caracterização estrutural da associação epifítica e endofítica
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CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA ASSOCIAÇÃO EPIFÍTICA E ENDOFÍTICA ENTRE MICRORGANISMOS E PLANTAS EM UM AMBIENTE AGRÍCOLA TROPICAL. LÍLIAN ESTRELA BORGES UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ MARÇO - 2006 CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA ASSOCIAÇÃO EPIFÍTICA E ENDOFÍTICA ENTRE MICRORGANISMOS E PLANTAS EM UM AMBIENTE AGRÍCOLA TROPICAL. LÍLIAN ESTRELA BORGES Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia, com ênfase em Biologia Celular. ORIENTADOR: PROF. FÁBIO LOPES OLIVARES CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ MARÇO - 2006 SUMÁRIO RESUMO......................................................................................................................1 ABSTRACT..................................................................................................................2 1. INTRODUÇÃO.........................................................................................................3 2. REVISÃO DE LITERATURA....................................................................................4 2.1. Biodiversidade e Sistemas Tropicais................................................................4 2.2. Interações entre plantas e bactérias.................................................................6 2.3. Bactérias endofíticas.......................................................................................11 2.4. Aplicação de bactérias endofíticas na agricultura e biotecnologia..................15 2.5. Bactérias epifíticas e biofilme..........................................................................16 2.6. Aplicação de bactérias epifíticas na agricultura e biotecnologia.....................20 2.7. Anatomia vegetal e microscopia aplicada ao estudo das interações entre plantas e bactérias.....................................................................................................21 3. OBJETIVOS...........................................................................................................23 3.1. Objetivo geral..................................................................................................23 3.2. Objetivos específicos.......................................................................................23 4. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................24 4.1. Caracterização agroecológica do local de coleta............................................24 4.1.1. Caracterização dos diferentes agroecossistemas........................................25 4.2. Material botânico.............................................................................................26 4.3. Processamento de amostras para microscopia ótica......................................29 4.4. Processamento de amostras para microscopia eletrônica de varredura........30 5. RESULTADOS.......................................................................................................32 5.1. Bactérias epifíticas nas amostras da lâmina foliar..........................................32 5.2. Fungos epifíticos nas amostras da lâmina foliar.............................................42 5.3. Microrganismos epifíticos nas amostras da raiz..............................................42 5.4. Microrganismos endofíticos.............................................................................42 6. DISCUSSÃO..........................................................................................................56 6.1. Microrganismos epifíticos nas amostras da lâmina foliar................................56 6.2. Microrganismos epifíticos nas amostras da raiz..............................................64 6.3. Microrganismos endofíticos.............................................................................65 7. CONCLUSÕES......................................................................................................67 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................68 AGRADECIMENTOS Ao Marihus, aos meus pais, Antônio e Maeli, e aos irmãos, Lavínia e Leonardo, pelo apoio, incentivo, confiança e carinho, dedico esse trabalho. Ao Professor Fábio Lopes Olivares, pela orientação e ensinamentos nesses anos de convívio. À Professora Maura da Cunha, pela revisão e sugestões, essenciais para a melhoria dessa dissertação. Ao Sr. Husdonil e à Sra. Marília, pela possibilidade de realização desse estudo na propriedade rural Pedra Lisa e por toda a atenção e carinho. Aos membros da comissão examinadora do projeto, Prof. Silvaldo Felipe da Silveira, Profa. Maura da Cunha, Profª. Kátia Valevski Sales Fernandes, e aos membros da comissão examinadora da dissertação, Prof. Flávio Costa Miguens, Prof. José Roberto Vieira Júnior, Prof. Reginaldo da Silva Romeiro, por todas as críticas e sugestões. Ao Marihus, pela colaboração durante a coleta do material botânico e caracterização agroecológica da propriedade. À Beatriz, Giovana, Ricardo, Rosane e Noil, pelo apoio técnico durante o preparo das amostras e utilização dos microscópios. A todos os professores, colegas e funcionários do Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, pelo aprendizado que de alguma forma me proporcionaram e pela amizade e convívio tranqüilo durante esses anos. Em especial aos amigos do grupo de pesquisa, Erineudo, Lúcia e Vanessa, pela amizade e por todos os auxílios. À Universidade Estadual do Norte Fluminense, ao Centro de Biociências e Biotecnologia e ao Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, pela oportunidade de realização desse trabalho. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa concedida. RESUMO Atualmente, a tendência do setor agrícola é utilizar técnicas e estratégias biotecnológicas para aumentar a produção, aliada à qualidade do produto e preservação ambiental. Nesse contexto, os estudos sobre bactérias epifíticas e endofíticas, que colonizam respectivamente a superfície e o interior de plantas assintomáticas se destacam, pois essas bactérias podem contribuir para o crescimento e desenvolvimento da planta hospedeira, além de atuarem no equilíbrio dinâmico dos ecossistemas. Entretanto, a caracterização estrutural da interação entre a flora tropical e bactérias em ambiente natural ainda tem sido pouco explorada. Logo, o presente estudo teve como objetivo caracterizar a micromorfologia e anatomia da associação natural epifítica e endofítica entre microrganismos e plantas em um ambiente agrícola tropical. Foram coletadas amostras de raízes e folhas sem sintomas de doença, de quarenta e sete espécies vegetais, pertencentes a vinte e oito famílias botânicas, em uma pequena propriedade rural localizada no município de Jerônimo Monteiro, ES, e processadas para microscopia ótica e microscopia eletrônica de varredura. Em todas as espécies vegetais foi observada colonização microbiana. As bactérias foram os colonizadores mais abundantes do filoplano, seguido por fungos, na forma de esporos e de hifas. Predominaram nas superfícies foliares bactérias no formato de bastonete, seguido por cocos, aderidos à parede periclinal externa das células epidérmicas e tricomas por adesão apolar. As bactérias estavam presentes no filoplano como células solitárias, ou formando microcolônias, ou estruturadas em biofilmes. Houve o predomínio de biofilmes multiespecíficos, compostos por bactérias e fungos. Os locais preferenciais de estabelecimento bacteriano epifítico foram as flanges cuticulares, os tricomas secretores, os tricomas tectores, os complexos estomáticos e as nervuras. Os caracteres anatômicos influenciaram no estabelecimento da microbiota epifítica, sendo a presença de tricomas uma característica favorável, e a presença de cera epicuticular do tipo plaqueta uma característica desfavorável à interação bactéria-planta. A microscopia eletrônica de varredura, aliada à microscopia ótica, foram ferramentas eficazes para o estudo estrutural da interação epifítica entre microrganismos e a planta hospedeira. Colonização endofítica fúngica foi observada nas amostras radiculares como associações micorrízicas. ABSTRACT Nowadays, the tendency of the agricultural section is to use biotechnologycal techniques and strategies to increase production, allied to the quality of the product and environmental preservation. In this context, the study of epiphytic and endophytic bacteria, which colonize, respectively, the surface and the interior of healthy plant tissues stand out, because those bacteria can contribute for plant host growth and development, besides they act in the dynamic balance of the ecosystems. However, the structural characterization of the interaction between tropical flora and microorganisms in natural environments has still been little explored. In this direction, the objective of this study was to characterize the micromorfology and anatomy of epiphytic and endophytic natural associations between microorganisms and healthy plants in a tropical agro-environment. Roots and leaves samples were collected from forty seven plant species, belonging to twenty-eight botanical families, in a small rural property located in Jerônimo Monteiro, ES., and processed for light microscopy and scanning electron microscopy. In all plants, microbial colonization was observed, being bacteria the most abundant settlers of the phylloplane, followed by fungi spore or hyphae. Bacteria with rod cell shape prevail in leave surface, followed by coccoide cell, adhered to the epiderm cell wall by apolar attachment. Bacteria occurred, on the phylloplane, as a solitary cell, or forming microcolonies, or structured in biofilm. Multiespecific biofilm, composed by bacteria and fungi, prevail on the phylloplane. The preferencial sites of phylloepiphytic bacteria establishment were epidermal cell wall junctions, glandular trichomes, non-glandular trichomes, stomata and veins. The anatomical characters influence the epiphytic microorganism establishment, being the presence of trichomes a favorable caracter and the presence of epicuticular wax like plates an unfavorable caracter for plant-bacteria interaction. Scanning electron microscopy, allied to light microscopy, can be considered important tools for structural studies of phylloepyphytic associaions between microorganisms and host plant. Fungi endophytic colonization was observed in root samples like mycorrhiza. 