Caracterização de Bactérias Endofíticas e Isolamento do
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS CURSO DE GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA Caracterização de Bactérias Endofíticas e Isolamento do Fitopatógeno Exserohilum turcicum de Milho Crioulo (Zea mays var. Rosado) Emanuela Pille da Silva Florianópolis Novembro/2013 Emanuela Pille da Silva Caracterização de Bactérias Endofíticas e Isolamento do Fitopatógeno Exserohilum turcicum de Milho Crioulo (Zea mays var. Rosado) Relatório de estágio apresentado ao curso de Graduação em Agronomia, do Centro de Ciências Agrárias, da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito para a obtenção do título de Engenheiro Agrônomo. Orientador: Cláudio Roberto F. S. Soares Supervisora: Kelly Justin da Silva Empresa: UFSC Florianópolis - SC 2013 AGRADECIMENTOS À minha família, especialmente aos meus pais Luiz Fernandes da Silva e Terezinha Ana Pille da Silva, por todo apoio em minha decisão profissional. Ao meu noivo, Matheus Vill, pela paciência, apoio e incentivo nas minhas decisões durante a trajetória da graduação. Dona Luciola e ao Senhor Neri, pela hospitalidade, troca de experiência e importante contato com o meio rural que me proporcionaram através do estágio de vivência. Ao meu orientador, durante a graduação, Márcio José Rossi, pela oportunidade de estagiar no DMS, assim como ao professor Cláudio Roberto F. S. Soares, meu orientador de TCC, e ao professor Admir José Giachini, por todo crescimento pessoal e conhecimento científico que me proporcionaram. Aos amigos do DMS pelas risadas, trocas de experiências, pelos cafés e principalmente pela amizade. À Doutoranda Kelly Justin da Silva e ao Dr. Rafael Dutra de Armas, pelos conhecimentos adquiridos em biologia molecular e por toda a paciência e auxílio nos experimentos de graduação e TCC. Aos amigos da turma 2009.1, não somente pela companhia durante estes anos, mas também pela amizade e troca de experiência. Agradeço à UFSC pelo ensino público e de qualidade e ao CNPq que me oportunizou a inserção no meio científico. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................ - 9 - 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................... - 10 - 2.1. O Milho .................................................................................................... - 10 2.2. Microrganismos Endofíticos .................................................................... - 13 2.3. BOX-PCR ................................................................................................ - 15 2.4. Queima de turcicum (Exserohilum turcicum) ........................................... - 16 3. OBJETIVO GERAL ................................................................................... - 23 - 3.1. Objetivos Específicos .............................................................................. - 23 4. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................... - 24 - 4.1. Coleta do Material ................................................................................... - 24 4.2. Isolamento de E. turcicum ....................................................................... - 25 4.3. Caracterização das culturas bacterianas................................................. - 26 4.4. Caracterização Molecular dos Isolados ................................................... - 26 4.4.1. Extração do DNA bacteriano ................................................................ - 26 4.4.2. BOX-PCR ............................................................................................. - 27 4.4.3. Extração do DNA fúngico ..................................................................... - 27 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................ - 29 - 5.1. Isolados Bacterianos Obtidos .................................................................. - 29 5.2. Isolado Fúngico ....................................................................................... - 30 5.4. Análise Morfológica das Culturas Bacterianas ........................................ - 31 5.5. Análise Molecular Dos Isolados Bacterianos........................................... - 34 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................... - 38 - 7. CONCLUSÕES ......................................................................................... - 39 - 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................... - 40 - LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS: BDA - meio de cultura Batata Dextrose Ágar BSA – albumina de soro bovino CTAB - brometo hexadeciltrimetilamônio DMSO - dimetilsulfóxido DNA - ácido desoxirribonucleico dNTPs – desoxirribonucleotídeos Fosfatados (A,T,C,G) EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético Fe(NO3)3.9H2O - nitrato de ferro nonahidratado KH2PO4 - fosfato de potássio monobásico LCHA - meio de cultura Lactose Caseína Hidrolisada Ágar Luz UV - luz ultra-violeta MgCl2 - cloreto de magnésio MgSO4 - sulfato de magnésio MnSO4.H4O - sulfato de manganês monohidratado NaCl - cloreto de Sódio (NH4)2SO4 - sulfato de amônio PCR - reação em cadeia da polimerase pH - potencial hidrogeniônico RNA - ácido ribonucleico TAE - tampão Tris-Acetato-EDTA Tris-HCl - (hidroximetil) aminometano cloridrato TSA 10 % - meio de cultura Tryptone Soya Ágar 10%. V - volts ZnSO4.7H2O - sulfato de zinco heptahidratato LISTA DE FIGURAS E ANEXOS Figura1. Crescimento em meio TSA 10% das bactérias endofíticas (A) do colmo e (B) da folha. ......................................................................................................... 30 Figura 2. Crescimento do Fungo E. turcicum no meio de isolamento LCHA..... 30 Figura 3. Cluster gerado pela análise de agrupamento hierárquico da caracterização molecular dos isolados de colmo (1C-14C) e folha (1F14F)..................................................................................................................... 34 Figura 4. BOX PCR dos isolados de bactérias endofíticas. (A) Perfis da BOX-PCR dos 14 isolados de colmo (01C-14C) e 14 de folha (01F-14F). M- Marcador; (B) Cluster gerado pela análise de agrupamento hierárquico do perfil de bandeamento da BOX PCR......................................................................................................... 35 Anexo 1. Laudo análise física do solo ................................................................ 47 Anexo 2. Laudo análise química do solo ............................................................ 48 Anexo 3. Croqui do experimento......................................................................... 49 Anexo 4. Localização do Experimento Brasil (A), Santa Catarina (B), Fazenda Experimental da Ressacada em Florianópolis-SC (C) e (D)............................... 50 Anexo 5. Parâmetros da caracterização morfológica.......................................... 51 RESUMO O milho representa uma cultura de grande importância para o Brasil, tanto no aspecto econômico como social. Entretanto, o aumento da produção traz consigo condições mais favoráveis para o aparecimento de doenças. Devido às grandes perdas na produção que essas doenças, como a queima de turcicum, podem acarretar na cultura do milho realizam-se cada vez mais aplicações de agroquímicos visando controlar tais moléstias. Entretanto, estas aplicações geram grandes problemas tanto sociais como ambientais, levando-nos a buscar soluções mais sustentáveis. Neste contexto, apesar de ainda pouco estudados, os microrganismos endofíticos, devido ao nicho ecológico que ocupam, vem mostrando potencial de uso na agricultura inclusive no controle biológico. Deste modo, este trabalho teve como objetivo realizar o isolamento e a caracterização de bactérias endofíticas de milho crioulo variedade Rosado e o isolamento do fungo Exserohilum turcicum (Pass.) K. J. Leonard & E. G. Suggs, agente causal da queima de turcium, para que futuramente possam ser testados esses isolados bacterianos no antagonismo ao patógeno. Para tanto através do método de fragmentação do tecido vegetal, foram isoladas assepticamente em meio TSA 10% bactérias endofíticas de folhas e colmos de milho crioulo no estádio vegetativo da cultura, realizando-se posteriormente a caracterização morfológica e molecular por BOX PCR, dos isolados obtidos. O isolado fúngico foi também isolado da folha, a partir de lesões típica da doença, utilizando-se o meio LCHA. No total, foram isolados 82 bactérias endofíticas, onde 56 foram provenientes de folha e 26 de colmo. Até o presente momento foi possível realizar a caracterização morfológica e molecular de 28 isolados, sendo 14 de cada órgão vegetal. A análise morfológica diferiu da molecular. Entretanto, esta última demonstrou que dos 28 isolados, 10 isolados de colmo e 12 isolados de folha, são diferentes e apenas 1 isolado comum tanto a folha quanto a colmo. Deste modo, a análise por BOX-PCR, mostrou-se um método eficiente