Resultados para planta Cajanus cajan
A Figura 21 mostra os gráficos da atividade citotóxica do extrato de Cajanus
cajan (concentrações de 50 mg/mL,40 mg/mL,30 mg/mL,15 mg/mL, 10 mg/mL, e 3
mg/mL), submetidos ao tratamento crônico com H2O2, em diferentes concentrações
mM/placa. Os resultados mostram atividade citotóxica do extrato nas doses de 50
mg/mL a 15 mg/mL, quando comparada ao controle.
A dosagem de 15mg/ mL apresentou inicialmente o efeito protetor das
linhagens pré-tratadas. As doses do extrato de 10 mg/ mL apresentaram para as
concentrações de 2, 3 e 4 mM de H2O2 respectivamente valores de P < 0.05
P<0.001
*,
***,P<0.001 ***.
Para a dose de 3 mg/mL, não mostraram atividade citotóxica e mostrou
atividade protetora, diminuindo aumentando a sobrevivência, quando comparada ao
controle das linhagem submetidas ao H2O2 .
Mostrando significância na analise estatística onde P foi significativo
para
linhagens tratadas com o extrato, onde os resultados são ; 2mM P<0.01 **,3mM
P<0.001***, 4mM P<0.001***, 5mM P<0.01 **, 6mM P<0.001***, 7mM P<0.001***.
69
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
s o b r e v iv ê n c ia %
100
10
co
nt
ro
l
2
3
4
5
6
co 7
nt
ro
l
2
3
4
5
6
co 7
nt
ro
l
2
3
4
5
6
co 7
nt
ro
l
2
3
4
5
6
co 7
nt
ro
l
2
3
4
5
6
co 7
nt
ro
l
2
3
4
5
6
co 7
nt
ro
l
2
3
4
5
6
7
1
WTs/t
3mg
15mg
10mg
30mg
40mg
50mg
H2O2mM
FIGURA 21: Citotoxicidade do extrato de Cajanus cajan; linhagem de S. cerevisiae (WT), WT s/t: sem
tratamento do extrato; WT c/t:
com tratamento do extrato nas dosagens (50mg/mL, 40mg/mL,
30mg/mL, 15mg/mL, 10mg/mL, 5mg/mL) frente ao peróxido de hidrogênio (Controle,2,3,4,5,6,7mM);
ensaios e triplicata de 3 experimentos independentes.
70
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
4.2. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MUTAGÊNICA E GENOTÓXICA
4.2.1
AVALIAÇÃO
DA
ATIVIDADE
MUTAGÊNICA
PELO
ENSASIO
Salmonella/microssoma – Teste de Ames
Foram utilizados as linhagens da bactéria Salmonella typhimurium TA100, TA
98, TA1535 e TA97a. O índice de mutagenicidade (IM) é calculado a partir da
contagem de UFC de cada amostra, dividido pelo controle. O (IM) iguais a 1 indicativo
de mutação espontânea; valores de IM abaixo de 0,7 é indicativo citotoxicidade; IM
2,0 ou maior indicativo de mutagenicidade .
RESULTADOS DA PLANTA Cassia alata
Tabelas 3 e 4 apresentam resultados da atividade mutagênica nas quatro
linhagens e os IM, ensaios sem metabolização hepática (-S9) e com metabolização
(+S9) de extrato aquoso das folhas.
Os resultados mostrados na TABELA 3 evidenciam que não houve atividade
mutagênica do extrato das folhas para as quatro linhagens testadas sem
metabolização. Observou-se atividade citotóxica do extrato na concentração de 5
mg/mL, nas linhagens TA 98 e TA97a. Nos resultados estatísticos utilizando o
programa SALANAL não foi verificado P-dose resposta atividade mutagênica para
nenhuma das linhagens. A linhagem TA 98 o modelo utilizado na analise estatística
foi Bernstein = 0.978; e o valor de P-value foi de 0.007. Para TA 1535 e TA 97 o
modelo foi Linear. A linhagem TA100 apresentou modelo Lintox2 = 0.553 onde
representa que amostra possui toxicidade, P-value dose response < .001
Na TABELA 4, semelhante ao resultado anterior o extrato aquoso das folhas
de C. alata não exerceu atividade mutagênica nas quatro linhagens testadas com
metabolização, mas mostrou citotoxicidade linhagem TA1535 na dosagem mais
alta.Não foi verificada diferença significativa da atividade mutagênica deste extrato
71
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
mas evidência de sua toxicidade pelos resultados estatístico as linhagens TA1535
modelo Lintox2 pval = 0.179 e TA98 modelo Lintox2 pval = 0.109
Tabela 3– Avaliação da Atividade mutagênica utilizando o ensaio Salmonella/microssoma extrato de C.
alata (folha) sem metabolização (-S9).
Extrato
(mg/pl)
CN
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
CP
TA98
Rev/placa*
IM
37,06 ± 2,20
1
33,66 ± 3,21
0,91
39,43 ± 6,27
1,07
42,66 ± 1,15
1,16
27,86 ± 2,13
0,75
20,10 ± 1,65
0,54
952,83 ± 74,44
TA100
Rev/placa*
142,4 ± 3,15
1
144,96 ± 6,31
1,03
163,15 ± 7,2
1,14
163,80 ± 0,28
1,14
138,95 ± 0,91
0,97
106,86 ± 11,03
0,74
a
5,78
824,1 ± 44,01
25,9
IM
TA97a
Rev/placa*
IM
TA1535
Rev/placa*
IM
86,65 ± 27,36
1
38,33 ± 8,01
1
74,41 ± 19,91
0,82
29,58 ± 1,30
0,78
73,55 ± 38,11
0,83
26,40 ± 8,34
0,72
74,75 ± 43,48
0,77
28,75 ± 3,18
0,77
110,25 ± 0,35
0,78
28,15 ± 7,28
0,77
67,75 ± 30,75
0,69
31,30 ± 1,83
0,82
691,50 ± 174,65
7,62
1582,50 ± 449,01
44,0
*Revertentes/placa (média ± desvio padrão) de 3 replicas de 3 experimentos independentes ; IM=índice de mutagenicidade; CN = controle negativo:
DMSO=100 µL/placa; CP = controle positivo: a azida sódica (1.25 µg/placa); b 2-antramine (0,125 µg/placa); c 4NQo 0,5ug/placa;
Tabela 4– Avaliação da Atividade mutagênica utilizando o ensaio Salmonella/microssoma do extrato de C.
alata (folha) com metabolização (+S9).
