Detecção e caracterização de isolados de vírus da Influenza em
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS ESCOLA DE VETERINÁRIA Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DO VÍRUS DA INFLUENZA EM SUÍNOS NO BRASIL DANIELA DE SOUZA RAJÃO Belo Horizonte Escola de Veterinária - UFMG 2012 Daniela de Souza Rajão DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DO VÍRUS DA INFLUENZA EM SUÍNOS NO BRASIL Tese apresentada à Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciência Animal. Área de concentração: Medicina Veterinária Preventiva. Orientador: Prof. Rômulo Cerqueira Leite Co-orientadores: Profa. Zélia Inês Portela Lobato Prof. Roberto Maurício Carvalho Guedes Belo Horizonte Escola de Veterinária - UFMG 2012 1 R161d Rajão, Daniela de Souza, 1983Detecção e caracterização de isolados do vírus da influenza em suínos no Brasil / Daniela de Souza Rajão. – 2012. 90p. : il. Orientador: Rômulo Cerqueira Leite Co-orientadores: Zélia Inês Portela Lobato, Roberto Maurício Carvalho Guedes Tese (doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinária Inclui bibliografia 1. Suíno – Doenças – Teses. 2. Vírus da influenza – Teses. 3. Imunohistoquímica – Teses. 4. Reação em cadeia da polimerase – Teses. I. Leite, Rômulo Cerqueira. II. Lobato, Zélia Inês Portela. III. Guedes, Roberto Maurício Carvalho. IV. Universidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. V. Título. CDD – 636.408 96 2 3 4 Dedico esta realização aos meus pais, Cid e Cecília, por serem meus maiores incentivadores; à minha irmã, Juliana, pelo companheirismo; ao Thiago, pelo carinho; ao avô Roberto, por ter sido minha inspiração, mesmo que distante. 5 6 AGRADECIMENTOS Aos meus pais, por serem meu exemplo de sucesso e me fazerem querer ser sempre melhor. À minha irmã e meu cunhado, pela amizade e apoio para desabafar nos momentos de tensão. Ao Thiago, pelo carinho e por ter entrado na minha vida para torná-la mais feliz. Sem vocês eu não teria conseguido! Ao Professor Rômulo Cerqueira Leite, exemplo profissional e principal motivador, sem o qual esta e outras conquistas não seriam possíveis. Foi o senhor quem fez tudo acontecer! À Professora Zélia Inês Portela Lobato e ao Professor Roberto Maurício Carvalho Guedes, essenciais para a realização deste doutorado, pelo incentivo e apoio constantes, pela paciência e por todos os ensinamentos. Aos membros da banca, Dra. Janice Reis Ciacci-Zanella, Dr. Jorge Caetano Júnior, Dr. Marcos Bryan Heinemann e Dr. Jenner Karlisson Pimenta dos Reis, pelas contribuições para aprimorar este trabalho. Aos Laboratórios Ipeve e Microvet, e ao Médico Veterinário José Eustáquio Cavalcante, pelo fornecimento das amostras utilizadas neste estudo. À EMBRAPA Suínos e Aves, ao LANAGRO Minas Gerais e ao Dr. Alexandre Machado, pelo fornecimento das amostras referência de vírus influenza. Ao Dr. Kurt Rossow pelo fornecimento de controle positivo para a Imuno-histoquímica. Aos colegas Diego Hussin, Marcela Gasparini e Bruno Brasil pelo imenso auxílio no desenvolvimento deste estudo, indispensáveis para a conclusão desta tese. Aos Professores Jenner Karlisson Pimenta dos Reis e Marcos Bryan Heinemann, que fizeram parte de toda a minha trajetória na Escola de Veterinária e foram essenciais para o meu crescimento. Às amigas do Retrolab, Fernanda, Helen, Fabiana e Gissandra, pela ajuda na elaboração deste trabalho e por tornarem os momentos no laboratório mais prazerosos. Aos demais companheiros do Retrolab, pelas opiniões e ideias, sempre bem-vindas. À Dra. Amy Vincent, por abrir as portas para um novo mundo na pesquisa, e por proporcionar meu crescimento profissional e pessoal ao me receber em seu laboratório. À Dra. Crystal Loving, não só pelos ensinamentos, mas por fazer a minha estadia nos EUA inesquecível. Aos amigos do Swine Lab, no USDA, em especial à Pravina Kitikoon, Jamie Henningson, Doug Braucher e Phill Gauger, pela acolhida e pelos ótimos momentos vividos juntos. Aos amigos da veterinária e do colégio, em especial às amigas Jú, Flávia, Lets, Marcela e Fê, pelos maravilhosos momentos de descontração para reduzir a tensão do dia-a-dia. Aos funcionários do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, em especial ao Eduardo, Grazielle, Graciela, Anita e Doraci, pela disponibilidade e apoio. Ao Colegiado de Pós-Graduação, pelo acompanhamento e auxílio. À CAPES pelo apoio financeiro ao meu doutorado e ao CNPq/Labex pelo apoio financeiro ao doutorado SWE; ao CNPq e à FAPEMIG, pelo financiamento deste projeto. Ao INCT-Pecuária pelo apoio a este projeto. 7 SUMÁRIO ABREVIAÇÕES E SIGLAS ..................................................................................................... 13 RESUMO .................................................................................................................................... 15 ABSTRACT ................................................................................................................................ 16 INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 17 CAPÍTULO 1: REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................... 18 Classificação e caracterização do vírus Influenza ....................................................................... 18 Genes e proteínas virais ............................................................................................................... 19 Restrição de hospedeiros ............................................................................................................. 20 Evolução genética do vírus Influenza .......................................................................................... 20 Histórico do vírus Influenza em suínos ....................................................................................... 21 Epidemiologia .............................................................................................................................. 21 Influenza suína e saúde pública ................................................................................................... 23 H1N1 pandêmico 2009 ................................................................................................................ 24 Patogênese ................................................................................................................................... 24 Sinais clínicos e lesões ................................................................................................................. 25 Resposta imune ............................................................................................................................ 26 Diagnóstico .................................................................................................................................. 27 Prevenção e vacinação ................................................................................................................. 28 CAPÍTULO 2: EVIDÊNCIA SOROLÓGICA DA CIRCULAÇÃO DO VÍRUS INFLUENZA EM SUÍNOS DE MINAS GERAIS, BRASIL ................................................ 31 Introdução .................................................................................................................................... 31 Material e Métodos ...................................................................................................................... 31 Resultados .................................................................................................................................... 33 Discussão ..................................................................................................................................... 34 CAPÍTULO 3: IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO CLÍNICO- PATOLÓGICA DO VÍRUS INFLUENZA EM SUÍNOS NO BRASIL ........................................................... 36 Introdução .................................................................................................................................... 36 Material e Métodos ...................................................................................................................... 36 1. Amostras clínicas ............................................................................................................. 36 2. Isolamento viral em cultivo celular .................................................................................. 37 3. Reação de hemaglutinação (HA)...................................................................................... 38 4. Imunocitoquímica............................................................................................................. 38 5. Titulação viral de amostras isoladas................................................................................. 38 8 6. 7. 8. 9. 10. 11. Extração de RNA e transcrição reversa............................................................................ 38 PCR em tempo real .......................................................................................................... 39 Clonagem e construção da curva padrão .......................................................................... 40 Quantificação de amostras positivas pela PCRrt.............................................................. 41 Diagnóstico histológico e imuno-histoquímico ............................................................. 41 Análise estatística .......................................................................................................... 41 Resultados .................................................................................................................................... 42 1. Achados clínicos .............................................................................................................. 42 2. Isolamento viral, hemaglutinação e imunocitoquímica.................................................... 42 3. RT-PCR em tempo real e quantificação ........................................................................... 42 4. Diagnóstico histológico e imuno-histoquímico................................................................ 44 Discussão ..................................................................................................................................... 46 CAPÍTULO 4: PERFIL SOROLÓGICO PARA O VÍRUS DA INFLUENZA EM GRANJAS COMERCIAIS DE SUÍNOS NO BRASIL .......................................................... 48 Introdução .................................................................................................................................... 48 Material e Métodos ...................................................................................................................... 48 Resultados .................................................................................................................................... 50 Discussão ..................................................................................................................................... 53 CAPÍTULO 5: CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DOS VÍRUS INFLUENZA ISOLADOS DE SUÍNOS NO BRASIL EM 2009 E 2010 ...................................................... 57 Introdução .................................................................................................................................... 57 Material e Métodos ...................................................................................................................... 58 1. Amostras clínicas ............................................................................................................. 58 2. Extração de RNA e transcrição reversa............................................................................ 59 3. PCR para segmentos HA e NA ........................................................................................ 59 4. Sequenciamento de nucleotídeos e análise filogenética ................................................... 60 Resultados .................................................................................................................................... 61 1. Isolados virais ................................................................................................................... 61 2. Análise filogenética .......................................................................................................... 61 3. Análise de sítios antigênicos e de ligação a receptores .................................................... 62 Discussão ..................................................................................................................................... 69 CAPÍTULO 6: CONCLUSÃO ................................................................................................. 72 BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................... 73 ANEXO I .................................................................................................................................... 87 9 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Genes dos vírus Influenza A e suas funções...............................................................19 Tabela 2. Ocorrência da influenza suína no Brasil para animais e rebanhos............................. 34 Tabela 3. Títulos de Inibição da Hemaglutinação para rebanhos positivos e negativos............ 34 Tabela 4. Percentual de animais com anticorpos contra múltiplos antígenos de vírus influenza em Minas Gerais, Brasil............................................................................. 34 Tabela 5. Conjunto de iniciadores e sondas para uso na PCR quantitativa em tempo real para detectar ácidos nucléicos do vírus influenza após isolamento viral........................... 39 Tabela 6. Caracterização das granjas estudadas......................................................................... 49 Tabela 7. Caracterização das amostras virais estudadas............................................................ 59 Tabela 8. Conjunto de iniciadores para uso na PCR para sequenciamento dos genes hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) completos dos vírus Influenza A.......... 60 Tabela 9. Sequências de vírus Influenza A depositadas no GenBank com maior identidade de nucleotídeos para os vírus isolados de suínos (A/swine/Brazil/1-17/2009 e A/swine/Brazil/18-20/2010) e de humano (A/Minas Gerais/21/2009)...................... 63 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Diagrama ilustrativo da estrutura do vírus influenza A. HA: hemaglutinina; NA: neuraminidase; NP: nucleoproteína; M1/M2: matriz; PA: polimerase ácida; PB1/PB2: polimerase básica....................................................................................... 18 Figura 2. Mapa das mesorregiões em que as granjas estudadas estavam localizadas............... 32 Figura 3. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o vírus da influenza suína (SIV) H1N1, H3N2 SIV e vírus influenza humano H1N1 nas granjas positivas. Amostras negativas (titulo <40); com título baixo (40 e 80); título médio (160 e 320); e título alto (≥640)............................................................................................. 33 Figura 4. Figura esquematizando os procedimentos realizados para detecção do vírus influenza em fragmentos de pulmão suíno................................................................ 37 Figura 5. Gráficos de amplificação na PCR em tempo real para detecção de ácidos nucleicos da proteína ribossomal canina S26 (A) e do vírus influenza (B)................................43 Figura 6. Gráficos representativos da curva padrão da PCR em tempo real quantitativa para quantificação de ácidos nucleicos do vírus influenza. Gráfico da eficiência da reação (A) e de amplificação da curva padrão (B)..................................................... 43 10 Figura 7. Fotomicrografias de fragmentos de pulmão suíno com lesões histológicas (A, C, E) e detecção de antígenos do vírus Influenza A pela Imuno-histoquímica (B, D, F). (A): Parede bronquial com infiltrado neutrofílico e linfocítico intenso na lamina própria da mucosa e submucosa, particularmente ao redor de glândulas bronquiais. Hematoxilina e eosina, 100X. (B): Marcação positiva em vermelho da nucleoproteína viral no citoplasma de células do epitélio bronquiolar, 200X. (C): bronquiolite necrotizante com descamação do epitélio bronquiolar devido à necrose e infiltração linfocitária na lamina própria, 100X. (D): mesma área de C, corada pela imuno-histoquímica, com intensa marcação no epitélio de revestimento bronquiolar remanescente, 100X. (E): Intenso infiltrado inflamatório neutrofílico no lúmen alveolar, associado ao espessamento de septo interlobular devido ao edema e discreto infiltrado linfocitário, 40X. (F): Intensa marcação positiva em vermelho para nucleoproteína viral em glândulas (setas) e epitélio bronquiais, 40X.......................................................................................................... 45 Figura 8. Perfil sorológico para os vírus influenza suíno clássico (cH1N1) e pandêmico (pH1N1) nas granjas estudadas. As médias geométricas dos títulos de anticorpos após transformação logarítmica foram comparadas entre as fases de criação das granjas positivas. Letras diferentes, minúsculas para cH1N1 e maiúsculas para pH1N1, indicam diferenças significativas (P<0,05). Granjas amostradas antes (G1 a G3a) e após (G3b a G6) a pandemia H1N1 2009 em humanos. A linha pontilhada indica o ponto de corte.............................................................................. 51 Figura 9. Distribuição dos títulos de anticorpos contra os vírus da influenza clássico (cH1N1) e pandêmico (pH1N1) das diferentes fases de criação nas granjas estudadas com resultados positivos. Amostras negativas (titulo <40); com título baixo (40 e 80); título médio (160 e 320); e título alto (≥640). Diferenças significativas (P<0,05) entre a distribuição de títulos numa mesma fase de criação das diferentes granjas estão indicadas por letras diferentes. G3b a G6 = granjas 3b a 6, que obtiveram resultados positivos na Inibição da Hemaglutinação................... 52 Figura 10. Estados onde estão localizadas as granjas nas quais os vírus influenza foram isolados. N= número de propriedades analisadas por Estado.....................................61 Figura 11. Análise filogenética dos isolados brasileiros de suínos e de humano. Árvore construída pelo método Neighbor-Joining de (A): HA (1658nt) e (B): NA (1363nt). Foram incluídas na análise sequências de genes HA e NA de vírus H1N1 pandêmico e de vírus sazonais H1N1 e H1N2 isoladas de suínos e humanos no mundo. A análise de HA (A) mostra quatro diferentes clusters (α, β, γ, δ) de vírus H1 endêmicos em suínos norte-americanos, indicado por chaves à direita da árvore. Losango fechado: amostras de vírus influenza pandêmico H1N1 2009 isoladas de suínos neste estudo; losango aberto: amostra de vírus influenza pandêmico H1N1 isolada de humano neste estudo; A/swine/Brazil/12A/2010: amostra de vírus influenza pandêmico previamente isolada no Brasil....................... 64 11 Figura 12. Dendrograma dos genes HA (A) e NA (B) dos isolados suínos e humano brasileiros, construída pelo método de Neighbor-Net. Sequências dos genes HA e NA de vírus pandêmicos humanos e suínos depositadas no GenBank foram incluídas na análise. Números 1 a 20: isolados suínos; número 21: isolado humano, destacado por borda preta; quadrado cinza: isolados brasileiros deste estudo; círculos pretos: sequências depositadas no Genbank e utilizadas como referência; pH1N1: sequências refêrencia de vírus pandêmicos de humanos; pH1N1swine: sequências refêrencia de vírus pandêmicos de suínos; quadrado cinza com borda preta = isolados brasileiros deste estudo idênticos a amostras depositadas no GenBank............................................................................................ 66 Figura 13. Alinhamento das sequências da hemaglutinina subunidade 1 (HA1) dos isolados pandêmicos H1N1 suínos e humano brasileiros. As sequências foram alinhadas e numeradas usando a proteína HA1 madura. Pontos representam aminoácidos iguais aos da sequência consenso A/Mexico/4108/2009 (número de acesso GenBank GQ162170). Retângulos grandes: sítios antigênicos (Sa, Sb, Ca1, Ca2 e Cb); triângulos: resíduos de aminoácidos nos sítios de ligação ao receptor; asterisco: alteração observada no resíduo 203............................................................ 68 Figura 14. Alinhamento das sequências da proteína neuraminidase (NA) dos isolados pandêmicos H1N1 suínos e humano brasileiros. Pontos representam aminoácidos iguais aos da sequência consenso A/Mexico/4108/2009 (número de acesso GenBank GQ162169). Triângulos: resíduos de aminoácidos associados com resitência a drogas anti-virais; asteriscos: alterações nos resíduos 106 e 248............ 69 12 ABREVIAÇÕES E SIGLAS AEC = Amino-etilcarbazol BALT = Tecido linfoide bronco-associado CDC = Center for Disease Control and Prevention cDNA = DNA complementar cH1N1 = Vírus H1N1 suíno clássico CO2 = Dióxido de carbono DNA = Ácido desoxirribonucléico DNAse = Desoxirribonuclease dNTP = Desorribonuleotídeo trifosfatado ECP = Efeito citopático EDTA = Ácido etilenodiamino tetra-acético EID50 = Dose infecciosa 50% em ovos FAO = Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação g = Força centrífuga HA = Hemaglutinina ou Reação de hemaglutinação HA0 / 1 / 2 = Hemaglutinina molécula única/ subunidade 1 / subunidade 2 HCL = Ácido clorídrico HE = Hematoxilina e eosina HI = Reação de inibição da hemaglutinação IAV = Vírus Influenza A IC = Intervalo de confiança ICQ = Imuno-citoquímica IF = Imunofluorescência IFNα = Interferon alfa IgA / G / M = Imunoglobulina A / G / M IHQ = Imuno-histoquímica IL = Interleucina IM = Intramuscular KCl = Cloreto de potássio KH2PO4 = Hidrogenofosfato de Potássio LANAGRO/MG = Laboratório Nacional Agropecuário de Minas Gerais M = Matriz ou Molar MAPA = Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MDCK = Células Madim-Darby de rim canino MEM = Meio essencial mínimo MgCl2 = Cloreto de magnésio MgSO4 = Sulfato de magnésio MHC = Complexo de Histocompatibilidade Principal mL = Mililitro mM = Milimolar NA = Neuraminidase NaCl = Cloreto de sódio NaOH = Hidróxido de sódio NeuAc α2,3/α2,6 = Ácido siálico N-acetilneuramínicos ligado à galactose α2,3/α2,6 ng = Nanograma NP = Nucleoproteína 13 NS = Não estrutural nt = Nucleotídeo ºC = Graus Celsius OFFLU = Rede de vigilância em influenza animal OIE = Organização Mundial de Saúde Animal OMS = Organização Mundial de Saúde p/v = Peso por volume PA = Polimerase ácida PB1 = Polimerase básica 1 PB2 = Polimerase básica 2 pb = Pares de bases PBS = Tampão salina fostato PCR = Reação em cadeia da polimerase PCV2 = Circovírus suíno tipo 2 pH1N1 = Vírus H1N1 pandêmico PRCV = Coronavírus respiratório suíno PRRSV = Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína q. s. p. = Quantidade Suficinte Para RIDT = Teste rápido para detecção do vírus influenza RNA = Ácido ribonucleico RNAse = Ribonuclease RNC = Região não-codificadora RNP = Complexo ribonucleoproteína rpm = Rotações por minuto rt = Tempo real RT = Transcrição reversa S26 = Proteína ribossomal canina S26 SFB = Soro fetal bovino SIV = Vírus influenza suíno SN = Soroneutralização TCID50 = Dose infecciosa 50% em cultura de tecido TNFα = Fator de necrose tumoral alfa U = Unidades µg = Micrograma µL = Microlitro µm = Micrômetro µM = Micromolar 14 RESUMO O vírus influenza A (IAV) é um importante causador de doença respiratória em suínos, mas a epidemiologia da influenza suína no Brasil ainda é desconhecida. O objetivo deste estudo foi detectar a infecção pelo IAV em suínos do Brasil; fazer a caracterização de cepas virais isoladas; e avaliar o perfil sorológico em granjas antes e após a pandemia de 2009. Foram utilizadas 355 amostras de soro de suínos de 17 granjas de Minas Gerais e 86 amostras de pulmão de 39 granjas de Minas Gerais, São Paulo, Mato Grosso, Santa Catarina, Rio Grande do Sul e Paraná. Dez amostras de soro de cada fase da produção de granjas coletadas antes (3) e após (4) 2009 foram utilizadas no perfil sorológico. As amostras de soro foram testadas pela inibição da hemaglutinação (HI) e as amostras de pulmão foram submetidas ao isolamento viral e à reação em cadeia da polimerase em tempo real (rtPCR). A caracterização genética foi realizada em 21 isolados. No levantamento sorológico, 158 amostras (44,5%) e 11 granjas (64,7%) foram positivas para o vírus suíno (SIV) H1N1; 36 animais (10,1%) e quatro granjas (23,5%) para H3N2 SIV; e 136 animais (38,3%) e 10 granjas (58,8%) para o vírus H1N1 humano. No isolamento viral, 31 amostras foram positivas e 36 na rtPCR. Das 86 amostras de pulmão, 60 foram submetidas à imuno-histoquímica e 38 (63,3%) foram positivas. No perfil sorológico, apenas granjas amostradas após 2009 eram positivas e com queda de anticorpos na creche. Todos os isolados foram agrupados com vírus pandêmicos H1N1. Este estudo comprova a circulação do IAV em suínos no Brasil, inclusive de vírus humanos, ressaltando a importância do suíno na epidemiologia da Influenza. Palavras-chave: Influenza; suíno; granja; inibição da hemaglutinação; PCR; imunohistoquímica; caracterização genética, H1N1 pandêmico, Brasil. 