para diferenciar isolados, demonstrando que bactérias que compartilham características morfológicas similares, podem representar isolados diferentes. Este método também demonstrou que órgãos vegetais, colmo e folha, compartilham de poucos isolados. Palavras chave: agentes de biocontrole; queima de turcicum; cultura do milho. ABTRACT Corn is a crop of great importance to Brazil , both economically and socially. However the increase in production carries the most favorable conditions for the onset of disease. Due to the large production losses these diseases , such as burning turcicum may entail in maize are held increasingly more applications of pesticides aimed at controlling such diseases . However , these applications generate large social as well as environmental problems , leading us to seek more sustainable solutions. In this context, although less studied endophytic microorganisms , due to the ecological niche they occupy, has shown potential for use in agriculture including biological control . So, this study aims to perform the isolation and characterization of endophytic bacteria of maize landraces Rosado variety and isolation of the fungus Exserohilum turcicum ( pass. ) k. j. e. leonard & g. suggs , the causal agent of burning turcium so that future can be tested in these bacterial isolates antagonistic to the pathogen . Therefore by the method of fragmentation of plant tissue were aseptically isolated amid TSA 10 % endophytic bacteria from leaves and stalks of maize landraces in the vegetative stage of culture, taking place later the morphological and molecular typing by BOX PCR , the isolates obtained . The fungus was isolated from folha also isolated from lesions typical of the disease, using the means LCHA . In total, we isolated 82 endophytic bacteria, 56 isolates from 26 leaf and stem. Until now it was possible to perform morphologic and molecular characterization of 28 isolates, 14 of each plant organ. Morphological analysis of molecular differ. however , the latter showed that the 28 isolates , 10 isolates from 12 isolates stem and leaf are different and only 1 isolate common both leaf and the stem. Thus, the BOX-PCR analysis, proved to be an efficient method to differentiate isolates, demonstrating that bacteria that share similar morphology. This method also demonstrated that plant, stem and leaf, isolated organs share a few. Keywords: biocontrol agents; burning turcicum; corn. -9- 1. INTRODUÇÃO O milho (Zea mays L.) encontra-se entre as principais e mais importantes culturas agrícolas produzidas pelo Brasil. Devido às suas possibilidades de uso, quer na alimentação humana quer na animal, assume relevante papel socioeconômico e indispensável matéria prima impulsionadora de diversificados complexos agroindustriais. A produção encontra-se bem distribuída nas duas safras que ocorrem no país. Entretanto, acompanhando o crescimento da produção no Brasil, ocorreu grande aumento na incidência e severidade de doenças na cultura. Dentre essas doenças, destaca-se a queima ou mancha das folhas de milho causada por Exserohilum turcicum que ocorre de forma generalizada em todo mundo e pode acarretar grandes perdas para o agricultor. Esta doença pode estar presente durante todos os períodos de cultivo em algumas regiões, entretanto, é na safrinha que ela vem ganhando destaque. Atualmente, devido a uma maior conscientização sobre a preservação do meio ambiente, buscando-se alternativas para a redução do uso de insumos químicos, tem aumentado o interesse na utilização de microrganismos na agricultura como alternativa ao controle de doenças. Dentre os microrganismos com potencial de aplicação, encontram-se os endofíticos que são principalmente fungos e bactérias que durante todo ou parte do ciclo de vida das plantas, invadem seus tecidos através de infecções não aparentes, sem causar sintomas de doenças. Os microrganismos endofíticos estão presentes em todas as espécies vegetais, permanecendo em estado de latência ou colonizando ativamente os tecidos de forma local ou sistêmica. Atualmente, sabe-se que endofíticos podem produzir toxinas, antibióticos e outros fármacos, fatores de crescimento e muitos produtos de potencial interesse biotecnológico, além de possuírem outras funções de importância para sobrevivência das plantas. Por ocuparem um nicho ecológico semelhante àquele ocupado por patógenos, apresentam também grande potencial para o controle biológico. Deste modo, este trabalho tem como objetivo isolar e caracterizar bactérias endofíticas de folha e colmo de milho crioulo, visando obter microrganismos que - 10 - possam ser futuramente testados no antagonismo ao patógeno E. turcicum e utilizados como alternativa no controle biológico desta doença. 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. O Milho O milho (Zea mays L.) é uma gramínea da família Poaceae, tribo Maydeae, do gênero Zea, o qual compreende cinco espécies, dentre elas Zea mays (BORÉM, 1999). É uma planta monocotiledônea, diplóide e alógama (FAGERIA, 1989), cujo ciclo fenológico, em condições tropicais, varia entre 110 e 180 dias, dependendo do genótipo e do clima (FANCELLI & DOURADO NETO, 2000). A espécie pertence ao grupo C4, o que lhe confere alta produtividade biológica, devido à eficiência na conversão de CO2 (SANGOI & DA SILVA, 2010). O milho é originário da América Central ou do México (PATERNIANI et al., 2000) e o primeiro contato do homem europeu com esta espécie vegetal ocorreu por volta de 1492, por ocasião da colonização da América. Importantes civilizações americanas antigas como a dos Astecas, Maias e Incas, o domesticaram entre 7.000 e 8.000 anos atrás, tornando-se um dos principais cultivos (BORÉM, 1999; BROWN et al., 1985). Segundo Brown et al. (1985) várias teorias de origem foram oferecidas ao longo dos anos, entretanto, atualmente, apenas duas são levadas em consideração. Uma delas é que o teosinto (Zea mexicana) é o progenitor selvagem do milho e a outra é que um milho selvagem, denominado milho tunicata (“Pod corn”), agora extinto, foi o antepassado do milho domesticado. Entretanto, a origem do milho atual a partir do teosinto é a mais aceita entre os pesquisadores. Além de seu possível papel na origem do milho, o teosinto teve grande impacto sobre sua evolução. No México, particularmente, a introgressão entre milho e teosinto ocorreu provavelmente durante séculos e continua até hoje. Os efeitos são evidentes na morfologia e citologia de ambas as espécies. Há também razões para acreditar que os genes de resistência a certos vírus tenham atingido o milho através da sua introgressão com teosinto. De qualquer maneira, de acordo com Paterniani et al. (2000), os povos primitivos que habitavam a - 11 - América Central conseguiram domesticar o milho e, ao mesmo tempo, por seleção, produzir um número bastante grande de raças. O milho é, provavelmente, a espécie que conta com a maior variabilidade genética entre todas as plantas cultivadas. Atualmente são identificadas cerca de 300 raças de milho e, dentro de cada raça milhares de variedades. A preservação de toda esta diversidade disponível é importante, tanto para o melhorista conduzir seu trabalho de seleção para produzir variedades e híbridos mais produtivos e mais adaptados às necessidades do produtor (PATERNIANI et al., 2000), quanto como fonte de estudo para potenciais biotecnológicos disponíveis. Além da ampla variabilidade genética, o milho tem uma característica bastante importante quanto ao seu nível de domesticação. Trata-se da espécie cultivada que atingiu o mais elevado nível de domesticação, o que faz com que a espécie só sobreviva quando cultivada pelo homem, uma vez que perdeu a capacidade de sobreviver espontaneamente na natureza (PATERNIANI et al., 2000; BROWN et al., 1985). A espécie é cultivada em praticamente todos os continentes, em diferentes condições edafo-climáticas. Porém, para cada região, existem milhos distintos com adaptações especificas, sendo a espécie que apresenta a capacidade de produzir maior quantidade de alimento por unidade de área e por unidade de tempo (PATERNIANI et al., 2000). É por este fato, em função de seu potencial produtivo, assim como por sua composição química e valor nutritivo, que ainda hoje se constitui em um dos mais importantes cereais cultivados e consumidos no mundo. As suas possibilidades de uso, quer na alimentação humana quer na animal, assume relevante papel socioeconômico, além de constituir em indispensável matéria prima impulsionadora de diversificados complexos agroindustriais (FANCELLI & DOURADO NETO, 2000). Segundo dados da USDA (2013), na safra de 2012/2013, o cereal foi cultivado em uma área de 175 milhões de hectares em todo o mundo, com uma produção total de 860 milhões de toneladas e uma produtividade média de 4.90 Mg.ha-1. Nesse cenário, o Brasil encontra-se como terceiro maior produtor, atrás de Estados Unidos e China. Estima-se, segundo dados da CONAB (2013), que na última década, houve