Extrato
(mg/pl)
CN
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
CP
TA98
TA100
Rev/placa*
IM
36,15 ± 2,61
1
34,00 ± 1,41
0,94
35,40 ± 4,10
0,97
39,30 ± 2,82
1,08
29,25 ± 1,06
0,80
23,15 ± 4,45
0,63
TA1535
Rev/placa*
IM
Rev/placa*
IM
140,63 ± 25,57
1
140,63 ± 25,57
1
138,09 ± 28,76
0,93
138,09 ± 28,76
0,93
153,15 ± 32,73
1,01
153,15 ± 32,73
1,01
147,95 ± 19,30
0,89
147,95 ± 19,30
0,89
131,80 ± 12,44
0,84
131,80 ± 12,44
0,84
114,30 ± 19,96
0,71
114,30 ± 19,96
0,71
b
795,00 ± 156,27 21,45
TA97a
671,93 ± 298,42
5,42
c
671,93 ± 298,42
5,42
Rev/placa*
IM
45,65 ± 2,33
1
32,50 ± 2,12
0,71
38,00
± 0,5
0,84
39,10 ± 7,77
0,85
39,50 ± 0,70
0,86
30,95 ± 1,90
0,67
271,50 ± 195,16 5,86
*Revertentes/placa (média ± desvio padrão) de 3 replicas de 3 experimentos independentes ; IM=índice de mutagenicidade; CN = controle negativo: DMSO=100 µL/placa; CP =
controle positivo: a azida sódica (1.25 µg/placa); b 2-antramine (0,125 µg/placa); c 4NQo 0,5ug/placa;
72
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
Os resultados da TABELAS 5 e 6 avaliaram a atividade mutagênica do
extrato aquoso de galhos que não mostraram atividade mutagênica para as quatro
linhagens testadas com e sem metabolização hepática.
Na TABELA 5 foi possível observar atividade citotóxica pelo IM nas
linhagens TA 97, TA 1535 e TA 98 na dosagem de 5mg/placa. Observamos atividade
citotóxica em diferentes concentrações do extrato, sendo esta significativa na
concentração de 5 mg/pl. Foi verificada atividade citotóxica significativa na analise
estatística do extrato, na linhagem TA 98 o modelo Lintox2 pval = 0.203 , para
linhagem TA 1535 foi utilizado o modelo que mais se adequou, Lintox2 pval = 0.179.
Na TABELA 6 foi verificado para a linhagem TA 98 na analise estatística a
utilização do modelo Bernstein pval = 0.728 achando valores preditivos de P- dose
0.001. Para a linhagem TA 1535 foi observado atividade citotóxica pólo modelo
estatístico, Lintox2 pval = 0.179
Tabela 5– Avaliação da Atividade mutagênica utilizando o ensaio Salmonella/microssoma do extrato de C.
alata (galho) sem metabolização (-S9).
Extrato
(mg/pl)
CN
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
CP
TA98
Rev/placa*
IM
TA100
Rev/placa*
TA97a
Rev/placa*
IM
35,80 ± 0,28
1
111,19 ± 37,83
1
94,40 ± 17,11
1
38,33 ± 8,01
1
32,45 ± 1,62
0,92
103,21 ± 41,44
0,85
84,80 ± 0,28
0,91
24,75 ± 6,01
0,67
36,80 ± 3,11
1,02
90,31 ± 50,89
0,81
75,66 ± 4,71
0,80
20,25 ± 15,20
0,58
50,30 ± 19,79
1,39
79,48 ± 52,06
0,69
75,50 ± 19,09
0,79
20,15 ± 10,11
0,56
28,80 ± 1,69
0,82
69,00 ± 46,66
0,60
75,55 ± 33,87
0,77
16,40 ± 4,10
0,44
16,95 ± 6,15
0,35
61,63 ± 58,78
0,80
63,58 ± 21,10
0,66
20,90 ± 1,97
0,56
995,50 ± 12,72
27,75
633,55 ± 200,69
5,81
691,75 ± 175,00
7,62
1582,50 ± 449,01
43,85
IM
TA1535
Rev/placa*
IM
*Revertentes/placa (média ± desvio padrão) de 3 replicas de 3 experimentos independentes ; IM=índice de mutagenicidade; CN = controle
negativo: DMSO=100 µL/placa; CP = controle positivo: a azida sódica (1.25 µg/placa); b 2-antramine (0,125 µg/placa); c 4NQo 0,5ug/placa;
73
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
Tabela 6– Avaliação da Atividade mutagênica utilizando o ensaio Salmonella/microssoma do extrato de C.
alata (galho) com metabolização (+ S9).
Extrato
(mg/pl)
CN
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
CP
TA98
Rev/placa*
IM
TA100
Rev/placa*
TA97a
Rev/placa*
IM
36,15 ± 2,61
1
135,42 ± 31,17
1
91,00 ± 5,65
1
43,65 ± 5,16
34,75 ± 2,47
0,96
140,41 ± 12,60
0,96
98,00 ± 5,65
0,91
37,75 ± 5,30
0,97
42,25 ± 4,59
1,16
144,98 ± 10,86
0,94
91,00 ± 5,65
0,90
43,00 ± 7,07
0,98
45,00 ± 4,24
1,24
150,15 ± 4,03
0,98
81,50 ± 6,36
1,12
50,80 ± 8,76
1,22
25,65 ± 3,74
0,68
132,50 ± 0,70
0,86
76,00 ± 8,48
0,90
39,00 ± 0,5
0,92
25,65 ± 3,74
0,70
121,15 ± 18,17
0,88
67,00 ± 9,89
0,64
27,80 ± 2,54
0,64
795,00 ± 156,27 21,45
458,5 ± 275,83
3,38
445,00 ± 1,00
5,42
358,50 ± 72,12
8,17
IM
TA1535
Rev/placa*
IM
1
*Revertentes/placa (média ± desvio padrão) de 3 replicas de 3 experimentos independentes ; IM=índice de mutagenicidade; CN = controle
negativo: DMSO=100 µL/placa; CP = controle positivo: a azida sódica (1.25 µg/placa); b 2-antramine (0,125 µg/placa); c 4NQo 0,5ug/placa;
RESULTADOS DA PLANTA Cajanus cajan
Foram avaliados a da atividade mutagênica do extrato metanólico da planta
Cajanus cajan em seis concentrações que estão representadas nas Tabelas 7 (sem
ativação metabólica) e 8 (com ativação metabólica).
