identificação dos subgrupos aeb do vírus respiratório sincicial

IDENTIFICAÇÃO DOS SUBGRUPOS A E B DO VÍRUS
RESPIRATÓRIO SINCICIAL, A PARTIR DE AMOSTRAS
ISOLADAS EM LINHAGENS DE CÉLULAS HEP-2.
GUILHERME RAMOS OLIVEIRA E FREITAS1; ORLANDO CÉSAR MANTESE2
Resumo: O vírus respiratório sincicial (VRS) constitui a principal causa de infecções do trato
respiratório inferior em crianças, produzindo anualmente surtos epidêmicos de bronquiolite e
pneumonia. Virtualmente todas as crianças têm a primeira infecção pelo VRS nos primeiros
dois anos de vida, sendo que o pico de incidência ocorre nos primeiros seis meses. Estudos
mostram que os isolados do VRS podem ser divididos em dois subgrupos antigênicos, A e B,
e a identificação desses subgrupos pode ser feita pelo uso de anticorpos monoclonais (MAbs)
contra as glicoproteínas F e G do envelope viral. Atualmente muitos estudos correlacionam a
gravidade da doença ao subgrupo do VRS, porém até hoje não existem dados suficientes para
afirmar se os dois subgrupos diferem em virulência. Assim, 29 espécimes de nasofaringe
coletados de crianças menores de cinco anos de idade, atendidas no Hospital de Clínicas da
Universidade Federal de Uberlândia (HC/UFU) de 2001 a 2004, com doença respiratória
aguda causada pelo VRS, foram inoculadas em cultura de células HEp-2, e submetidas à
técnica de imunofluorescência indireta (IFI) para serem subgrupadas. Dentre estas, 16
apresentaram efeito citopático e nove foram positivas para VRS pela IFI. Porém, apenas cinco
foram subgrupadas, sendo quatro amostras pertencentes ao subgrupo A e um ao subgrupo B.
Os resultados apresentados sugerem que os monoclonais, produzidos na década de 80, e
utilizados na IFI para subgrupagem, podem não ter reagido com as cepas circulantes nesta
região devido à variabilidade antigênica deste vírus causada pelo acúmulo de mutações, sendo
estes monoclonais dirigidos contra epítopos ausentes nas cepas atuais, justificando assim, a
baixa sensibilidade do método.
Abstract: Syncytial respiratory virus (RSV) constitutes the main cause of lower respiratory
tract infections in children, producing yearly epidemic outbreaks of bronchiolitis and
pneumonia. Virtually all the children have the first infection for RSV in the firsts two years of
life, and the incidence peak occurs in the first six months. Studies show that the RSV isolated
can be divided in two antigenic subgroups, A and the B, and the identification of them can be
made by the use of monoclonal antibodies (MAbs) against glycoproteins F and G of the viral
1-Iniciação Científica PIBIC/UFU/CNPq; 2-Laboratório de Virologia, Faculdade de Medicina (FAMED) –
Universidade Federal de Uberlândia (UFU). Av. Pará, 1720, Bloco 4C,Campus Umuarama, Uberlândia MG.
CEP 38400-902. e-mail [email protected]
1
envelope. Nowadays, many studies correlate the severity of the illness with the subgroup of
RSV, however, until today doesn’t exist enough data to affirm if the two subgroups differ in
virulence. Thus, 29 nasopharyngeal aspirates of children less than five years old, taken care of
the Hospital de Clínicas of the Universidade Federal de Uberlândia (HC/UFU) between 2001
and 2004, with acute respiratory illness caused by the VRS, were inoculated in HEp-2 cells,
and submitted to the technique of indirect immunofluorescence (IFI) to be subgrouped.