um avanço na produção de milho no Brasil, onde a - 12 - produção da safra de 2002/2003 foi de 47 milhões de toneladas contra 81 milhões de toneladas na safra 2012/2013, sendo produzidas na 1ª e 2ª safras, 34 e 47 milhões de toneladas, respectivamente. Entretanto, acompanhando o crescimento da produção no Brasil, ocorreu também grande aumento na incidência e severidade de doenças na cultura, podendo este aumento ser explicado por vários dos fatores que contribuíram para o crescimento da produção e também pelo deslocamento da cultura para novas regiões (FANCELLI & DOURADO NETO, 2000). A agricultura moderna vem criando, por si só, as suas dificuldades pois os produtores tecnificados precisam destinar altos investimentos para a aquisição das novas tecnologias. Recentemente, o produtor tem adquirido sementes das cultivares transgênicas de empresas multinacionais, sujeitando-se à dependência de aquisição associada de insumo (herbicida) e, também, à cobrança de royalties na comercialização do seu produto. Por outro lado, também percebe-se que os conceitos de ecologia, saúde pública-alimentar e valor social têm aguçado os princípios de agroecologia embasada no uso mínimo de agroquímicos e práticas agrícolas alternativas (SANDRI & TOFANELLI, 2008). Dentro deste contexto, apesar das populações de milho crioulo serem de um modo geral, consideradas menos produtivas que as cultivares comerciais, essas populações, em condições naturais adversas apresentam melhor produtividade que os híbridos convencionais (RAMALHO et al., 2008; ARAUJO & NASS, 2002). O milho crioulo da variedade Rosado apresenta altos índices de produtividade, na safra de 2002/2003 produziu 5,2 Mg.ha-1 e na safra seguinte foi de 6,6 Mg.ha-1, em condições de cultivo orgânico, ultrapassando a média nacional que foi de 3,6 Mg.ha-1 e 3,3 Mg.ha-1, nos respectivos anos (ALVES, et al., 2007). Além disso, a variedade Rosado apresenta bom valor nutricional, altos teores de antocianinas (KUHNEN, 2007) e é uma das mais antigas da região oeste de SC, sendo cultivada a quase 50 anos no município de Anchieta (VOGT, 2005). As variedades de milho crioulo são também importantes por constituírem fonte de variabilidade genética que podem ser exploradas na busca por genes tolerantes e/ou resistentes aos fatores bióticos e abióticos (ARAUJO & NASS, 2002). Além disso, sua própria constituição pode abrigar microrganismos que podem apresentar potencial de uso biotecnológico na agricultura moderna. - 13 - 2.2. Microrganismos Endofíticos Evolutivamente as plantas vêm desenvolvendo complexos mecanismos adaptativos, muitos destes somente possíveis, graças às interações com os microrganismos (PEIXOTO NETO et al., 2004). Dentre estes mecanismos encontram-se alterações anatômicas e morfológicas nas plantas devido às interações simbióticas, assim como, a simples produção de exsudatos que podem participar neste processo. Além disso, sua própria constituição pode servir por si só como abrigo e gerar interações com microrganismos. Dentre essas interações encontram-se aquelas relacionadas com os microrganismos denominados endofíticos, que podem produzir toxinas, antibióticos e outros fármacos, fatores de crescimento e muitos outros produtos de potencial interesse biotecnológico, além de exercerem outras funções de importância para a planta, tais como a maior resistência às condições de estresse, à alteração de propriedades fisiológicas e à produção de fitohormônios (AZEVEDO, 1998). Os endofíticos são principalmente fungos e bactérias que colonizam tecidos vivos através de infecções não aparentes, sem causar sintomas de doenças (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). Alguns fatores interferem qualitativa e quantitativamente na biodiversidade da microbiota dos endofíticos, destacandose, a idade da planta e o tecido ou órgão colonizado (PEIXOTO NETO et al., 2004). Em geral, os microrganismos endofíticos penetram nas plantas por aberturas naturais e ferimentos. Uma das portas de entrada mais utilizadas pelos endófitos são as raízes; a emergência de raízes laterais resulta em uma abertura, que serve de entrada para os microrganismos. O próprio crescimento das raízes, ao penetrar no solo, gera abrasões que também facilitam a entrada dos mesmos. Outras portas de entrada são aberturas naturais como estômatos e hidatódios, aberturas causadas por insetos, e até por estruturas de fungos patogênicos, como os apressórios (AZEVEDO, 1998). Estes microrganismos estão presentes em todas as espécies vegetais, permanecendo em estado de latência ou colonizando ativamente os tecidos de forma local ou sistêmica, sendo encontrados, portanto, em órgãos e tecidos vegetais como as folhas, ramos e raízes (AZEVEDO, 1998; PEIXOTO NETO et al., 2002). - 14 - Há tempos, os agroquímicos têm sido usados na agricultura. Entretanto seus efeitos colaterais têm estimulado a redução do seu uso e adoção de métodos naturais menos agressivos (GRIGOLETTI JUNIOR et al., 2000). Além de seus riscos para a saúde humana, também são geradores de fortes desequilíbrios no ambiente, sendo responsáveis por eliminar os inimigos naturais das diferentes pragas de culturas nas áreas em que são utilizados (MEDEIROS et al., 2006). O controle químico pode também causar danos na microbiota benéfica às plantas, além de deixar resíduos no ambiente (ETHUR et al., 2007) e nos alimentos (SANTOS & VARAVALLO, 2011). Deste modo, o controle biológico mostra-se como uma alternativa mais sustentável (ETHUR et al., 2007). Neste contexto, deve-se destacar que o interesse na utilização de microrganismos na agricultura tem aumentado significativamente devido a uma maior conscientização sobre a preservação do meio ambiente, com a busca de alternativas para a redução do uso de insumos químico (DE SOUZA, 2001). Por ocuparem um nicho ecológico semelhante àqueles ocupados por patógenos, os endofíticos apresentam grande potencial para o controle biológico, como verificado em tomate (SILVA et al., 2008) e em café (SILVA et al., 2006). Atualmente, tem havido um crescente interesse no estudo da ocorrência e especialmente, do potencial de colonização e da utilização de bactérias endofíticas para promoção de crescimento e controle biológico de doenças em plantas. Estas bactérias não estão sujeitas à competição por nutrientes que normalmente ocorre no solo rizosférico e ao contrário das colonizadoras de rizosfera, já estão interiorizados na planta, onde os compostos bioativos sintetizados por elas encontram-se prontamente disponíveis às plantas. A associação entre bactéria endofitica-planta consiste numa interação íntima, na qual a planta fornece os nutrientes e habitat, enquanto a bactéria irá promover o crescimento e sanidade da planta (MARIANO et al., 2004), Tendo em vista a grande biodiversidade vegetal de clima tropical em países da América Latina, estima-se que cada espécie vegetal possua microrganismos endofíticos ainda não classificados e, portanto, apresentando diversidade genética capaz de prover compostos estruturalmente diversificados e de bioatividade pouco conhecida, gerando um potencial de aplicação para a - 15 - produção em escala de compostos de alto valor agregado e um novo campo de estudo, no que se refere às interações desses metabólitos com o ecossistema (PEIXOTO NETO et al., 2004). Entretanto, nosso conhecimento da extensão e caráter de diversidade microbiana têm sido limitados, principalmente, pela dependência no estudo de microrganismos cultivados. Estima-se que mais de 99% dos microorganismos observáveis na natureza, não são cultivados usando técnicas convencionais (ARMANN et al, 1995). No entanto, apesar das técnicas dependentes de cultivo não serem tão eficientes, representam o único método até então conhecido e utilizado para se obter estes microrganismos a fim de utilizá-los e testá-los quanto ao seu potencial biotecnológico. Técnicas independentes de cultivo, baseadas na biologia molecular, podem ser utilizadas a fim de auxiliar na identificação e caracterização destes microrganismos, assim como, de compostos de interesse. 