Na TABELA 7 as linhagens TA 1535 e TA 97a, mostraram atividade
mutagênica positiva, pelo cálculo do IM, comparada ao número de revertentes/placa
dos controles.
Observou-se valor de IM de 2.1 para a linhagem TA 97, na concentração de
250mg/pl; e na linhagem TA 1535, o IM foi de 6,10 e 7,26 nas concentrações de 200
e 250mg/placa.
Estes dados representam um aumento de 3 vezes, em comparação ao
controle. Nas linhagens TA 98 e TA 100 não se observaram atividade mutagênica,
74
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
mas foi verificada atividade citotóxica (linhagem TA 98) nas maiores concentrações
testadas .
Pelo programa SANALAL, os valores de P-dose resposta na linhagem TA 1535
não foram significativos, pois os valores achados foram maiores que o valore de P0,005 a qual representaria ser significativo.
Porem para a linhagem TA 97 os valores encontrados para P-dose resposta,
foram significativos, sendo de 0,001 utilizou o modelo Linear = 0.143 Estes valores
representam atividade positiva para mutagenicidade.
Na TABELA 8 nos ensaios com metabolização hepática (+ S9) o extrato da C.
cajan não induziu mutação nas linhagens testadas, porém mostrou atividade
citotóxica pelo IM nas concentrações do extratos maiores em todas as linhagens
testadas.
Tabela 7– Avaliação da Atividade mutagênica utilizando o ensaio Salmonella/microssoma do extrato de
C cajan sem metabolização (-S9).
Extrato
(mg/pl)
TA98
Rev/placa*
IM
TA100
Rev/placa*
IM
TA97a
Rev/placa*
IM
TA1535
Rev/placa*
IM
CN
37,88±2,60
1
158,22 ± 11,70
1
97,27±13,0
1
35,33±8,50
1
5
29,72±6,10
0,78
115,55 ± 11,10
0,73
97,05±12,17
0,99
29,4±6,28
0,82
25
33,61±4,15
0,88
140,61 ± 18,70
0,89
324,55±6,0
0,84
27,76±10,85
0,78
50
37,33±7,37
0,97
151,44 ± 4,99
0,96
83,88±15,7
0,85
29,2±14,57
0,82
100
27,11±3,46
0,70
129,80 ± 4,19
0,82
110,16±11,98
1,13
40±26,87
1,13
200
20,88±2,11
0,55
103,10 ± 4,76
0,65 166,66±18,9
1,71
215,6±32,52
6,10
250
15,88±1,51
0,41
0,65
206±44,3
2,10
256,5±97,77
7,26
CP
918,5±101,60
24,14
101,33 ± 34,38
1145,83 ±
406,74
7,35
813±243,5
8,49
1704,16±858,78
48,68
*Revertentes/placa (média ± desvio padrão) de 3 replicas de 3 experimentos independentes ; IM=índice de mutagenicidade; CN = controle
negativo: DMSO=100 µL/placa; CP = controle positivo: a azida sódica (1.25 µg/placa); b 2-antramine (0,125 µg/placa); c 4NQo 0,5ug/placa;
75
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
Tabela 8– Avaliação da Atividade mutagênica utilizando o ensaio Salmonella/microssoma do extrato
de C cajan com metabolização (+S9).
Extrato
(mg/pl)
TA98
Rev/placa*
IM
CN
36,16 ± 2,59
1
5
35,00 ± 2,12
25
IM
TA97a
Rev/placa*
IM
136,10 ± 41,0
1
82,00 ± 12,37
1
33,75 ± 4,84
1
0,97
149,88 ± 13,76
1,17
1,23
44,11 ± 11,40
1,33
34,75 ± 1,76
0,95
146,50 ± 8,26
1,15 161,08 ± 18,90 *
1,96
32,22 ± 13,10
0,93
50
31,25 ± 3,88
0,87
120,11 ± 17,15
0,91
158,75 ± 30,00
1,92
29,77 ± 4,22
0,87
100
21,75 ± 3,88
0,60
77,38 ± 40,72
0,57
113,75 ± 40,65
1,36
22,00 ± 3,78
0,64
200
16,00 ± 3,53
0,44
47,70 ± 33,83
0,34
74,91 ± 17,79
0,90
15,66 ± 7,85
0,44
250
12,25 ± 2,47
0,33
38,88 ± 32,88
0,27
19,66 ± 18,85
0,22
13,20 ± 1,53
0,39
795,00 ± 156,27 21,44
673,00 ± 99,87
5,11
408,75 ± 51,20
4,94
278,30 ± 94,25
8,11
CP
TA100
Rev/placa*
101,75 ± 12,30
TA1535
Rev/placa*
IM
*Revertentes/placa (média ± desvio padrão) de 3 replicas de 3 experimentos independentes ; IM=índice de mutagenicidade; CN = controle
negativo: DMSO=100 µL/placa; CP = controle positivo: a azida sódica (1.25 µg/placa); b 2-antramine (0,125 µg/placa); c 4NQO 0,5ug/placa;
4.2.2. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GENOTOXICA E ANTIGENOTOXICA COM
Saccharomyces cerevisiae XV
Foi utilizada a levedura Saccharomyces cerevisiae, como modelo para a
análise do potencial mutagênico e antimutagênico do extrato aquoso da Cassia alata (
folhas e galhos) frente ao H2O2 .Não foram detectadas mutações induzidas pelos os
extratos (folha e galho) para a linhagem XV 185-14c - haplóide (Tabela 9). A
linhagem, quando pré-tratada com os extratos, mostrou atividade protetora frente à
indução pelo peróxido de hidrogênio, quando comparada com a linhagem sem prétratamento.