15 ABSTRACT Influenza A virus (IAV) is an important pathogen causing respiratory disease in pigs. However, influenza epidemiology in Brazilian pigs is still unknown. The aim of this study was to detect IAV infection in Brazilian pigs; characterize isolated viruses; and evaluate the serological profile in swineherds prior and after 2009 pandemics. Serum samples of 355 animals from 17 herds in Minas Gerais and 86 swine lung samples from 39 herds in Minas Gerais, São Paulo, Mato Grosso, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, and Paraná were used. Ten serum samples from each production phase from herds sampled before (3) and after (4) 2009 were used for the serological profile. Serum samples were tested by hemagglutination inhibition (HI), and lung samples were tested by virus isolation and real time polymerase chain reaction (rtPCR). Genetic characterization was performed in 21 isolates. In the serological survey, 158 animals (44.5%) and 11 herds (64.7%) were positive for swine virus (SIV) H1N1; 36 animals (10.1%) and 4 herds (23.5%) for SIV H3N2; and 136 animals (38.3%) and 10 herds (58.8%) for human H1N1 virus. Virus was isolated from 31 lung samples and 36 were positive for rtPCR. Sixty lung samples were tested by immunohistochemistry and 38 (63.3%) were positive. For the serological profile, only herds sampled after the pandemic were naturally infected and showed maternal derived antibodies decay in nursery stage. All isolates were clustered with pandemic H1N1 influenza when sequenced. This study shows influenza virus is circulating in Brazilian pigs, mainly human origin viruses, and proves the importance of the swine for influenza epidemiology. Keywords: Influenza; swine; herd; hemagglutination inhibition; PCR; immunohistochemistry; genetic characterization, pandemic H1N1, Brazil. 16 INTRODUÇÃO A Influenza é uma zoonose viral que representa um problema econômico e para a saúde pública e animal em todo o mundo. Os vírus Influenza A infectam várias espécies de mamíferos e aves, sendo que a transmissão interespécie pode ocorrer. Os vírus influenza apresentam alta variabilidade genética, principalmente nas duas proteínas principais da superfície viral, hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). Essas alterações genéticas podem levar à formação de novos subtipos e novas cepas virais contra os quais a população humana não possui imunidade, o que pode resultar na ocorrência de pandemias. Alguns vírus Influenza estão adaptados à espécie suína, circulam nos rebanhos suínos mundiais, e são endêmicos em diversos países, causando perdas consideráveis na produção. No Brasil, estudos sobre o vírus da influenza em suínos são escassos e não foram capazes de identificar os subtipos e cepas virais endêmicas, mas comprovaram a infecção nos rebanhos suínos nacionais. O suíno pode se infectar tanto com vírus de origem aviária, quanto de origem humana, e apresenta potencial para atuar como hospedeiro intermediário na transmissão de vírus aviários para humanos. Dessa forma, essa espécie tem um papel importante na epidemiologia da Influenza, pois participa na formação de novos vírus, dificultando o controle da Influenza em outras espécies. Existe uma rede de vigilância da Influenza humana formada por diversos países do mundo e coordenada pela Organização Mundial de Saúde (OMS), com o intuito de monitorar as cepas dos vírus da Influenza circulantes anualmente nos dois hemisférios e definir a melhor cepa vacinal. Além disso, foi criada uma rede de vigilância da Influenza animal (OFFLU) englobando diversos países, através da parceria entre a Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) e a Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO), para trocar informações científicas e conhecimentos, com o intuito de reconhecer e caracterizar cepas do vírus Influenza infectando animais, promovendo segurança alimentar mundial e o bem estar animal. A OMS em associação com a OIE preconizam o monitoramento da Influenza em suínos visando identificar vírus tipo aviários capazes de causar infecção em humanos. Entretanto, não existe um sistema de monitoramento do vírus influenza em suínos no Brasil, medida que é fundamental para avaliar os efeitos da infecção nos plantéis nacionais e identificar os variantes virais existentes. A pouca informação sobre a infecção pelo vírus influenza em suínos no Brasil e a não associação do vírus a surtos respiratórios nos plantéis nacionais limitam a elaboração e implantação de medidas preventivas. Portanto, este estudo é um passo importante para determinar a real situação em que se encontra a infecção por esse vírus nos rebanhos brasileiros, permitindo elaborar medidas de prevenção e sistemas ideais para monitoramento. 17 CAPÍTULO 1: REVISÃO DE LITERATURA Classificação e caracterização do vírus Influenza A Influenza é uma doença respiratória altamente contagiosa que acomete humanos e animais. Os vírus influenza são membros da família Orthomyxoviridae (do grego orthos: padrão, ordenado; e myxo: muco) (Palese e Shaw, 2007). A família Orthomyxoviridae possui cinco gêneros diferentes: Influenza A, Influenza B, Influenza C, Thogotovirus e Isavirus (King et al., 2011). Os vírus influenza dos tipos A, B e C são diferenciados de acordo com características antigênicas distintas entre suas proteínas internas do nucleocapsídeo (NP) e da matriz (M) (Palese e Shaw, 2007). Os vírus influenza do tipo A podem ser classificados em diferentes subtipos com base nas características antigênicas de suas glicoproteínas de superfície, hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). Até o momento, 16 subtipos de HA e nove subtipos de NA foram identificados (Fouchier et al., 2005). Os vírus influenza A (IAV) infectam naturalmente uma variedade de espécies aviárias e de mamíferos, incluindo humanos, suínos e equinos. Vírus Influenza B infectam apenas humanos, enquanto que os vírus influenza C infectam principalmente humanos, mas também foram isolados em suínos (Webster et al, 1992; Palese e Shaw, 2007). Os vírus influenza apresentam genoma segmentado composto por RNA fita simples senso negativo. Os genomas dos vírus influenza A e B são divididos em oito segmentos (Palese e Schulman, 1976; Ritchey et al., 1976; Palese et al., 1977) (Fig. 1), enquanto que o dos vírus influenza C apresentam apenas sete segmentos (Palese e Shaw, 2007). O vírus possui um envelope 18 lipídico derivado da membrana plasmática da célula hospedeira, onde estão embebidas as proteínas HA, NA e matriz 2 (M2), se projetando na superfície viral. Cada segmento de RNA viral é envolto por várias moléculas de nucleoproteínas (NP), formando o complexo ribonucleoproteína (RNP) (Nayak, et al. 2004). As três subunidades da RNA polimerase (polimerase básica 1 - PB1, polimerase básica 2 - PB2 e polimerase ácida - PA) se ligam à extremidade 3’ do RNP, que por sua vez é envolto pela proteína da matriz 1 (M1) (Palese e Shaw, 2007). A partícula viral é pleomórfica, podendo ser encontrada na forma esférica ou filamentosa. Os vírus isolados de humanos e animais geralmente apresentam partícula filamentosa de diâmetro uniforme (diâmetro ~80nm), mas após o cultivo em laboratório a forma viral esférica (diâmetro de 80-120 nm) é observada mais comumente (Chopin et al., 1960). Figura 1. Diagrama ilustrativo da estrutura do vírus influenza A. HA: hemaglutinina; NA: neuraminidase; NP: nucleoproteína; M1/M2: matriz; PA: polimerase ácida; PB1/PB2: polimerase básica. Fonte: Horimoto et al., 2005. Genes e proteínas virais O genoma do vírus Influenza A consiste em RNA fita simples, dividido em oito segmentos que codificam 11 proteínas virais (Tab. 1) (Ritchey et al, 1976). Todos os segmentos de RNA viral do Influenza A possuem sequências conservadas nas terminações 5’ (13 nucleotídeos) e 3’ (12 nucleotídeos) da região não codificadora (RNC), seguidas de sequências específicas para cada segmento (Skehel e Hay, 1978; Desselberger et al., 1980). Tabela 1. Genes dos vírus Influenza A e suas funções. Segmento Gene Tamanho (nt) Função 1 PB 2 2341 Transcriptase: polimerase, início da transcrição 2 PB1 2341 Transcriptase: polimerase, extensão do RNAv 3 PA 2233 Transcriptase: polimerase, replicação do RNAv 4 HA 1778 Hemaglutinina: ligação à célula hospedeira 5 NP 1565 Nucleoproteína: ligação do RNA, parte do complexo RNP, transporte núcleo-citoplasma do RNAv 6 NA 1413 Neuraminidase: liberação viral 7 M 1027 Matriz: M1 maior componente do vírion, estrutural M2 canal de íon da membrana 8 NS 890 Não-estrutural: NS1 transporte de RNA, montagem, tradução, antagonista de interferon NS2/NEP: proteína de exportação nuclear do RNAv RNAv = RNA viral; Fonte: Adaptado de Webster et al., 1992 A glicoproteína HA é o antígeno de superfície mais importante do vírus influenza e principal alvo para a resposta imune do hospedeiro, é altamente variável e com frequente substituição de aminoácidos (Skehel e Wiley, 2000). A molécula da HA tem aparência de espiga, com a cabeça arredondada e um corpo transmembrana (Webster et al., 1992). A HA é importante determinante de virulência e de especificidade de hospedeiros, pois media a ligação inicial do vírus a receptores de ácido siálico na célula hospedeira, mas também participa da liberação do complexo RNP no citoplasma através da fusão com a membrana do endossomo (Shinya et al., 2006; Nicholls et al., 2008). Nas células infectadas, a HA é inicialmente sintetizada na forma precursora como molécula polipeptídica única (HA0). A clivagem proteolítica da HA0 é necessária para a infectividade do vírus e crucial para a patogenicidade viral (Taubenberger, 1998; Steinhauer, 1999). A HA0 é clivada por endoproteases tipo-tripsina do hospedeiro em duas subunidades, HA1 e HA2, ligadas entre si por ligações dissulfeto (Taubenberger, 1998). A subunidade HA1 forma a extremidade distal que contém os sítios de atividade antigênica e o sítio de ligação ao receptor. A subunidade HA2 contém uma sequência altamente conservada de aminoácidos hidrofóbicos que insere a glicoproteína na bicamada lipídica (Schoch e Blumenthal, 1993; Cross et al., 2001). A glicoproteína NA também é um antígeno de superfície do vírus influenza, tem aparência de cogumelo e, como a HA, sofre 19 constantes variações antigênicas. Sua atividade enzimática cliva receptores presentes na mucina que impedem o acesso aos receptores da membrana (Gottschalk, 1957), auxiliando na penetração na célula hospedeira, além de atuar na liberação e disseminação da progênie viral (Matrosovich et al., 2004). Além disso, determinantes de resistência a antivirais foram detectados na proteína NA (Le et al., 2005) e M (Marozin et al., 2002). Os seis segmentos restantes codificam proteínas estruturais e acessórias (Tab. 1). Uma proteína acessória adicional, PB1-F2 pode ser codificada pelo segmento 2, conferindo virulência aos vírus, pois induz apoptose em células imunes ao se associar a proteínas mitocondriais (Chen et al., 2001). Restrição de hospedeiros Análises filogenéticas indicam que todos os 16 subtipos de HA e nove subtipos de NA do vírus influenza A já foram detectados em espécies aviárias, o que sugere que os vírus influenza de mamíferos vieram de reservatórios aviários. Além disso, a infecção geralmente não causa doença em aves silvestres, sugerindo que o vírus é adaptado a esse hospedeiro (Webster et al., 1992). Embora a transmissão interespécie dos vírus influenza tenha sido demonstrada (Koopmans et al., 2004; Li et al., 2004; Crawford et al., 2005; Newman et al., 2008), os vírus influenza apresentam algumas restrições de hospedeiros e a infecção de novos hospedeiros não resulta em transmissão adequada entre eles. Vírus influenza aviários não replicam eficientemente em humanos (Beare e Webster, 1991), enquanto que vírus influenza humanos não replicam eficientemente em aves (Hinshaw et al., 1983). Os vírus influenza A apresentam afinidade da glicoproteína HA com 20 receptores de ácido siálico distintos. Vírus humanos reconhecem preferencialmente receptores de ácido siálico Nacetilneuramínicos (NeuAc) ligados à galactose por uma ligação do tipo α2,6 (NeuAc α2,6Gal), pois as células epiteliais da traqueia humana possuem receptores com ligação do tipo NeuAc α2,6Gal (Couceiro et al., 1993), enquanto que vírus aviários e equinos geralmente reconhecem receptores de ácido siálico com ligação α2,3 (NeuAc α2,3Gal) (Ito, 2000; Gambaryan et al., 2005), uma vez que células da traqueia de cavalos e do cólon de aves possuem receptores com esse tipo de ligação (Ito, 2000). Os suínos apresentam ambos os receptores em seu epitélio respiratório (Kida et al., 1994; Gambaryan et al., 2005). Portanto o suíno é susceptível à infecção com vírus humanos e aviários e pode servir de hospedeiro intermediário ou “sítio de mistura” (mixing vessel) para esses patógenos (Ito e Kawaoka, 2000; Ma et al., 2009). No entanto, os receptores de ácido siálico parecem estar distribuídos de forma irregular no trato respiratório dos suínos, com receptores NeuAc α2,3Gal presentes em menor abundância no trato superior, o que leva à pior replicação de vírus aviários nas traqueia e fossas nasais de suínos, dificultando a transmissão de vírus aviários entre suínos (Lipatov et al., 2008; Van Poucke et al., 2011). Existem casos em que humanos se infectaram com vírus aviários, através do contato com animais dessa espécie, mas a transmissão desse vírus humano-humano é limitada (Shinya et al., 2006). Evolução genética do vírus Influenza As populações de vírus influenza estão em constante evolução e apresentam ampla diversidade genética, resultante de mecanismos distintos como: i) recombinação genética; ii) mutação pontual ou antigenic drift; e iii) rearranjo ou antigenic shift (Webster et al., 1982; 1992). i) Recombinação pode gerar variantes novas do vírus influenza através da troca de informação genética, que ocorre quando a polimerase muda o molde ou quando segmentos de ácido nucléico são quebrados e reunidos. Por exemplo, dois vírus aviários de baixa patogenicidade podem ser revertidos em um vírus de alta patogenicidade após a inserção de 21 nucleotídeos do segmento M no segmento HA do outro (Pasick et al., 2005). Em geral, a recombinação é mascarada pela baixa atividade biológica dos vírus recombinantes, mas, em casos de pressão seletiva, podem resultar em vantagem para a linhagem recombinante. ii) Mutação ou antigenic drift resulta do acúmulo de mutações pontuais resultantes da baixa fidelidade da RNA polimerase e sua inabilidade de correção de erros (Hampson, 2002). Essas mutações ocorrem principalmente em genes que codificam as glicoproteínas de superfície, HA e NA, e resultam da pressão de seleção imposta pelos mecanismos de defesa do hospedeiro (Wright et al., 2007). Embora a maioria das novas variantes não seja viável, algumas podem apresentar vantagens e se tornar dominantes. Na população humana, novas variantes do vírus causam doença grave e podem levar à morte de pacientes com depressão imunológica. Entretanto, antigenic drift no segmento HA do vírus influenza suíno é limitada e ocorre em segmentos sem atividade antigênica (Brown et al., 1997), provavelmente devido à baixa seleção imune em suínos, resultante da constante introdução de animais sem proteção. iii) Rearranjo ou antigenic shift é a troca de segmentos de diferentes vírus que ocorre em uma célula co-infectada com dois ou mais vírus. Esse mecanismo resulta em grande variação antigênica das glicoproteínas HA e NA, podendo gerar novos subtipos e introduzir novas cepas virais em populações não imunizadas (Wright et al., 2007). A introdução de novos vírus pode levar à ocorrência de pandemias, como foi o caso da emergência do novo H1N1 (Smith et al., 2009). Histórico do vírus Influenza em suínos O primeiro relato da infecção pelo vírus influenza A (IAV) em suínos ocorreu nos Estados Unidos durante a pandemia de 1918 (Gripe Espanhola), quando foi documentado um surto de doença respiratória aguda em suínos semelhante àquele observado em humanos no mesmo período, que levou à morte de 40 milhões de pessoas em todo o mundo (Koen, 1919 citado por Zimmer e Burke, 2009). A etiologia infecciosa da Influenza suína foi confirmada em 1931, quando Robert Shope, um veterinário, foi capaz de causar doença em animais sadios utilizando secreções filtradas de animais doentes (Shope, 1931). Mais tarde Shope sugeriu que o vírus suíno e o vírus humano pandêmico de 1918 eram antigênica e geneticamente semelhantes, o que foi confirmado por estudos moleculares recentes. Entretanto, ainda não se sabe se o vírus original foi transmitido de suínos para humanos ou de humanos para suínos (Shope e Francis, 1936; Reid et al., 2001). Epidemiologia A introdução da Influenza em um rebanho geralmente está associada à movimentação e introdução de novos animais (Olsen et al., 2006a). A secreção nasal de animais infectados apresenta altos títulos infecciosos durante a fase aguda da infecção (2 a 5 dias após a exposição) e é a principal fonte de transmissão, que ocorre pela via nasofaringeal (Brankston et al., 2007). A 21 transmissão respiratória ocorre através de gotículas e aerossóis, pelo contato direto entre animais, mas também contato indireto com objetos e superfícies contaminadas (Bridges et al., 2003). O vírus se mantém viável por 8 a 12 horas em superfícies porosas (tecido e papel) e por até 48 horas em superfícies não porosas (metal) e nas mãos (Bean et al., 1982). Já em aerossóis, pode permanecer viável por até 24 horas em ambiente com umidade relativa do ar baixa (Brankston et al., 2007). Embora surtos da doença sejam mais comuns em meses mais frios, a doença ocorre durante todo o ano, principalmente em regiões sem grandes variações de temperatura (Hinshaw et al., 1978; Olsen et al., 2000; Caron et al., 2010). Em rebanhos comerciais de ciclo completo infectados, geralmente todos os animais entram em contato com o vírus até a idade de abate (Vincent et al., 2008). Atualmente, três diferentes subtipos do IAV (H1N1, H1N2 e H3N2) circulam na população de suínos em todo o mundo e, ao contrário do que ocorre com vírus influenza de humanos, os vírus suínos têm origem e caracterização distinta nos diferentes continentes (Vincent et al., 2008). Nos EUA a doença está em constante circulação e acredita-se que cerca de 50% dos suínos possuam anticorpos contra H1N1 (Chambers et al., 1991). Na Europa, vírus H1N1 e H3N2 se tornaram endêmicos em algumas regiões, com prevalências que chegam a 80% e 58%, respectivamente (Van Reeth et al., 2008). Até a década de 90, a Influenza suína na América do Norte era causada quase que exclusivamente pelo vírus suíno clássico H1N1 (cH1N1), que permaneceu antigênica e geneticamente conservado desde sua introdução em 1918 (Vincent et AL., 2008). No final da década, entretanto, vírus do subtipo H3N2 de dois genótipos diferentes passaram a circular nos rebanhos americanos: um vírus de rearranjo duplo, contendo genes de vírus humano (HA, NA, 22 PB1) e do suíno clássico (NS, NP, M, PB2, PA); e um vírus de rearranjo triplo, contendo genes de vírus humano (HA, NA, PB1), suíno (NS, NP, M) e aviário (PB2, PA) (Zhou et al., 1999; Vincent et al., 2008). Desses, apenas o rearranjo triplo se manteve na população suína, cuja co-circulação com cH1N1 levou ao aparecimento de novos rearranjos (Webby et al., 2000) que são endêmicos no rebanho suíno americano e canadense, incluindo H3N2 (Webby et al., 2000), H1N1 rearranjado (Webby et al., 2004) e H1N2 (Choi et al., 2002a; Karasin et al., 2002). A maior parte das linhagens do IAV que circulam nos rebanhos norte-americanos atualmente são rearranjos com combinações diversas de HA e NA com genes internos de vírus humanos, suínos e aviários (Ito, 2000), conhecidos como genes internos de rearranjo triplo (TRIG), com PB1 de linhagem humana, PB2 e PA de linhagem aviária, e NP, M e NS de linhagem suína (Vincent et al., 2008). Na Europa, os vírus H1N1 são de origem aviária e foram introduzidos na população suína por patos selvagens em 1979 (Pensaert et al., 1981). Já o vírus H3N2 foi introduzido na população suína no início da década de 70 e tinha todos os segmentos originados do vírus humano (Castrucci et al., 1993). Essa linhagem inicial do H3N2 suíno circulou no continente Europeu até a década seguinte, mas a partir daí a linhagem originada do rearranjo entre o vírus tipo humano H3N2 (HA e NA) com o vírus H1N1 tipo aviário (proteínas internas e não estruturais) passou a ser predominante (Jong et al., 2007). O vírus H1N2 emergiu no Reino Unido no início dos anos 90 e se tornou endêmico nos suínos da Europa (Lam et al., 2007). Essa linhagem contém genes de origem humana (HA e NA) e derivados do vírus Europeu tipo aviário H1N1. Os subtipos H1N1 e H3N2 estão amplamente disseminados nos rebanhos asiáticos (Li et al., 2004). Na Coréia do Sul, ambos os subtipos estão disseminados em quase todo o território, e a co-infecção entre os subtipos existe (Jung et al., 2002; 2007). Na China, o cH1N1 é o vírus influenza predominante infectando suínos, mas os vírus de origem aviária H1N1 (Guan et al., 1996) e H3N2 (Kida et al., 1988) também foram relatados no país. Os vírus H3N2 que circulam em suínos na Tailândia são relacionados a linhagens suínas da América do Norte, Ásia e Europa e também à linhagem humana, e o H1N1 circulante é principalmente relacionado a um vírus humano “tipo-suíno”, mas também a vírus endêmicos suínos norte-americanos (Chutinimitkul et al., 2008). O subtipo H1N2 circula em suínos na Ásia desde a década de 70 (Sugimura et al., 1980) e possui NA de vírus humano e os outros sete segmentos do cH1N1 (Ito et al., 1998). Evidências da circulação do vírus H1N1 e H3N2 foram relatadas em estudos sorológicos na Argentina (Teodoroff et al., 2003; Piñeyro et al., 2007). No Brasil, existem evidências sorológicas da circulação do vírus H1N1 e H3N2 nos estados do RS, SC, PR, SP, MG, MS, MT e GO, com ocorrência de 2,2 e 16,7% em animais, e 11,8 e 50,9% em propriedades para H1N1 e H3N2, respectivamente. Tentativas de isolamento e caracterização dos vírus circulantes foram realizadas, mas sem muito sucesso (Brentano et al, 2002; Mancini et al, 2006; Schaefer et al, 2008). Recentemente, um estudo relatou a prevalência sorológica de 46% de granjas e 20% de animais infectados com H3N2 no Paraná (Caron et al., 2010). Alguns subtipos distintos também foram isolados em suínos, principalemte em animais de países asiáticos, como o H9N2 e o H5N1 isolados na China (Li et al., 2004), o H3N1 isolado em Taiwan (Tsai e Pan, 2003), mas também o H2N3 isolado nos EUA (Ma et al., 2007), o H1N7 no Reino Unido (Brown et al., 1997) e H3N8 no Brasil (Schaefer et al., 2011a). Influenza suína e saúde pública Além do suíno contribuir para a geração de vírus com potencial pandêmico para a população humana, o IAV também apresenta potencial zoonótico (Thacker e Janke, 2008; Neumann et al., 2009). Infecções de humanos com vírus influenza de suínos foram relatadas na América do Norte, Europa e Ásia, geralmente envolvendo indivíduos com contato direto com suínos, e sem distinção de sinais clínicos das infecções com vírus humanos (Alexander e Brown, 2000; Gregory et al., 2003). A maioria dos casos ocorreu pela infecção com o vírus cH1N1, embora casos de infecção com vírus tipo aviário H1N1, rearranjos H3N2 e rearranjos H1N1 também tenham sido relatados em humanos (Gray et al., 2007; revisado por Myers et al., 2007; Newman et al., 2008). Alguns casos de infecções humanas com IAV de suínos sem qualquer contato com esses animais foram relatados, sugerindo a disseminação do vírus suíno de humano para humano (revisado por Myers et al., 2007), como são os casos do Fort Dix (Gaydos et al., 1977) e do vírus Influenza H1N1 2009 (Neumann et al., 2009). A presença de receptores para vírus humanos e aviários no trato respiratório de suínos (Ito e Kawaoka, 2000) e sua capacidade de atuar como “sítio de mistura” fazem dessa espécie um potencial hospedeiro intermediário dos vírus influenza. Dessa forma, o suíno tem papel importante na epidemiologia da influenza humana e pode ser responsável pelo surgimento de cepas virais com potencial pandêmico para a população não imunizada (Brown, 2000). 