2.3. BOX-PCR Fragmentos de DNA estão repetidos e presentes em genomas dos procariotos. Sequências de codificação, tais como genes do RNA ribossomal e sequências de inserção, representam os maiores elementos repetidos que estão presentes em número relativamente baixo de cópias. Em contraste com esses elementos repetidos maiores, padrões de sequência relativamente curtas de polinucleotídeos podem representar sequências altamente repetitivas no genoma procarioto (VERSAVILOVIC et al. 1994). Um método reconhecido de caracterização de estirpes consiste na determinação do perfil de DNA após a amplificação com iniciadores relacionados a regiões repetitivas e conservadas do DNA, em geral no espaço intergênico, a denominada avaliação por rep-PCR (repetitive-sequence-based-PCR) (VERSALOVIC et al, 1994). Estes elementos repetitivos parecem estar localizados em distintas posições intergênicas no genoma, em ambas as orientações. Existem três famílias principais de elementos, incluindo as sequências REP (Repetitive Extragenic Palindromic) (35-40 pb) (STERN et al., 1984), ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) (124-127 pb) - 16 - (HULTON et al., 1991) e BOX – subdivididas em box A (54 pb), box B (43 pb) e box C (50 pb) (MARTIN et al., 1992). Iniciadores para estas sequências têm sido desenhados e utilizados para amplificar regiões entre estes elementos repetitivos por meio de PCR, gerando perfis específicos (fingerprinting) que podem ser utilizados para tipagem e identificação de espécies bacterianas, sendo estas técnicas denominadas de REP-PCR, ERIC-PCR e BOX-PCR (GILLINGS E HOLLEY, 1997), respectivamente. Segundo HUNGRIA et al., (2008) a análise por BOX-PCR resulta em perfis com maior número de bandas e menor custo na análise, por requerer um único iniciador. Além disso, a análise por BOX-PCR possui poder de discriminação e confiabilidade em diferenciar estirpes, além de ser um método que possui repetibilidade, sendo recomendando a obtenção de perfis a partir de BOX-PCR para a utilização no controle de qualidade de coleções de culturas de bactérias diazotróficas e promotoras do crescimento de plantas, inclusive para a distribuição das estirpes para outros laboratórios e para as indústrias de inoculantes. Deste modo, justifica-se a escolha pelo método de BOXPCR, que nos fornece, confiabilidade em discriminar isolados diferentes, através do perfil de bandas por eletroforese. 2.4. Queima de turcicum (Exserohilum turcicum) A cultura do milho está sujeita à ocorrência de várias doenças que podem afetar a produção, a qualidade, a palatabilidade e o valor nutritivo dos grãos e da forragem. Dentre as doenças que ocorrem na cultura do milho, merecem destaque as doenças foliares, as podridões do colmo e das raízes, além das doenças causadas por vírus, fitoplasmas e nematoides (SASSE, 2008). Os danos associados com as manchas foliares são decorrentes do mau funcionamento e da destruição dos tecidos fotossintéticos devido ao aumento do número e da área de lesões que podem determinar a necrose de toda a folha. A necrose e a morte prematura das folhas limitam a interceptação da radiação solar e a translocação de fotossintatos ao desenvolvimento dos grãos (REIS et al., 2004). Dentre as doenças foliares que frequentemente atacam a cultura do milho, - 17 - a queima de turcicum ou requeima das folhas, ocorre em quase todas as áreas de produção no Brasil (SASSE, 2008; PEREIRA, 1995), apresentando também ocorrência generalizada em todo mundo (CARSON & VAN DYRE, 1994). O fungo agente causal da queima tem sua forma assexuada denominada de Exserohilum turcicum (Pass) K.J. Leonard & Suggs. (sinonímia Helminthosporium turcicum) que possui conídios e conidóforos escuros e expostos ao ar livre. Entretanto, este fungo possui forma sexuada conhecida e denominada de Setosphaeria turcica (Lutrell) K.J. Leonard & E.G. Suggs (REIS, 2004) e por isso, segundo os taxonomistas deve ser classificado na divisão Ascomycota, na qual é classificada seu teleomorfo. Uma toxina, Helminthosporium Turcicum (HT) toxina , tem sido identificada como uma fitotoxina, chamada Monocerin. Esta toxina tem demonstrado exibir atividade antifúngica, herbicida e características inseticidas (WEERASOORIYA & CROSBY, 2007). A toxina Monocerin provoca uma inibição na síntese de clorofila, uma redução no crescimento das raízes e formações de lesões e áreas de necrose em genótipos suscetíveis de milho e sorgo (CUQ et al., 1993; BASHAN et al., 1995). Além disso, as folhas perfuradas e tratadas com Monocerin desenvolveram necrose que se propagou ao longo do sistema vascular. Deste modo, a toxina mostra não estar apenas envolvida na penetração, mas também nas fases posteriores da infecção (CUQ et al., 1993). Os primeiros sintomas causados pela queima de turcicum iniciam nas folhas inferiores e progridem para a parte superior da planta. Em infecções severas, o número de lesões por folha aumenta, ocasionando murchamento e seca foliar. O aspecto geral do milho afetado é o de seca, as folhas ficam torcidas, penduradas, como se tivessem sofrido os efeitos de geada, podendo levar a morte prematura da planta (DE ROSSI, 2012). Sobre as lesões foliares o patógeno esporula facilmente em condições favoráveis de umidade e temperatura, produzindo uma massa de esporos de coloração verde-oliva a preta (REIS et al., 2004). Quanto às características particulares de Exserohilum, os conídios além de possuírem coloração verde-oliva a preta, são fusiformes a ligeiramente curvos, apresentando de 3 a 8 septos, com dimensões de 20 x 105 m (PEREIRA et al., 1996). - 18 - Se as condições forem favoráveis ao patógeno (alta umidade e temperatura entre 18 e 27º C) e se o cultivar de milho não possuir nível de resistência satisfatório, o dano econômico pode ser bastante significativo. Os cultivares de milho pipoca utilizados atualmente no Brasil são bastante suscetíveis ao patógeno. O prejuízo causado pela doença depende da severidade e do estádio de desenvolvimento da cultura na época de infecção, sendo a incidência severa antes do embonecamento bastante danosa (PEREIRA, 1995). O tempo de sobrevivência do patógeno nos restos culturais é determinado principalmente pelas condições de temperatura, umidade e luz. Em geral, enquanto existirem nutrientes e fonte de carbono disponível no substrato, ele continuará consumindo-o e se desenvolvendo, sendo esta a fonte de inóculo mais importante para a infecção das plantas de milho (REIS et al., 2004 e DE ROSSI, 2012 ). Deste modo, durante a fase saprofítica, o inóculo de E. turcicum é produzido e disseminado por meio de agentes externos como o ar, a água, insetos e muitas vezes a própria ação do homem (REIS et al., 2004; PEREIRA et al., 1996). Este fungo sobrevive na forma de micélio e conídios em restos de cultura, onde clamidósporos podem ser formados. Os conídios são disseminados a longas distâncias através do vento e as infecções secundárias resultam da disseminação de conídios produzidos abundantemente em lesões foliares (PEREIRA,1995). As condições ambientais favoráveis à ocorrência da doença são encontradas nos primeiros plantios, em agosto e setembro, e nos plantios após dezembro, considerados como plantios de safrinha. Nas regiões altas, as chamadas chapadas, estas condições podem ser observadas durante o ano todo (PEREIRA, 1995). Especialmente no cultivo de safrinha, em condições de fotoperíodos curtos, e quando são frequentemente encontradas baixas intensidades luminosas e baixas concentrações de açúcar nas plantas de milho, a ocorrência da mancha por E. turcicum atinge alta severidade no Brasil (FERNANDES & OLIVEIRA, 1997). Deste modo, devido à grande participação que o cultivo safrinha vem representando para a cultura do milho, ressalta-se a importância no controle de - 19 - doenças relacionadas a este período de cultivo, que é agravada pelo acúmulo de inóculo da safra anterior e às condições favoráveis para a multiplicação de patógenos, como E. turcicum. Este fungo ataca em alta severidade principalmente neste período, onde as perdas podem atingir 50% em ataques antes do período de floração (CASELA et al., 2006). Apesar de apresentar maior importância no cultivo de milho pipoca (VIEIRA et al., 2009) e/ou no plantio da safrinha do milho convencional (CASELA et al., 2006), não se pode ignorar que a presença de inóculo no período de safra possa acarretar prejuízos para a cultura, principalmente quando este período apresenta longos dias nublados, pois, a falta de irradiação pode favorecer o aparecimento da doença devido à baixa concentração de açúcares nas plantas (ALVIM et al., 2010). As medidas de controle da queima de turcicum devem ser baseadas no uso de cultivares resistentes, escolha de melhor época e local de plantio, adubação equilibrada e outras práticas de manejo (mobilização dos restos culturais e rotação de culturas), assim como, na aplicação de fungicidas (PEREIRA, 1995). A resistência do milho à queima do turcicum pode ser do tipo geral, poligênica ou multigênica e específica ou monogênica. A resistência poligênica ou não específica confere a tolerância a todas as raças de E. turcicum, pois a resistência não é absoluta para todas estas raças. Este tipo de tolerância é geralmente caracterizado por criar um ciclo de desenvolvimento da doença mais lento, com menos lesões e de menores dimensões (PIONEER HI-BRED INTERNACIONAL, 2010a). Porém, algumas cultivares podem ser especificamente tolerantes a uma doença, com resistência monogênica ou específica. Muitas vezes, este tipo de resistência é controlado por um único gene dominante. No entanto, existe um risco desse único gene de tolerância se tornar ineficaz devido a uma mudança na capacidade do patógeno para causar a doença. Tal mudança pode ocorrer por meio de mutação genética e consequente seleção de indivíduos dentro da população do patógeno, com capacidade de superar o gene da cultivar para