76
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
4. RESULTADOS
Tabela 9: Efeito do pré-tratamento com extrato da Cassia alata (folha) e (galho), frente ao
H2O2 nas linhagens de S. cerevisiae XV
Saccharomyces cerevisiae XV 185 14c
Tratamento
Sobrevivência
(%)
His 1/107
Mutagenese
Lys1/107
CN
100
11,26 ± 0,86
2,96 ± 0,75
2,27 ± 0,21
2 H2O2mM
97
31,50 ± 3,7
3,00 ± 0,75
2,60 ± 0,14
3 H2O2mM
86
27,50 ± 7,5
4,40 ± 1,83
2,85 ±0,21
4 H2O2mM
69
34,00 ± 3,0
4,75 ± 1,62
3,00 ± 0,28
5 H2O2mM
40
30,00 ± 5,0
5,25 ± 1,06
3,22 ± 0,45
6 H2O2mM
25
31,00 ± 8,0
6,20 ± 1,80
3,65 ± 0,35
EF 30mg/mL
100
8,35 ± 1,76
2,43 ± 0,47
2,26 ± 0,41
EF 30mg/mL + 2 H2O2mM
100
5,80 ± 4,7
2,33 ± 0,50
2,06 ± 0,40
EF 30mg/mL + 3 H2O2mM
98
5,30 ± 2,31
2,26 ± 0,41
1,86 ± 0,23
EF 30mg/mL + 4 H2O2mM
95
3,60 ± 0,62
2,10 ± 0,40
1,83 ± 0,20
EF 30mg/mL + 5 H2O2mM
80
2,60 ± 1,63
1,93 ± 0,25
1,53 ± 0,23
EF 30mg/mL + 6 H2O2mM
45
1,53 ± 0,86
1,87 ± 0,20
1,26 ± 0,20
EG 30mg/mL
100
11,85 ± 0,55
2,80 ± 0,98
2,60 ± 0,14
EG 30mg/mL + 2 H2O2mM
100
5,50 ± 0,5
2,50 ± 0,55
2,65 ± 0,07
EG 30mg/mL + 3 H2O2mM
95
3,55 ±0,77
2,40 ± 0,50
2,68 ± 0,06
EG 30mg/mL + 4 H2O2mM
85
2,80 ± 0,30
2,30 ± 0,62
2,60 ± 0,14
EG 30mg/mL + 5 H2O2mM
79
2,50 ± 0,70
2,10 ± 0,51
2,60 ± 0,28
EG 30mg/mL + 6 H2O2mM
55
1,55 ± 0,30
1,96 ± 0,42
2,50 ± 0,40
CP
35,5
65,5±13,0
64,5 ± 20,70
75,30 ±29, 27
Hom3/107
CN: controle negativo (NB 100µl); CP: controle positivo 4NQO 0.5µg; (EF) extrato aquoso folha Cassia
alata; (EG) extrato aquoso galho Cassia alata; (Media ± desvio de três experimentos independentes
77
DISCUSSÃO
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5.DISCUSSÃO
5. DISCUSSÃO
Estima-se que cerca de um terço da população ocidental utilize de
plantas medicinais de diferentes formas. Em geral, plantas medicinais contêm
inúmeras classes de compostos químicos que conferem propriedades
antimutagênica,
antioxidante,
anticarcinogênica
e/ou
imunomodulatória,
caracterizando o potencial farmacológico das mesmas no tratamento de muitas
doenças, (LOPES et al., 2004).
Estudos buscando a composição química das plantas, e avaliada por
ensaios biológicos, nos fornecem a base para estudos mais aplicados, já que
muitos desses compostos apresentam atividade citotóxica ou genotóxica. Uma
vez que muitos extratos vegetais podem produzir efeitos colaterais como
qualquer droga industrializada (AMES et al., 1973; MARON & AMES et al.,
1983; RAVANEL et al.,1987; SIMÕES,1999; CAPASSO et al., 2000;STICKEL
et al., 2000).
Visto que os fitoterápicos utilizados em tratamentos de longa duração,
devem passar por uma bateria de ensaios, sendo a analise da genotoxicidade
fundamental. A ANVISA órgão responsável pela liberação e fiscalização dos
fitoterápicos, estabeleceu que produtos de origem vegetal (fitoterápicos) devem
ser avaliados quanto à sua toxicidade. Onde ensaios de toxicidade aguda
devem fazer parte dos ensaios biológicos aplicáveis para a sua analise, bem
como analise mutagênica o através dos testes de Ames e do Micronúcleo.
A família Fabaceae com ampla distribuição no Brasil apresenta varias
espécies de grande importância econômica, representando uma das maiores
famílias das Angiospermas (IRWIN, 1964; SILVA, 1976; BASTOS, 1996) onde
a espécie Cassia alata e a espécie Cajanus cajan são bem conhecidas por sua
utilização na medicina tradicional para o tratamento de diversas enfermidades e
79
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5.DISCUSSÃO
como alimento (NENE et al., 1990; LI et al., 2001; GROVER, et al., 2002;
MAGASSOUBA et al., 2007; AJIBESIN et al., 2008; ABO et al., 2008).
A planta Cassia alata nativa da América encontra-se distribuída em
diferentes locais que lhe confere a facilidade e o uso para diferentes problemas
de saúde (GIRÓN et al., 1991, LONGUEFOSSE & NOSSIN et al., 1996;
MAGASSOUBA et al., 2007; AJIBESIN et al., 2008; ABO et al., 2008). E a
planta Cajanus cajan nativa da África do Sul, aonde seu uso vem sido
reportado para diferentes aplicações por ser bem distribuído no território
brasileiro (NENE et al., 1990).
Com o intuito de ampliar o conhecimento sobre estas plantas, o
objetivo deste trabalho foi verificar se os extratos das plantas Cassia alata e
Cajanus cajan em induzir a metagênese e seu potencial genotoxico bem como
analisar seu efeito antioxidante e efeito protetor.
Utilizando sistemas in vitro com a bactéria Salmonella typhimurium
através do Teste de Ames e em sistema eucarioto, com a levedura
Saccharomyces cerevisiae, modelos biológicas conhecidos na literatura e
relativamente rápidos e de alta reprodutibilidade para detectar substâncias
genotóxica (MORTELMANS & ZEIGER, 2000; RIBEIRO et al., 2004).
Atividade antioxidante e genotóxica da planta Cassia alata com
teste de Ames e em leveduras.
Neste estudo, foi realizado a avaliação da atividade antioxidante e o
potencial genotoxico dos extratos aquoso da planta Cassia alata tanto para
parte folhas como galhos. Foram utilizadas diferentes linhagens de levedura
com características distintas, sendo proficientes e deficientes no sistema de
defesa antioxidante frente a um agente oxidante o peróxido de hidrogênio
(MACHIDA & NAKAI, 1980; GRALLA & KOSMAN, 1992; FRIEDBERG et
al.,1995).