23 H1N1 pandêmico 2009 Patogênese Em março de 2009, um novo vírus de origem suína H1N1 (pH1N1) foi identificado em humanos e se disseminou rapidamente na população mundial, levando a Organização Mundial de Saúde a declarar fase de pandemia 6 após poucas semanas (CDC, 2009b). O vírus replica em células epiteliais de todo o trato respiratório, como mucosa nasal, tonsilas, traqueia, pulmão e linfonodos traqueo-bronquiais (Nicholls et al., 2007). A infecção geralmente fica restrita ao trato respiratório, mas a viremia de curto prazo e título baixo já foi detectada em casos raros (Brown et al., 1993). No entanto, o vírus não foi detectado em nenhum tecido não respiratório (Vincent et al., 2009a; Brookes et al., 2010). O tropismo por tecidos específicos ocorre devido à expressão de proteases necessárias para a ativação viral (Rot et al., 1995). O pulmão é o principal órgão alvo da infecção e títulos virais podem chegar a 109 dose infecciosa 50% em ovo (EID50/mL) (Haesebrouck et al., 1985), uma vez que o IAV apresenta tropismo elevado pelo epitélio bronquiolar e se replica rapidamente nessas células (Brown et al., 1993; Olsen et al., 2006a). O novo vírus pH1N1 é resultante do rearranjo quádruplo entre vírus influenza tipo aviários circulantes em suínos na Europa e Ásia, e vírus de rearranjo triplo circulantes em suínos norte-americanos (Smith et al., 2009). Portanto, o H1N1 pandêmico possui genes derivados de linhagens aviárias (PB2 e PA), humanas H3N2 (PB1) e do vírus suíno clássico (HA, NP e NS) presentes no vírus norte americano, e genes derivados do vírus suíno tipo aviário da Eurásia (NA e M) (Smith et al., 2009). O pH1N1 pode infectar e se disseminar em suínos (Lange et al., 2009; Brookes et al., 2010) e a infecção natural de suínos com o vírus pandêmico já foi demonstrada em diversos países, geralmente relacionada ao contato prévio com seres humanos que apresentavam sinais clínicos respiratórios (Pasma e Joseph, 2010; Pereda et al., 2010; Sreta et al., 2010; Schaefer et al., 2011c). Suínos infectados pelo pH1N1 apresentam sinais clínicos e lesões semelhantes aos observados na infecção pelo IAV sazonal (Pasma e Joseph, 2010; Pereda et al., 2010) e a resposta imune gerada por exposição prévia a vírus endêmicos resulta apenas em proteção parcial contra o pH1N1 (Vincent et al., 2010b). Além disso, animais infectados apresentaram eliminação viral nas secreções respiratórias por 11 a 20 dias, período mais prolongado que na infecção pelo influenza suíno sazonal (Lange et al., 2009; Pasma e Joseph, 2010; Pereda et al., 2010). 24 As lesões celulares causadas diretamente pelo IAV estão atribuídas a apoptose, desencadeada pelas proteínas NA e PB1-F2 (Schultz-Cherry e Hinshaw, 1996; Gibbs et al., 2003). No entanto, as citocinas próinflamatórias iniciais, produzidas por células não imunes no local da infecção durante a fase aguda, possuem papel fundamental para o desenvolvimento da reação inflamatória local e de alguns sinais clínicos sistêmicos. As citocinas iniciais como o Interferon-α (IFNα), fator de necrose tumoral-α (TNFα), interleucina-1 (IL-1) e IL-6, têm sido associadas à ocorrência de febre, prostração e anorexia (Van Reeth, 2000; Jo et al., 2007). TNFα e IL-1 estimulam moléculas quimioatrativas de neutrófilos e macrófagos, como IL-8, levando à rápida infiltração dessas células fagocíticas no trato respiratório (Ulich et al., 1991). As citocinas tardias são produzidas principalmente pelos linfócitos T após reconhecimento de antígenos, e são moduladores importantes da resposta imune específica (La Gruta et al., 2007). Apesar de participar no estímulo à resposta inflamatória, as citocinas iniciais e tardias também contribuem para a injúria pulmonar, com aumento da permeabilidade vascular, hemorragia e edema (Ulich et al., 1991). A duração da infecção pelo IAV é curta e o clearance viral é extremamente rápido. Não é possível detectar o vírus na secreção nasal e no pulmão a partir de sete dias após a infecção natural ou experimental (Brown et al., 1993; Jo et al., 2007). Sinais clínicos e lesões A Influenza suína é uma doença aguda de rebanho, com alta morbidade (pode chegar a 100%) e baixa mortalidade (inferior a 1%). As principais perdas econômicas da Influenza resultam dos altos custos de medicações, mortalidade aumentada e produtividade diminuída nos rebanhos acometidos. O aparecimento da doença é súbito, após um período de incubação de um a três dias e recuperação rápida após quatro a sete dias (Maes et al., 1984). A doença clínica geralmente é restrita a animais susceptíveis sem proteção imune contra o vírus, e a faixa etária mais acometida em propriedades de ciclo completo é de animais com idade de até 16 semanas (creche, recria e terminação) (Loeffen et al., 2009). As manifestações clínicas da infecção pelo IAV em suínos são febre (40,5 a 41,7°C), apatia, inapetência, prostração e anorexia, que resultam em perda de peso significativa. Tosse, espirros, conjuntivite, rinite e descargas nasais são sinais comuns da infecção. Sinais de angústia respiratória, como respiração abdominal e com a boca aberta, podem ocorrer (Alexander e Brown, 2000; Richt et al., 2003). Ocasionalmente alguns sinais reprodutivos podem ser observados, como abortos, natimortos, infertilidade e leitegadas pequenas e fracas (Wallace e Elm, 1979; Vannier, 1999; Wesley, 2004). Além da doença clínica aparente, a doença subclínica ocorre frequentemente. Diversos fatores podem alterar a gravidade de sinais clínicos, como estado imune do animal, idade, infecções concomitantes e condições climáticas (Olsen et al., 2006a). Apesar de geralmente resultar em doença branda, a infecção por IAV em suínos pode apresentar complicações quando ocorre infecção intercorrente com outros patógenos. A infecção bacteriana secundária com Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis e Streptococcus suis tipo 2 pode aumentar a gravidade e a duração de sinais clínicos da Influenza (Thacker et al., 2001; Choi et al., 2003). A co-infecção com vírus respiratórios, como Coronavírus Respiratório Suíno (PRCV), Circovírus Suíno tipo 2 (PCV2) ou Vírus da Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suína (PRRSV), também pode agir como fator de complicação da Influenza, aumentando o curso e a gravidade da doença (Choi et al., 2003; Hansen et al., 2010). As alterações patológicas são predominantes nos lobos apical e cardíaco e os lobos diafragmático e acessório são menos afetados. Macroscopicamente observa-se consolidação vermelho-escura bem demarcada, geralmente na porção crânioventral. Edema pulmonar grave, principalmente nos septos interlobulares, e pleurite serosa ou serofibrinosa são achados comuns na necropsia, além de vias aéreas repletas de exsudato fibrinoso a mucopurulento e linfonodos mediastinais edemaciados (Olsen et al., 2006a). Achados microscópicos comuns consistem em necrose e descamação das células epiteliais bronquiolares e acúmulo de restos celulares, fluído proteináceo e leucócitos no lúmen de vias aéreas (Van Reeth et al., 2008). Também podem ser observadas 25 infiltração leucocitária peribronquial e perivascular, e pneumonia intersticial de intensidade variada (Richt et al., 2003). Resposta imune A resposta imune contra a infecção com IAV é rápida, envolve tanto a imunidade humoral como a celular, e resulta no clearance viral completo dentro de uma semana após a infecção. A infecção leva à ativação da imunidade inata e liberação de IL-6 e IFNα pelas células epiteliais, além de estimular a atividade de células natural killers (NK) para lise de células infectadas (Wright et al., 2007). A correlação entre a resposta humoral e a resposta mediada por células é necessária para desencadear a imunidade protetora contra a infecção com o vírus influenza. A imunidade humoral tem papel importante na prevenção e resistência contra a infecção e contra a manifestação clínica. Os anticorpos produzidos durante a infecção são direcionados contra as proteínas HA, NA, M e NP, no entanto apenas aqueles específicos contra HA e NA são capazes de neutralizar a infectividade viral, enquanto que os demais podem interferir na liberação da progênie viral da célula hospedeira (Cox et al., 2004). Todas as principais imunoglobulinas (IgA, IgG e IgM) podem ser identificadas na infecção pelo IAV em soro e lavados nasal e broncoalveolar de suínos (Heinen et al., 2000). Anticorpos específicos contra o vírus Influenza podem ser detectados no soro três dias após a infecção e em suabes nasais quatro dias após a infecção (Lee et al., 1993). A IgA secretória é a principal imunoglobulina neutralizante contra o IAV no trato respiratório e é detectada em altos títulos na secreção nasal e broncoalveolar após a fase aguda (Heinen et al., 2000). A proteção clínica contra a Influenza geralmente está diretamente relacionada aos níveis de anticorpos capazes de inibir a hemaglutinação (HI), que são direcionados 26 contra a proteína HA (Cox et al., 2004). Os anticorpos HI podem ser detectados de sete a 10 dias após a infecção e apresentam pico entre duas e três semanas, se mantendo em níveis elevados por várias semanas. Os títulos começam a declinar por volta de 10 semanas após a infecção, mas são mantidos até o abate (Renshaw, 1975; Desrosiers et al., 2004; Van Reeth et al., 2004). Títulos consideráveis de anticorpos podem ser detectados até seis meses após a infecção (Olsen et al., 2006a). Após a recuperação da infecção primária, é estabelecida a imunidade duradoura. Diante de um contato secundário, o sistema imune monta resposta rápida e forte. No entanto, a proteção imune humoral contra uma nova infecção só ocorre contra vírus homólogos, mas a infecção com vírus diferentes pode ocorrer (Vincent et al., 2008). Anticorpos maternos são capazes de reduzir a manifestação clínica, mas não impedem a infecção com vírus diferentes. Em rebanhos com circulação viral contínua, animais lactentes podem se infectar e eliminar vírus nas secreções mesmo na presença de anticorpos passivos, mas quanto maior os níveis de anticorpos, menor a gravidade de sinais clínicos (Renshaw, 1975; Loeffen et al., 2003a; Kitikoon et al., 2006; Vincent et al., 2008). A imunidade celular tem papel importante na recuperação da Influenza e no clearance viral (Flynn et al., 1998; Woodland et al., 2001), mas não contribui significativamente na prevenção da infecção. Linfócitos específicos para o IAV foram detectados no sangue, linfonodos do trato respiratório, mucosa faríngea e nasal e no baço de animais infectados experimentalmente (Larsen et al., 2000). A lise de células infectadas é mediada por linfócitos TCD8+ em associação com anticorpos específicos e com o Complemento (Cox et al., 2004). A resposta T citotóxica contra o IAV pode ser detectada a partir de sete dias de infecção em suínos e os TCD8+ apresentam reatividade cruzada contra vírus Influenza do mesmo tipo (Larsen et al., 2000). A lise de células infectadas por células TCD8+ ocorre através da apresentação de peptídeos pelos receptores do Complexo de Histocompatibilidade Principal de classe I (MHC I) e sua atividade é direcionada aos epítopos mais conservados das proteínas NP e M (Heinen, 2002). Diagnóstico O diagnóstico definitivo da infecção pelo IAV em suínos deve ser realizado através da associação entre diagnóstico clínico e laboratorial, uma vez que outras afecções respiratórias apresentam sinais clínicos semelhantes. A Influenza pode ser diagnosticada através de isolamento viral, detecção de RNA e/ou proteínas virais, ou pela detecção de anticorpos específicos. A detecção de anticorpos contra o IAV não indica necessariamente infecção atual, uma vez que anticorpos podem ser detectados vários meses após a infecção (Olsen et al., 2006a). O IAV pode ser isolado de secreções respiratórias coletadas através de suabe nasal ou naso-faringeal de animais vivos, durante a fase aguda da doença. Em animais eutanasiados ou que morrerem durante o estágio agudo, amostras de tecido de traqueia ou pulmão podem ser utilizadas para isolamento. Suabes e amostras de tecido devem ser mantidos refrigerados a 4°C para serem testados em até 48 horas. Em caso de estoque por maior período, as amostras devem ser mantidas a -80°C, uma vez que o vírus não é estável a -20°C (OIE, 2010). As suspensões preparadas a partir de suabes nasais ou de tecidos podem ser inoculadas na cavidade alantoide de ovos embrionados com 10 a 11 dias de incubação ou em cultura de células. A confirmação da presença do vírus é realizada através da reação de Hemaglutinação (HA) (Meguro et al., 1979; Clavijo et al., 2002). A técnica padrão para isolamento do vírus influenza é a inoculação em ovos embrionados, entretanto devido à sua longa duração, o isolamento em cultura de células MadinDarby de rim canino (MDCK) é amplamente utilizado. Entretanto, é necessária a utilização de meio de cultura contendo tripsina, importante para a clivagem da HA (Tobita et al., 1975; Herman et al., 2005). Técnicas moleculares para identificar material genético do vírus vêm sendo aprimoradas e largamente utilizadas no diagnóstico da Influenza, uma vez que apresentam alta sensibilidade, rapidez de resultados e possibilidade de teste de grande número de amostras ao mesmo tempo (Hall et al., 2009). A transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) tem sido amplamente utilizada na detecção de vírus humanos e animais (Schorr et al., 1994; Lorusso et al., 2010), e algumas RT-PCR multiplex para detecção e subtipagem simultâneas do vírus já foram desenhadas (Choi et al, 2002b; Lee et al., 2008). A RTPCR em tempo real é amplamente utilizada, apresenta maior sensibilidade e segurança que a RT-PCR convencional, além de gerar resultados mais rápidos (Spackman et al., 2002). Os testes rápidos para detecção do vírus influenza (RIDT) detectam antígenos virais em secreções respiratórias (lavados ou suabes) através de imunoensaios enzimáticos ou ópticos, geram resultados rápidos (30 minutos) e têm custo baixo, mas sua eficiência depende do tipo e qualidade da amostra e do tipo do vírus Influenza a ser testado (Gavin e Thomson, 2003; CDC, 2009a). Mas esses testes parecem ter baixa sensibilidade para o vírus pandêmico 2009 (Drexler et al., 2009). Atualmente, a reação de inibição da hemaglutinação (HI) é o método sorológico mais utilizado para detecção da infecção causada pelo IAV. Esse teste baseia-se na habilidade da proteína HA da superfície viral de aglutinar eritrócitos e na presença no soro de anticorpos capazes de inibir tal atividade. 27 Alguns problemas do teste estão relacionados à presença de inibidores inespecíficos da hemaglutinação ou à ocorrência frequente de alterações genéticas dos vírus circulantes, que podem levar a resultados errôneos (Wood et al., 1994; Julkunen et al., 1985). Além da HI, também podem ser utilizados o teste de soro neutralização (SN) e o ensaio de imunoadsorção ligada à enzima (ELISA) (Julkunen et al., 1985). Atualmente existem testes ELISA comerciais disponíveis para detecção de anticorpos contra H1N1 e H3N2 (Lee et al., 1993; Leuwerke et al., 2008), que são de fácil execução e geram resultados rápidos, mas que demonstraram uma sensibilidade reduzida e custo elevado (Yoon et al., 2004). A SN detecta anticorpos neutralizantes capazes de impedir a infecção do vírus em células (Leuwerke et al., 2008). Esse teste é trabalhoso e é vírus-específico (Julkunen et al., 1985). A existência de anticorpos maternos contra o IAV em leitões lactentes ou desmamados pode levar à ocorrência de resultados falso-positivos nos métodos sorológicos (Kitikoon et al., 2006). Outros métodos de detecção do IAV ou seus antígenos são a reação de imunofluorescência (IF) em tecido pulmonar, células nasotraqueais ou lavado broncoalveolar; ou imunohistoquímica (IHQ) em tecidos fixados em formol e embebidos em parafina (Vincent et al., 1997). A IF gera resultados mais rápidos que o isolamento, mas exige habilidade técnica e necessita de microscópio de fluorescência (Rabalais et al., 1992; Selleck et al., 2003). A IHQ é um teste relativamente rápido, de baixo custo e de fácil execução. O vírus presente em células epiteliais, macrófagos ou pneumócitos, pode ser visualizado e sua presença pode ser associada a lesões microscópicas características da doença (Vincent et al., 1997). Esse teste também é útil em estudos retrospectivos em que tecidos frescos podem não estar disponíveis (Haines et al., 1993). 28 Prevenção e vacinação As principais formas de prevenção da Influenza suína são a biossegurança e a vacinação. Algumas medidas podem prevenir a introdução do vírus em uma propriedade, como o controle da entrada de novos animais, quarentena, limpeza e desinfecção de instalações antes da entrada de um novo lote e prevenção do contato com outras espécies, especialmente aves ou humanos com sinais de influenza (Olsen et al., 2006a). Segregação e depopulação parcial de animais infectados, além de medidas rigorosas de higiene são essenciais para controlar a disseminação do IAV dentro de um plantel e para minimizar os efeitos da doença no rendimento econômico da granja (Kothalawala et al., 2006). A vacinação é o método específico mais utilizado na prevenção da Influenza suína, geralmente utilizado em fêmeas reprodutoras. As vacinas atuais são compostas por vírus inativado re-suspendido em adjuvante oleoso, sendo geralmente preparadas por propagação em ovos embrionados (Ma et al., 2010). A vacinação induz altos títulos de IgG pulmonar e sistêmica em cerca de 2-6 dias, que reduzem a ocorrência e gravidade de sinais clínicos, mas a proteção total só ocorre quando a proteína HA vacinal é geneticamente relacionada à HA do vírus que causa a infecção (vírus homólogos). No entanto, a replicação e eliminação viral em secreções respiratórias são reduzidas (Poland et al., 2001; Kothalawala et al., 2006). A vacinação em plantéis susceptíveis geralmente consiste de duas aplicações pela via intramuscular (IM) com intervalo de duas a quatro semanas entre elas (Olsen et al., 2006a). Vacinas comerciais para suínos contra IAV estão disponíveis em vários países. Como existem diferenças genéticas e antigênicas entre as cepas virais circulantes nos diferentes continentes, a composição vacinal também difere. Nos Estados Unidos, são utilizadas vacinas bivalentes contendo cH1N1 e rearranjo triplo H3N2, mas também existem vacinas trivalentes ou mesmo pentavalentes contendo vírus de rearranjo (Kitikoon et al., 2006; Vincent et al., 2008; Vincent et al., 2010a). Na Europa, as vacinas utilizadas são compostas por vírus H1N1 (A/New Jersey/8/76 ou Sw/Netherlands/25/80) e vírus H3N2 (A/Port Chalmers/1/73) (Van Reeth et al., 2003). A constante variação genética que ocorre nos vírus influenza de suínos resultou numa ampla diversidade de IAV circulando nos suínos do mundo. A influenza suína não é mais considerada sazonal, e existe um número elevado de variantes virais circulando, dificultando, assim, a produção de vacinas comerciais eficazes. Consequentemente, o uso de vacinas autógenas com cepas específicas do rebanho de origem está aumentando como medida alternativa de controle da enfermidade (Vincent et al., 2008; Ma e Richt, 2010). A utilização de vacinas autógenas preparadas de culturas de vírus após inativação deve ser restrita àquele rebanho e de acordo com a legislação vigente no país, além de que o acompanhamento veterinário deve ser preconizado (BRASIL, 2003; Ma e Richt, 2010). Vacinas vivas modificadas são capazes de aumentar a imunidade local e promover proteção cruzada para outros subtipos (Thacker e Janke, 2008). Entretanto a utilização de vacinas vivas gera a possibilidade de rearranjo entre vírus vacinais e vírus de campo e o surgimento de novos vírus, portanto vacinas vivas para Influenza não estão disponíveis para suínos (Erdmann e Crabtree, 2006). Vacinas de DNA são uma alternativa para a proteção contra a Influenza e vêm sendo amplamente estudadas. Esse tipo de vacina utiliza DNA viral para a produção de antígenos virais intracelulares que serão apresentados por moléculas MHC I e MHC II, induzindo a resposta humoral e celular de longa duração (Thacker e Janke, 2008). Vacinas de DNA mostram-se vantajosas por levarem à produção de resposta imune contra diversos subtipos e não sofrerem interferência de anticorpos maternos (Kim e Jacob, 2009). Entretanto, testes experimentais mostraram que são eficientes apenas como estímulo primário e que existe a necessidade de revacinação com vacinas inativadas convencionais (Heinen et al., 2002; Larsen e Olsen, 2002). Além disso, existe a preocupação de integração do DNA vacinal à célula hospedeira, aumentando o risco de malignidade e ocorrência de doenças auto-imunes (Kim e Jacob, 2009). Vetores vacinais contra a infecção com IAV vêm sendo estudados para suínos, utilizando alphavirus (Vander Veen et al., 2009), adenovírus (Wesley et al., 2004) ou vírus da pseudoraiva (Tian et al., 2006). O uso de baculovírus vem sendo utilizado na vacinação de humanos e aves, mas ainda não é empregado em suínos (King Jr et al., 2009). Embora a ocorrência de antigenic drift nos suínos seja menos frequente que em humanos, a variabilidade genética e antigênica do IAV resulta na perda de eficácia vacinal devido à discordância entre o antígeno vacinal e a amostra viral circulante no campo. Dessa forma, a vigilância epidemiológica global do IAV é uma ferramenta necessária para a atualização frequente de cepas circulantes e para melhorar os resultados vacinais (Thacker e Janke, 2008; Ma e Richt, 2010). Além disso, outro obstáculo importante para a vacinação bem sucedida é a presença de anticorpos maternos, que consequentemente reduz a eficiência vacinal e aumenta a incidência da doença na fase em que os níveis de anticorpos colostrais reduzem. Anticorpos passivos podem suprimir a resposta de anticorpos e de linfócitos T específicos para o IAV resultante da vacinação (Kitikoon et al., 2006). 29 A cartografia antigênica é uma ferramenta importante para auxiliar na vacinação, é um método computacional que permite a visualização da distância antigênica entre antígenos e anti-soros, auxiliando na detecção de reação cruzada entre eles (de Jong et al., 2007; Garten et al., 2009; Lorusso et al., 2011). Além da vacinação, drogas antivirais podem ser utilizadas para controlar a Influenza. 30 Bloqueadores dos canais de íon M2 (amantadina e rimantadina) e inibidores da NA (zanamivir e oseltamivir) são exemplos de drogas utilizadas no tratamento da Influenza em humanos. No entanto, não existe nenhum tratamento antiviral contra IAV aprovado para uso em suínos, e seu emprego não é economicamente viável (Vincent et al., 2008). CAPÍTULO 2: EVIDÊNCIA SOROLÓGICA DA CIRCULAÇÃO DO VÍRUS INFLUENZA EM SUÍNOS DE MINAS GERAIS, BRASIL1 Introdução O vírus da influenza suína (SIV) é um Orthomixovirus que causa doença respiratória aguda em suínos. A doença é caracterizada por surtos explosivos, com alta morbidade e baixa mortalidade (Olsen et al., 2006a). Sinais clínicos comuns da influenza suína são hipertermia, anorexia, tosse e descargas nasais (Brown, 2000). Desde seu primeiro relato em 1931 (Shope, 1931), três subtipos de SIV têm circulado na população de suínos mundial (H1N1, H1N2 e H3N2), entretanto estes subtipos diferem na origem e caracterização genética em diferentes continentes e regiões (Olsen et al., 2006a). O vírus influenza suíno clássico H1N1 (cH1N1) era o subtipo predominante nos Estados Unidos (Chambers et al., 1991), mas a introdução de um novo vírus H3N2 em 1998 levou a rearranjos que resultaram na circulação de outros genótipos H1N1, bem como de novos subtipos H1N2 e H3N1 (Vincent et al., 2008). Na Europa, o vírus H1N1 tipo aviário se tornou o subtipo predominante infectando suínos, mas o vírus rearranjo H3N2 suíno também é endêmico em rebanhos suínos europeus (Van Reeth et al., 2008). A infecção pelo SIV na população suína brasileira não é bem definida, e apenas poucos estudos evidenciam essa infecção 1 Artigo publicado na revista Influenza and Other Respiratory Viruses, DOI: 10.1111/j.17502659.2012.00366.x. Ver ANEXO I. por diagnóstico sorológico (Brentano et al., 2002; Mancini et al., 2006). Minas Gerais é o Estado com o quarto maior efetivo de suínos do Brasil, representando 12,9% do total de animais. Além disso, o município com maior efetivo está situado em Minas (Uberlândia) (IBGE, 2010). Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a presença de anticorpos contra o vírus influenza em suínos e demonstrar sua circulação no Estado de Minas Gerais, Brasil. Material e Métodos Foram utilizadas 355 amostras de soro originadas de explorações de suínos de Minas Gerais, gentilmente cedidas pelo Laboratório Microbiologia Veterinária Especial (MICROVET). As amostras de sangue foram coletadas entre Janeiro e Março de 2009, anteriormente à ocorrência da pandemia H1N1 2009, através de punção da veia jugular. As amostras foram centrifugadas e, após separação do soro, mantidas a -20ºC até o processamento. O tamanho amostral e a localização das propriedades foram baseados na disponibilidade de amostras do banco de soros. Foram testados animais na idade de reprodução (marrãs e porcas) em 17 granjas comerciais de suínos distribuídas ao acaso no Estado de Minas Gerais, localizadas nas mesorregiões: Triângulo Mineiro; Zona da Mata; Metropolitana de Belo Horizonte; Sul e Sudoeste; Oeste; Norte e Noroeste de Minas (Fig. 2). Em cada propriedade foram testados pelo menos 10 animais. Os rebanhos eram de ciclo completo com sistema “todos dentro - todos fora”, localizados em áreas com alta densidade de suínos e sem histórico de vacinação para SIV. Nenhum sinal respiratório foi relatado nos animais amostrados. 31 Figura 2. Mapa das mesorregiões em que as granjas estudadas estavam localizadas. Cada amostra foi testada com três vírus referência, um humano A/WSN/1933 (H1N1) (H1N1h) e dois suínos: A/swine/Iowa/15/1930 (H1N1) (H1N1 SIV) gentilmente cedido pelo Laboratório Nacional Agropecuário em Minas Gerais (LANAGRO-MG); e A/swine/Iowa/85482/98 (H3N2) (H3N2 SIV) gentilmente cedido pela EMBRAPA Suínos e Aves. Os vírus foram cultivados em ovos embrionados com 10 dias de incubação. Os ovos foram inoculados na cavidade alantoide com 0,1mL de inóculo e incubados a 35-37°C por 4 dias. Diariamente foi realizada a ovoscopia para detectar possível morte do embrião. Caso ocorresse morte nas primeiras 24 horas após a inoculação, o ovo era descartado, se a morte ocorresse após 24 horas o líquido alantoide era coletado, clarificado a 2000 rpm por 20 minutos e armazenado a -80ºC (WHO, 2002; OIE, 2010). As amostras de soros testadas contra os vírus H1N1 foram inativadas a 56°C por 30 minutos e tratadas com suspensão de Caolin 20% por 20 minutos. Em seguida foram tratadas com suspensão de hemácias de galo 0,5% por 30 minutos, para eliminar inibidores inespecíficos e aglutininas séricas. Após centrifugação a 1500rpm por cinco minutos foi coletado o sobrenadante (soro 32 tratado) para ser utilizado na reação de inibição da hemaglutinação (HI) (WHO, 2002; OIE, 2010). Para serem testadas contra o H3N2 SIV, as amostras de soro foram tratadas com tripsina 0,4% a 56°C por 30 minutos, seguido por tratamento com periodato de potássio 0,01M por 15 minutos. A mistura foi então acrescida de glicerol 1% e incubada a temperatura ambiente por 15 minutos (Dowdle et al., 1979; Boliar et al, 2006). Para a HI, a diluição inicial utilizada para as amostras de soro tratado foi de 1:10. Foi então realizada a diluição seriada na base dois até 1:10.240 em tampão salina fosfato (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 mM, pH7,4) em placas de fundo “V” de 96 poços, no volume de 25µL. Em seguida, 25µL do vírus referência (H1N1 SIV, H3N2 SIV ou H1N1h) contendo 4 unidades hemaglutinantes (4UHA/25µL) foram adicionados a cada poço e a placa foi incubada a temperatura ambiente por 60 minutos. Finalmente, 50µL de suspensão de hemácias de galo 0,5% foram adicionados e a placa foi incubada a temperatura ambiente por 30 minutos. O título dos anticorpos foi determinado pelo inverso da maior diluição do soro capaz de inibir completamente a aglutinação das hemácias, em unidades de inibição da hemaglutinação (UHI). Foram utilizados controles de suspensão de eritrócitos e de soro positivo (diluição 1:64), obtido através de pool de soros testados previamente contra cada um dos antígenos utilizados. Uma coluna foi utilizada para controle de soros teste para observar a presença de inibidores inespecíficos (Pedersen, 2008). Os soros apresentando título de anticorpos igual ou superior a 40 foram considerados positivos (WHO, 2002; Choi et al., 2002a). Amostras com títulos iguais a 40 e 80 foram consideradas com título baixo; 160 e 320, título médio; e ≥640, título alto. Um rebanho era considerado positivo se apresentasse ao menos um animal positivo. As médias de títulos HI para rebanhos positivos e negativos estão relatadas na Tab. 3. As médias e medianas dos títulos de anticorpos foram relativamente baixas nos rebanhos positivos para os vírus H1N1 suíno e humano, com valores próximos ao ponto de corte, o que é corroborado pelo percentual elevado de animais negativos e com títulos baixos para esses vírus na maior parte das granjas (Fig. 3). Já para o H3N2 SIV, tanto a média como a mediana dos títulos HI nos rebanhos positivos foram abaixo do ponto de corte, o que se justifica pelo alto percentual de animais nãoinfectados nesses rebanhos (Fig. 3). O percentual de fêmeas positivas para múltiplos antígenos foi calculado (Tab. 4). Intervalos de confiança de 95% foram calculados para as prevalências de rebanhos e animais e a estatística descritiva foi calculada para os títulos de anticorpos de rebanhos positivos e negativos. Resultados Dos 355 soros testados, 158 (44,5%) possuíam anticorpos contra o H1N1 SIV, 36 (10,1%) contra H3N2 SIV e 136 (38,3%) contra H1N1h. Dos 17 rebanhos testados, 11 (64,7%) foram considerados positivos para H1N1 SIV, 4 (23,5%) para H3N2 SIV e 10 (58,8%) para H1N1h (Tab. 2). Figura 3. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o vírus da influenza suína (SIV) H1N1, H3N2 SIV e vírus influenza humano H1N1 nas granjas positivas. Amostras negativas (titulo <40); com título baixo (40 e 80); título médio (160 e 320); e título alto (≥640). 33 Tabela 2. Ocorrência da influenza suína no Brasil para animais e rebanhos. H1N1 SIV Variável H3N2 SIV H1N1h Animal Rebanho Animal Rebanho Animal Rebanho Número de amostras testadas 355 17 355 17 355 17 Número de positivos 158 11 36 4 136 10 Prevalência, % (IC 95%) 44,5 64,7 10,1 23,5 38,3 58,8 (39,33−49,67) (41,98−87,42) (6,97−13,23) (3,34−43,66) (33,24−43,36) (35,4−82,2) IC = Intervalo de confiança; H1N1 SIV = H1N1 suíno; H3N2 SIV = H3N2 suíno; H1N1h = H1N1 humano Tabela 3. Títulos de Inibição da Hemaglutinação para rebanhos positivos e negativos. Rebanhos Positivos Variável Rebanhos Negativos H1N1 SIV H3N2 SIV H1N1h H1N1 SIV H3N2 SIV H1N1h 11 4 10 6 13 7 Título mínimo 29,97 14,64 19,10 11,89 10,34 10,68 Mediana 46,30 22,36 46,08 13,19 11,49 12,03 Título máximo 146,72 26,70 118,19 16,62 14,32 20,00 Média 59,34 21,02 47,50 13,58 11,59 13,27 Desvio padrão 16,77 13,27 16,82 11,45 10,91 12,61 Erro padrão 11,69 11,52 11,79 10,57 10,25 10,91 Número de valores IC 95% 41,90-83,98 13,41-32,97 32,76-68,92 11,78-15,66 11,00-12,22 10,71-16,44 IC = Intervalo de confiança; H1N1 SIV = H1N1 suíno; H3N2 SIV = H3N2 suíno; H1N1h = H1N1 humano Tabela 4. Percentual de animais com anticorpos contra múltiplos antígenos de vírus influenza em Minas Gerais, Brasil. Número Percentual (%) H1N1 SIV H3N2 SIV H1N1h H1N1 SIV + H3N2 SIV H1N1 SIV + H1N1h H3N2 SIV + Três H1N1h antígenos 57 4 42 12 74 5 15 16,05 1,13 11,83 3,38 20,84 1,41 4,22 H1N1 SIV = H1N1 suíno; H3N2 SIV = H3N2 suíno; H1N1h = H1N1 humano Discussão Foi observada uma alta ocorrência de animais com anticorpos anti-influenza H1N1 nas amostras analisadas no Estado de Minas Gerais, provavelmente devido à infecção 34 prévia, pois a vacinação não era realizada nos rebanhos avaliados. No entanto, um menor percentual de animais obteve resultado positivo para o subtipo H3N2. Até o momento, poucos estudos foram realizados no Brasil com o intuito de demonstrar a presença de anticorpos contra o vírus influenza em suínos, e este é o primeiro estudo a relatar a distribuição de animais com anticorpos anti-influenza em Minas Gerais. As taxas observadas neste estudo de 44,5% e 38,3% de animais com anticorpos contra H1N1 suíno e humano, respectivamente, são semelhantes àquelas encontradas em estudos de prevalência da influenza em suínos nos Estados Unidos (66,3%), Itália (46,4%) e Espanha (38,5%) (Choi et al., 2002a; Van Reeth et al., 2008). Entretanto, a prevalência de anticorpos anti-SIV em outro estudo na Espanha foi inferior à observada aqui, e evidências mostram que um SIV H1N2 recentemente introduzido nos rebanhos suínos está amplamente distribuído naquele país (Maldonado et al., 2006). Mancini et al. (2006) observaram taxa muito elevada (85,3%) de animais positivos para H1N1 em um único rebanho do Estado de São Paulo, enquanto que Brentano et al. (2002), em um estudo abrangendo diversos Estados brasileiros, observaram uma prevalência para esse subtipo viral muito inferior (2,2%) àquela encontrada no presente estudo, mas foi utilizado na HI apenas antígeno humano. Já para H3N2, estes estudos revelaram taxas de 85,3% e 16,7%, respectivamente. A taxa de 10,1% de animais positivos para H3N2 encontrada no presente trabalho foi semelhante à de 20% observada em um estudo recente realizado no Estado do Paraná (Caron et al., 2010) e também semelhante à taxa observada na Irlanda (4,2%) anteriormente (Van Reeth et al., 2008). Entretanto, foi inferior às ocorrências observadas na Itália (41,7%), Espanha (38%) e Estados Unidos (33,7%) (Choi et al., 2002a; Van Reeth et al., 2008). Mesmo que tenha sido observado um percentual elevado de animais positivos para H1N1, poucos animais apresentaram títulos altos, provavelmente por se tratar de circulação viral antiga ou pressão de infecção baixa nos rebanhos. Dessa forma, embora anticorpos contra o SIV tenham sido detectados, os animais não apresentavam proteção imune adequada. A proporção de animais com anticorpos para ambos os vírus H1N1 (20,84%) foi superior à proporção para apenas um deles (16,05% para H1N1 SIV e 11,83% para H1N1 humano). Alguns animais foram positivos para ambos os vírus suínos (3,38%) e uma porcentagem de animais também foi positiva para todos os três antígenos (4,22%). Portanto, diferentes cepas virais de influenza estão co-circulando na população de suínos brasileiros, causando infecção mista e possibilitando o rearranjo genético entre esses vírus. Também foi observada uma alta prevalência de granjas positivas para H1N1 SIV (64,7%) e H1N1 humano (58,3%) neste estudo, semelhante àquela observada em rebanhos na Coréia (71,5%) (Jung et al., 2002), e ligeiramente inferior à prevalência de 83,1% observada em porcas no Canadá (Poljak et al., 2008). Para H3N2, a ocorrência encontrada neste estudo foi inferior às observadas para H1N1, além de ser inferior à observada no estudo recente no Paraná (46%) (Caron et al., 2010). Os resultados positivos tanto para H1N1 suíno e humano, como para H3N2 suíno em amostras coletadas previamente à ocorrência da pandemia de 2009 indica a circulação do vírus Influenza em suínos no Brasil anterior à introdução do vírus pandêmico. Além disso, os resultados obtidos neste estudo indicam que o vírus influenza está disseminado em Minas Gerais e que pode ser endêmico na população de suínos do Brasil. 35 CAPÍTULO 3: IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO CLÍNICOPATOLÓGICA DO VÍRUS INFLUENZA EM SUÍNOS NO BRASIL Introdução A primeira descrição clínica da influenza em suínos ocorreu em 1918, simultaneamente à ocorrência da Gripe Espanhola em humanos (Koen, 1919 citado por Zhimer et al., 2009; Webster, 1992). Desde então, os vírus influenza A são associados ao complexo de doença respiratória suína (CDRS), em conjunto com outros patógenos como Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, vírus da síndrome respiratória e reprodutiva suína (PRRSV) e circovírus suíno tipo 2 (PCV2) (Thacker et al., 2001; Vincent et al., 2008). A influenza em suínos é causada pelo vírus influenza A (IAV), que é envelopado, com genoma de RNA segmentado, pertencente à família Orthomyxoviridae (Palese e Shaw, 2007). Três subtipos antigenicamente distintos de influenza A circulam em suínos no mundo, H1N1, H3N2 e H1N2, e são endêmicos e frequentemente isolados nos Estados Unidos, Europa e Ásia (Van Reeth, 2007). A influenza suína é uma doença respiratória aguda, cuja gravidade depende de diversos fatores, incluindo estado imune do hospedeiro, cepa viral e infecções secundárias (Vincent et al., 2008). Os sinais clínicos da influenza em suínos são semelhantes aos observados em humanos, incluindo febre, tosse, espirros, descarga nasal, angústia respiratória, prostração, anorexia e conjuntivite (Alexander e Brown, 2000; Richt et al., 2003). As lesões macroscópicas associadas à influenza em suínos são áreas de 36 consolidação pulmonar vermelho escura bem delimitada, multifocal a difusa, com localização principalmente crânio-ventral. Microscopicamente observa-se necrose do epitélio bronquiolar e presença de restos celulares, fluído proteináceo e leucócitos no lúmen de vias aéreas. A necrose é acompanhada de infiltrado linfocitário peribronquiolar e pneumonia intersticial (Vincent et al., 2008). Estudos anteriores mostraram que o SIV está disseminado nos suínos brasileiros (Brentano et al., 2002; Mancini et al., 2006; Ciacci-Zanella et al., 2011a; Schaefer et al., 2011a,b,c), mas a enfermidade não está bem caracterizada nos suínos nacionais. O objetivo deste estudo foi identificar e realizar a caracterização clínica e patológica da influenza em suínos no Brasil. Material e Métodos 1. Amostras clínicas Foram utilizadas 86 amostras de pulmão de casos de diagnóstico de rotina recebidas pelo Laboratório de Diagnóstico Instituto de Pesquisas Veterinárias Especializadas (IPEVE) e por Médicos Veterinários após visita técnica. As amostras foram coletadas durante surtos de doença respiratória em 37 rebanhos suínos de ciclo completo e duas Unidades Produtoras de Leitões (UPL), com sistema “todos dentro – todos fora” sem histórico de vacinação para o SIV, localizados em Minas Gerais (24), São Paulo (2), Paraná (1), Rio Grande do Sul (4), Santa Catarina (1) e Mato Grosso (7). Os dados clínicos foram obtidos junto ao laboratório após serem fornecidos pelos proprietários e médicos veterinários. Os fragmentos foram coletados assepticamente durante a necropsia, resfriados e processados em até 48 horas após a coleta. As amostras de tecido foram maceradas, pesadas e acrescidas de meio essencial mínimo (MEM) contendo antibióticos (200U/mL de penicilina, 200µg/mL de estreptomicina e 1,25µg/mL de anfotericina B) para obter uma suspensão 10% p/v. A mistura foi então centrifugada a 2000 rpm a 4ºC por 30 minutos e o sobrenadante foi coletado e filtrado com filtro de seringa 0,22µm (Clavijo et al., 2002). Uma porção do tecido original e uma alíquota da suspensão 10% p/v foram armazenadas a −80ºC. A detecção viral nos fragmentos de pulmão foi realizada pelo isolamento viral em cultura de MDCK, PCR em tempo real (PCRrt) e Imuno-histoquímica (IHQ) (Fig. 4). Figura 4. Figura esquematizando os procedimentos realizados para detecção do vírus influenza em fragmentos de pulmão suíno. 2. Isolamento viral em cultivo celular Para isolamento viral, foram utilizadas monocamadas confluentes de células MDCK em placas de 24 poços. As células foram cultivadas na concentração de 8x104 células/cm2, em MEM contendo 5% de soro fetal bovino (SFB) e antibióticos (200U/mL de penicilina, 200µg/mL de estreptomicina e 1,25µg/mL de anfotericina B), e mantidas em atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37ºC. A monocamada foi lavada três vezes com PBS esterilizado. Para cada amostra, 0,2mL da suspensão 10% p/v de pulmão com diluição 1:2 em MEM de inoculação (contendo albumina sérica bovina 5% e antibióticos) foram inoculados em três poços de cultivo celular. O inóculo foi incubado com a monocamada a 37ºC por 60 minutos em estufa com 5% de CO2. Foi então acrescido MEM contendo tripsina (2 µg/mL) e as placas foram incubadas a 37ºC e 5% de CO2 por até sete dias e avaliações diárias do efeito citopático (ECP) foram realizadas. O ECP é caracterizado por arredondamento de células, formação de grumos e lise da monocamada (OIE, 2010). Após observação de ECP ou após sete dias da inoculação, o sobrenadante foi coletado assepticamente e testado para atividade hemaglutinante pela reação de hemaglutinação (HA). Amostras que apresentaram hemaglutinação positiva foram consideradas positivas. Na ausência de hemaglutinação, uma nova passagem em MDCK foi realizada (WHO, 2002). 37 3. Reação de hemaglutinação (HA) A reação de hemaglutinação (HA) foi realizada para confirmar o isolamento viral e para a titulação viral. Cinquenta µL de sobrenadante de cada amostra foram diluídos em série na base dois até 1:1.024 em placas de fundo “V” de 96 poços. Os sobrenadantes foram então incubados com mesmo volume de suspensão de hemácias de galo a 0,5% por 30 minutos ou até que botões de células fossem observados no fundo dos poços de controle de hemácias (última coluna) (Killian, 2008). Para cada placa foi utilizada a amostra referência A/swine/Iowa/15/1930 (H1N1) como controle do vírus. O título de hemaglutinação foi determinado pelo inverso da maior diluição capaz de aglutinar completamente as hemácias. 4. Imunocitoquímica Para confirmar a replicação viral nas células inoculadas e o resultado do isolamento, os sobrenadantes das amostras positivas na HA foram testados em duplicata pela imunocitoquímica (ICQ). Os sobrenadantes foram inoculados com diluição 1:10 em MEM com tripsina, em placas de 96 poços com monocamadas confluentes de MDCK. Após 24 horas as placas foram fixadas com formalina 4% em PBS por 30 minutos a temperatura ambiente. Para coloração das placas foi utilizado o protocolo da imunohistoquímica detalhado a seguir, com anticorpo monoclonal anti-Influenza A contra a nucleoproteína viral, pelo método da streptavidina-biotina marcada com peroxidase e revelação com solução de cromógeno AEC (3-amino-9-etilcarbazol). 5. Titulação viral de amostras isoladas Foram utilizadas placas de 96 poços com monocamadas confluentes de MDCK para a titulação viral de amostras positivas no 38 isolamento. A monocamada foi lavada com PBS esterilizado e o sobrenadante obtidos após o isolamento viral de cada amostra foi testado em triplicata em MEM contendo tripsina em diluições seriadas na base dez, de 10-1 a 10-7. A última linha foi utilizada como controle negativo, contendo apenas meio de cultura. As amostras foram inoculadas e incubadas por 48 horas, e então os sobrenadantes foram submetidos à reação de hemaglutinação. O título viral foi calculado pela dose infecciosa 50% em cultura de tecido (TCID50/mL) utilizando o método de Reed e Muench (Reed e Muench, 1938). 6. Extração de RNA e transcrição reversa O RNA viral foi extraído de 140µL de sobrenadante após isolamento, utilizando o kit QIAamp viral RNA mini kit (Qiagen Inc., Valencia, CA, EUA) de acordo com especificações do fabricante. Para a transcrição reversa, 10 µL de RNA (1-2µg) foram aquecidos por 2 minutos a 94ºC e imediatamente resfriados em gelo. O RNA foi então acrescido de 0,2µM de primer universal para vírus Influenza (primer Uni12 5’-AGCAAAAGCAGG-3’), complementar à terminação 3’ conservada dos segmentos de RNA dos vírus influenza A (Hoffmann et al., 2001), e 0,2µM de primer reverso para o gene da proteína ribossomal S26 canina (Primer S26 5’-CGATTCCGGACTAC CTTGCTGTG-3’). A mistura foi aquecida a 70ºC por 5 minutos para retirar estruturas secundárias, e imediatamente resfriada em gelo. A transcrição reversa foi realizada a 42ºC por 60 minutos utilizando 100 unidades de transcriptase reversa M-MLV (Promega, Madison, WI, EUA), 5 µL de tampão de reação 5X, 0,8mM de cada dNTP, 40 unidades de inibidor de ribonuclease RNaseOUT™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e água livre de RNAse para o volume final de 25 µL. 7. PCR em tempo real Antes da análise quantitativa, todas as amostras foram previamente submetidas a PCR em tempo real (PCRrt), pela análise de presença/ausência, para confirmar a infecção por IAV nos animais coletados. Foram utilizados primers e sondas para o segmento M do vírus influenza e o protocolo recomendado pelo Center for Disease Control and Prevention/Organização Mundial de Saúde (CDC/OMS) (WHO, 2009), com algumas modificácões. A PCRrt foi realizada utilizando-se sistema TaqMan® de detecção, um par de iniciadores para detecção de ácidos nucléicos do vírus Influenza A baseados em sequência conservada do segmento da matriz (InfA) e um par de iniciadores para detecção do gene da proteína ribossomal S26 canina (S26) para controle interno da reação. Para cada amostra foram realizadas duas reações de amplificação, uma para Influenza e outra para controle interno, em duplicata. As sequências de iniciadores e sondas estão descritas na Tab. 5. Tabela 5. Conjunto de iniciadores e sondas para uso na PCR quantitativa em tempo real para detectar ácidos nucléicos do vírus influenza após isolamento viral. Iniciadores e Sondas Sequência (5’>3’) InfA Forward GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C InfA Reverse AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA Sonda InfA* TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG S26 Forward CGT GCT TCC CAA GCT GTA CGT GA S26 Reverse CGA TTC CGG ACT ACC TTG CTG TG Sonda S26* CTC CAT TAC TGC GTG AGT TGT GCC A *As sondas foram marcadas com fluorocromo repórter 6-carboxifluoresceína (FAM) na extremidade 5’ e com quencher 6-carboxi-tetrametilrodamina (TAMRA) na 3’. A amplificação foi realizada em uma reação de 20µL utilizando o kit TaqMan® Universal PCR Master Mix e o sistema de detecção Applied Biosystems 7500 RealTime PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As concentrações de iniciadores InfA e S26 foram otimizadas a partir de 0,2µM, 0,4µM e 0,8µM, e as concentrações das sondas InfA e S26 foram otimizadas a partir de 0,05µM, 0,1µM e 0,2µM. As concentrações de 0,8µM e 0,2µM foram selecionadas como concentração final de iniciadores e sondas, respectivamente. As reações foram incubadas a 50°C por 2 minutos, 95°C por 10 minutos, seguidas de 45 ciclos a 95°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto. A fluorescência foi coletada a 60°C. A reação final otimizada consistiu em 10µL de TaqMan Universal PCR Master Mix (2X), 0,8µM de cada primer, 0,2µM da sonda, 2 µL de cDNA (1µg) e água livre de RNAse para 20µL. Para cada reação foram utilizados dois controles negativos, um no-template e um de sobrenadante de MDCK não infectada, e um controle positivo de MDCK infectada com a amostra referência (A/swine/Iowa/15/1930 (H1N1)). Todas as amostras e o controle de MDCK não infectada deveriam apresentar curva de amplificação para S26 cruzando o threshold em até 38 ciclos. As amostras foram consideradas positivas se a curva de crescimento para InfA cruzasse o threshold em até 40 ciclos. 