Among these, 16 had presented cytophatic effect and nine of them had been positive for RSV
by IFI. However, only five had been subgruped, being four samples of subgroup A and one of
subgroup B. The presented results suggest that the monoclonal, produced in the decade of 80,
and used by IFI for subgruped, can not react with strains circulating in this region due the
antigenic variability of this virus caused for the accumulation of mutations, being these
monoclonal directed against absent epitopes in current strain, thus justifying low sensitivity of
this method.
Palavras chave: Vírus Respiratório Sincicial; Subgrupos A e B; Imunofluorescência Indireta;
Linhagem Celular HEp-2.
Keywords: Respiratory Syncytial Virus; Subgroup A and B; Indirect Immunofluorescence;
Cellular Lineage HEp-2.
linear e de polaridade negativa. As
1. Introdução
partículas
virais
apresentam
envelope
O vírus respiratório sincicial (VRS)
derivado da membrana plasmática da
constitui a principal causa de doenças do
célula hospedeira (COLLINS et al., 1996;
trato respiratório inferior (DTRI) em
DOMACHOWSKE;
crianças (COLLINS et al., 2000; CANE,
1999).
2001; VIEGAS et al., 2004), produzindo
nucleotídeos
anualmente
de
identificação de 11 genes: NS1, NS2, N, P,
bronquiolite e pneumonia, tanto em países
M, SH, G, F, M2-ORF1, M2-ORF2 e L.
desenvolvidos quanto em desenvolvimento
Esses
(QUEIRÓZ et al., 2002; CALEGARI etal.,
seqüencialmente
2005).
mensageiros,
surtos
epidêmicos
O VRS é um membro da família
ROSEMBERG,
Análises
traduzidos
de
do
seqüências
VRS
genes
permitiram
são
em
e
em
Paramyxoviridae, gênero Pneumovirus e
(DOMACHOWSKE;
possui genoma do tipo RNA de fita simples
1999).
de
a
transcritos
distintos
RNAs
subseqüentemente
11
proteínas
ROSEMBERG,
2
Virtualmente todas as crianças têm a
et al., 2003), à resposta imune do
primeira infecção pelo VRS nos primeiros
hospedeiro
dois anos de vida (GLEZEN; DENNY,
SINHA et al., 2003) e ao próprio vírus
1973), sendo que o pico de incidência
(PAPADOPOULUS et al., 2004).
ocorre nos primeiros seis meses, a despeito
da
presença
de
anticorpos
maternos
(QUEIRÓZ
et
al.,
2002;
Estudos mostram que os isolados do
VRS
podem
ser
divididos
em
dois
transferidos passivamente (QUEIRÓZ et
subgrupos antigênicos, A e B, que por sua
al.,
2003).
vez se dividem em outros diferentes
Aproximadamente 40% dessas crianças
subtipos (PERET et al., 1998; PERET et
apresentam sintomas de envolvimento do
al., 2000). A identificação dos subgrupos
trato respiratório inferior (OTTOLINE;
se
HEMMING,
na
anticorpos monoclonais (MAbs) contra as
maioria dos casos pode levar à internação,
glicoproteínas F e G do envelope viral
sendo que alguns requerem ventilação
(MUFSON et al., 1985; GIMENEZ et al.,
mecânica devido a falência respiratória
1986).
2002;
MOURA
1997).
et
A
al.,
gravidade
(FLETCHER et al., 1997). Além disso,
dá
principalmente
Também
pelo
existem
uso
estudos
de
que
aproximadamente 10% dos que requerem
correlacionam a gravidade da doença ao
ventilação
subgrupo
mecânica
podem
morrer
(BUCKINGHAM et al., 2001).
durante
a
vida
VRS,
onde
indivíduos
infectados pelo subgrupo A apresentam
Apesar de as infecções pelo VRS serem
comuns
do
toda,
a
uma sintomatologia clínica mais severa
(STRALIOTTO
et
al.,
1994;
al.,
2004).
sintomatologia clínica em crianças mais
PAPADOPOULUS
velhas e adultos geralmente é de natureza
Entretanto, outros estudos sugerem que a
mais branda (HALL et al., 1991) e embora
gravidade no trato respiratório superior
o homem constitua o único reservatório do
relaciona-se com a infecção pelo subgrupo
VRS humano, não se sabe onde esse vírus
B, sendo a otite média aguda a principal
reside após os surtos epidêmicos, quando
manifestação clínica (HEIKKINNEN et al.,
as
1995; DENNY, 1995). Já Martinello et al.
infecções
são
raras
(OTTOLINE;
HEMMING, 1997).