a resistência (STUCKEY et al., 1993). Deste modo, o resultado mais provável do uso continuado de cultivares com resistência monogênica será a seleção de - 20 - novas raças de E. turcicum e consequentemente uma procura por uma série de novos genes para o seu controle. A resistência monogênica a E. turcicum é caracterizada pela formação de lesões cloróticas, um atraso no aparecimento da necrose, e/ou esporulação reduzida. As manchas cloróticas de cor amarela visíveis nas folhas ao redor do local da infecção, não são tão grandes ou tão bem definidas como lesões necróticas e são encontradas em cultivares com maior tolerância à queima do turcicum (PIONEER HI-BRED INTERNACIONAL, 2010a). A utilização de resistência poligênica tem sido limitada pela dificuldade de transferir esta característica para linhas puras sem alterar o ciclo, a estabilidade, a umidade dos grãos na colheita, e outros fatores (GUIOMAR, 2011). Medidas como a prática de mobilização também são recomendadas, pois reduzem a quantidade de inóculo presente no campo, diminuindo-se assim, o nível inicial de infecção ou a probabilidade do aparecimento da doença (STUCKEY et al., 1993). A rotação de culturas com uma cultura não hospedeira da doença do milho, como a soja, também ajuda a reduzir os níveis da doença, principalmente em cultivares suscetíveis (LIPPS & MILLS, 2002; JESCHKE, 2012), uma vez que faz quebrar o ciclo de vida do patógeno, por não ter um hospedeiro que lhe permita completar o seu ciclo de vida. Mesmo assim, a rotação nem sempre é eficaz, porque os conídios de E. turcicum podem disseminar-se a partir de campos adjacentes (STUCKEY et al., 1993). Outras práticas, como a fertilização equilibrada em função dos níveis nutricionais do solo e da cultura, também ajudam a reduzir a gravidade de algumas doenças (STUCKEY et al., 1993). Entretanto, além destes métodos mais conservacionistas, há aplicação de produtos químicos. A aplicação de fungicida pode efetivamente controlar E. turcicum, estando vários fungicidas disponíveis para uso no milho para o controle da queima de turcicum desde que aplicados oportunamente, nas concentrações corretas e em pulverização adequada (LIPPS & MILLS, 2002). Estudos demonstram que os fungicidas tebuconazole, imibenconazole, sulfato de estreptomicina + oxitetraciclina, triforine e prochloraz, que pertencem a diferentes grupos químicos, são eficientes no controle da queima de Exserohilum turcicum (PINTO, 2004). Alvim et al., (2010), também demonstraram que a estrobilurina - 21 - (azoxistrobina) juntamente com o triazol (ciproconazole) propiciaram um bom controle da doença e poderiam ser utilizados como um componente importante do manejo integrado da doença comum na cultura do milho, ajudando na tomada de decisão dos agricultores no sentido de utilizar híbridos produtivos, embora pouco resistentes, em regiões consideradas restritivas a esses materiais devido à presença de inóculo. Segundo Stuckey et al. (1993), a aplicação foliar de fungicidas justifica-se apenas em cultivares susceptíveis e se as três folhas inferiores estiverem infectadas antes do embandeiramento, até duas semanas após o embandeiramento. Mas, infelizmente, quando a infecção ocorre, a cultura está normalmente com um porte muito alto para um normal equipamento de pulverização poder efetuar na aplicação e a aplicação aérea é cara. Assim, a aplicação de produto químico é normalmente recomendada antes do embandeiramento (PIONEER HI-BRED INTERNACIONAL , 2010b). O controle químico pode ser muito atrativo em campos de alto valor, como o milho para a produção de sementes ou o milho doce (SCHWARTZ & GENT, 2005). Outros métodos de controle que vem ganhando destaque são os mecanismos de resistência e o controle biológico. O mecanismo de resistência pode estar presente em plantas suscetíveis e a resistência sistêmica ser induzida por substâncias inorgânicas simples, produtos químicos orgânicos e/ou biológicos. Pulverizações com NPK (principalmente em fósforo e potássio) reduziram o número e área de lesões de E. turcicum e número de pústulas de Puccinia sorghi no milho (REUVENI et al., 1993). Segundo os mesmos autores, a resistência sistêmica induzida contra a ferrugem comum e queima de turcicum foi obtida em folhas superiores das plantas de milho no estádio V7 (estádio em que a cultura apresenta-se com sete folhas completamente expandidas), como resultado de uma pulverização foliar de diferentes fosfatos nas primeiras (1 a 3 folhas), após 24 horas antes da inoculação com suspensões de conídios. Em se tratando de controle biológico, HARLAPUR et al. (2007) testando in vitro a atividade de extratos aquosos e o antagonismo de diferentes microrganismos frente à E. turcicum, obteve resultados interessantes. Oito agentes de controle biológico foram pesquisados sob condições in vitro contra E. - 22 - turcicum para a sua atividade antagonista usando o método de cultura dupla. Todas as bactérias e fungos antagonistas testados inibiram o crescimento de E. turcicum variando de 19-65%, entretanto o fungo Trichoderma harzianum causou inibição significativa máxima (65%), seguido por Trichoderma viride (57%) e Bacillus subtilis (50%), enquanto a Pseudomonas fluorescens foi menos eficaz (19%). O autor relata que o efeito inibitório destes bio-agentes foi, provavelmente, devido à concorrência e/ou antibiose. Outro estudo, avaliando o potencial de antagonismo das bactérias endofíticas, Escherichia coli GC subgrupo B, Morganella morganii, Ewingella americana, Xanthomonas axonopodis, Microbacterium imperial, Bacillus agaradhaerens, Bacillus subtilis G0, B. lentimorbus e Streptomyces sp., à E. turcicum, obtive de 30-50% de inibição in vitro (SHIOMI, 2007),. De acordo com Murdoch et al. (1985), para um efetivo controle biológico, as teorias do modelo de Nichoson-Bailey, propõem importantes características ao agente controlador e seu hospedeiro. Este modelo propõe que o sucesso no controle biológico só ocorre quando o inimigo impõe um equilíbrio baixo e estável com o hospedeiro. Além disso, o seu funcionamento ocorre com mais sucesso quando o inimigo tem as seguintes características: é hospedeiro-específico; tem sincronia com o hospedeiro; pode aumentar rapidamente sua densidade quando o hospedeiro aumenta sua densidade; precisa de poucos indivíduos (geralmente um), para completar seu ciclo de vida e possui alta habilidade de busca. Deste modo, o controle da queima de turcicum deve ser realizado, devido às grandes perdas que a doença pode ocasionar na produção de milho. Dentre os métodos que apresentam baixo custo e eficiência, encontra-se o controle biológico e entre os possíveis agentes de controle destacam-se os microrganismos, especialmente, as bactérias que estão presentes naturalmente no ambiente. As bactérias possuem alto potencial de utilização devido, principalmente, à sua facilidade de multiplicação e aplicação. - 23 - 3. OBJETIVO GERAL Isolar e caracterizar bactérias endofíticas de plantas de milho crioulo para posterior realização de antagonismo ao patógeno Exserohilum turcicum. 3.1. • Objetivos Específicos Isolar bactérias de folhas e colmos de milho crioulo, no estádio vegetativo da cultura; • Caracterizar morfológica e molecularmente os isolados bacterianos obtidos; e • Isolar o fungo Exserohilum turcicum presente na cultura. - 24 - 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Coleta do Material Plantas de milho crioulo da variedade Rosado foram colhidas em experimento de pesquisa implantado na Fazenda experimental da Ressacada da Universidade Federal de Santa Catarina, localizada em Florianópolis (Anexo 4). O referido experimento faz parte do projeto de Doutorado do PPG em Recursos Genéticos Vegetais da Doutoranda Kelly Justin da Silva, aonde foram semeados milhos crioulo (variedade Rosado), convencionais e transgênicos (Anexo 3). O delineamento experimental adotado foi o de blocos casualisados, composto por três blocos, constituídos de 15 parcelas por bloco, sendo estas representadas por quatro linhas de 20 m, com quatro plantas por metro linear. Através das análises físicas e químicas foi possível observar que no local do experimento, os blocos possuem características físicas similares, entretanto diferem quanto às características químicas, conforme os laudos dos Anexos 1 e 2. O solo foi corrigido conforme a recomendação da COMISSÃO DE QUÍMICA E FERTILIDADE DO SOLO-RS/SC (2004). Capinas manuais foram realizadas periodicamente, para eliminação das ervas daninhas. A coleta foi realizada no dia 07 de junho de 2013, quando as plantas se encontravam entre os estádios V6-V7 (com seis à sete folha completamente expandidas), ainda no período vegetativo da cultura. Foram coletadas plantas da 4ª linha, escolhendo-se aquelas menos atacadas por doenças, ou seja, mais sadias. As plantas inteiras foram transportadas à temperatura ambiente até o laboratório de Microbiologia do Solo da UFSC onde procedeu-se a coleta dos órgãos vegetais de interesse (folha e colmo). Foram