39 8. Clonagem e construção da curva padrão A amostra referência foi clonada e utilizada para a construção da curva padrão da PCR quantitativa em tempo real (qPCRrt), após ser submetida à transcrição reversa como descrito anteriormente. Para a obtenção do plasmídeo recombinante, os primers InfA forward e InfA reverse (Tab. 5) foram utilizados em uma reação de PCR convencional para gerar um amplicon de 106pb do gene M do vírus Influenza. A reação consistiu em 5µL de tampão 5X e 0,15µL de GoTaq HotStart DNA Polimerase (Promega, Madison, WI, EUA), 2mM de MgCl2, 0,2mM de cada dNTP, 0,2µM de cada primer, 1µL de cDNA (0,5µg) e água livre de DNAse para 25µL. seguida de incubação a 42ºC por 90 segundos e imediato retorno ao gelo por 5 minutos. Em seguida, foram adicionados 500µL de meio PSI (meio LB, KCl 10mM, MgSO4 4mM) aos tubos, sendo esta mistura incubada a 37°C por 1,5 horas sob agitação a 180 rpm. Posteriormente, 200µl da suspensão de bactérias foram plaqueados em placas de petri contendo o meio LB (Luria Bertani, contendo ampicilina 100µg/mL). As placas foram incubadas invertidas a 37°C por 24 horas. A amplificação foi realizada nas seguintes condições: desnaturação inicial a 94°C por 5 minutos, seguida de 30 ciclos com desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento de primers a 60°C por 30 segundos e extensão a 72°C por 3 minutos, concluindo com uma extensão final a 72°C por 7 minutos. Os produtos amplificados foram visualizados em gel de agarose 1% e purificados utilizando a técnica freeze and squeeze (Hartman, 1991). O produto purificado foi, então, ligado ao vetor pGEMT-Easy (Promega, Madison, WI, EUA), numa reação que consistiu em 7,5µL de tampão 2X Rapid ligation, 1µL de vetor pGEM-T Easy, 1,5µL de T4 DNA ligase e 5,0µL do produto da PCR purificado para um volume final de 15µL, de acordo com o protocolo do fabricante. A reação foi incubada a temperatura ambiente por 1 hora e em seguida a 4°C overnight (aproximadamente 16 horas). O DNA plasmidial foi extraído utilizando o protocolo Miniprep, em que 4mL de bactérias crescidas foram centrifugados a 1000 g por 10 minutos, a temperatura ambiente. O pellet foi então ressuspendido em 200µL da solução GET/RNase (glicose ou dextrose; Tris-HCl pH 8,0 1M; EDTA 0,2M; Água Milli-Q q.s.p. 100mL; RNAse 10mg/mL), adicionando-se em seguida 400µL da solução de lise (SDS 20%; NaOH 10N; água Milli-Q q.s.p.100mL). Após três minutos, foram adicionados 400µL da solução de neutralização (solução de acetato de potássio 13%, pH 4,8). Os tubos foram incubados em gelo por 20-30 minutos e então centrifugados a 10.000 g a 8°C, por 15 minutos. Em seguida, 800µL do sobrenadante foram transferidos para tubos contendo 600µL de isopropanol, homogeneizados e centrifugados a 10.000 g a 8ºC por 10 minutos. Foram adicionados 500µl de etanol 70% aos precipitados, que foram homogeneizados e centrifugados a 10.000 g por cinco minutos. Os tubos foram drenados, o DNA foi diluído em água MilliQ e quantificado por meio de um espectrofotômetro (NanoVue Plus Spectrophotometer/ GE Healthcare, Waukesha, WI, EUA). A seguir, foi realizada a transformação em Escherichia coli XL10 quimicamente competente (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), adicionando-se 50-100ng da reação de ligação a 50µL de bactérias competentes com incubação por 30 minutos em gelo, A confirmação do recombinante foi realizada através de digestão enzimática com a enzima de restrição PST I (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Aproximadamente 650ng de DNA plasmidial foram digeridos em 100U de PST I, 2 µL de tampão H 10X 40 (500 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, 1.000 mM NaCl) e água para uma solução final de 20µL, e a mistura foi incubada a 37°C por uma hora, seguida de inativação a 80°C por 20 minutos. O produto da digestão foi confirmado em gel de agarose a 1%. O DNA plasmidial contendo o inserto de 106pb foi quantificado no NanoVue, e o número de moléculas/µL foi estimado (Whelan et al., 2003). Foram então realizadas diluições seriadas na base dez para a construção da curva padrão, que consistiu de seis diluições diferentes (107; 106; 105; 104; 102; 10 cópias de cDNA). 9. Quantificação de amostras positivas pela PCRrt As amostras com resultado positivo na PCRrt foram submetidas à PCR quantitativa em tempo real (qPCRrt), através da quantificação absoluta. As reações foram realizadas como descrito acima, utilizando apenas iniciadores InfA. As amostras foram testadas em duplicata e a curva padrão foi utilizada em triplicata. 10. Diagnóstico histológico e imunohistoquímico Das 86 amostras de pulmão estudadas, 60 foram avaliadas no diagnóstico histológico e pela técnica de imuno-histoquímica (IHQ), pois as demais amostras foram recebidas congeladas. Os fragmentos de tecidos foram fixados em formol tamponado 10% e incluídos em parafina. As lâminas para análise histológica foram processadas por métodos histológicos de rotina (Luna, 1968) e coradas com hematoxilina-eosina (HE). Os fragmentos foram também corados pela IHQ utilizando anticorpo monoclonal antiInfluenza A (anti-nucleoproteína, clones A1, A3 Blend; Millipore, Billerica, MA, EUA), pelo método da streptavidina-biotina marcada com peroxidase (Universal LSAB™+ Kit/HRP, Rabbit/Mouse/Goat; Dako, Glostrup, Dinamarca) e solução de cromógeno AEC (3-amino-9-etilcarbazol). Os cortes de tecido foram desparafinizados em xilol e re-hidratados em concentrações decrescentes de etanol. A inativação de peroxidases endógenas foi realizada através da incubação com 3% de peróxido de hidrogênio diluído em PBS por 30 minutos. Em seguida foi realizada a digestão com Proteinase K 0,05% por cinco minutos a 37°C para aumentar a reatividade entre anticorpo e antígeno, e incubação com leite em pó desnatado 2,5% por 30 minutos para inibir a ligação inespecífica de anticorpos. A incubação com o anticorpo primário foi feita por 45 minutos a 37°C. Em seguida foi realizada a incubação com o anticorpo biotinilado por 30 minutos e com a Streptavidina por mais 25 minutos à temperatura ambiente. A reação foi revelada com solução AEC e montada em meio aquoso. Foi utilizado como controle positivo fragmento de pulmão de suíno em bloco de parafina gentilmente cedido pelo Dr. Kurt Rossow, do Laboratório de Diagnóstico Veterinário (VDL), da Universidade de Minnesota, EUA. Foram consideradas positivas as amostras com marcação de cor vermelha no citoplasma e/ou núcleo de células respiratórias. A marcação na IHQ foi classificada em grau I: focal leve; grau II: multifocal moderada; grau III: multifocal intensa. Todas as avaliações foram realizadas pelo mesmo observador. 11. Análise estatística Os dados foram tratados no Excel 2011 (Microsoft Corporation, USA) e Intervalos de Confiança de 95% (IC 95%) foram calculados para frequências de positivos nos testes utilizados. A análise estatística foi 41 realizada pelo GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Resultados 1. Achados clínicos As amostras estudadas eram de pulmões de suínos de creche, recria ou terminação, com idade entre 29 e 150 dias. Em geral, os sinais clínicos observados foram tosse, espirros, secreção nasal, hipertermia, apatia, anorexia, redução na ingestão de ração, perda de peso e refugagem, que permaneciam por cinco a 10 dias. Alguns rebanhos apresentaram mortalidade aumentada na fase de creche e recria. Em um rebanho, os sinais mais intensos foram observados em porcas, que apresentavam secreção nasal, tosse, hipertermia e taxa de abortos aumentada. Cinquenta amostras de pulmão foram testadas para infecção por outro(s) patógeno(s) respiratório(s) (dados não mostrados), e algumas apresentaram diagnóstico positivo para um ou mais agentes, como Mycoplasma hyopneumoniae (4), Pasteurella multocida (18), Bordetella bronchiseptica (7), Haemophilus parasuis (12), Streptococcus suis (11), PCV2 (23). Dessas, 32 apresentaram infecção concomitante com IAV, seja pela PCR em tempo real ou pela imunohistoquímica. 2. Isolamento viral, hemaglutinação e imunocitoquímica Das 86 amostras submetidas ao isolamento viral, 30 (34,9%; IC 95%: 24,83-44,97%) apresentaram ECP, sendo que cinco apresentaram ECP após dois dias, 10 após três dias, duas após quatro dias e 11 após cinco dias. Duas amostras apresentaram ECP apenas após a segunda passagem. Uma amostra não apresentou ECP em nenhuma das duas passagens, embora tenha apresentado resultado positivo na hemaglutinação, sendo considerada positiva 42 no isolamento viral. Portanto, 31 amostras (36,0%; IC 95%: 25,86-46,14%) foram positivas no isolamento viral. Nenhum sobrenadante apresentou crescimento bacteriano após o isolamento viral (dados não apresentados). Os títulos de HA variaram de dois a 64, e os títulos virais variaram de 102,25 a 106,75 TCID50/mL, com média de 104,54 TCID50/mL. Todas as amostras positivas no isolamento viral apresentaram marcação positiva na imunocitoquímica. As amostras isoladas foram submetidas ao sequenciamento e análise filogenética dos genes HA e NA, e todos os isolados foram classificados como sendo do subtipo H1N1 (resultados apresentados no capítulo 5). 3. RT-PCR em quantificação tempo real e Ácidos nucléicos do vírus influenza foram detectados em 36 (41,9%; IC 95%: 31,552,3%) das 86 amostras submetidas à PCRrt. Os CTs variaram de 14,97 a 37,88, com média de 25,27 (Fig. 5), e o limiar de detecção dos primers InfA foi de 10 cópias de cDNA/µL. Todas as amostras apresentaram amplificação para o gene S26, com CT variando de 24,45 a 35,15 e média de 29,61, indicando que a extração de RNA viral e a transcrição reversa foram realizadas adequadamente. Em todas as reações, o controle positivo apresentou amplificação para influenza A e S26, o controle notemplate não apresentou amplificação e o controle de MDCK não infectada mostrou amplificação apenas para S26 (Fig. 5). As 36 amostras positivas apresentaram quantificação variando de 101,22 a 107,85 cópias de cDNA/µL (média 104,92 cópias/µL). A reação apresentou 95,469% de eficiência, Slope de 3,435 e R2 de 0,997 (Fig. 6). Figura 5. Gráficos de amplificação na PCR em tempo real para detecção de ácidos nucleicos da proteína ribossomal canina S26 (A) e do vírus influenza (B). Figura 6. Gráficos representativos da curva padrão da PCR em tempo real quantitativa para quantificação de ácidos nucleicos do vírus influenza. Gráfico da eficiência da reação (A) e de amplificação da curva padrão (B). A B 43 4. Diagnóstico histológico e imunohistoquímico A principal alteração macroscópica observada foi hepatização vermelho escura nos lobos cardíaco, apical e diafragmático, variando entre 30% e 70% de acometimento. As principais alterações microscópicas observadas nas amostras com resultado positivo na IHQ foram a presença de infiltrado de neutrófilos, linfócitos, e/ou macrófagos de intensidade variada no lúmen de alvéolos, brônquios e bronquíolos; necrose com descamação do epitélio bronquiolar e acúmulo de restos celulares no lúmen; além de espessamento de septo alveolar ou interlobular. Este espessamento de septos era devido ao infiltrado linfocítico e histiocitário, e, nos septos interlobulares, também devido a dilatação de linfáticos e acúmulo de material proteináceo amorfo (edema). Outras alterações observadas foram congestão, hemorragia e edema, acúmulo de muco no lúmen de brônquios e bronquíolos e hiperplasia de tecido linfoide bronco associado (BALT). Os principais diagnósticos histopatológicos encontrados foram bronquiolite necrotizante e broncopneumonia neutrofílica. Algumas alterações observadas estão ilustradas na Fig. 7 (A, C, E). Pleurite fibrino-purulenta foi observada em casos isolados. Das 60 amostras avaliadas pela IHQ, 38 (63,3%) tiveram marcação positiva para a presença de antígeno do vírus da influenza tipo A. Das amostras positivas, 14 (36,8%) foram classificadas com grau I, 15 (39,5%) com grau II e nove (23,7%) com grau III. Foi observada a marcação evidente no citoplasma e núcleo de células do epitélio bronquial, bronquiolar, pneumócitos e macrófagos alveolares, e com frequência em glândulas bronquiais (Fig. 7 B, D, F). Figura 7. Fotomicrografias de fragmentos de pulmão suíno com lesões histológicas (A, C, E) e detecção de antígenos do vírus Influenza A pela Imuno-histoquímica (B, D, F). (A): Parede bronquial com infiltrado neutrofílico e linfocítico intenso na lamina própria da mucosa e submucosa, particularmente ao redor de glândulas bronquiais. Hematoxilina e eosina, 100X. (B): Marcação positiva em vermelho da nucleoproteína viral no citoplasma de células do epitélio bronquiolar, 200X. (C): bronquiolite necrotizante com descamação do epitélio bronquiolar devido à necrose e infiltração linfocitária na lamina própria, 100X. (D): mesma área de C, corada pela imuno-histoquímica, com intensa marcação no epitélio de revestimento bronquiolar remanescente, 100X. (E): Intenso infiltrado inflamatório neutrofílico no lúmen alveolar, associado ao espessamento de septo interlobular devido ao edema e discreto infiltrado linfocitário, 40X. (F): Intensa marcação positiva em vermelho para nucleoproteína viral em glândulas (setas) e epitélio bronquiais, 40X. 44 45 Discussão Este é um dos primeiros estudos a relatar o isolamento e a caracterização patológica da infecção pelo vírus influenza em suínos no Brasil, identificando a circulação viral em seis estados brasileiros. Trinta e seis amostras de pulmão de suínos foram positivas na PCRrt, e 31 amostras do vírus influenza foram isoladas. O isolamento viral foi realizado em estudos anteriores no Brasil, mas os subtipos isolados não foram identificados (Mancini et al., 2006; Schaefer et al., 2008). Recentemente, o vírus pandêmico H1N1 2009 (pH1N1) foi identificado em suínos na região sul do Brasil, além de um vírus H3N8 de origem equina e um rearranjo H1N2 derivado do pH1N1 (Schaefer et al., 2011a,c). Foram identificadas 38 amostras de pulmão com marcação positiva na IHQ, apresentando marcação no núcleo e citoplasma de células epiteliais de brônquios e bronquíolos, assim como relatado anteriormente por Vincent et al. (1997). A síntese de RNA, transcrição e replicação do vírus influenza ocorre no núcleo e a síntese das moléculas de nucleoproteína ocorre no citoplasma (Yoshida et al., 1981), portanto proteínas do vírus influenza podem ser detectadas tanto no núcleo como no citoplasma de células infectadas. A marcação frequente de glândulas bronquiais observada neste estudo é achado comum em casos de infecção em humanos por vírus sazonais e pelo vírus pandêmico, principalmente em casos fatais (Gill et al., 2010; Nakajima et al., 2012). Em suínos, essa marcação foi observada na infecção pelo vírus pandêmico (Sreta, et al., 2009), mas não é comum em infecções por vírus endêmicos (Vincent et al., 1997). Um fato interessante é que os receptores para vírus humanos (NeuAc α2,6Gal) estão presentes em glândulas mucosas/serosas do trato respiratório inferior de suínos (Nelli et al., 2010). Também foi observada marcação em 46 macrófagos alveolares, assim como relatado por Sreta et a. (2009). Macrófagos alveolares podem se infectar pelo vírus influenza, mas a infecção parece ser abortiva e o vírus não se replica eficientemente (Rodgers e Mims, 1982; Yu et al., 2011). Os achados microscópicos encontrados nas amostras positivas foram semelhantes àqueles relatados na literatura para infecções com IAV em suínos, caracterizados principalmente por descamação do epitélio respiratório, com infiltração inflamatória peribronquiolar e perivascular (Richt et al., 2003; Jung et al., 2005; Sreta et al., 2009). Necrose de células epiteliais também é um achado comum na infecção pelo IAV em suínos, com acúmulo de restos celulares e leucócitos no lúmen de bronquíolos (Richt et al., 2003), semelhante ao observado neste estudo. Além disso, uma lesão importante observada nos animais infectados foi a traqueíte fibrinonecrótica (dados não apresentados) resultante da infecção de células traqueais. Sabe-se que os vírus influenza infectam células tanto do trato respiratório superior como do inferior de suínos, mas os receptores NeuAc α2,6Gal são mais abundantes no trato superior (Nelli et al., 2010). E ainda, casos fatais de infecção do vírus pandêmico em humanos frequentemente resultam em traqueobronquite necrotizante (Nakajima et al., 2012). Os achados microscópicos encontrados corroboram com os achados clínicos observados nos rebanhos estudados, em que os animais apresentavam sintomatologia respiratória leve a intensa, com quadro agudo típico de influenza em suínos. A infecção bacteriana ou por PCV2 foi comprovada (dados não apresentados) em alguns rebanhos em que a infecção pelo vírus influenza não foi confirmada, sugerindo que outros agentes são responsáveis pelas manifestações clínicas respiratórias observadas. A maioria dos animais infectados com o vírus influenza também apresentaram infecções concomitantes com outros patógenos, mas, embora sinais clínicos e lesões graves sejam frequentemente observados em infecções múltiplas do vírus influenza com outros patógenos respiratórios (Choi et al, 2003), a manifestação clínica grave não foi frequente nesses animais e achados microscópicos sugestivos de infecção secundária foram obsevados apenas em casos raros. Algumas lesões macro e microscópicas observadas, como hiperplasia de tecido linfoide bronco associado (BALT), são comuns também em infecções com outros patógenos respiratórios, principalmente por M. hyopneumoniae, corroborando com a ocorrência de infecção múltipla em muitos animais avaliados. A vacinação de porcas contra o IAV é utilizada rotineiramente em países da Europa e nos Estados Unidos (Van Reeth, 2007; Ma e Richt, 2010). As vacinas utilizadas são inativadas e, assim como na infecção natural, conferem proteção total apenas contra vírus homólogos (Poland et al., 2001; Kothalawala et al., 2006). O crescimento da suinocultura e a concentração em áreas com alta densidade de animais, além da introdução frequente de novas cepas virais faz com que o controle do IAV em suínos seja cada vez mais dependente de protocolos de vacinação (Vincent et al., 2008). A ocorrência da influenza clínica em animais de creche, recria e terminação aqui relatada em seis estados do Brasil apontam para a falta de proteção imune e alta susceptibilidade dos animais nos rebanhos brasileiros e ressaltam a necessidade de dar mais atenção à essa enfermidade na suinocultura nacional. Só então será possível a aplicação de medidas de manejo e prevenção específicas, como a vacinação, capazes de reduzir a disseminação viral e o acometimento clínico dos animais. Entretanto, alguns fatores devem ser considerados antes de implantar a vacinação nos rebanhos nacionais, sendo importante a associação da circulação viral com o quadro clínico e com a presença de outros patógenos respiratórios na granja, para então avaliar a real necessidade e a viabilidade da vacinação em determinada propriedade. A circulação do vírus influenza em rebanhos suínos em diversos estados brasileiros foi comprovada neste estudo, desencadeando surtos de doença respiratória nos animais e gerando prejuízos ao produtor. Apesar da influenza ser uma enfermidade com baixa mortalidade e rápida recuperação, a morbidade elevada acarreta em impacto econômico considerável devido à queda da ingestão alimentar e consequente aumento no período para atingir o peso de abate (Heinen, 2002). Dessa forma, a influenza é uma ameaça para o produtor e o conhecimento sobre sua epidemiologia e características clínicas e patológicas é essencial para estabelecer métodos de diagnóstico adequados e desenvolver vacinas eficazes. A identificação do vírus influenza circulando e causando doença clínica em rebanhos suínos brasileiros comprova o papel importante da influenza na ocorrência de doenças respiratórias em suínos no Brasil, e a necessidade de incluí-la no diagnóstico diferencial de enfermidades respiratórias e de considerar a vacinação como medida preventiva contra a influenza em rebanhos sem proteção. 47 CAPÍTULO 4: PERFIL SOROLÓGICO PARA O VÍRUS DA INFLUENZA EM GRANJAS COMERCIAIS DE SUÍNOS NO BRASIL Introdução O vírus da influenza A (IAV) é um dos principais agentes causadores de doença respiratória em suínos, gerando perdas econômicas devido à redução do ganho de peso e ao aumento no tempo para alcançar o peso de abate (Olsen et al., 2006a). O primeiro relato da infecção de suínos com o IAV ocorreu simultaneamente à pandemia de 1918 em humanos (Koen, 1919 citado por Zimmer e Burke, 2009), e esse vírus H1N1 clássico (cH1N1) permaneceu conservado durante várias décadas (Vincent et al., 2008). Após a introdução na população humana do vírus pandêmico H1N1 em 2009 (pH1N1), houve alerta para a possibilidade de disseminação do pH1N1 para as populações suínas mundiais. Desde então, muitos países identificaram a infecção natural de suínos com pH1N1, inclusive o Brasil (Pereda et al., 2010; Moreno et al., 2010; Sreta et al., 2010; Schaeffer et al., 2011). Tanto a imunidade humoral como a celular contribuem para a resistência contra a infecção pelo vírus influenza e contra a manifestação da doença clínica, mas a resposta imune induzida pela infecção protege apenas contra vírus homólogos ou antigenicamente relacionados (Cox et al., 2004; Kitikoon et al., 2006). A hemaglutinina (HA) é o alvo principal da resposta imune do hospedeiro e leva à produção de anticorpos neutralizantes inibidores da hemaglutinação (HI), relacionados à proteção contra a sintomatologia clínica da doença (Hannoun et al., 2004). Anticorpos HI são detectados sete dias após a infecção e permanecem por 48 várias semanas, podendo ser detectados até a idade de abate (Heinen et al., 2000; Desrosiers et al., 2004). Frequentemente, anticorpos contra IAV são detectados em rebanhos suínos sem quaisquer sinais clínicos da Influenza, o que indica que em muitos casos a infecção pelo IAV é subclínica (Maes et al., 2000; Loeffen et al., 2003a). Anticorpos maternos reduzem as manifestações clínicas da leitegada, mas não protegem totalmente contra a infecção ou a eliminação viral (Loeffen et al., 2003a,b; Kitikoon et al., 2006). A queda gradativa de anticorpos passivos, cujos níveis mais baixos geralmente são observados entre cinco e 12 semanas de idade, aumenta a susceptibilidade dos animais à infecção, resultando em maior acometimento de animais geralmente ao final da creche e início da recria (Loeffen et al., 2003b; Liu et al., 2008). Entretanto, anticorpos passivos também podem interferir no desenvolvimento da resposta imune ativa diante da infecção pelo vírus Influenza, pois a presença de anticorpos colostrais pode suprimir a resposta de anticorpos inibidores da hemaglutinação (Loeffen et al., 2003a; Kitikoon et al., 2006). O perfil sorológico de um rebanho fornece informações importantes para estabelecer a dinâmica dos patógenos circulantes, de acordo com o fluxo dos animais nos vários estágios da produção. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil sorológico para o vírus da influenza em granjas comerciais no Brasil amostradas antes e após a pandemia de 2009. Material e Métodos O perfil sorológico foi realizado em um estudo transversal seccionado. Foram utilizados ao menos dez animais, escolhidos aleatoriamente, de cada categoria do ciclo de produção (matrizes; leitões de maternidade – de 15 a 21 dias de idade; creche –de 40 a 70 dias; recria –de 80 a 110 dias; terminação – de 120 a 150 dias), pertencentes a sete granjas comerciais localizadas em três Estados brasileiros (Minas Gerais, São Paulo e Paraná). Amostras de sangue foram colhidas através de punção da veia jugular, centrifugadas e, após separação do soro, mantidas a -20ºC até o processamento. localizados em áreas com alta densidade de suínos e sem histórico de vacinação para IAV. Todas as propriedades realizavam vacinação para Mycoplasma hyopneumoniae, Streptococcus suis, Leptospira spp, Parvovírus suíno e Erysipelothrix rhusiopathiae. As informações sobre as granjas estudadas estão relatadas na Tab. 6. Os rebanhos eram de ciclo completo com sistema “todos dentro - todos fora”, Tabela 6. Caracterização das granjas estudadas. Granja Data da coleta Local Matrizes Sinais observados G1 2005 Minas Gerais 500 Refugagem, tosse e dificuldade respiratória em animais de recria, ocorrência de SRM; diagnóstico confirmado para PCV2. Sinais observados no momento da coleta. 2005 São Paulo 800 Tosse e espirros brandos e refugagem na creche e recria, perda de peso, ocorrência de SRM; diagnóstico confirmado para M. hyopneumoniae, P. multocida e PCV2. Sinais observados no momento da coleta. 