(2002)
Diversos fatores de risco são referidos
como
agravantes
para
as
infecções
respiratórias causadas pelo VRS (SIMOES,
não
et
observaram
diferença
significante quanto à gravidade causada
por infecções dos subgrupos do VRS.
Surtos epidêmicos geralmente ocorrem
2003; WELLIVER, 2003) sendo eles
anualmente
inerentes ao meio ambiente (AVENDAÑO
embora picos difiram nas diferentes partes
em
intervalos
regulares,
3
do
mundo
(JACKSON;
MULDOOM,
novo vírus contribua para uma transmissão
1975). Esses surtos são causados por
mais eficiente do mesmo ou para uma
subgrupos e subtipos distintos do vírus, que
maior gravidade da doença respiratória
conseguem co-circular em uma mesma
(PERET et al., 1998).
região, predominando um subtipo a cada
epidemia
(PERET
et
al.,
No Brasil, estudos já detectaram a co-
2000;
circulação dos dois subgrupos do VRS
RAFIEFARD et al., 2004; SATO et al.,
durante um mesmo surto (STRALIOTTO
2005).
et al., 2001; MOURA et al., 2003). Em
Existem diversos estudos (MENTEL et
trabalho realizado na cidade de Porto
al., 2005; ARBIZA et al. 2005) relatando
Alegre/RS de 1990 a 1995 e 1998, além da
que o subgrupo A do VRS é predominante
confirmação da co-circulação dos dois
durante o surto epidêmico. Na cidade de
subgrupos, foi observada a predominância
Montevidéu, Uruguai, foi realizado um
do subgrupo A durante os meses de
estudo
inverno, enquanto que o subgrupo B
investigando-se
17
picos
consecutivos do VRS, onde foi constatado
predominou
que na maioria dos surtos houve a co-
(STRALIOTTO et al., 2001). Entretanto,
circulação
B,
esse tipo de investigação ainda precisa ser
predominando entretanto, o subgrupo A em
desenvolvida em outras regiões, uma vez
13 desses anos. Pôde-se observar também
que
que a predominância do subgrupo A
territorial, há indícios que os surtos de
ocorreu por até quatro anos consecutivos,
VRS sejam de ocorrência regional e não
enquanto que o subgrupo B conseguiu
um fenômeno nacional (ANDERSON et
predominar apenas por um ano (ARBIZA
al., 1990). Porém a existência de poucos
et al. 2005). Thomas et al. (1994) também
dados no Brasil ainda não permite uma
relataram predominância do subgrupo B
conclusão.
dos
subgrupos
A
e
sobre o A em apenas um dos cinco surtos
epidêmicos estudados.
Essa
alternância
em
no
países
verão
de
de
grande
1998
extensão
A detecção dos subgrupos do VRS
circulantes em uma determinada região
anual
entre
os
constitui informação importante para a
diferentes subgrupos e diferentes cepas do
compreensão
VRS é considerada uma conseqüência da
epidemiológicos desse vírus. Assim, foi
pressão
imune,
realizada neste estudo a identificação dos
desenvolvida pela população em um surto
subgrupos do VRS presentes em secreções
anterior. É sugerido também, que a falta de
de nasofaringe de crianças menores de
imunidade numa população contra um
cinco
seletiva
da
resposta
anos
de
de
aspectos
idade,
com
clínico-
doença
4
respiratória aguda, atendidas no Hospital
A
coleta
foi
realizada
após
o
pais
ou
de Clínicas da Universidade Federal de
consentimento
Uberlândia (HC/UFU), por meio da técnica
responsável e preenchimento de ficha
de Imunofluorescência Indireta.