coletadas três plantas de cada parcela, perfazendo um total de nove plantas por bloco e um total de 27 amostras. Após as plantas serem lavadas em água corrente, realizou-se a escolha do material foliar vegetal, selecionando-se a folha posterior à última completamente expandida, que de um modo geral apresentavam-se sadia. Já a amostra de caule foi coletada a cerca de 15 cm do colo da planta. Após a escolha dos materiais procedeu-se ao isolamento, realizando-se uma amostra composta por bloco, - 25 - cortando os tecidos vegetais em fragmentos de cerca de 1 cm, realizando-se logo após o processo de desinfecção. Em seguida, realizou-se o processo de desinfecção para eliminação dos microrganismos epifíticos que consistiu na exposição à luz UV por cinco minutos em cada face do material vegetal, seguido de lavagens com álcool 70% por dois minutos, solução de hipoclorito de sódio a 33% dois minutos, mais uma lavagem em álcool 70% por 30 segundos e quatro lavagens em água destilada estéril, conforme metodologia proposta por CERIGOLI (2005). Após o processo de desinfecção as extremidades do órgão vegetal foram retiradas a fim de possibilitar a saída dos endófitos quando colocados em contato com o meio de cultura. Para o isolamento foram utilizadas cinco placas contendo meio TSA 10 %, colocando-se três pedaços do respectivo órgão vegetal em cada placa e duas placas do tratamento controle com alíquota de 100 µL de água, para cada bloco coletado. Deste modo, utilizou-se no total 15 placas para cada órgão vegetal assim como, seis placas de tratamento controle por órgão. As placas foram armazenadas em incubadoras tipo B.O.D. a 25 ºC até o crescimento das colônias bacterianas. As colônias bacterianas crescidas a partir dos tecidos vegetais foram transferidas para novas placas de Petri com o mesmo meio de cultura utilizado no isolamento, sendo purificadas pela técnica de esgotamento por estrias cruzadas. Após a obtenção de culturas puras, estas foram armazenadas sob refrigeração. 4.2. Isolamento de E. turcicum Devido a fase assexuada do fungo ser denominada E. turcicum e rotineiramente ser a utilizada na área de fitopatologia, o fitopatógeno terá tal denominação do presente trabalho. Folhas com lesão necróticas, elípticas de cor verde-acinzentada a marrom, foram cortadas em pequenos pedaços de cerca de um cm, contendo parte da lesão e do tecido sadio. Posteriormente, realizou-se a assepsia do material, conforme De Rossi (2012), através da imersão em álcool 96 % por um minuto, enxague em água destilada e, em seguida, em uma solução aquosa de hipoclorito de sódio 1 %, por três minutos e novo enxague com água destilada e estéril, por três vezes, para remover o excesso do hipoclorito. Posteriormente estes - 26 - fragmentos foram colocados em câmara úmida utilizando-se placas de Petri, contendo algodão umedecido com água estéril e mantidos em incubadoras tipo B.O.D. com luz constante a 25 ºC, durante cinco dias. Posteriormente, os esporos contidos nas lesões foram raspados em vidro relógio e observados em microscópio estereoscópio, sendo estes coletados e lançados diretamente em placas de Petri contendo o meio LCHA composto em g.L-1 por: lactose 37,5; Caseína hidrolisada 3,0; KH2PO4 1,0; MgSO4 0,5; 2 mL de micronutrientes de uma solução estoque [0,723 g.L-1 de Fe(NO3)3.9H2O; 0,439 g.L-1 de ZnSO4.7H2O; 0,203 g.L-1MnSO4.H4] e 15,0 de ágar, com pH ajustado para 6,0 (TUITE, 1969), para obtenção de um pool de esporos do fitopatógeno. 4.3. Caracterização das culturas bacterianas As bactérias endofíticas mantidas sob refrigeração, foram repicadas para meio TSA 10 % e armazenadas em BOD à 25 ºC afim de se realizar caracterizações morfológicas e culturais tais como: forma da colônia (puntiforme circular e irregular); elevação da colônia (plana, lenticular, convexa, drop-like, umbonada e umbilicada); borda da colônia (inteira, ondulada, lobada, denteada e filamentosa); superfície da colônia (lisa, rugosa e papilada); produção de muco (escassa, pouca, moderada e abundante); consistência da massa de crescimento (seca, aquosa, gomosa, viscosa e butírica); e detalhes ópticos (transparente, translúcido, opaco e brilhante), cor da colônia, tempo de crescimento (dias); reação à colocação de Gram em microscopia de luz em aumento de 1000x (Anexo 4). Ao final das avaliações utilizando o programa Systat 11.0 os dados foram submetidos a um agrupamento hierárquico com base em dados binários, utilizando o algoritmo Ward e a distância euclidiana como unidade de medida. 4.4. Caracterização Molecular dos Isolados 4.4.1. Extração do DNA bacteriano As bactérias endofíticas isoladas foram repicadas para placa de Petri contendo o mesmo meio de armazenamento (TSA 10 % sólido) e mantidas em - 27 - incubadoras tipo BOD à 25ºC, por 24 horas. A extração de DNA foi realizada através de lise térmica, seguindo a metodologia proposta por Hagen et al. (2002), modificada por Armas (2011). As colônias foram friccionadas e diluídas em 100 µL de água ultrapura, em tubos eppendorfs de 0,2 mL, sendo estes posteriormente submetidos à temperatura de 100ºC durante cinco minutos. Em seguida foi realizada a centrifugação dos tubos à 13.000 r.p.m. por três minutos. O sobrenadante contendo o DNA genômico foi transferido para um novo tubo, para posterior utilização nas reações de BOX-PCR. 4.4.2. BOX-PCR Para a diferenciação dos isolados foi empregada a técnica de BOX-PCR, utilizando-se o iniciador BOX A1R (5’ CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G 3’) (VERSALOVIC et al., 1994). A reação de amplificação foi realizada utilizando-se 1µL do DNA extraído, 50 pmol do primer BOX A1R, 2,5 µL de dNTPs 2 mmol L-1, 2,5 µL de DMSO 100%, 4,0 µL de BSA (1mg.mL-1), 0,5 µL (1U) de Taq DNA polimerase Platinum e 5µL de 5X Gitschier Buffer (83 mmol L-1 de (NH4)2SO4; 335 mmol L-1 de tris-HCl pH 8,8; 33,5 mmol L-1 de MgCl2; 33,5 µmol L-1 de EDTA; 150 mmol L-1 de B- mercaptoetanol) e H2O ultrapura para um volume final de 25 µL da reação. As condições de amplificação foram: 2 min a 95ºC; 30 ciclos de 3 seg a 94ºC, 30 seg a 92 ºC e 1 min a 50ºC, e extensão final por 8 minutos a 65ºC (ARMAS, 2011). Os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5 % em tampão 1X TAE (50 mmol L-1 de Tris-HCl pH 8,8; 50 mmol L-1 de ácido acético glacial; 25 mmol L-1 de EDTA), a 80 V por 1h e 30 min. A aquisição das imagems foi realizada através de fotodocumentador (ChemiDoc MP Bio-Rad). Os perfil de amplicons foram analisados com o programa GelCompar II, versão 6.68 gerando uma matriz com dados binários, os quais foram submetidos a um agrupamento hierárquico através do programa Systat, utilizando o algoritmo Ward e a distância euclidiana como unidade de medida. 4.4.3. Extração do DNA fúngico - 28 - Após crescimento da cultura fúngica em meio BDA, procedeu-se à extração do seu DNA, através do método CIA (clorórmio-álcool isoamílico). Em tubos de eppendorfs com capacidade de 1,2 mL, fragmentos do fungo foram suspensos em 200 µl de tampão de lise CTAB (2 % CTAB ;- 1.4 M NaCl; 20 mM EDTA; e 100 mM Tris, pH 8.0) e em seguida, com auxílio de um pistilo, macerados. O volume foi completado com 400 µl de tampão (total = 600 µl) e adicionado - mercaptoetanol 0,2 % = 1,2 µl. Posteriormente a amostra foi congelada/incubada a 65 C, 2 vezes, sendo a última incubação à 65 C realizada por 1 hora. Após este período foi adicionado ao tubo um volume de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e realizada a centrifugação por 15 minutos a 12.000 g. Estes compostos são solventes orgânicos que realizam a separação dos ácidos nucleicos e proteínas através da sua desnaturação. Estas precipitam na face orgânica, assim como os lipídeos da membrana, tornando-os insolúveis à fase aquosa, onde se encontram os ácidos nucleicos. O álcool isoamílico, em especial, evita a formação de espumas o que facilita a separação da fase aquosa da orgânica. Deste modo, a fase aquosa foi removida e transferida para um novo tubo, onde adicionou-se um volume de isopropanol gelado, por possuir a função de precipitar o DNA e armazenou-se em freezer à -20 ºC overnight. Ao final deste período foi realizada uma nova centrifugação à 12.000 g por 15 min. Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e ao DNA foi adicionado 500 L de etanol (EtOH) 70% afim de limpar mais o DNA, sendo realizada uma nova centrifugação por 15 minutos a 12.000 g. Após o descarte do sobrenadante e a completa evaporação do etanol 70% foi realizada a suspenção do pellet em 50 L de água milliQ. Para eliminação de possíveis RNAs presentes na amostra foi adicionado 1µL de RNAse à suspensão de DNA, com incubação à 37 ºC por 1 hora, tendo em vista a temperatura de atividade da enzima. - 29 - 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Isolados Bacterianos Obtidos Os órgãos vegetais foram mantidos em B.O.D. por quatro a cinco dias, pois foi o tempo que os fungos endofíticos, também começaram a apresentar crescimento. Deste modo, a fim de se evitar com que estes se estabelecessem nas placas e dificultassem o isolamento dos organismos de interesse, realizou-se o isolamento das bactérias endofíticas. Entretanto, períodos mais longos de incubação além de possibilitarem o crescimento de bactérias com crescimento mais tardio, aumentam a probabilidade de isolamento daquelas que se apresentam em baixa quantidade de inóculo na planta. As bactérias endofíticas cresceram macroscopicamente ao redor dos órgãos vegetais, conforme ilustrado na figura 1, sendo possível obter 82 isolados, 56 provenientes de folha e 26 obtidos de colmo. Este número, provavelmente poderia ser maior, pois além do método dificultar o isolamento de colônias devido à forma de crescimento ao redor dos órgãos vegetais tonando difícil diferenciar àquelas que apresentam características distintas. Além disso, selecionou-se apenas aquelas capazes de se desenvolver no meio de cultura utilizado. Segundo Cerigioli, (2005) tais limitações aplicam-se à maioria dos estudos baseados em métodos de cultivo. Entretanto, esses métodos fornecem indicações relativas da estrutura da população microbiana. Deste modo, a quantidade de isolados totais obtidos não revela a real quantidade de isolados distintos, podendo muitos destes representantes ser da mesma espécie e que com auxílio, principalmente, da caracterização molecular poderão ser diferenciados. - 30 - Figura 1. Crescimento em meio TSA 10% das bactérias endofíticas oriundas de folha (A) e colmo (B). (A) (B) Fonte: o Autor 5.2. Isolado Fúngico A etapa de isolamento do fitopatógeno consistiu apenas em uma etapa inicial para estudos futuros de teste de antagonismo. Dentro deste contexto, o meio LCHA mostrou-se propício para o isolamento de Exerohilum turcicum, como relatado por De Rossi (2012), onde foi possível observar o crescimento dos esporos em microscópio esteroscópio, dois dias após a inoculação. O crescimento do micélio fúngico na placa pode ser observado na figura 2. Figura 2. Crescimento do fungo E. turcicum no meio de isolamento LCHA. Fonte: o Autor - 31 - O fungo encontra-se armazenado e será mantido na coleção do grupo DMS, para estudos futuros. 5.3. Extração do DNA Fúngico Foi possível realizar a extração do DNA fúngico, observando-se a formação do pelete no final do processo. Uma técnica muito utilizada para taxonomia de fungos é a amplificação da região ITS do rDNA por PCR. A região ITS está localizada entre os genes 18S rDNA e 28S rDNA e pode ser amplificada por oligonucleotídeos iniciadores específicos (HILLIS & DIXON, 1991), sendo frequentemente usada para taxonomia de espécies e gêneros (GOMES et al., 2002). Deste modo, Posteriormente será realizada a PCR, utilizando os primers ITS1 e ITS4, realizando-se o sequenciamento parcial da região intergênica, para confirmação do isolado obtido. 5.4. Análise Morfológica das Culturas Bacterianas A análise das culturas bacterianas fornece importantes características, que poderiam ser relevantes em isolados para serem testados no controle de fitopatógenos, como o E. turcicum. Até o presente, apenas 28 isolados foram caracterizados morfológica e molecularmente, sendo 14 isolados de folha e 14 de colmo. O crescimento em meio TSA 10% possibilitou o crescimento das culturas bacterianas para análise das características morfológicas. As bactérias apresentaram forma circular ou puntiforme; elevação plana, lente, convexa ou drop-like; borda inteira, ondulada ou lobada; superfície lisa, sendo translúcidas ou opacas; produção de muco escassa ou moderada; a consistência da massa de seca à gomosa; e a coloração creme, branca, amarela, laranja, rosa ou verdepreta. Foram observadas tanto bactérias Gram negativas como positivas, com tempo de crescimento entre um e dois dias. Entretanto, em relação às características morfológicas avaliadas (Anexo 5) pode-se observar que inicialmente o cluster divide as bactérias em 2 grandes grupos, um referente às Gram positivas e outro às Gram negativas (Figura 3). Nota-se também que algumas colônias apresentaram características iguais - 32 - agrupando-se no cluster, sendo elas: 14C e 13C; 01C, 03C e 04C; 10C e 13F; 06C e 07C; 12F, 09F, 08C, 11C e 10F; e 06F, 02F, 12C e 03F. Deste modo, morfologicamente 9 isolados de colmo apresentaram-se diferentes, assim como, 10 isolados de folha. Pode-se observar que entre os indivíduos agrupados alguns isolados de colmo e de folha parecem ser iguais. Pode-se observar que todas as bactérias com coloração laranja (06F, 02F, 12C, 03F 02C e 05 C) são Gram positivas. Além disso, os isolados 06F, 02F, 12C e 03F, apesar de diferirem morfologicamente dos isolados 02C e 05 C, compartilham de outras características como o tempo de crescimento de dois dias, forma puntiforme, borda inteira, superfície lisa e pouca produção de muco. Entretanto, algumas características diferem neste grupo, os isolados 06F, 02F, 12C e 03F, apresentam a elevação convexa para os primeiros e os 02C e 05 C, drop-like, assim como também há diferenças entre os isolados 02C e 05 C, onde o primeiro apresenta colônia com consistência gomosa e translúcida e o segundo com consistência aquosa e opaca. Já entre as Gram negativas as amarelas, também formam um subgrupo deparado dos demais (12F, 09F, 08C, 11C, 10F, 06C e 07C). Elas apresentam tempo de crescimento de 1 dia, forma puntiforme, borda inteira, superfície lisa, pouca produção de muco com consistência gomosa e aspecto translúcido. Entretanto o que a diferencia é a elevação tipo convexa dos isolados 12F, 09F, 08C, 11C e 10F e drop-like dos 06C e 07C. Os isolados 10C e 13F também apresentam iguais morfologicamente possuindo forma circular, elevação lente, borda inteira, superfície lisa, moderada produção de muco, com colônias gomosas e translúcidas. Entretanto, apresentarem características que os tornam diferentes, também compartilham de características similares, entretanto uma característica exclusiva compartilhada por este subgrupo é a moderada produção de muco. De uma forma geral, pode-se observar que as culturas bacterianas apresentaram crescimento rápido, entre um e dois dias. Entretanto à campo, na maioria das vezes, as condições são adversas e nem sempre propícias para a sobrevivência dos microrganismos. Deste modo, evolutivamente as bactérias desenvolveram mecanismos adaptativos que lhe conferem em situações de adversidade, melhor sobrevivência, como seria o caso da produção de - 33 - exopolissacarídeos (EPS). A grande diversidade de estruturas e de microrganismos produtores de exopolissacarídeos está relacionada às diferentes funções desempenhadas por essas moléculas (CHRISTENSEN, 1989). Talvez a principal função dos exopolissacarídeos na fisiologia microbiana seja a de promover a adesão das células, formando agregados (COSTERTON et al., 1995) Agregados de células bacterianas envoltos por EPS formam uma matriz altamente organizada e hidratada na qual múltiplas camadas de células estão embebidas. Entretanto, na análise morfológica realizada, as bactérias endofíticas apresentaram escassa à pouca produção de muco quando submetidas à cultivo em meio TSA 10 %, porém, visando que as condições se apresentavam satisfatórias para o seu crescimento, essa característica pode não ser expressa ou mesmo o meio de cultura pode não favorecer a sua produção, dependo da função que estes podem assumir nos biofilmes bacterianos. Segundo Ahimou et al. (2007), o teor de EPS de um biofilme pode variar em quantidade e carácter como um resultado de fatores ambientais. Inúmeros fatores ambientais têm sido relatados por promover a produção de EPS. Estes incluem altos níveis de oxigênio (BAYER et al., 1990), a disponibilidade limitada de nitrogênio (MIAN et al., 1978), dessecação (OPHIR & GUTNICK, 1994) a baixa temperatura (JUNKINS & DOYLE, 1992), baixo pH (RYU & BEUCHAT, 2004), e privação de nutrientes (MAO et al., 2001). Deste modo, a existência desta matriz confere às células uma série de vantagens seletivas, tais como a adesão à superfícies (BEVERIDGE & GRAHAM, 1991), proteção contra variações bruscas no macroambiente, aumento da variabilidade antigênica, retenção de íons e nutrientes (COSTERTON et al., 1987) e resistência à dessecação (ROBERSON & FIRESTONE, 1992). Assim, esta característica se apresenta como de grande interesse na veiculação de potenciais microrganismos de uso no controle biológico, por se apresentar como uma de suas estratégias de sobrevivência. - 36 - O BOXPCR, como já demonstrado por Hungria (2008), é um método eficiente e confiável. Deste modo, a caracterização morfológica nos oferece dados interessantes, mas que nem sempre revelam a realidade existente. Diferentemente da análise morfológica, pode-se observar que dos 14 isolados de colmo avaliados por técnicas moleculares, apenas 10 são realmente diferentes (Figura 4). Já quando se observa os isolados obtidos de folha, 12 isolados foram distintos. Ao se analisar os dois órgãos vegetais observa-se que apenas 1 isolado foi comum tanto à folha quanto ao colmo. Magnani (2005), isolando