1200 Baixa ocorrência de espirros na creche e recria, refugagem em animais de creche; diagnóstico confirmado para Mycoplasma hyopneumoniae, Pasteurella multocida e PCV2. Sinais observados no momento da coleta. G2 G3a* 2005 Paraná G3b* 2010 Paraná 1650 Tosse intensa em animais de creche, recria e terminação, crescimento abaixo do normal; diagnóstico confirmado para M. hyopneumoniae. Sinais observados no momento da coleta. G4 2010 Minas Gerais 900 Refugagem e tosse intensa permanecendo 7 dias em animais de creche; diagnóstico confirmado para H. parasuis e PCV2. Sinais observados 2 semanas antes da coleta. G5 2009 Minas Gerais 5000 Tosse intensa, hipertermia e perda de peso em animais de creche e recria e em porcas; diagnóstico confirmado para M. hyopneumoniae, P. multocida e PCV2. Sinais observados 2 semanas antes da coleta. G6 2010 São Paulo 1600 Tosse e pneumonia em animais de creche e recria; diagnóstico confirmado para P. multocida e PCV2. Sinais observados 3 semanas antes da coleta. G = granja; PCV2 = Circovírus suíno tipo 2; SRM = Síndrome da refugagem multissistêmica * G3a e G3b são a mesma granja amostrada em épocas diferentes 49 As amostras das granjas G1 a G3a foram coletadas anteriormente à pandemia de 2009 em humanos, e as amostras de G3b a G6 foram coletadas após o início da pandemia. G3a e G3b são a mesma granja, amostrada em épocas diferentes, antes e após o início da pandemia de 2009 com intervalo de cinco anos entre as coletas. O perfil sorológico foi determinado pela reação de inibição da hemaglutinação (HI) como descrito anteriormente (WHO, 2002; OIE, 2010), utilizando como antígenos o vírus clássico A/swine/Iowa/15/1930 (cH1N1) e o vírus pandêmico A/swine/Brazil/11/2009 (pH1N1) isolado neste estudo. Títulos de anticorpos menores que 40 foram considerados negativos; 40 e 80, baixos; 160 e 320, médios; e iguais ou acima de 640, altos. A análise das médias dos títulos de anticorpos foi realizada após transformação logarítmica [Log2(título/10)]. A variação dos títulos de anticorpos entre categorias de animais na mesma granja foi analisada utilizando o teste de Kruskal-Wallis e a distribuição nos níveis dos títulos de anticorpos entre categorias de diferentes granjas foi analisada através do teste de Mann-Whitney, e foram consideradas diferenças significativas quando P<0,05. Resultados Os títulos sorológicos contra os vírus influenza cH1N1 e pH1N1 nas propriedades estudadas variaram amplamente. Do total de 407 amostras testadas, 191 (46,9%) foram positivas pela HI para cH1N1 e 196 (48,1%) para pH1N1, com títulos variando entre 40 e 5.120 UHI/25µL. As granjas G1 a G3a foram consideradas negativas para os antígenos empregados, pois todas as amostras apresentaram títulos abaixo do ponto de corte (Fig. 8). Foram detectadas amostras positivas em todas as fases das granjas G3b a G6, para ambos os vírus. Os 50 resultados dos perfis sorológicos estão detalhados na Fig. 8. A Fig. 9 ilustra as distribuições dos níveis de títulos de anticorpos dentro de cada fase das granjas estudadas consideradas positivas. As granjas positivas mostraram padrão semelhante de perfil sorológico para ambos os antígenos, com exceção de G6. Os títulos das porcas em G3b a G5 foram aparentemente mais elevados que nas demais fases (Fig. 8). As porcas de G3b, G4 e G6 apresentaram distribuição nos níveis de títulos de anticorpos semelhantes entre elas, mas G5 apresentou percentual mais elevado de animais com títulos altos (≥ 640) tanto para cH1N1 como para pH1N1 (Fig. 9). Foi observada queda de anticorpos na fase de creche de todas as granjas, para ambos os vírus, indicando o provável decaimento da imunidade passiva no início dessa fase (Fig. 8). Os percentuais de animais negativos em G4 e G5 para cH1N1 na creche (40% e 30%) e na recria (40% e 45%), e em G3b e G4 na creche (65% e 70%) para pH1N1, foram mais elevados que nas demais fases. G3b apresentou percentual mais elevado de animais negativos para cH1N1 na recria (80%) e na terminação (78%) que nas outras fases. A granja 6 apresentou percentual mais elevado de animais negativos na terminação para cH1N1 (70%) e na creche, recria e terminação para pH1N1 (35% a 45%) em comparação com as outras fases (Fig. 9). Em G3b e G4 a circulação viral do cH1N1 parece ser baixa. Em G3b não houve soroconversão após a queda de anticorpos passivos e as médias dos títulos de anticorpos nas fases de recria e terminação foram abaixo do ponto de corte. E mesmo nas porcas e nos leitões de maternidade os títulos são próximos ao ponto de corte (Fig. 8). Para o pH1N1, esse quadro se repetiu, mas os títulos observados em porcas, na recria e na terminação foram levemente mais elevados (Fig. 8). Em G4, a soroconversão pode ser observada na fase de recria, embora (!"*"#!" ! ! "$ " "$ " &$ &$ ! &$ "$ " ! "$ " "$ " &$ &$ ! ! "$ " "$ " &$ &$ (% % &#%# 6# $% #& )4%(& " ("* &(4"# +&&# $"2!# $ "& %"& &'(& & !1& #!1'%& #& '4'( #& "'#%$#& $6& '%"&#%!/-# #%4'! #%!#!$%&"'%&&&%/-#&%"&$#&')&'%& %"'& !"7&( & $% !7&( & $% $ "! %"/&&"')& %"&!#&'%&"'& $6& $"! ! (!"#& " $#"' "#$#"'##%' ! ! sem aumento significativo nos títulos para cH1N1. Entretanto, os títulos de anticorpo não se elevaram na terminação para ambos os vírus, mantendo-se próximos ao ponto de corte (Fig. 8). 51 estatística não tenha sido observada em algumas comparações (Fig. 9). G5 apresentou médias de títulos de anticorpos mais elevadas que nas demais granjas para cH1N1 e pH1N1, com títulos acima do ponto de corte na creche. E ainda existem indícios de nova exposição ao vírus na fase de terminação, o que é indicado pelo percentual mais elevado de animais com títulos altos (Fig. 9). Além disso, G5 apresentou maior percentual de animais com título alto em todas as outras fases da criação para ambos os antígenos, embora diferença Em G6, leitões de maternidade apresentaram médias de títulos de anticorpos mais elevadas que de porcas. Houve queda nos títulos dos animais de creche em comparação com os de maternidade para ambos os vírus, mas as médias naquela fase foram superiores ao ponto de corte. E ainda, os títulos mantiveram-se acima do ponto de corte nas fases de recria para cH1N1 e recria e terminação para pH1N1. Figura 9. Distribuição dos títulos de anticorpos contra os vírus da influenza clássico (cH1N1) e pandêmico (pH1N1) das diferentes fases de criação nas granjas estudadas com resultados positivos. Amostras negativas (titulo <40); com título baixo (40 e 80); título médio (160 e 320); e título alto (≥640). Diferenças significativas (P<0,05) entre a distribuição de títulos numa mesma fase de criação das diferentes granjas estão indicadas por letras diferentes. G3b a G6 = granjas 3b a 6, que obtiveram resultados positivos na inibição da hemaglutinação. #$ #! !" ! ! !&$ !" 52 #$ #! ! ! !&$ Discussão Este estudo revelou variação nos títulos de anticorpos e na soroconversão nas granjas estudadas, sugerindo introdução e circulação viral em momentos variados de propriedade para propriedade. Essa observação reflete a ocorrência de surtos esporádicos num rebanho, característica comum na infecção pelo SIV (Olsen et al., 2006a; Liu et al., 2008). Além disso, foi observada uma distribuição heterogênea dos níveis de títulos de anticorpos dentro de cada fase da produção, indicando que animais de uma mesma categoria apresentavam diferentes níveis de proteção contra o vírus influenza, o que pode ser considerado o motivo para a manutenção da transmissão viral nos rebanhos afetados e para o aparecimento de sinais clínicos. As granjas G1 a G3 foram consideradas negativas, o que indica que antes da pandemia de 2009 a circulação do vírus influenza nestas granjas não existia. Nesse sentido, como apenas as granjas coletadas após 2009 foram positivas, a ocorrência da pandemia humana em 2009 parece ter levado à introdução e circulação do vírus pandêmico nos rebanhos avaliados. Os animais das propriedades negativas para o vírus influenza apresentavam sinais clínicos respiratórios, que provavelmente eram resultantes da infecção com outros patógenos que circulavam nesses rebanhos, como Mycoplasma hyopneumoniae, Pasteurella multocida e Circovírus suíno tipo 2. As granjas positivas (G3b a G6) também apresentavam circulação de outros patógenos respiratórios, indicando a coinfecção com o vírus influenza. O vírus influenza é importante fator predisponente para infecções bacterianas secundárias (Olsen et al., 2006a), e a infecção intercorrente do IAV com bactérias ou vírus respiratórios pode agravar e prolongar a duração dos sinais clínicos (Van Reeth et al., 1996; Thacker et al., 2001; Choi et al., 2003; Hansen et al., 2010), porém os rebanhos avaliados que exibiram infecção mista não possuíam indícios de manifestações clínicas exacerbadas. As porcas apresentaram médias de títulos de anticorpos mais elevadas e maior percentual de animais com títulos altos e médios que as demais categorias, exceto em G6. Tal resultado pode indicar a exposição frequente desses animais ao vírus e contínua replicação viral, uma vez que esses animais permanecem por mais tempo no rebanho. Poljak et al (2008) também observaram uma prevalência mais elevada de anticorpos antiH1N1 em porcas (58,3%) do que em suínos de terminação (17,6%). Em G3b, G4 e G5, os animais de maternidade apresentaram médias de títulos semelhantes às de porcas para cH1N1 e pH1N1, o que provavelmente indica a transferência de anticorpos passivos pelo colostro. Porcas e leitões parecem servir de reservatório para a contínua circulação viral do influenza em um rebanho, facilitando a disseminação para as outras fases em rebanhos de ciclo completo (Loeffen et al., 2003b). Então, os títulos mais elevados observados nesses animais no presente estudo podem indicar a contínua exposição ao vírus influenza, facilitando a manutenção viral no rebanho. Entretanto, o percentual de animais com títulos médios e altos na maternidade foi inferior ao de porcas nas três granjas, o que pode ser resultante da ingestão inadequada do colostro, prejudicando a transferência de anticorpos maternos. Além disso, algumas porcas foram negativas (35% e 15% em G3b, 25% e 30% em G4, 20% e 20% em G5, para cH1N1 e pH1N1 respectivamente), indicando que, mesmo em rebanhos com circulação viral, pode não haver transferência de anticorpos para os leitões. Em G6, os leitões de maternidade apresentaram aumento nos títulos de anticorpos em relação às porcas para ambos os vírus, indicando infecção pelo influenza mesmo na presença de anticorpos maternais. 53 Estudos anteriores comprovaram que anticorpos passivos contra o vírus influenza protegem os animais parcialmente, reduzindo a ocorrência de febre e sinais clínicos, entretanto não são capazes de impedir a infecção (Loeffen et al., 2003a; Kitikoon et al., 2006). Nessa granja, os animais de maternidade não apresentavam manifestações clínicas, mas foram observados sinais respiratórios nos animais de creche e recria, e a infecção pelo vírus influenza foi confirmada em animais de recria por PCR em tempo real (dados não apresentados). Todavia não foi observado aumento nos títulos de anticorpos na recria e terminação em soros coletados três semanas após as manifestações clínicas. No entanto, os títulos de anticorpos nessas fases estavam acima do ponto de corte (>40). Em humanos, títulos de anticorpos inibidores da hemaglutinação acima de 40 são associados à redução em 50% do risco de infecção ou doença causadas por vírus sazonais (Potter e Oxford, 1979), mas em suínos a proteção contra a infecção está diretamente relacionada com o título HI do animal, sendo que títulos altos conferem melhor proteção (Vincent et al., 2008). Portanto, mesmo apresentando anticorpos contra o IAV, esses animais podem não estar protegidos. A queda da imunidade passiva nas granjas estudadas ocorreu na fase de creche (4 a 10 semanas) para ambos os antígenos, semelhante ao demonstrado por Loeffen et al. (2003b) e Liu et al. (2008), em que o decaimento de anticorpos maternos ocorreu a partir de 5 semanas de idade. Portanto, os animais da fase de creche e recria dessas granjas apresentavam maior susceptibilidade para se infectar com o vírus influenza e, principalmente, manifestar sinais clínicos. Além disso, os animais da creche geralmente são agrupados com status imunológicos diferentes tornando-os ainda mais vulneráveis, fato confirmado pela distribuição variada observada nos níveis de anticorpos nos animais da maternidade. 54 Consequentemente, em todas as granjas positivas foram observados sinais clínicos respiratórios nos animais de creche. Embora a infecção com outros patógenos respiratórios tenha sido relatada nas propriedades avaliadas, a associação do curso agudo dos sinais clínicos com a presença de anticorpos contra o IAV sugere infecção pelo vírus influenza nesses animais. A granja G3b apresentava baixa circulação viral, e a eliminação viral não foi detectada por diagnóstico direto em animais amostrados na recria (resultados não apresentados). Os baixos títulos de anticorpos observados em porcas e leitões de maternidade provavelmente se devem à exposição prévia das fêmeas ao vírus, mas com pressão de infecção baixa. Embora tenha havido aumento nos títulos na terminação para cH1N1 e na recria para pH1N1, um percentual significativo dos animais foram negativos ou com títulos baixos, mantendo as médias de títulos abaixo do ponto de corte. Nessa propriedade os animais encontram-se com baixa proteção imune, e medidas de manejo e biossegurança adequadas devem ser reforçadas para evitar a ocorrência de sinais respiratórios caso o vírus influenza seja reintroduzido. Além disso, pôde-se constatar que o vírus influenza foi introduzido recentemente nessa propriedade, pois ela foi considerada negativa na amostragem anterior (G3a). Em granjas de ciclo completo, a incidência da infecção pelo vírus influenza é mais elevada no início do período de crescimento (Loeffen et al., 2009b). Em G4, sinais clínicos respiratórios compatíveis com a influenza foram observados em animais de creche e a eliminação viral foi confirmada por PCR em tempo real em um animal dessa fase (resultados não apresentados). Como resultado, a soroconversão para ambos os vírus nessa granja foi observada na recria duas semanas depois. Os títulos elevados para cH1N1 e pH1N1 nas porcas, animais de maternidade e de terminação observados em G5, e ainda títulos acima do ponto de corte na creche e recria, indicam alta circulação viral em toda a granja. A propriedade apresentava animais com sinais clínicos respiratórios intensos na creche, recria e em porcas, e o vírus influenza foi identificado em animais de recria e em uma fêmea (resultados não apresentados). Dessa forma, justifica-se os títulos elevados em porcas e animais de terminação observados duas semanas após as manifestações clínicas, provavelmente devido à alta pressão de infecção e baixa imunidade prévia dos animais, confirmando o surto de influenza nessa granja. A utilização de anti-inflamatórios na água durante um surto pode reduzir alguns sinais clínicos (Ciacci-Zanella et al., 2011b), mas medidas de biossegurança, como limpeza e desinfecção das instalações antes da entrada de um novo lote, além do controle na circulação de animais e pessoas, devem ser melhoradas para impedir a disseminação e manutenção do vírus dentro da propriedade. Os resultados encontrados na HI foram semelhantes para ambos os vírus utilizados, o influenza suíno clássico e o influenza pandêmico 2009, para todas as granjas, indicando reação cruzada com os anticorpos presentes nos soros testados. Soros com anticorpos contra o vírus pandêmico apresentam reação cruzada na inibição da hemaglutinação com diversos outros vírus H1 suínos, inclusive o cH1N1 (Perera et al., 2011). Por outro lado, a reação cruzada contrária, em que anticorpos para os vírus H1 suínos endêmicos norte-americanos reagem contra o vírus pandêmico, parece ser limitada (Vincent et al., 2010a). Logo, como a reação cruzada é mais comum entre o antígeno de vírus endêmicos e anticorpos contra o pH1N1, e como apenas as granjas amostradas após o início da pandemia de 2009 foram positivas, os animais testados provavelmente apresentavam anticorpos contra o vírus influenza pandêmico, e a reação cruzada ocorreu entre o antígeno cH1N1 e anticorpos específicos para o pH1N1. Inicialmente, o controle da circovirose suína era realizado através da utilização de imunógenos produzidos a partir de macerados de órgãos de animais doentes (BRASIL, 2008), em desacordo com a Instrução Normativa No 31 (BRASIL, 2003). A IN31 regulamenta a produção de vacinas autógenas e prevê que essas devem conter apenas o agente específico e serem livres de contaminantes. Como os macerados utilizados contra o PCV2 não apresentavam comprovação de pureza e segurança, planteis nacionais foram expostos ao risco de disseminação de outros patógenos (BRASIL, 2008) e, possivelmente, à imunização com outros antígenos, incluindo o vírus influenza, o que poderia resultar em reação positiva na sorologia. Entretanto, essa interferência nos resultados sorológicos não existiu neste estudo, pois todas granjas amostradas antes de 2008, quando a utilização deste tipo de imunização foi encerrada, não apresentaram títulos positivos na HI. A vacinação de suínos contra os vírus influenza é realizada geralmente em fêmeas reprodutoras nos países que a empregam, embora alguns produtores também vacinem leitões desmamados, e em ambos os casos a resposta de anticorpos ocorre em 2-6 dias (Olsen et al., 2006a; Vincent et al., 2008). No Brasil, a vacinação de suínos contra o vírus influenza ainda não faz parte da rotina dos rebanhos tecnificados. Recentemente foram relatados vários surtos respiratórios em suínos em todo o Brasil (Ciacci-Zanella et al., 2011b), e muitos produtores e médicos veterinários vêm apontando a necessidade de realizar a vacinação contra influenza. Como não existem vacinas comerciais disponíveis, a utilização de vacinas autógenas vem sendo considerada. O uso de vacinas autógenas está crescendo em países que vacinam os 55 suínos contra influenza, devido à grande diversidade de vírus circulando nas populações suínas mundiais e à dificuldade da indústria biológica de modificar a composição vacinal na velocidade em que os vírus estão mudando (Vincent et al., 2008). Com base na cinética dos níveis de anticorpos obtidos no perfil sorológico dos rebanhos estudados, e considerando a idade em que os sinais clínicos foram observados, a vacinação tanto de porcas como de leitões desmamados deve ser considerada em G3b e G4, pois os animais destas propriedades apresentavam baixa proteção imune, principalmente na fase de creche, e, portanto, estavam susceptíveis à infecção pelo vírus influenza. A presença de anticorpos passivos interfere com a resposta imune contra o SIV resultante de infecção ou vacinação (Kitikoon et al., 2006; Renshaw, 1975). Entretanto, como muitos animais da creche dessas granjas foram negativos (40 a 70%) ou apresentaram níveis de anticorpos maternos baixos, provavelmente não ocorreria interferência com a vacinação, principalmente se não for realizada no início da fase. Já G5 e G6 apresentaram infecção ativa e os animais de creche e recria exibiram níveis mais elevados de anticorpos, mas ainda assim foram observados animais negativos. Portanto, a vacinação apenas de porcas será suficiente para manter níveis homogêneos de anticorpos no plantel capazes de proteger contra os sinais clínicos. Enquanto vacinas comerciais não são disponibilizadas no Brasil, a utilização de vacinas autógenas pode servir como alternativa, desde que feita de acordo com as normas regulamentadas pelo Ministério da Agricultura Pecuária e 56 Abastecimento (BRASIL, 2003) e com acompanhamento de médico veterinário. Mas a vacinação, seja com vacinas autógenas ou comerciais, só deve ser preconizada em regiões de alta circulação viral em que surtos respiratórios são frequentes, levando-se em consideração o estado imunológico do rebanho e a viabilidade econômica dessa medida. Os resultados aqui relatados ajudam a entender a forma como o vírus influenza circula em granjas suínas naturalmente infectadas. Além disso, esse estudo foi realizado em granjas comerciais e, portanto, mostra a flutuação de anticorpos contra o vírus influenza dentro do rebanho em condições naturais, em que diversos fatores podem interferir na imunidade do plantel, como características do animal, medidas de manejo e biossegurança, ocorrência de infecções concomitantes, entre outros. O conhecimento do perfil sorológico possibilita a elaboração e adoção consciente de medidas de manejo preventivas e o estabelecimento do momento ideal para realizar a vacinação, caso a vacinação contra o IAV seja acrescentada aos programas sanitários das granjas brasileiras. A vacinação baseada no perfil sorológico do rebanho evita a interferência de anticorpos maternos e permite a montagem da resposta imunológica no momento de maior susceptibilidade dos animais. Além disso, o conhecimento da distribuição dos níveis de anticorpos em cada categoria enfatiza a importância de monitorar a ingestão de colostro pelos leitões nas primeiras horas de vida, a fim de garantir níveis adequados e protetores de anticorpos passivos. CAPÍTULO 5: CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DOS VÍRUS INFLUENZA ISOLADOS DE SUÍNOS NO BRASIL EM 2009 E 2010 Introdução A infecção de suínos por vírus influenza A não apenas resulta em prejuízos à produção, como representa também grande problema à saúde pública (Neumann et al., 2009). Os vírus influenza A contêm genoma de RNA composto de oito segmentos distintos, o que permite o rearranjo de segmentos entre vírus diferentes (Palese e Shaw, 2007). As proteínas de superfície hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) são os principais alvos para a resposta imune do hospedeiro, e têm papel importante para a especificidade de hospedeiros, antigenicidade, patogenicidade e diagnóstico da infecção (Nicholls et al., 2008). Três diferentes subtipos do vírus da influenza suína (SIV), H1N1, H3N2 e H1N2, circulam atualmente em suínos (Olsen et al., 2006b). O primeiro SIV descrito foi um H1N1, também conhecido como SIV clássico (cH1N1), semelhante ao vírus H1N1 pandêmico de 1918. Na população suína dos EUA, a maioria dos vírus H1N1 permaneceu conservada antigenicamente, e manteve-se semelhante ao cH1N1, até a introdução de um vírus H3N2 de rearranjo triplo em 1998 (Zhou et al., 1999; Vincent et al., 2008). Com o aparecimento desse novo vírus, ocorreram rearranjos que levaram à combinação de diferentes HA e NA a uma combinação de genes internos de rearranjo triplo (TRIG), formada por PB1 de linhagem humana, PB2 e PA de linhagem aviária, e NP, M e NS de linhagem suína (Vincent et al., 2008). Os vírus H1 endêmicos nos suínos americanos são classificados em clusters: clusters α, β e γ, que evoluíram dos vírus cH1N1; e cluster δ, com HA semelhante a vírus H1 sazonais humanos. Os genes NA em todos esses clusters podem ser tanto N1 como N2 (Vincent et al., 2009b). Na Europa o H1N1 predominante era inteiramente de origem aviária, mas o rearranjo entre este vírus H1N1 e o vírus H3N2 humano introduzido na década de 80 levou à formação de um H3N2 que também circula em suínos europeus (Jong et al., 2007; Van Reeth, 2007). Além disso, o subtipo H1N2, com genes de origem humana (HA e NA) e genes derivados do vírus Europeu tipo aviário H1N1, também é endêmico nos suínos da Europa (Lam et al., 2008). No Brasil, vírus influenza A já foram isolados da secreção nasal de suínos comerciais e algumas amostras foram positivas pela PCR, entretanto tais amostras não foram caracterizadas geneticamente, e o subtipos virais e cepas circulantes não foram determinados (Mancini et al, 2006; Schaefer et al, 2008). Após a introdução na população humana do vírus pandêmico H1N1 em 2009 (pH1N1), houve alerta para a possibilidade de disseminação do pH1N1 para as populações suínas mundiais. Estudos comprovaram a susceptibilidade de suínos ao novo vírus, e demonstraram sua capacidade de disseminação na espécie (Lange et al., 2009; Brookes et al., 2010). Desde então, muitos países identificaram a infecção natural de suínos com pH1N1, inclusive o Brasil, geralmente associada ao quadro de doença respiratória em humanos que mantinham contato com os animais (Pereda et al., 2010; Moreno et al., 2010; Sreta et al., 2010; Schaefer et al., 2011c). O H1N1 pandêmico contém seis segmentos da linhagem de rearranjo triplo suína norte americana, com os segmentos M e NA da linhagem H1N1 da Europa e Ásia (Dawood et al., 2009; Garten et al., 2009). Pouco após a identificação do pH1N1 em suínos, rearranjos entre esses 57 vírus e vírus endêmicos suínos foram relatados (Ducatez et al., 2011; Starick et al., 2011; Zhu et al., 2011). Embora a infecção por vírus influenza A tenha sido relatada em suínos brasileiros, a caracterização genética e subtipagem não foi realizada na maior parte dos casos (Mancini et al, 2006; Schaefer et al, 2008, Schaeffer et al., 2011a,b,c). Além disso, características evolutivas das cepas do SIV circulando em suínos no Brasil ainda são desconhecidas. Portanto, neste estudo realizamos a caracterização genética dos genes HA e NA de 20 vírus influenza isolados de suínos em cinco Estados brasileiros durante os anos de 2009 e 2010. Os resultados revelam uma alta ocorrência do vírus H1N1 pandêmico, sugerindo transmissão de vírus influenza humanos para a população suína. E ainda, descrevemos um caso com suspeita da transmissão de suínos para humano. Material e Métodos 1. Amostras clínicas Foram utilizadas vinte amostras virais isoladas de pulmão de suínos no Brasil. Os vírus foram isolados de fragmentos de pulmão enviados para diagnóstico de rotina de doença respiratória ao Laboratório de Diagnóstico Instituto de Pesquisas Veterinárias Especializadas (IPEVE) e por médicos veterinários após visita técnica, durante os anos de 2009 e 2010. As amostras de pulmão foram coletadas durante surtos de doença respiratória em 13 rebanhos suínos de Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Rio Grande do Sul e Mato Grosso. Todos os rebanhos tinham animais apresentando sinais agudos respiratórios como tosse e descarga nasal, além de febre e anorexia, principalmente nas fases de creche e recria. Os isolados foram numerados em sequência de acordo com o ano de isolamento, de 58 1/2009 a 17/2009 e 18/2010 a 20/2010. O nome das amostras, respectivas propriedades e estados de origem, espécie do hospedeiro, ano de coleta e número de acesso no GenBank estão detalhados na Tab. 7. Uma amostra isolada de humano também foi utilizada neste estudo. Após visita a uma propriedade comercial de suínos de Minas Gerais durante um surto de afecção respiratória, o técnico responsável apresentou sintomas respiratórios semelhantes aos observados nos suínos, os quais tiveram início três dias após a visita e permaneceram por uma semana. Segundo o