clínica pelo pediatra responsável. Consistiu
2.
expresso
dos
na instilação de 0,5 mL de soro fisiológico
Material e Métodos
estéril (0,9%) em cada narina da criança,
seguida de aspiração da secreção de
2.1. Antecedentes
Desde
2001
coletadas
nasofaringe com um catéter, utilizando-se
amostras de secreção de nasofaringe de
um sistema de vácuo (VIEIRA et al.,
crianças menores de cinco anos de idade,
2001). As amostras clínicas “in natura”
com doença respiratória aguda (DRA),
foram transportadas em gelo para o
atendidas no Pronto Socorro de Pediatria
Laboratório
(PSPED),
Atendimento
processadas no período máximo de quatro
Pediátrico (PAP), internadas na Enfermaria
horas após a coleta, conforme previamente
de Pediatria (EP), na Unidade de Terapia
descrito (COSTA et al., 2006), sendo
Intensiva Pediátrica (UTIPED) ou na
divididas em três alíquotas: (i) para reações
Unidade de Terapia Intensiva Neonatal
de IFI, (ii) para inoculação em cultura de
(UTIN), do Hospital de Clínicas da
células e (iii) para PCR. Os espécimes
Universidade
foram armazenados em nitrogênio líquido
no
vêm sendo
Pronto
Federal
de
Uberlândia
(HC/UFU). A coleta desses espécimes
clínicos foi aprovada pela Comissão de
de
Virologia/UFU
ou freezer –70ºC (Figura 1).
Amostras SNF (Hospital de Clínicas-UFU)
Ética da Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-
Processamento
Graduação da UFU, atendendo a resolução
n° 196/1996/CNS. Até dezembro de 2004
PCR
foram
coletadas
e
processadas
379
amostras, investigadas pela técnica de
imunofluorescência indireta (IFI) para a
presença de vírus respiratório sincicial
(VRS),
influenzavírus
A
e
Negativo ou
Inconclusivo
IFI
Triagem
Positivo VRS
CC
Positivo
para outros
vírus
respiratórios
Isolamento
CC (HEp-2)
B,
parainfluenzavírus 1, 2 e 3 e adenovírus,
Subgrupagem
(IFI - MAbs)
sendo que 46% (174/379) foram positivas
para algum desses vírus. Do total de
amostras, 26,4% (100/379) foram positivas
para o VRS.
Subgrupo
A
SNF- Secreção de Nasofaringe
PCR- Reação em Cadeia da Polimerase
IFI- Imunofluorescência Indireta
CC- Cultura de Células
MAbs- Anticorpos Monoclonais
Subgrupo
B
e
5
Figura 1: Fluxograma da Investigação
detectado, a amostra foi coletada para
Os espécimes clínicos foram submetidos
montagem de novas lâminas de IFI, porém
á técnica de IFI para detecção dos sete
aquelas
vírus
Foram
identificar ECP, foram sub-cultivadas em
tratados com uma mistura de anticorpos
mais duas passagens para confirmação da
monoclonais (MAbs) anti-vírus respiratório
negatividade.
referidos
anteriormente.