80
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5.DISCUSSÃO
Foram bem reportadas anteriormente que lesões oxidativas, podem
gerar modificações nas bases no DNA, ocasionando diferentes doenças neuro
degenerativas e o câncer (AMES et al.,1991) neste intuito foram avaliados o
potencial dos extratos contra um agente oxidante, bastante conhecido na
literaturas o peróxido de hidrogênio.
Para analise da atividade antioxidante dos extratos as células foram
pré-tratadas como demonstradas nas figuras 14 e 15 utilizando os ensaios de
sensibilidade, também chamado Teste em Gota como pré indicador da
dosanges a ser utilizada. Este ensaio forneceu as primeiras indicações da
dosagem e condições experimentais a serem trabalhadas num segundo
momento.
Este modelo, teste em gota fornece uma resposta do potencial
citotóxico da substancia em teste para as linhagens de S. cerevisiae, através
da inibição de crescimento, esta é uma estratégia simples e sensível para
avaliação do efeito biológico de diferentes substâncias naturais em tratamentos
diversos (ROSA et al., 2004).
Os dados mostraram inicialmente reportados na figuras 14 e 15, que a
sensibilidade das linhagens frente ao agente oxidantes, utilizando a
metodologia do teste em gota, foram suficientes para avaliar que as linhagens
foram mais sensíveis a partir da concentração inicial de 4 mM de peróxido de
hidrogênio, agente oxidante utilizado. Sendo estabelecidos as dosagens do
agente oxidante e também
dos extratos utilizados para os ensaios de
sobrevivência, onde a menor dosagem respondeu protetora para atividade
antioxidante, sendo estipulado 30mg/mL para o ensaios , modelo do ensaios
esta representado na figura 11.
Posteriormente foram realizados os ensaios com varias linhagens de
levedura na verificação da sobrevivência, sendo estas sod1∆, sod2∆, WT,
cat1∆, ctt1∆, yap1∆, sod1∆cat1∆ e sod1 ∆ ctt1∆, SOD (WT), XS2316, XV18514c, W303, N123, e BY10000, frente ao agente oxidante.
81
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5.DISCUSSÃO
A escolha e utilização do peróxido de hidrogênio como sinalizador de
atividade oxidante vem de sua estabilidade e por apresentar maior
concentração in vivo do que outras espécies reativas de oxigênio, reforçando a
idéia que os organismos possuem mecanismos de eliminação desta espécie
química (GIORGIO et al.,2007).
Estas linhagens foram pré-tratadas na dose de 30mg/mL com extrato
aquoso da planta Cassia alata, três horas sob agitação, tanto para extrato
aquoso bruto de galhos como o de folhas, os quais demonstraram um
significativo aumento da sobrevivência comparado ao controle para as
dosagens mais altas, dados apresentados nas figuras 17, 18, 19, 20 e 21,
frente à ação do peróxido de hidrogênio. Ficando mais evidente o efeito
protetor das células tratadas com o extrato, quando submetidas as
concentrações mais altas de peróxido de hidrogênio, revelando a ação
antioxidante dos extratos.
A linhagem yap 1 , uma das importantes mediadoras das respostas
adaptativas, induzindo genes de defesa a agentes oxidantes (DALAUNAY et
al., 2000). Onde foi observado que na linhagem yap1 (figura 19), onde a
levedura sem tratamento com o extrato da Cássia alata frente ao peróxido de
hidrogênio, foi mais sensível. Apresentando baixa sobrevivência comparada as
outras linhagens, demonstrando que esta linhagem é muito sensível ao
estresse oxidativo (COLEMAN et al., 1999). Quando esta linhagem a yap1 foi
submetida ao pré-tratamento com o extrato, observou-se aumento de sua
sobrevivência, demonstrando que os constituintes das plantas testadas em
questão os extratos C. alata, têm uma ação direta sobre as diferentes espécies
reativas de oxigênio induzindo a defesas antioxidantes e não por ação a
indução de sistema adaptativos da levedura.
Observa-se maior sensibilidade das linhagens cta1 e ctt1, no gráfico
apresentado na figura 18. Onde as linhagens frente ao peróxido de hidrogênio,
mostraram ser mais sensíveis ao agente oxidante sem o pré tratamento com o
extrato. Sendo que a sobrevivência nesse experimento foi maior após o pré82
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5.DISCUSSÃO
tratamento com os extratos aquosos, tanto para o estrato de folhas como para
o de galhos. As enzimas CTA1 e CAT2 também têm a função de remover o
H2O2, através da β-oxidação de ácidos graxos e converte-las em moléculas de
água e oxigênio (MICHIELS et al.,1998; GRALLA & KOSMAN,1992).
O gene SOD esta envolvido na defesa ao radical superoxido e
homeostase de metais (MARIS, et al, 1999). Os mutantes sod, não possuem
essa defesa, sendo que os dados apresentados nas figuras 18 e 19 para os
duplos mutantes de sod mostraram um significante aumento em sua
sobrevivência para as leveduras pré-tratadas com ambos os extratos para
folhas e galhos,
Um dos mecanismos que pode envolver o efeito protetor visualizado
para as linhagens de S. cerevisiae, pré-tratadas com os extratos, frente ao
peróxido de hidrogênio, pode ser explicado pela presença de determinados
constituintes da amostra, ou da misturas deles e também flavonóides no extrato
dessa planta, já relatado em outros trabalhos (ALI et al.,1999; MORIYAMA
(2001, 2003; FERNAND et al. 2008).
Os
flavonóides
possuem
um
potencial
quimiopreventivo
e
antioxidante, com capacidade de seqüestrar diretamente radicais hidroxila e
eliminar os ERO gerado pelo peróxido de hidrogênio (MIDDLETON et al.,
2000).
Os resultados aqui apresentados demonstram efeito antagônico dos
extratos. Pois os mesmos apresentam efeito antioxidante e citotóxico,
reforçando a idéia de que mistura complexas podem exercer diferentes dosesrespostas. Ou mesmo possam ser responsáveis pela modulação do estado
redox intracelulares da levedura S. cerevisiae, ou também o efeito protetor
pode estar relacionado, com a integridade proporcionada para as estruturas
celulares do ataque de ERO.
83
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5.DISCUSSÃO
No presente trabalho, foi verificado que o extrato bruto aquoso de
folhas e também de galhos da espécie Cassia alata, não induziram danos
mutagênicos, avaliados pelos ensaios com a bactéria Salmonella typhimurium
no ensaio Salmonella/microssoma (Teste de Ames).