referido técnico, não houve contato com outras propriedades produtoras de suínos nem com pessoas que apresentavam sintomas respiratórios por no mínimo sete dias antes e após a visita àquela propriedade. Foi realizado o diagnóstico oficial através da PCR em tempo real pela Fundação Oswaldo Cruz em parceria com as Secretarias Municipal e Estadual de Saúde, seguindo o protocolo do CDC (WHO, 2009), e o resultado foi positivo para influenza A / H1 linhagem suína. Uma amostra de suabe nasal foi fornecida pelo técnico para utilização neste estudo, denominada A/Minas Gerais/21/2009, e o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido foi fornecido dando permissão para uso da amostra e das informações. Duas das amostras de suínos (A/swine/Brazil/16 e 17/2009) analisadas neste estudo foram provenientes da mesma propriedade visitada pelo técnico. As amostras de tecido e de suabe nasal foram inoculadas em monocamadas de células MDCK e os sobrenadantes testados pela reação de hemaglutinação (HA) como descrito anteriormente (WHO, 2002; OIE, 2010). Tabela 7. Caracterização das amostras virais estudadas. Nome da amostra Granja Estado A/swine/Brazil/1 A/swine/Brazil/2 A Minas Gerais A/swine/Brazil/3 A/swine/Brazil/4 A/swine/Brazil/5 A/swine/Brazil/6 A/swine/Brazil/7 B Minas Gerais C Minas Gerais D Minas Gerais E Minas Gerais A/swine/Brazil/8 A/swine/Brazil/9 A/swine/Brazil/10 Espécie Ano de coleta Número de acesso HA Número de acesso NA suíno 2009 JQ666845 JQ666866 suíno 2009 JQ666846 JQ666867 suíno 2009 JQ666847 JQ666868 suíno 2009 JQ666848 JQ666869 suíno 2009 JQ666849 JQ666870 suíno 2009 JQ666850 JQ666871 suíno 2009 JQ666851 JQ666872 suíno 2009 JQ666852 JQ666873 suíno 2009 JQ666853 JQ666874 suíno 2009 JQ666854 JQ666875 A/swine/Brazil/11 F Minas Gerais suíno 2009 JQ666855 JQ666876 A/swine/Brazil/12 G Mato Grosso suíno 2009 JQ666856 JQ666877 A/swine/Brazil/13 H Rio Grande do Sul suíno 2009 JQ666857 JQ666878 A/swine/Brazil/14 I Minas Gerais suíno 2009 JQ666858 JQ666879 A/swine/Brazil/15 J Minas Gerais suíno 2009 JQ666859 JQ666880 K Minas Gerais suíno 2009 JQ666860 JQ666881 suíno 2009 JQ666861 JQ666882 L Paraná suíno 2010 JQ666862 JQ666883 M São Paulo suíno 2010 JQ666863 JQ666884 suíno 2010 JQ666864 JQ666885 K Minas Gerais humano 2009 JQ666865 JQ666886 A/swine/Brazil/16 A/swine/Brazil/17 A/swine/Brazil/18 A/swine/Brazil/19 A/swine/Brazil/20 A/Minas Gerais/21 2. Extração de RNA e transcrição reversa O RNA viral foi extraído de sobrenadante após isolamento, utilizando o kit QIAamp viral RNA mini kit (Qiagen Inc., Valencia, CA, EUA) de acordo com especificações do fabricante. O RNA foi então transcrito em cDNA a 42ºC por 60 minutos utilizando 0,2µM de primer universal para vírus Influenza (primer Uni12 5’AGCAAAAGCAGG-3’) (Hoffmann et al., 2001), 100 unidades de transcriptase reversa M-MLV (Promega, Madison, WI, EUA), 5 µL de tampão de reação 5X, 0,8mM de cada dNTP, 40 unidades de inibidor de ribonuclease RNaseOUT™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e água livre de RNAse para o volume final de 25 µL. 3. PCR para segmentos HA e NA O isolamento viral foi confirmado pela PCR em tempo real mediante a utilização de primers para o gene da matriz (M) como descrito anteriormente (WHO, 2009). A região codificadora dos genes HA e NA completos foram amplificadas a partir do cDNA utilizando iniciadores externos forward e reverse publicados por Hoffmann et al. (2001) (Tab. 8). A reação consistiu em 5µL de tampão 5X e 0,15µL de GoTaq HotStart DNA Polimerase (5 U/µL - 59 Promega, Madison, WI, EUA), 2mM de MgCl2, 0,2mM de cada dNTP, 0,2µM de cada iniciador, 1µL de cDNA (0,5µg) e água ultra pura livre de DNAse para 25µL. A amplificação foi realizada em um termociclador (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) nas seguintes condições: desnaturação inicial a 94°C por 5 minutos, seguida de 30 ciclos com desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento de primers a 60°C por 30 segundos e extensão a 72°C por 3 minutos, concluindo com uma extensão final a 72°C por 7 minutos. Em seguida os produtos da PCR de cada gene foram submetidos a reações nested separadas utilizando pares externo-interno e interno-externo dos primers (forward externo com reverse interno; forward interno com reverse externo; para cada gene – Tab. 8). Cada reação de 25µL consistiu de 15,85µL de água ultra pura livre de DNAse, 5µL de tampão 5X e 0,15µL de GoTaq HotStart DNA Polimerase (Promega, Madison, WI, EUA), 2mM de MgCl2, 0,2mM de cada dNTP, 0,1µM de cada iniciador e 1µL do produto da PCR com primers externos. As condições do termociclador consistiram de desnaturação inicial a 94°C por 5 minutos, seguida de 30 ciclos a 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos e 72°C por 1 minuto, concluindo com uma extensão final a 72°C por 7 minutos. Os produtos amplificados na PCR foram visualizados em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo. Tabela 8. Conjunto de iniciadores para uso na PCR para sequenciamento dos genes hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) completos dos vírus Influenza A. Iniciadores Sequência (5’>3’) HAF externo CAGGGAGCAAAAGCAGGGG HAR externo CCAGTAGAAACAAGGGTGTTTT HAF interno CGAAGCAACTGGAAATCTAGTGG HAR interno GRAGGCTGGTGTTTATAGCACC NAF externo CAG GGAGCAAAAGCAGGAGT NAR externo CCAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT NAF interno TRAGAACACAAGAGTCWGAATGTG NAR interno GGAGCATTCCTCRTAGTGRTAATTAGG F= forward; R= reverse 4. Sequenciamento de nucleotídeos e análise filogenética Os genes HA e NA foram sequenciados bidirecionalmente de pelo menos dois produtos de amplificação distintos utilizando o BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), seguindo o protocolo do fabricante, através do ABI 3130 DNA Analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As sequências obtidas foram editadas utilizando o SeqScape Software 60 v2.5 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) e alinhadas usando Clustal W. As sequências geradas foram depositadas no GenBank sob os números de acesso JQ666845-JQ666886 e numeradas de 1 a 17 para 2009, 18 a 20 para 2010, e 21/2009 (Tab. 7). As sequências de vírus influenza suínos e humanos utilizadas para a análise filogenética foram obtidas do banco de dados Influenza Virus Sequence Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU /Database/nph-select.cgi?go=database). A análise filogenética para cada gene foi realizada pelo método de distância Neighbor-Joining (Saitou e Nei, 1987) utilizando o modelo evolutivo Tamura-Nei através do software MEGA 5.01 (Tamura et al., 2011). Foi utilizado teste de bootstrap de 1000 replicatas e os valores acima de 70 foram indicados no nódulo correspondente (Tamura et al., 2011). Árvores network foram construídas utilizando o método de distância Neighbour-Net no software SplitsTree v4.8 (Huson e Bryant, 2006). Nesse tipo de dendrograma, cada árvore é construída de forma a minimizar a distância (ou número de mutações) entre os haplótipos. As diversidades haplotípica e de nucleotídeos foram calculadas para as amostras utilizando o programa DnaSP 5.1 (Librado e Rozas, 2009), com a correção de Jukes e Cantor (1969). A tradução das sequências de nucleotídeos em sequências de proteína e o alinhamento de múltiplas sequências foram realizados com o software MEGA 5.01 (Tamura et al., 2011). Resultados 1. Isolados virais Durante os anos de 2009 e 2010, amostras virais foram isoladas de pulmões de suínos coletados durante surtos respiratórios no sul (Paraná e Rio Grande do Sul), centro-oeste (Mato Grosso) e sudeste (Minas Gerais e São Paulo) do Brasil (Fig. 10). Em alguns casos, mais de um animal por propriedade foram analisados, sendo que os isolados A/swine/Brazil/1 a 3/2009 pertenciam à mesma propriedade; assim como A/swine/Brazil/5 e 6/2009; A/swine/Brazil/8 a 10/2009; A/swine/Brazil/16 e 17/2009; além de A/swine/Brazil/19 e 20/2010 (Tab. 7). A propriedade visitada pelo técnico que apresentou sintomas de influenza era a mesma onde haviam sido obtidas as amostras 16/2009 e 17/2009 (Tab. 7, granja K), na qual havia se iniciado surto em agosto de 2009, quando matrizes e animais de recria apresentaram sinais respiratórios que perduraram por sete dias. Figura 10. Estados onde estão localizadas as granjas nas quais os vírus influenza foram isolados. N= número de propriedades analisadas por Estado. 2. Análise filogenética Após análise e edição pelo software SeqScape v2.5, as sequências codificadoras parciais dos genes HA contendo 1658nt (321689) e NA contendo 1363nt (25-1387) foram obtidas. Os resultados da análise de identidade para os genes HA e NA realizada nas sequências obtidas estão detalhados na Tab. 9. As árvores filogenéticas dos genes HA e NA isolados neste estudo estão demonstradas na Fig. 11 A e B, respectivamente, em comparação com outras amostras de vírus influenza depositadas no GenBank. Ambos os genes HA e NA de todos os 20 vírus influenza isolados de suínos e do vírus isolado de humano mostraram alta identidade (~ 99%) e foram agrupados com genes do vírus pandêmico H1N1 introduzido na população humana em 2009. Nenhum dos genes dos isolados foi agrupado com genes de vírus suínos sazonais H1N1 e H1N2 circulantes no mundo e os vírus sazonais 61 humanos e suínos formaram ramos distintos das linhagens brasileiras isoladas em 2009/2010. Esses resultados indicam a alta prevalência do vírus pH1N1 na população suína brasileira em 2009 e 2010. Amostras virais isoladas durante surtos podem ser geneticamente relacionadas a outras numa mesma região. Para avaliar esse fenômeno populacional foram construídas redes capazes de ilustrar as várias conexões entre isolados virais. Árvores network foram construídas, baseadas no método NeighborNet, com as sequências dos isolados descritos neste estudo e com sequências do vírus pandêmico H1N1 isolados de humanos e suínos no mundo (Fig. 12 A e B). A maioria dos haplótipos eram únicos, principalmente para o gene HA (diversidade haplotípica = 0,952±0,028; diversidade de nucleotídeos = 0,0049±0,0008), que apresentou maior diversidade que o gene NA (diversidade haplotípica = 0,962±0,026; diversidade de nucleotídeos = 0,0034±0,0006). As networks sugerem uma origem comum para todos os isolados, independentemente da região de origem ou hospedeiro. Haplótipos idênticos foram observados em alguns casos, geralmente entre isolados de uma mesma propriedade (Fig. 12 A: isolados 5-6 e 16-17; Fig. 12 B: isolados 1-3, 8-10 e 19-20). E ainda, a sequência de HA do isolado humano 21/2009 é idêntica aos isolados 16/2009 e 17/2009 da mesma propriedade, e a sequência de NA é mais relacionada a essas amostras suínas que a outras amostras nas árvores network (Fig. 12 A e B). 3. Análise de sítios antigênicos e de ligação a receptores As sequências da proteína hemaglutinina subunidade 1 (HA1) dos isolados foram analisadas para avaliar as mudanças de 62 amino ácidos capazes de alterar a especificidade de receptores e a antigenicidade virais. O alinhamento de aminoácidos da HA1 está ilustrado na Fig. 13 e o alinhamento da proteína NA está ilustrado na Fig. 14. Apesar da sequência e estrutura tridimensional da HA ter sido caracterizada em detalhes apenas para os subtipos H3 do vírus influenza (Wiley et al., 1981), um modelo adaptado é utilizado para estudos de outros subtipos como o H1 (Caton et al., 1982). Então, a numeração de aminoácidos do peptídeo maduro de H1 foi utilizada de acordo com esse modelo adaptado (Caton et al., 1982). Todos os isolados brasileiros 2009/2010 continham resíduos de linhagem suína/humana nos sítios de ligação a receptores, sem substituições nesses sítios na maioria dos isolados em comparação com a cepa A/Mexico/4108/09 (sequência consenso; Fig. 13). Apenas os isolados 19/2010 e 20/2010 apresentaram as substituições A134T e D222N nos sítios de ligação, sem alteração na especificidade de receptores. Após análise comparativa, algumas substituições diferentes foram detectadas nos sítios antigênicos de HA1, todas localizados nos sítios Ca1, Ca2 e Cb (Fig. 13). A substituição S203T na HA1 (Fig. 13) associada às substituições V106I e N248D em NA (Fig. 14) foi observada em quase todos os isolados. O isolado A/swine/Brazil/7/2009 apresentou a substituição Q293H associada à V106I e N248D em NA, enquanto que o isolado A/swine/Brazil/14/2009 continha a mutação S203T na HA1 com apenas V106I em NA (Fig. 13, Fig. 14). Nenhum dos isolados apresentou as substituições H275Y ou N295S na proteína NA (Fig. 14), que são associadas à resistência ao oseltamivir (Collins et al., 2009). 63 A/swine/Brazil/1/2009 A/swine/Brazil/2/2009 A/swine/Brazil/3/2009 A/swine/Brazil/4/2009 A/swine/Brazil/5/2009 A/swine/Brazil/6/2009 A/swine/Brazil/7/2009 A/swine/Brazil/8/2009 A/swine/Brazil/9/2009 A/swine/Brazil/10/2009 A/swine/Brazil/11/2009 A/swine/Brazil/12/2009 A/swine/Brazil/13/2009 A/swine/Brazil/14/2009 A/swine/Brazil/15/2009 A/swine/Brazil/16/2009 A/swine/Brazil/17/2009 A/swine/Brazil/18/2010 A/swine/Brazil/19/2010 A/swine/Brazil/20/2010 A/Minas Gerais/21/2009 Amostra Identidade (%) 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% Gene HA Sequência A/Chile/4182/2009 A/Chile/4182/2009 A/Chile/4182/2009 A/Argentina/08AR/2009 A/Sao Paulo/55312/2009 A/Sao Paulo/55312/2009 A/Santa Catarina/6235/2009 A/England/730/2009 A/England/730/2009 A/England/611/2009 A/San Diego/INS214 A/England/611/2009 A/England/611/2009 A/Shanghai/1783T/2009 A/England/611/2009 A/England/94120043/2009 A/England/94120043/2009 A/England/730/2009 A/Malaysia/8860/2009 A/Malaysia/8860/2009 A/England/94120043/2009 Identidade (%) 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% Gene NA Sequência A/Toyama/291/2009 A/Toyama/291/2009 A/Toyama/291/2009 A/Toyama/291/2009 A/Toyama/291/2009 A/Philippines/TMC09262/2009 A /Thailand/CU-MV50/2010 A/Philippines/TMC09262/2009 A/Philippines/TMC09262/2009 A/Philippines/TMC09262/2009 A/New York/3305/2009 A/Philippines/TMC09262/2009 A/Finland/630/2009 A/swine/Shandong/N1/2009 A/New York/3305/2009 A/New York/3305/2009 A/New York/3305/2009 A/swine/QC/4036-5/2009 A/District of Columbia/INS23/2009 A/District of Columbia/INS23/2009 A/New York/3305/2009 Tabela 9. Sequências de vírus Influenza A depositadas no GenBank com maior identidade de nucleotídeos para os vírus isolados de suínos (A/swine/Brazil/1-17/2009 e A/swine/Brazil/18-20/2010) e de humano (A/Minas Gerais/21/2009). A 99 A/swine/Brazil/19/2010 A/swine/Brazil/20/2010 A/Goias/16651/2010(H1N1) A/swine/Brazil/11/2009 A/swine/Brazil/15/2009 A/swine/Brazil/12A/2010(H1N1) A/swine/Brazil/1/2009 85 A/swine/Brazil/2/2009 A/swine/Brazil/3/2009 A/swine/Brazil/4/2009 A/swine/MN/8761/2010(H1N1) A/swine/Brazil/18/2010 A/swine/Brazil/9/2009 93 91 A/swine/Brazil/10/2009 A/swine/Brazil/12/2009 A/swine/Brazil/13/2009 A/Sao Paulo/55312/2009(H1N1) A/swine/Brazil/5/2009 85 90 A/swine/Brazil/6/2009 A/swine/Brazil/14/2009 72 A/Mexico/4108/2009 (H1N1) A/swine/Alberta/OTH-33-8/2009(H1N1) A/swine/Brazil/7/2009 A/San Diego/WR1650P/2009(H1N1) A/swine/Brazil/16/2009 A/swine/Brazil/17/2009 A/Minas Gerais/21/2009 99 99 A/swine/Argentina/SAGiles31215/2009(H1N1) A/California/04/2009(H1N1) A/swine/Brazil/8/2009 A/swine/Kansas/00246/2004(H1N2) 99 99 A/swine/Ohio/891/01(H1N2) ! A/swine/Kentucky/02086/2008(H1N1) 99 94 A/swine/Iowa/00239/2004(H1N1) A/swine/Alberta/56626/03(H1N1) A/swine/Iowa/15/1930(H1N1) # A/swine/IL/07003243/2007(H1N2) 99 A/Wisconsin/04/2009(H1N1) A/swine/NC/00573/2005(H1N1) 0.05 64 $ " A/swine/Brazil/5/2009 A/swine/Brazil/6/2009 A/swine/Brazil/12/2009 B A/Chile/15/2010(H1N1) A/Hong Kong/433397/2009(H1N1) A/swine/Argentina/SAGiles-31215/2009(H1N1) A/England/854/2009(H1N1) 90 A/swine/Brazil/7/2009 A/swine/Brazil/19/2010 A/swine/Brazil/20/2010 A/swine/Brazil/4/2009 A/swine/Brazil/14/2009 A/California/04/2009(H1N1) A/Mexico/4108/2009 (H1N1) 76 A/swine/Alberta/OTH-33-8/2009(H1N1) A/swine/MN/8761/2010(H1N1) A/swine/Brazil/18/2010 A/swine/Brazil/9/2009 A/swine/Brazil/10/2009 A/swine/Brazil/8/2009 A/swine/Brazil/1/2009 A/swine/Brazil/2/2009 99 A/swine/Brazil/11/2009 A/swine/Brazil/15/2009 A/swine/Brazil/16/2009 A/swine/Brazil/17/2009 A/Minas Gerais/21/2009 A/swine/Brazil/3/2009 A/swine/Brazil/13/2009 0.1 A/swine/Iowa/15/1930(H1N1) A/swine/NC/00573/2005(H1N1) 99 A/Wisconsin/04/2009(H1N1) A/swine/Alberta/56626/03(H1N1) 99 A/swine/Kentucky/02086/2008(H1N1) A/swine/IL/07003243/2007(H1N2) A/Michigan/2/2003(H1N2) 99 A/swine/Kansas/00246/2004(H1N2) 85 82 A/Swine/Ohio/891/01(H1N2) Figura 11. Análise filogenética dos isolados brasileiros de suínos e de humano. Árvore construída pelo método Neighbor-Joining de (A): HA (1658nt) e (B): NA (1363nt). Foram incluídas na análise sequências de genes HA e NA de vírus H1N1 pandêmico e de vírus sazonais H1N1 e H1N2 isoladas de suínos e humanos no mundo. A análise de HA (A) mostra quatro diferentes clusters (α, β, γ, δ) de vírus H1 endêmicos em suínos norte-americanos, indicado por chaves à direita da árvore. Losango fechado: amostras de vírus influenza pandêmico H1N1 2009 isoladas de suínos neste estudo; losango aberto: amostra de vírus influenza pandêmico H1N1 isolada de humano neste estudo; A/swine/Brazil/12A/2010: amostra de vírus influenza pandêmico previamente isolada no Brasil. 65 66 Figura 12. Dendrograma dos genes HA (A) e NA (B) dos isolados suínos e humano brasileiros, construída pelo método de NeighborNet. Sequências dos genes HA e NA de vírus pandêmicos humanos e suínos depositadas no GenBank foram incluídas na análise. Números 1 a 20: isolados suínos; número 21: isolado humano, destacado por borda preta; quadrado cinza: isolados brasileiros deste estudo; círculos pretos: sequências depositadas no Genbank e utilizadas como referência; pH1N1: sequências refêrencia de vírus pandêmicos de humanos; pH1N1swine: sequências refêrencia de vírus pandêmicos de suínos; quadrado cinza com borda preta = isolados brasileiros deste estudo idênticos a amostras depositadas no GenBank. 67 Ca1 180 183 187 192 * 203 Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A GW . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K E V L V L WG I H H P S T S A DQQ S L Y QN A D A Y V F V G S S R MX/4108/09 swine/BR/1/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . swine/BR/2/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . swine/BR/3/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . swine/BR/4/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . swine/BR/5/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . swine/BR/6/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . swine/BR/7/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/8/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . swine/BR/9/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . swine/BR/10/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . swine/BR/11/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . swine/BR/12/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . T . . swine/BR/13/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . T . . swine/BR/14/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . swine/BR/15/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . swine/BR/16/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . swine/BR/17/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . swine/BR/18/10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . swine/BR/19/11 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . swine/BR/20/12 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . MG/21/09 Sb I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . KK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 ECE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . KP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L GNP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L . . . . . . . . . F . . . . . . . . . . . Cb TAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . WS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . F . . R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DQ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N . N . . . Ca2 S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G R MN Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222 223 225 RPKV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . PGDK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ca1 VE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L . L . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . PGD F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 DNG T C Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . YWT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ERF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . PKT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V V P R Y A F AM E R N A G S G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . LN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . REQL S SVS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .G. . . . . . .G. . . . . . .G. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E A T GN L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DY . . . . . . . . N. N. . . . . . . . . . . N. N. . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ca2 S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P VHDCNT T CQT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .A. . . . . . . . . .A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .D.N. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P KGA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Q. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133 134 I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . NT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . S WP NHD S NK GV T AA C P HAGA K S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .R. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .R. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ER . . . . . . . .D. . . . T . . . . . . . . . . . . . . . .D. . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sa L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 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Sa L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . GKCPKYVK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V K K GN S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sa S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . TKL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .N. .N. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . V V . NDKG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ca1 Figura 13. Alinhamento das sequências da hemaglutinina subunidade 1 (HA1) dos isolados pandêmicos H1N1 suínos e humano brasileiros. As sequências foram alinhadas e numeradas usando a proteína HA1 madura. Pontos representam aminoácidos iguais aos da sequência consenso A/Mexico/4108/2009 (número de acesso GenBank GQ162170). Retângulos grandes: sítios antigênicos (Sa, Sb, Ca1, Ca2 e Cb); triângulos: resíduos de aminoácidos nos sítios de ligação ao receptor; asterisco: alteração observada no resíduo 203. T V T H S V N L L E D K HNGK L C K L RGV A P L H L GK CN MX/4108/09 swine/BR/1/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/2/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/3/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/4/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/5/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/6/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/7/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/8/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/9/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/10/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/11/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/12/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/13/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/14/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/15/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/16/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/17/09 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/18/10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/19/11 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . swine/BR/20/12 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . MG/21/09 68 Figura 14. Alinhamento das sequências da proteína neuraminidase (NA) dos isolados pandêmicos H1N1 suínos e humano brasileiros. Pontos representam aminoácidos iguais aos da sequência consenso A/Mexico/4108/2009 (número de acesso GenBank GQ162169). Triângulos: resíduos de aminoácidos associados com resitência a drogas anti-virais; asteriscos: alterações nos resíduos 106 e 248. MX/4108/09 swine/BR/1/09 swine/BR/2/09 swine/BR/3/09 swine/BR/4/09 swine/BR/5/09 swine/BR/6/09 swine/BR/7/09 swine/BR/8/09 swine/BR/9/09 swine/BR/10/09 swine/BR/11/09 swine/BR/12/09 swine/BR/13/09 swine/BR/14/09 swine/BR/15/09 swine/BR/16/09 swine/BR/17/09 swine/BR/18/10 swine/BR/19/11 swine/BR/20/12 MG/21/09 S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . MX/4108/09 swine/BR/1/09 swine/BR/2/09 swine/BR/3/09 swine/BR/4/09 swine/BR/5/09 swine/BR/6/09 swine/BR/7/09 swine/BR/8/09 swine/BR/9/09 swine/BR/10/09 swine/BR/11/09 swine/BR/12/09 swine/BR/13/09 swine/BR/14/09 swine/BR/15/09 swine/BR/16/09 swine/BR/17/09 swine/BR/18/10 swine/BR/19/11 swine/BR/20/12 MG/21/09 GAV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . GDV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . QGA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SWRNN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Q . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . NDKH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . NG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VMT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . LMS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . AWS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . HDG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . S S . NW L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . NGQA D . . . D . . . D . . . D . . . D . . . D . . . D . . . D . . . D . . . D . . . D . . . D . . . D . . . . . . . D . . . D . . . D . . . DR . . D . . . D . . . D . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E MN A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D NW . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . * 106 NG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VNG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . * 248 Discussão Suínos têm papel importante na transmissão interespécie da influenza, uma vez que possuem receptores para vírus humanos e aviários em seu trato respiratório. Essa espécie é considerada o “sítio de mistura” em que a troca de material genético pode ocorrer e levar à formação de vírus contra os quais a população humana não tem imunidade (Webster, 1992). No Brasil, além de um estudo descrevendo um isolado de vírus pandêmico H1N1 em suínos e da identificação de vírus H3N8 e um rearranjo H1N2 derivado do pH1N1 na região sul do Brasil (Schaefer et al., 2011a,b,c), nenhuma caracterização genética detalhada e epidemiológica foi relatada. Portanto, este estudo é o primeiro a apresentar a caracterização molecular detalhada do vírus I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 275 295 influenza em suínos de diversos Estados no Brasil. Os resultados obtidos demonstraram que o vírus influenza estava amplamente disseminado em populações de suínos no Brasil em 2009 e 2010, encontrando-se associado a casos clínicos respiratórios em indivíduos de várias idades. Todos os isolados suínos descritos aqui foram agrupados no mesmo cluster que o vírus pandêmico H1N1 2009, indicando que essa se tornou a cepa predominante circulando em suínos no Brasil. Schaefer et al (2011c) relataram anteriormente a transmissão do pH1N1 para suínos no Brasil, assim como em outros países (Pereda et al., 2010; Pasma e Joseph, 2010; Sreta et al., 2010). Todas as amostras foram coletadas a partir de agosto de 2009, quando a influenza pandêmica já estava disseminada na população brasileira e 69 apresentava-se predominante em relação à influenza sazonal (SVS, 2010). Além disso, Ciacci-Zanella et al (2011a) relatam uma mudança em 2009 na detecção de anticorpos contra vírus influenza em suínos no Brasil, havendo aumento na taxa de infecção dos animais a partir daquele ano. Dessa forma, justifica-se a detecção exclusiva dessa cepa viral nos plantéis estudados, já que o vírus apresentava elevada taxa de morbidade entre humanos, e, consequentemente, em suínos. Todavia, não apenas os isolados suínos de 2009 mas também os de 2010 foram agrupados com vírus pandêmicos, evidenciando que o vírus pandêmico circulou e conseguiu se manter na população de suínos brasileira mesmo quando a atividade viral em humanos reduziu (SVS, 2010). A pressão imune do hospedeiro está associada à ocorrência de mutações e substituições de aminoácidos no vírus influenza (antigenic drift), e a HA é o principal alvo da resposta imune durante a infecção (Skehel and Wiley, 2000). Portanto, a diversidade genética entre os isolados foi maior no gene HA, embora todos eles tenham sido agrupados no mesmo clado. A maior parte das amostras que vieram da mesma propriedade eram idênticas, exceto pelo isolado 8/2009, evidenciando a disseminação intra-rebanho. Esses achados também corroboram com a hipótese de que a pressão de seleção em suínos é baixa devido à constante introdução de animais susceptíveis no rebanho (Brown, 2000). Entretanto, substituições de aminoácidos observadas nos sítios antigênicos de alguns isolados brasileiros comprovaram a ocorrência de antigenic drift, principalmente nos sítios Ca e Cb. Sete clados distintos do vírus pandêmico foram identificados circulando no mundo no início da pandemia (Nelson et al., 2009). Com base nas substituições S203T no gene HA em combinação com V106I e N248D no 70 gene NA encontradas em 18 dos 20 isolados suínos e no isolado humano, eles podem ser agrupados no clado 7 descrito por Nelson et al. (2009). O isolado 7/2009 pertence ao clado 6, pois não apresentou a substituição de HA, e o isolado 14/2009 não pôde ser agrupado em nenhum dos sete clados, pois não apresentou a mutação N248D em NA. Com o decorrer da pandemia, o clado 7 passou a predominar (Valli et al., 2010), o que justifica a detecção principalmente deste clado nos isolados do Brasil. Subsequentemente, a seleção e evolução do clado 7 resultou na circulação de variantes com mutação HA D222G/N ou E (Miller et al., 2010). A mutação D222G na hemaglutinina está amplamente relacionada ao curso clínico da infecção, pois é encontrada frequentemente em casos graves e fatais da influenza pandêmica em humanos (Kilander et al., 2010). Da mesma forma, a substituição D222N, observada nos isolados 19/2010 e 20/2010, está associada a casos fatais da doença (Houng et al., 2012). Entretanto, os animais a partir dos quais esses variantes virais foram isolados não apresentaram sinais clínicos mais graves do que os observados normalmente na infecção por vírus influenza. Os vírus influenza suínos são patógenos zoonóticos, cuja infecção em humanos já foi relatada pelo vírus clássico H1N1, mas também por vírus rearranjos, embora em menor frequência que a transmissão de humanos para suínos (Gregory et al., 2003; Olsen et al., 2006b; Myers et al., 2007; Newman et al., 2008). Este estudo fornece provas da possível transmissão viral de suínos para um ser humano. O técnico responsável por uma propriedade produtora de suínos que passava por um surto confirmado de influenza pandêmica apresentou sinais clínicos compatíveis com a doença após contato com os animais doentes. Levando-se em consideração o período de incubação da influenza, pode-se inferir que o rebanho visitado é a fonte mais provável de infecção. Adicionalmente, os genes HA e NA da amostra do indivíduo em questão (21/2009) apresentaram maior proximidade genética com as amostras de suínos coletadas na propriedade acometida (16 e 17/2009) do que com qualquer outra amostra de humano ou suíno. Dessa forma, existem indícios de que a transmissão do vírus pandêmico de suínos para humano ocorreu. Árvores network foram usadas para ilustrar as inúmeras ligações ancestrais possíveis entre haplótipos. Assim, as rotas epidemiológicas com que a disseminação viral pode ter ocorrido foram evidenciadas. Ambos os dendrogramas de HA e NA sugerem que amostras de pH1N1 isoladas em diversas partes do mundo são relacionadas umas às outras e têm uma origem em comum, como é esperado em pandemias (Rambaut e Holmes, 2009). A maior parte dos isolados brasileiros e de outras partes do mundo apresentou ancestrais derivados de humanos, indicando que a transmissão do vírus pandêmico é mais frequente de humano para humano ou de humano para suíno do que a transmissão zoonótica de suíno para humano (Pereda et al., 2010; Schaefer et al., 2011c). E ainda, relatos do surto pandêmico de 2009 sugerem que o vírus evoluiu silenciosamente no suíno até seu aparecimento na população humana (Solovyov et al., 2010), quando teve rápida disseminação e frequente transmissão interespécie para suínos (Pasma e Joseph, 2010; Sreta et al., 2010). Em todos os casos avaliados neste estudo, os animais infectados apresentavam sinais clínicos e lesões semelhantes às da influenza endêmica, assim como em relatos anteriores da infecção pelo vírus pandêmico em suínos (Brookes et al., 2010; Vincent et al., 2010a). Logo, os suínos brasileiros não apresentaram imunidade protetora cruzada contra a infecção pelo vírus pH1N1 ou contra a manifestação clínica. Em um estudo recente, vacinas multivalentes compostas por subtipos H1 e H3 endêmicos apresentaram proteção parcial na infecção experimental com o pH1N1, e a vacina monovalente homóloga foi a única capaz proteger totalmente os animais, inclusive contra a eliminação viral nas secreções (Vincent et al., 2010b). Evidencia-se, portanto, a necessidade de considerar a vacinação para a influenza nos suínos susceptíveis no Brasil, contra vírus endêmicos e também contra o vírus pandêmico, com o intuito de proteger os animais principalmente contra a manifestação clínica, reduzir perdas econômicas, restringir a eliminação do vírus nas secreções e, assim, limitar a transmissão viral. A caracterização genética e antigênica dos vírus influenza que infectam a população de suínos mundial é crítica para conhecer a epidemiologia dessa infecção na espécie, e também para selecionar linhagens vacinais adequadas. Esse monitoramento também deve ser realizado nos planteis brasileiros, a fim de garantir o melhor controle da influenza suína e, assim, reduzir o risco de rearranjos e do surgimento de novos vírus com potencial pandêmico para a população humana. Os resultados obtidos revelam que o vírus H1N1 pandêmico se disseminou em suínos em vários estados brasileiros, mostrando potencial para se estabelecer como uma infecção endêmica. Dessa forma, fica evidente a necessidade de medidas de controle específicas, como a vacinação, para evitar a reintrodução desse vírus na população humana através do contato com animais doentes. 71 CAPÍTULO 6: CONCLUSÃO Esse estudo identificou a infecção pelo vírus influenza em suínos no Brasil, caracterizando detalhadamente a dinâmica dessa infecção nos planteis nacionais. Foi comprovado que a influenza circula em suínos no Brasil mesmo antes da introdução do vírus H1N1 pandêmico 2009, com alta ocorrência para vírus H1N1 suíno e humano. No entanto, a pandemia parece ter sido importante para potencializar a distribuição dessa enfermidade nos planteis brasileiros. A ampla disseminação do vírus pandêmico encontrada neste estudo, associada à frequente observação de manifestação clínica, indica que os suínos no Brasil não apresentavam imunidade protetora contra o vírus pandêmico. Portanto, os anticorpos contra H1N1 presentes nos animais anteriormente à pandemia não conferiram imunidade cruzada adequada. Além disso, a distribuição da influenza em seis Estados brasileiros, com sinais clínicos observados em diversas faixas etárias, comprova que essa enfermidade vem gerando prejuízos para os produtores na suinocultura nacional. Nos rebanhos infectados, a imunidade passiva pareceu decair nos animais da creche, indicando que no final dessa fase e na recria os animais encontram-se mais susceptíveis à infecção. 72 Nossos resultados sugerem que o vírus pandêmico H1N1 se estabeleceu na população de suínos no Brasil e pode vir a se tornar endêmico. A detecção exclusiva do vírus pandêmico em amostras com diferentes origens comprova que essa cepa se tornou predominante em suínos no Brasil nos anos de 2009 e 2010 e, como ainda não existe protocolo de vacinação para influenza no país, continuará a circular e causar prejuízos até que os animais adquiram imunidade. Portanto, a elaboração de medidas de manejo adequadas para o controle da influenza é fundamental para conter a disseminação viral, e a realização da vacinação contra essa enfermidade é uma medida preventiva a ser considerada. Associando-se os resultados do isolamento e identificação viral e os de perfil sorológico observados, conclui-se que a vacinação contra o vírus influenza em fêmeas reprodutoras pode resultar em proteção homogênea do rebanho, mas outras categorias de animais susceptíveis também devem ser incluídas. No entanto, o monitoramento de vírus circulantes para produção de vacinas apropriadas é essencial para garantir a proteção adequada do rebanho nacional. E ainda, a utilização do perfil sorológico como ferramenta para elaboração do protocolo vacinal mais adequado para cada rebanho deve ser preconizada. BIBLIOGRAFIA ALEXANDER, D.J.; BROWN, I.H. Recent zoonosis caused by influenza A viruses. Rev. Sci. Tech., v. 19, p.197-225, 2000. BEAN, B.; MOORE, B.M.; STERNER, B. et al. 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Correspondence: Daniela S. Rajão, Preventive Veterinary Medicine Department, Veterinary School, Universidade Federal de Minas Gerais, 6627 Presidente Antônio Carlos Ave, POBox 567, Campus UFMG, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil 31270-901. E-mail: [email protected] Accepted 3 March 2012. Published Online 5 April 2012. The aim of this work was to detect serum antibodies specific to influenza viruses in swine in Brazil. Serum samples of 355 pigs from 17 herds in Minas Gerais state were tested by hemagglutination inhibition (HI) for antibodies against H1N1 swine (SIV) and human influenza viruses, and H3N2 SIV. HI revealed that 158 animals (44Æ5%) and 11 herds (64Æ7%) were positive for H1N1 SIV, 36 animals (10Æ1%) and four herds (23Æ5%) were positive for H3N2 SIV, and 136 animals (38Æ3%) and 10 herds (58Æ8%) were positive for H1N1 human. This study indicates that swine influenza is disseminated throughout Minas Gerais state, Brazil. Keywords Hemagglutination inhibition test, herd, influenza, pigs, swine. Please cite this paper as: Rajão et al. (2012). Serological evidence of swine influenza in Brazil. Influenza and Other Respiratory Viruses DOI: 10.1111/j.17502659.2012.00366.x. Introduction Swine influenza virus (SIV) is an Orthomixovirus that causes an acute respiratory disease in pigs. The disease is characterized by sudden and explosive outbreaks, with high morbidity and low mortality.1 Common clinical signs are hyperthermia, anorexia, coughing, and nasal discharge.2 Since its first report in 1931,3 three subtypes of influenza A virus have been circulating in swine populations worldwide (H1N1, H1N2, and H3N2). However, these SIV subtypes differ in origins and genetic characteristics in different continents and regions.1 Classical swine H1N1 influenza virus (cH1N1) was the predominant SIV subtype circulating in the United States,1 but the introduction of a H3N2 subtype in 1998 led to reassortments that resulted in the circulation of other H1N1 viruses, H3N2 viruses, and novel subtypes like H1N2.4 In Europe, avian-like H1N1 has become the predominant subtype infecting swine populations, but reassortant swine H3N2 virus is also endemic among European pig herds.5 Swine influenza virus infection in Brazilian swine population is not well characterized, and only a few data demonstrate evidence of SIV infection by serological diagnosis.6,7 Minas Gerais is the fourth largest swine-producing state in Brazil, accounting for 12Æ9% of the country’s pig ª 2012 Blackwell Publishing Ltd population. Therefore, the objective of this study was to evaluate the presence of anti-swine and anti-human influenza virus antibodies in swineherds in Minas Gerais state so as to demonstrate the circulation of SIV in Brazil. Materials and methods A total of 355 serum samples from a diagnostic laboratory sera panel were used for this study. Blood samples were collected between January and March 2009 previously to the H1N1 pandemic occurrence, by jugular puncture, centrifuged after clot formation, and the serum kept at )20!C until used. Sample size was based on financial and availability limitations. At least 10 breeding-age animals (sows and gilts) were sampled per farm, from 17 commercial herds randomly distributed in Minas Gerais state, Brazil. All herds were farrow-to-finish operations with all-in-allout system, located in pig densely populated areas, and with no SIV vaccination history. No respiratory signs were reported in any sampled pig. This study did not have an ethics committee approval because all samples were sent by the herd owners, previously to the start of the study, to the diagnostic laboratory for diagnostic purposes unrelated to this study. All herd owners gave their consent for the use of the sera in this study. 1 87 Rajão et al. Hemagglutination inhibition test (HI) was performed as previously described.8 Briefly, sera were heat inactivated at 56!C, followed by a treatment with a 20% Kaolin suspension and adsorption with 0Æ5% rooster red blood cells (RBC) suspension to remove non-specific inhibitors and natural serum agglutinins. For HI against H3N2 SIV, sera were treated with trypsin–potassium periodate (KIO4), as previously described.9 The initial serum dilution was 1:10 using phosphate-buffered saline (PBS; pH 7Æ4), and then each sample was twofold diluted to a final dilution of 1:10,240 in 96-well V-bottom plates. Samples were tested for HI activity against 4 hemagglutination units of H1N1 SIV reference strain (A ⁄ swine ⁄ Iowa ⁄ 15 ⁄ 1930), H3N2 SIV reference strain (A ⁄ swine ⁄ Iowa ⁄ 8548-2 ⁄ 98), and H1N1 human reference strain (A ⁄ WSN ⁄ 1933) grown in specific pathogen-free 10-day-old embryonated chicken eggs (passage number 3). HI antibody titer of each sample was determined as the reciprocal of highest dilution in which no hemagglutination was observed, and a sample was considered positive if it had HI titer equal or above the cutoff value of 1:40, as lower titers may be due to non-specific reactions. A herd was considered positive when at least one of the animals sampled were positive. Ninety-five percent confidence intervals (CIs) were calculated for herd and animal percentages, and descriptive statistic was calculated for antibody titer in positive and negative herds. Results Hemagglutination inhibition results are summarized in Table 1. Of the 355 sera tested, 158 (44Æ5%) had antibodies against H1N1 SIV, 36 (10Æ1%) against H3N2 SIV, and 136 (38Æ3%) against H1N1 human. Of the 17 herds tested, 11 (64Æ7%) were considered positive for H1N1 SIV, four (23Æ5%) for H3N2 SIV, and 10 (58Æ8%) for H1N1 human, and the percentages of infected and non-infected animals in positive farms for each virus are shown in Figure 1. The Figure 1. Percentage of infected and non-infected animals in positive herds. Hemagglutination inhibition was performed with H1N1 swine influenza virus (SIV), H3N2 SIV, and H1N1 human influenza virus. percentage of breeding females positive for multiple antigens was calculated (Table 2). A higher percentage of animals positive to both H1N1 viruses (20Æ84%) than to only one of them (16Æ05% to H1N1 SIV and 11Æ83% to H1N1 human) was found. A few animals were positive for both SIV viruses (3Æ38%), and a small percentage was also positive for all three antigens (4Æ22%). Mean HI titers for positive and negative herds are shown in Table 3. Discussion Our results demonstrate a high occurrence of anti-H1N1 influenza antibodies in swine in Minas Gerais state’s herds, which are likely to be due to previous infection because no vaccines are available in the country. However, anti-H3N2 SIV antibodies occurrence was lower than those found for H1N1 swine and human viruses, and even positive herds Table 1. Pig- and herd-level seroprevalence of H1N1 and H3N2 swine influenza viruses (SIV) and H1N1 human influenza virus in Minas Gerais state, Brazil H1N1 SIV Variables Pig H3N2 SIV Herd Pig H1N1 human Herd Pig Herd Number of samples 355 17 355 17 355 17 tested Positive number 158 11 36 4 136 10 Prevalence, 44Æ5 (39Æ33)49Æ67) 64Æ7 (41Æ98)87Æ42) 10Æ1 (6Æ97)13Æ23) 23Æ5 (3Æ34)43Æ66) 38Æ3 (33Æ24)43Æ36) 58Æ8 (35Æ4)82Æ2) % (CI 95%) CI, Confidence interval. 2 88 ª 2012 Blackwell Publishing Ltd Swine influenza in Brazil Table 2. Percentage of animals with antibodies to multiple influenza virus antigens in Minas Gerais state, Brazil Number of animals Percentage (%) H1N1 SIV only H3N2 SIV only H1N1 human only H1N1 SIV + H3N2 SIV H1N1 SIV + H1N1 human H3N2 SIV + H1N1 human All 3 antigens 57 16Æ05 4 1Æ13 42 11Æ83 12 3Æ38 74 20Æ84 5 1Æ41 15 4Æ22 Table 3. Hemagglutination inhibition titers of positive and negative herds against H1N1 and H3N2 swine influenza viruses (SIV), and H1N1 human influenza virus in Minas Gerais state. Brazil Positive herds Negative herds Variables H1N1 SIV H3N2 SIV H1N1 human H1N1 SIV H3N2 SIV H1N1 human Number of herds Minimum titer Median Maximum titer Mean titer Standard deviation Standard error CI 95% 11 29.97 46.30 146.72 59.34 16.77 11.69 41.90–83.98 4 14.64 22.36 26.70 21.02 13.27 11.52 13.41–32.97 10 19.10 46.08 118.19 47.50 16.82 11.79 32.76–68.92 6 11.89 13.19 16.62 13.58 11.45 10.57 11.78–15.66 13 10.34 11.49 14.32 11.59 10.91 10.25 11.00–12.22 7 10.68 12.03 20.00 13.27 12.61 10.91 10.71–16.44 CI, Confidence interval. showed a high percentage of non-infected animals. So far, this is one of the first studies to show SIV infection in Brazilian herds, and the first to show anti-influenza antibody prevalence in Minas Gerais state. Influenza virus has been identified previously in Brazilian pigs in São Paulo6 and in Paraná7 states. The rates of 44Æ5% and 38Æ3% animals with antibodies against H1N1 swine and human viruses, respectively, found in the present study are similar to those in prevalence studies for H1N1 virus in the United States (66Æ3%),10 Italy (46Æ4%), and Spain (38Æ5%).5 However, the prevalence of anti-SIV H1N1 antibodies in another study in Spain seemed to be lower than the findings in the present study, and evidences show that a novel recently emerged H1N2 SIV is widespread in that country.11 The rate of 10Æ1% of H3N2-positive animals found here was similar to that of 20% found in a recent study in Paraná state, Brazil,7 and also similar to that found in Ireland (4Æ2%) previously.5 However, it was significantly lower than those rates found in Italy (41Æ7%) and Spain (38%),5 and in the United States (33Æ7%).10 The proportion of animals with antibodies to both H1N1 viruses was higher than the proportion of animals with antibodies to only one of them. Some animals were positive for both swine influenza viruses. In addition, a ª 2012 Blackwell Publishing Ltd percentage of animals were also positive for all three antigens. Thus, different influenza virus strains are cocirculating in the Brazilian swine population and causing mixed infection, which may result in genetic reassortment between these viruses. This study also showed herd-level prevalences of 64Æ7% for H1N1 SIV and 58Æ8% for human H1N1, which are close to the reported in Korean herds (71Æ5%).12 In addition, a herd-level prevalence of 80Æ1% in saws was found in Canada,13 which is slightly higher than our results. For H3N2, the herd-level prevalence was lower (23Æ5%) than that of H1N1 viruses, and also lower than in the recent study in Paraná state (46%).7 Thus, HI results presented in this work indicate that influenza viruses are circulating in Minas Gerais state and may be endemic in Brazilian swine population. Acknowledgments The authors wish to thank Dr José Lúcio dos Santos and Dr Daniel Lúcio do Santos for sample supply. The authors wish to thank LANAGRO Minas Gerais, EMBRAPA Suı́nos e Aves, and Dr Alexandre Machado for supplying virus reference samples. This study was financially supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais 3 89 Rajão et al. (FAPEMIG), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientı́fico e Tecnológico (CNPQ), and National Institutes of Science and Technology Program (INCT-Animal Production). References 1 Olsen CW, Brown IH, Easterday BC, Van Reeth K. Swine influenza; in Straw BE, Zimmerman JJ, D’Allaire S, Taylor DJ (eds): Diseases of Swine. 9th edn. Ames: Blackwell Publishing, 2006; 469–482. 2 Brown IH. The epidemiology and evolution of influenza viruses in pigs. Vet Microbiol 2000; 74:29–46. 3 Shope RE. Swine influenza. III. Filtration experiments and etiology. J Exp Med 1931; 54:373–385. 4 Vincent AL, Ma W, Lager KM, Janke BH, Richt JA. 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