do “Respiratory Panel 1 Viral Screening
and
Identification
International,
Inc.,
Kit”
(Chemicon
Temecula,
CA),
conforme instruções do fabricante
nas
quais
não
foi
possível
Subgrupagem do VRS tipos A e B
– após o aparecimento e identificação do
ECP, as amostras isoladas em HEp-2 foram
centrifugadas 1390 rpm durante 10 minutos
a 4°C e lavadas duas vezes em PBS
2.2 – Proposta Atual:
(Phosphate-Buffered Saline) 0,01 M (pH
Isolamento do VRS em cultura de
7,2). Após a última lavagem, o sedimento
células - os espécimes de nasofaringe,
foi ressuspenso em 100 µL de PBS, sendo
positivos para VRS pela IFI e armazenados
que 8 µL dessa suspensão foram colocados
em meio de congelamento em freezer –
nos anéis delimitados por teflon de duas
70ºC, foram inoculados em linhagem
lâminas, uma para a reação com os
contínua de células HEp-2, provenientes de
anticorpos monoclonais (MAbs) e a outra
carcinoma de laringe humano (ATCC
para estoque. As lâminas foram secadas
CCL-23), crescidas em microplacas de
dentro do fluxo laminar e o sedimento foi
poliestireno de 24 orifícios, para fins de
fixado com acetona gelada por 10 minutos.
isolamento do vírus, conforme Queiróz et
Não sendo possível a realização imediata
al. (2002). Resumidamente, um volume de
do teste, as lâminas foram armazenadas a
125µL do aspirado de nasofaringe foi
-20°C até que a investigação pudesse ser
inoculado em duas ou mais monocamadas
realizada. Para a caracterização antigênica
sub-confluentes de células Hep-2. Após 30
dos isolados de VRS, foram utilizados
minutos de incubação em estufa de CO2 a
MAbs específicos, contra a proteína F de
5% e 37°C, para a adsorsão viral, foram
cada um desses subgrupos virais, MAbs
acrescentados 375 µL de meio completo
92-11c (Long) e 102-10 (18537), conforme
DMEM com 2% de Soro Fetal Bovino,
previamente descrito (ANDERSON et al.,
seguido
1985). A leitura das lâminas foi realizada
de
nova
incubação.
Uma
observação diária foi realizada durante sete
em
dias para verificação do aparecimento de
(Olympus BX50), sendo o espécime
efeito citopático (ECP). Quando este foi
considerado positivo quando pelo menos
microscópio
de
epi-fluorescência
6
uma
célula,
por
campo,
apresentou
padrões, resultando em uma visualização
fluorescência específica e negativo se
fracamente positiva. Já a reação para o
nenhuma
subgrupo B não apresentou fluorescência.
fluorescência
específica
foi
observada.
Entretanto quando tais amostras foram
Controles
Padrão)
-
positivos
O
(Amostras
Laboratório
de
submetidas
Reversa
da
à
técnica
Reação
de
Transcrição
em
Cadeia
da
Virologia/UFU recebeu cepas padrão dos
Polimerase
(RT-PCR),
subgrupos A e B, LONG e CH18537
positividade,
ou
respectivamente,
confirmou o crescimento dos padrões
do
vírus
respiratório
sincicial (VRS) do Laboratório de Vírus
seja,
observou-se
esta
técnica
subgrupo A e B.
Respiratório e Sarampo - Fiocruz/RJ, que
De um total de 100 espécimes clínicos
foram utilizadas como controle positivo
positivos para o VRS obtidos entre os anos
tanto no isolamento em cultura de células
de 2001 e 2004, foram inoculados 29 em
quanto na reação de Imunofluorescência
células Hep-2. A inoculação de um número
Indireta (IFI). Estes vírus foram inoculados
maior de amostras não foi possível devido
e crescidos em cultura de células HEp-2 e
a
após a detecção de efeito citopático (ECP),
microrganismos de origem bacteriana e
foram coletados e montadas lâminas para
fúngica, que ocorreram nos primeiros
reação de IFI.
meses do estudo. Desse total de 29
episódios
de
contaminações
por
amostras inoculadas, aproximadamente 16
3.