Utilizamos nestes ensaios as linhagens TA98, TA97 a, TA100 e
TA1535, capazes de promover uma triagem abrangente de diferente
compostos mutagênicos primários ou secundários, com vários mecanismos de
ação (CHUNG et al., 2005).
Os resultados apresentados nas tabelas 3, 4, 5 e 6 mostraram que os
revertentes e o índice de mutagenicidade (IM), observados não foram
mutagênicos nas cinco dosagens testadas dos extratos de folhas e também do
extrato de galhos, nos ensaios com e sem metabolização hepática.
Para verificar a possível atividade citotóxica, além da verificação pelo
IM e análises estatísticas, as linhagens também foram avaliadas visualmente
em microscópio ótico verificando através do tapete celular, quanto a sua
mortalidade. Foram verificadas atividades citotóxicas para as células expostas
às concentrações mais altas do extrato aquoso de folhas e também de galhos
da Cassia alata.
Nos ensaios sem metabolização a citotoxicidade foi verificada para o
extrato de folhas, na linhagem S. typhimurium TA100, dados apresentados na
tabela 3, e também analisados estatisticamente pelo programa SALANAL. Seu
potencial tóxico foi verificado, também pela a expressão dos valores
apresentados e pelo modelo escolhido pelo programa que mais se adquou com
os resultados expressões para a analise estatística, a qual foi Lintox2 = 0.553.
No extrato aquoso de galhos, em ensaios sem metabolização, também foi
verificado atividade citotóxica para a linhagem TA 98, verificada na tabela 5.
As linhagens TA100 e TA98 estão relacionadas a diferentes tipos danos
moleculares. Estas linhagens conseguem verificar danos moleculares que
84
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5.DISCUSSÃO
correspondem a mutações do tipo substituição no quadro de leitura e
deslocamento no quadro de leitura (MARON & AMES, 1983).
Entretanto, as linhagens bacterianas não apresentam enzimas de
metabolização, desta forma, ocorrendo identificação de agentes mutagênicos
de ação direta. Acredita-se que estas linhagens, detectam grande número de
compostos indutores de mutagenicidade e também citotoxicidade, e sejam as
primeiras a detectar o potencial mutagênico e genotóxico de uma substância
teste AMES et al., 1973; MARON & AMES 1983.
Nos ensaios com metabolização hepática, resultados demonstrados
na tabela 4 e tabela 6. O extrato aquoso bruto das folhas, nos ensaios com
metabolização a citotoxicidade ficou evidenciada para as linhagens e TA1535 e
TA 98. A ausência de observação dos efeitos mutagênicos em associação à
atividade citotóxica dos extratos testados indica cautela em sua interpretação,
uma vez que resultado citotóxico pode mascarar a atividade mutagênica de
amostras biológicas.
Os compostos químicos encontrados na planta C. alata reportado por
diversos autores como FERNAND, et al. (2008), citam vários compostos
químicos conhecidos quanto sua potencialidade e resultarem em citotoxicidade
para as bactérias, como já reportado em outros trabalhos que verificaram sua
atividade antifúngica e antibacteriana (GUPTA & SINGH, 1991; GIRÓN et al.,
1991, LONGUEFOSSE & NOSSIN et al., 1996; AJIBESIN et al., 2008).
Algumas substâncias conhecidas na literatura como quercetina e
antraquinona, são compostos já foram descritos na literatura como sendo, os
metabólitos majoritários em extratos da planta C. alata.
Estas substâncias
também apresentam atividade genotóxica conhecida (MACGREGOR, 1986;
PATRINELI et al., 1996), e podem atuar como citotóxicas para as bactérias e
leveduras (IBRAHIM & OSMAN, 1994).
85
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5.DISCUSSÃO
Frente aos dados obtidos nos ensaios de mutagenicidade, veio a
necessidade de verificar o potencial protetor dos extratos em sistemas mais
complexos utilizando as leveduras como indicadores da possível atividade
antioxidante.
O grande interesse sobre os efeitos biológicos de antioxidantes
naturais na proteção contra danos ao DNA oriundo de plantas revela que
alimentos ricos em antioxidantes naturais têm um papel importante na
prevenção de doenças cardiovasculares (KRIS–ETHERTON et al.,2002).
Estudos mostram que diferentes doenças também está associada
com o aumento de estresse oxidativo (ABOU-SEIF & YOUSSEF, 2004), bem
como as complicações vasculares (JANDELEIT-DAHM et al.,2000), além da
arteriosclerose, doenças neurodegenerativas que estão também relacionadas
com espécies reativas de oxigênio e radicais livres (MOSKOVITZ et al., 2002),
o que reforça a necessidade de estudos com plantas medicinais.
Também utilizamos neste estudo, a linhagem haplóide XV185 14c de
S. cerevisiae, a qual possibilitou analisar atividade mutagênica para três tipos
de ação mutagênica, frente ao peróxido de hidrogênio como um agente
mutagênico (tabela 9). As linhagens pré-tratadas com o extrato bruto aquoso
da C. alata das folhas e de galhos mostraram atividade protetora frente à
exposição ao peróxido de hidrogênio.
Muitos compostos antimutagênicos encontrados nos alimentos são
agentes antioxidantes e atuam seqüestrando os radicais livres de oxigênio,
quando administrados como pré-tratamento ou nos tratamentos simultâneos
com o agente que induz as mutações no DNA (SASAKI et al., 1988).
Desta forma também foi verificado que os extratos não induziram
atividade mutagênica nos ensaios, mostrando que estes extratos não têm
potencial mutagênico para esta linhagem.
86
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5.DISCUSSÃO
Estes dados revelaram o seu potencial protetor nas três mutações
especificam testadas, sendo mais expressiva para a mutação lócus específica
His1-7 tipo de dano sendo reversão do alelo missence, códon alterado que
codifica para um aminoácido diferente, no DNA. O agente antimutagênico,em
questão os extratos, no caso seja com pré-tratamento ou tratamento, podem
atuar como agentes desmutagênicos, fato que estes estejam atuando em
mecanismos de bio-antimutagênese, este processo esta relacionado com
mecanismo de reparo das mutações (SASAKI & KODAMA, 1987).
Os compostos presentes no extrato aquoso bruto tanto das folhas
como dos galhos da Cassia alata podem estar quelando espécies reativas
de oxigênio, por interação direta podendo agir substituindo e/ou reforçando
algumas defesas antioxidantes celulares e protegendo as organelas celulares.