bactérias endofíticas de colmo e folha de cana de açúcar, identificados por sequenciamento parcial do gene 16S, também obteve isolados comum à folha e colmo, à nível de gênero. Embora testes de antagonismo não tenham sido realizados, os órgãos vegetais apresentam diferentes microrganismos peculiares que podem exercer algum efeito sobre o crescimento do E. turcicum. Tendo em vista que o fungo ataca a área foliar, justifica-se o interesse em se analisar tanto o órgão de ataque como órgãos próximos, como o colmo, que poderia facilmente difundir até a folha a toxina produzida pelas bactérias endofíticas antagonistas. Estas bactérias podem ser veiculadas tanto na forma de microbiolização de sementes, que consiste no envolvimento destas com o microrganismo de interesse, onde através de lesões provocadas pelo crescimento da planta há o seu estabelecimento no interior desta, assim como na forma de aspersão que seria a pulverização destes microrganismos sobre a superfície da folha. Shiomi (2007), trabalhando com milho, visando controlar a mancha de turcicum em condições de casa de vegetação, obteve resultados positivos com a inoculação de bactérias endofíticas tanto com a aplicação via pulverização, onde isolados B. subtilis 0G, B. lentimorbus Streptomyces sp. e B. agadhaerens se destacaram dos demais isolados, reduzindo a severidade da doença entre 16 e 39 %, em todos os intervalos de aplicação testados, 72 e 24 horas e no mesmo dia da inoculação do patógeno; quanto através da microbiolização das sementes com os isolados endofíticos, observou-se que os isolados B. lentimorbus, Streptomyces sp., Ewingella americana e Xanthomonas axonopodis foram os mais efetivos na redução da severidade da doença, com um controle relativo variando entre 23% e 35%. - 37 - Neste contexto, a bactéria endofítica isolada no presente trabalho que é comum a folha e colmo, mostra-se como um microrganismo a ser avaliado no teste de antagonismo que possui potencial de uso para ambas formas de aplicações, tendo em vista, que consegue colonizar diferentes órgãos vegetais. Caso esta bactéria seja realmente antagonista in vitro, pode haver um antagonismo mais severo à campo, devido à maior quantidade de toxinas que podem ser produzidas e difundidas, pela colonização de diferentes órgãos vegetais. - 38 - 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS Apenas uma parte do trabalho foi realizada até o presente momento, para estudos futuros haja vista a quantidade de isolados obtidos de folha e colmo, deve-se realizar uma triagem destas bactérias endofíticas, para se saber a real quantidade de isolados diferentes que possui. Assim como, a confirmação do isolado fúngico também deve ser realizada, tanto a nível morfológico como molecular. Com estes dados em mãos deve-se então realizar uma seleção qualitativa de antagonismo in vitro, procedendo-se ao teste de culturas pareadas. Aqueles que forem considerados promissores, devem então ser submetidos à um teste quantitativo de inibição e posteriormente veiculados de diferentes formas em testes de casa de vegetação e à campo, para avaliação do seu antagonismo em condições naturais. - 39 - 7. CONCLUSÕES O método de isolamento utilizado propiciou o isolamento de bactérias endofíticas e de E. turcicum do milho crioulo variedade Rosado. A análise molecular por BOX PCR permitiu diferir bactérias endofíticas que possuíam as mesmas características morfológicas, mostrando-se um método eficiente para diferenciar isolados. Os órgãos vegetais, colmo e folha, compartilham de poucos isolados. - 40 - 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGNANI, G. DE S. Diversidade De Bactérias Endofíticas Em Cana-De-Açúcar (Dissertação de mestrado em Bioquímica). Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2005. AHIMOU, F.; SEMMENS, M.J.; HAUGSTAD, G.; NOVAK, P.J. 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Methyl transferase, a polyketide biosynthetic enzyme from Dreschlera monoceras: purification and properties. J. Sci. Univ. Kelaniya, 2007. - 47 - Anexo 1. Laudo análise física do solo. - 48 - Anexo 2. Laudo análise química do solo - 49 - Anexo 3. Croqui do experimento (RS: Milho crioulo var.Rosado) - 51 - Anexo 5. Parâmetros da caracterização morfológica. GRAM Nº CLUSTER negativo 1C 1 DIAS CRESC positivo 1 dia 0 1 2 dias 0 Forma Circular Irregular Pontiforme 0 1 0 Plana Lente Convexa Elevação drop-like Umbonada Umbilicada 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 2C 0 1 0 1 0 0 3C 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 4C 1 0 1 0 0 0 5C 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 6C 1 0 1 0 0 0 7C 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 8C 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 9C 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 10C 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 11C 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 12C 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 13C 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 14C 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1F 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 2F 0 1 0 1 0 0 3F 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 4F 1 0 1 0 1 0 5F 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 6F 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 7F 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 8F 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 9F 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 10F 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 11F 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 12F 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 13F 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 14F 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 - 52 - Anexo 5. Continuação. Borda Superfície Denteada Filamentosa Produção de muco Nº CLUSTER Inteira Ondulada Lobada Lisa Rugosa Papilado Escassa Pouca Moderada Abrundandte 1C 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 2C 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 3C 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 4C 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 5C 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 6C 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 7C 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 8C 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 9C 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 10C 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 11C 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 12C 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 13C 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 14C 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1F 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 2F 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 3F 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 4F 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 5F 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 6F 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 7F 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 8F 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 9F 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 10F 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 11F 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 12F 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 13F 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 14F 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 - 53 - Anexo 5. Continuação. Consisência da massa de crescimento Detalhes ópticos Cor Nº CLUSTER Seca Aquosa Gomosa Viscosa Butírica Translúcida Opaca creme branco amarelo laranja rosa verde 1C 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 2C 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 3C 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 4C 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 5C 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 6C 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 7C 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 8C 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 9C 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 10C 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 11C 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 12C 0 1 0 0 0 0 1 0 0 13C 0 0 1 0 0 1 0 1 0 14C 0 0 1 0 0 1 0 1 1F 0 1 0 0 0 1 0 2F 0 1 0 0 0 0 1 3F 0 1 0 0 0 0 4F 0 0 1 0 0 5F 0 1 0 0 0 6F 0 1 0 0 7F 0 1 0 0 8F 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 9F 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 10F 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 11F 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 12F 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 13F 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 14F 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0