Resultados e Discussão
(55%)
apresentaram
ECP,
conforme
Após a leitura das lâminas de IFI feitas
exemplificado pela Figura 2. Entretanto,
a partir das amostras padrão, constatou-se
apenas nove foram confirmadas como
que apesar da reação com anticorpo
positivas para VRS. Dessas, cinco foram
monoclonal (MAbs) do kit comercial
subgrupadas, sendo quatro pertencentes ao
(Chemicon International, Inc., Temecula,
subgrupo A, e uma ao subgrupo B (Gráfico
CA) específico para VRS, ter apresentado
1).
uma fluorescência bem característica, a
reação com o MAb específico para o
subgrupo A não apresentou os mesmos
7
a)
b)
Figura 2: Células HEp-2. (A) Efeito Citopático causado pelo VRS
subgrupo A – setas. (B) Controle Negativo – células não infectadas.
Aumento 400x
VRS
A pequena sensibilidade apresentada
identificado em amostras coletadas de
pela cultura de células, pode ser atribuída
crianças
ao tipo de amostra clínica inoculada, que
Gráfico
1:
Subgrupo
menores
de
do
5
anos,
no
foi previamente armazenada por longo
HC/UFU, pela IFI.
Nº de amostras
período
em
meio
de
congelamento
5
(aproximadamente 3 ou 4 anos), e sabe-se
4
3
que o inóculo da amostra “in natura”
2
aumentaria a chance de isolamento do
1
0
VRS A
VRS. Outra possibilidade, seria o fato de a
VRS B
linhagem de células Hep-2 utilizada, ter
Subgrupo do VRS
perdido parte da sensibilidade para isolar
A inoculação das amostras em cultura
e/ou permitir o desenvolvimento do VRS,
de células foi utilizada no intuito de
durante
aumentar o número de partículas virais
laboratório (COLLINS et al., 1996). Além
aumentando assim a sensibilidade da IFI.
disso, sabe-se que o manuseio de amostras
Foram coletadas também alíquotas que nos
clínicas, durante o processamento e o
permitirá futuramente classificar estas
armazenamento, pode ser responsável pela
amostras
e/ou
rápida perda da capacidade infecciosa de
molecularmente por meio da RT-PCR e
partículas virais do VRS (COLLINS et al.,
seqüenciamento genético.
1996).
antigenicamente
a
propagação
seriada
no
8
número
ANDERSON, L. J.; PARKER, R. A.;
reduzido de amostras clínicas subgrupadas
STRIKAS, R. L. Association between
pela IFI específica para cada um dos
respiratory syncytial virus outbreaks and
subgrupos do VRS. Esse fato pode ter
lower respiratory tract deaths of infants and
ocorrido devido os MAbs utilizados na
young children. Journal of Infectious
subgrupagem,
Disease, 161(4): 640-646, 1990.
Pode-se
notar
também,
terem
sido
o
produzidos
contra epítopos de cepas circulantes no ano
de 1985 (ANDERSSON et al., 1985), e que
ARBIZA,
J.;
DELFARO,
A.;
devido à mutações as cepas de VRS
FRABASILE, S. Molecular epidemiology
circulantes nos anos deste estudo poderiam
of human respiratory syncytial virus in
não mais apresentar tais epítopos.
Uruguay:
Estudos
desta
natureza
vêm
contribuindo para o fornecimento de
1985-2001-
A
Review.
Memórias do Instituo Oswaldo Cruz,
100(3): 221-30, 2005.
informações a respeito das características
clínicas e epidemiológicas deste vírus na
AVENDAÑO, L. F.; PARRA, J.;
nossa região. Assim faz-se necessário, dar
PADILLA,
continuidade às inoculações das amostras
Impacto en salud infantil del invierno
clínicas na tentativa de subgrupar um
2002:
maior número de espécimes. Também a
ambientales y virus respiratorio sincicial,
aplicação de uma técnica complementar
en Santiago. Revista Medica del Chile,
que apresente uma maior sensibilidade,
131: 902-08, 2003.
como
a
RT-PCR,
nos
auxiliará
C.;
PALOMINO,
disociación
entre
M.
A.
factores
na
BUCKINGHAM, S. C.; QUASNEY,
conclusão deste trabalho.
M.W.; BUSH, A.J.; DE VINCENZO, J.P.
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