Atividade antioxidante e genotóxica da planta Cajanus cajan com
teste de Ames e em levedura.
Nos ensaios de atividade mutagênica foi verificado o potencial do
extrato da planta Cajanus cajan em induzir mutações pelo teste de Ames. Os
resultados apresentados na tabelas 7 e 8 mostraram que não houve atividade
mutagênica para as linhagens TA 100 e TA 98 com e sem metabolização
hepática. E nas linhagens TA 1535 e TA97
foram observadas atividade
mutagênica positiva, somente em ensaios sem metabolização hepática.
Os ensaios foram realizados com o DMSO, por que os extratos foram
inicialmente solubilizados nesse solvente sendo que as diluições não
ultrapassaram a um limite de 2% de DMSO, com a finalidade de evitar
interferências nos ensaios.
Concentrações crescentes de extratos foram testadas, com a
finalidade de determinar a maior concentração não tóxica. A determinação da
maior concentração não tóxica baseou-se na viabilidade celular, ou seja, uma
87
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5.DISCUSSÃO
concentração foi considerada atóxica quando se verificou viabilidade celular
acima de 90%.
Mediante estes resultados, pode-se inferir que a substância teste não
necessita de ativação de enzimas relacionadas ao citrocromo 450 para serem
metabolizadas e biotransformadas.
Nos ensaios os extratos foram realizados foram dissolvidos com
DMSO, nesse solvente sendo que a diluição não ultrapassou a um limite de
2%, com a finalidade de evitar interferências nos ensaios. Concentrações
crescentes de extratos foram testadas, com a finalidade de determinar a maior
concentração não tóxica, determinada pela viabilidade celular.
Segundo GASPAR et al. (1993) a substancia quercetina é o agente
responsável pela
mutagenicidade do vinho tinto e essa mutagenicidade é
causada provavelmente pela formação de espécies reativas de oxigênio num
processo de auto-oxidação.
Posteriormente também foram realizados ensaios com a linhagem de
S. cerevisiae no intuito de verificar a sua potencialidade antioxidante frente a
um agente oxidante, o peróxido de hidrogênio. No ensaio com S. cerevisiae a
linhagem selvagem WT, resultados apresentados na figura 22, onde o gráfico
mostra as seis concentrações dos extratos utilizadas. Para o ensaio com o
extrato Cajanus cajan os resultados mostraram atividade citotóxica nas
dosagens mais altas do extrato bruto etanólico testado. A levedura quando foi
pré-tratada com o extrato em concentrações acima de 30mg/mL mostrou
sobrevivência menor comparada com o controle onde a levedura não foi
tratada.
Para a dose de 3,0 mg/mL, mostrou significância onde P foi significativo
para todas as dosagens frente ao agente oxidante peróxido de hidrogênio 2mM
P<0.01 **,3mM P<0.001***, 4mM P<0.001***,
5mM P<0.01 **, 6mM
P<0.001***, 7mM P<0.001***, mostrando efetivo efeito protetor do extrato.
88
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5.DISCUSSÃO
Reforçando a idéia de que misturas complexas possuem constituintes
que podem agir antagonicamente. Pois ao mesmo tempo em que o extrato de
Cajanus cajan, apresentou características citotóxicas também mostrou efeito
protetor contra agente oxidante.
Novamente pode-se atribuir que ação protetora do extrato foi mais
evidente nas concentrações menores dos extratos, mesmo que na maior dose
desse extrato tenha sido extremante citotóxico, verificando um comportamento
pró-oxidante, o qual
se manifesta
através
da
potencialização
da
citotoxicidade do agente oxidante na dose mais alta do extrato.
Estes dados sugerem que apesar da maior parte dos constituintes da
planta C. cajan estar representada por flavonóides (LIN et al., 1990; DUKERESHUN et al.,2002) e que estes são reconhecidamente antioxidantes potentes
(HASSIG et al.,1999; OHSHIMA et al.,1998; VINSON,1998), podem também
estar interagindo com outros constituintes que atuam com toxicidade para as
leveduras, quando em grande concentrações do extrato.
Agentes antioxidantes pode também agir como agente citotóxico, pro oxidante a depender de sua concentração, podendo destruir biomoléculas
(CHEN et al., 2003).
Autores relacionam a atividade mutagênica e antimutagênica com a
concentração e presença de diversas substâncias fitoquímicas encontradas
nas plantas (BROWN & DIETVICH, 1979; RAVANEL et al., 1987;
MACGREGOR & WILSON ,1988; BEUDOT et al., 1998).
Diversos estudos com plantas e chas,
como o chá verde, foram
verificados por diferentes autores, que em sua constituição na planta, na
maioria é representada por polifenóis e outros compostos como galate
Epigalacatequin (EGCG), visto que este composto é considerado o principal
antioxidante e que confere a tão falada propriedades benéfica (AHMAD et al.,
2002.). O EGCG possui efeito antigenotóxico (ARIMOTO & KOBAYASHI ,
89
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5.DISCUSSÃO
2003) e também foi demonstrada a redução de carcinógenos químicos em
animais expostos, porém em altas concentrações esta substância mostrou
efeito genotóxico.
Outra substância que possui efeito antagônico é o ácido ascórbico
(AA) um antioxidante bem estudado (SMIRNOFF, 1996; NOCTOR & FOYER,
1998) detectado na maioria das plantas (FOYER & LELANDAIS, 1996). Têm o
papel de reduzir o peróxido de hidrogênio via peroxidação, agindo nas ERO,
mas em altas doses também pode ter efeito adverso (NOCTOR & FOYER,
1998).
Destacamos a importância dos ensaios de mutagenicidade com os
compostos isolados, uma vez que os resultados nos direcionaram para a
substância possivelmente responsável por esses efeitos, embora a atividade de
um composto nem sempre podem ser potencialmente tão eficazes.
Este trabalho é o primeiro a reportar a atividade genotóxica, e
atividade mutagênica pelo Teste de Ames para extrato da planta Cajanus cajan
em modelo in vitro.
Na analise dos extratos da planta Cassia alata, este trabalho vem a
contribuir por se tratar de um trabalho a analisar a atividade antioxidante in
vitro, utilizando quatorze linhagens de levedura S. cerevisiae como modelo
frente a um agente oxidante conhecido. E ainda submeter os mesmos extratos
de folhas e extrato dos galhos, em ensaios de mutagênese utilizando o ensaio
clássico o Teste de Ames, em quatro linhagens.
Este trabalho possibilitou uma idéia inicial da potencialidade destas
plantas para promissoras aplicações, torna-se necessários novos estudos
avaliando diferentes parâmetros.
Ensaios com levedura e bactéria permitiram neste trabalho uma
avaliação da atividade mutagênica, citotóxica e genotóxica bem como seus
mecanismos protetores, das plantas Cassia alata e Cajanus cajan e revelaram
90
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
5.DISCUSSÃO
que deve haver diferentes rotas de agentes protetores que interagem entre si,
substâncias diversas encontradas nestas plantas que lhe conferem seu
potencial antioxidante e antigenotóxico.
Estes dados remetem a frase “todas substâncias são venenos, a dose
correta diferencia um remédio de um veneno” (Paracelso, 1493-1541).
91
CONCLUSÃO
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
6.CONCLUSÃO
6. CONCLUSÃO
Os extratos das plantas Cassia alata e Cajanus cajan possuem
propriedades antioxidantes, e provavelmente estes resultados são atribuídos
aos seus constituintes como moléculas de flavonóides e antraquinonas que e
luteolina e quecertina que também podem atuar no reparo ao dano no DNA, e
na peroxidação lipídica.
Os resultados neste estudo fornecem as seguintes evidências para a planta:
Cassia alata
•
Nos ensaios com a bactéria Salmonella typhimurium os extratos
aquosos das folhas e de galhos não foram capazes de induzirem
atividade mutagênica nas linhagens TA 100, TA 98, TA 1535 e TA
97a em presença e ausência de metabolização (fração S9), no
entanto mostraram uma citotoxicidade nas concentrações mais altas
testadas;
•
Nos ensaios com a levedura Saccharomyces cerevisiae em
ensaios antioxidantes com as linhagens deficientes em sistemas
antioxidantes (SOD-WT; cat1 ∆; ctt1 ∆; sod1∆ctt1∆; sod1 ∆ cat1∆;
sod1∆; sod2 ∆; Yap 1∆; cat1∆ ctt1∆.
•
Proficientes (N123, W303; XS 2316; XV185 14c, BY10000 )
frente a diferentes concentrações de H2O2;
Nos extratos aquosos de galho e folha, mostraram atividade
protetora (antioxidante) em todas as linhagens testadas em
diferentes concentrações de H2O2.
•
Nos ensaios com a levedura Saccharomyces cerevisiae em
ensaios mutagênico e genotóxico com as linhagens XV 185-14c
O extrato mostrou atividade protetora comparado aos controles.
93
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
6.CONCLUSÃO
Cajanus cajan
•
Nos ensaios com a bactéria Salmonella typhimurium os extratos
metanólico das folhas não foram capazes de induzirem atividade
mutagênica nas linhagens TA 100, TA 98 em presença e ausência de
metabolização (fração S9);
•
No entanto mostraram atividade mutagênica positiva para as
linhagens TA 1535 e TA 97a sem metabolização nas dosagens mais
altas testadas e negativas para Mutagenicidade nos ensaios com
metabolização;
•
No ensaio com a levedura- Saccharomyces cerevisiae em ensaios
antioxidantes e genotóxico com a linhagem WT frente a diferentes
concentrações de peróxido de hidrogênio;
O extrato mostrou Citotóxicidade em concentrações mais altas do
extrato; e atividade Protetora (antioxidante) na concentração mais baixa
testadas, frente às diferentes concentrações de H2O2
94
PERSPECTIVAS
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
7-PERSPECTIVAS
7. PERSPECTIVAS
9
Realizar estudos do potencial antimutagênico e antitumoral em
células de fibroblastos humano, teste cometa e ensaio de micronúcleo
com os extratos das plantas Cassia alata e Cajanus cajan;
9
Realizar Estudo do potencial antimutagênico dos extratos em
ensaios com a bactéria Salmonella typhimurium frente a diferentes
mutágenos conhecidos;
9
Submeter as frações dos extratos aos ensaios mutagênicos e
antimutagênicos o ensaio Salmonella/microssoma e ensaios com
diferentes linhagens da levedura S. cerevisiae.
96
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Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
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Anexos
Resultados
Experimentos Salmonella/microssoma
(Teste de Ames)
Planta Cassia alata
Folhas
Atividade Antimutagênica
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
ANEXOS
Avaliação da atividade Antimutagênica
Dados referentes aos experimentos de antimutagênese com o extrato
aquoso da Cassia alata, parte folha, utilizando a linhagem de S. typhimurium
TA 100 com e sem ativação metabólica, frente ao mutagênico 4NQO.
Em um ensaio piloto, avaliamos a atividade antimutagênica do extrato de
Cassia alata frente a um mutagênico conhecido 4NQO. Os resultados
encontrados foram promissores, mostrando atividade protetora do extrato
frente ao mutagênico. A habilidade antimutagênica do extrato de Cassia alata
tem efeito anti-genotóxico, pois preveniu a indução por 4NQO.
A análise da atividade antimutagênica também é vista por outros autores
em extratos de plantas. MELO-CAVALCANTE et al., (2005; 2008), registraram
a atividade protetora para o extrato da planta Anacardium occidentale, frente a
mutagênicos conhecidos. UENOBE et al., (1997) avaliaram o extrato da planta
Yucca schidigera quanto a sua atividade antimutagênica frente a três
mutagênicos conhecidos da literatura e observaram atividade protetora na
fração isolada da planta, o resveratrol.
122
Dissertação Tatiane Rocha Cardozo
ANEXOS
Atividade antimutagênica
Tratamento extrato
Cassia alata folhas
negative control
4nqo( 0,5µg /plate)
1,0mg extract (l)+ 4nqo
2,0mg extract (l)+ 4nqo
3,0mg extract (l)+ 4nqo
4,0mg extract (l)+ 4nqo
5,0mg extract (l)+ 4nqo
positive control
TA 100
Rev /pl
( media ± desvio)
-S9
+S9
210,5±4,94
1281±84,85
401±16,97
399±14,14
384±98,99
199±106,06
191,5±7,77
995±113,13
168±11,31
1258±62,22
662±42,57
510±75,62
306,66±39,80
475,5±105,3
278±28,2
1105,5±133,6
Rev/pl: número de revertentes por placa; media ± desvio de três replicas de 2
experimentos independentes.
123
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