1. INTRODUÇÃO As plantas abrigam microecossistemas complexos, possuindo diferentes habitats, explorados por bactérias benéficas, como as simbióticas, e por bactérias maléficas, como as fitopatogênicas. Há mais de 50 anos, diversos trabalhos têm demonstrado que as bactérias presentes epifiticamente (Lindow & Brandl, 2003) e endofiticamente (Hallmann et al., 1997; Sturz et al., 2000; Lodewyckx et al., 2002) podem ser isoladas de tecidos vegetais sadios, não estabelecendo de forma clara interações simbióticas ou patogênicas. Recentemente, foi descoberto que essas bactérias podem conferir vários benefícios ao seu hospedeiro, como promoção do crescimento vegetal (Baldani et al., 1997; Cássan et al. 2001) e maior resistência a condições de estresse biótico e abiótico (Whipps, 2001; Zahir et al., 2003), além de possuírem uso biotecnológico (Lindow & Leveau, 2002). Portanto, as definições de bactérias epifíticas e endofíticas, que antes se referiam apenas à localização do microrganismo, evoluem para representar associações entre bactérias e plantas saudáveis (Andrews & Harris, 2000; Baldani et al., 2002). As bactérias epifíticas e endofíticas apresentam uma ampla diversidade genética e metabólica (Andrews & Harris, 2000; Yang et al., 2000) e atuam diretamente nos ciclos biogeoquímicos de nutrientes e no crescimento e desenvolvimento vegetal (Baldani et al., 1997; Gilbert et al., 1998; Bloemberg & Lugtenberg, 2001). Apesar de possuírem importância global e local no equilíbrio dinâmico dos ecossistemas, são escassos os levantamentos sobre as associações naturais entre bactérias epifíticas e endofíticas com a planta hospedeira em ambientes tropicais. Questionamentos básicos ainda persistem, como: quais espécies vegetais são colonizadas por bactérias epifíticas e endofíticas? Existem diferenças nos padrões de colonização e estabelecimento epifítico e endofítico considerando órgãos vegetais, famílias botânicas e espécies vegetais? Como é caracterizada anatomicamente a interação entre bactérias epifíticas e endofíticas com a planta hospedeira? Nessa direção, a anatomia vegetal aliada à microscopia, pode ser utilizada de forma promissora para elucidar essa interação, pois permite observar e caracterizar o microrganismo em seu habitat natural, gerando informações sobre a estrutura, localização e distribuição dos mesmos nos microecossistemas vegetais. Diante do exposto, o presente estudo teve como objetivo caracterizar estruturalmente a associação natural epifítica e endofítica entre microrganismos e plantas em um ambiente agrícola tropical. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Biodiversidade em Sistemas Tropicais Diversidade biológica ou biodiversidade é a variabilidade de organismos vivos de todas as origens, compreendendo, dentre outros, os ecossistemas terrestres, marinhos e os complexos ecológicos de que fazem parte; compreendendo ainda a diversidade dentro de espécies, entre espécies e de ecossistemas (BrasilM.M.A., 1998). A biodiversidade, juntamente com os fatores abióticos, é responsável pela manutenção da estabilidade dos ecossistemas, bem como, fonte inestimável de recursos econômicos potencialmente exploráveis. Neste sentido, além de seu valor intrínseco, a diversidade biológica possui valores ecológicos, genéticos, sociais, econômicos, científicos, educacionais, culturais, recreativos e estéticos (OdaliaRímoli et al., 2000). Wilson (1997) sugere que os ecossistemas tropicais são os ambientes que apresentam a maior biodiversidade, porém, estão sofrendo um processo de acelerada degradação, que pode ocasionar perdas irreversíveis através da extinção de inúmeras espécies. Os sistemas tropicais possuem características diferenciadas dos sistemas temperados, referentes não apenas a localização geográfica e ao clima, com temperaturas mais elevadas e constantes durante o ano, mas também, em relação aos solos, bastante intemperizados, naturalmente inférteis e resilientes. Segundo Novais & Smyth (1999), com o aumento do intemperismo, os solos se tornam mais eletropositivos, resultando em uma diminuição da capacidade de troca catiônica e aumento da retenção de ânions como o fosfato, sulfato e molibdato. Logo, os solos passam gradualmente de fonte para dreno de nutrientes. Por apresentarem características peculiares, os sistemas tropicais necessitam serem estudados de forma constante e interdisciplinar, pois só com a compreensão integral da dinâmica desse ambiente, poderão ser criadas técnicas de manejo agrícola sustentáveis. O Brasil possui a maior diversidade biológica do planeta, tanto em relação às potencialidades genéticas, como em relação ao número de espécies e ecossistemas (Odalia-Rímoli et al., 2000). O país possui também a mais alta taxa de endemismo, além de utilizar diversas espécies exóticas, que representam a base para as atividades agropecuárias (Brasil-M.M.A., 1998). Segundo Altieri (2002), nos agroecossistemas, a biodiversidade além de ser fornecedora de matéria-prima, apresenta importantes funções ecológicas, como a reciclagem de nutrientes, regulação do microclima, supressão de organismos indesejados e detoxificação de compostos químicos. Portanto, é de fundamental importância que se intensifique a implementação de programas de pesquisa na busca da compreensão e de um melhor aproveitamento da diversidade biológica. Dados sobre o número de espécies atualmente conhecidas e a estimativa das que estão por ser descobertas estão presentes na tabela 1. Tabela 1. Participação das espécies conhecidas e estimadas da população de espécies existentes, adaptado de Azevedo (1999) e Manfio (2003). Número de espécies Grupos Conhecidas (C) Estimadas (E) % C/E Bactéria 4.700 40.000 a 3.500.000 < 12,00 Fungi 69.000 1.500.000 4,60 Protoctista 30.800 100.000 30,80 Plantae 307.750 3.010.000 10,22 Animalia 9.827.000 80.615.000 12,19 5.000 130.000 3,84 Vírus O levantamento indica que os conhecimentos atuais a respeito da diversidade biológica ainda são bastante incipientes, principalmente em relação aos microrganismos. Sem conhecê-los, torna-se impossível preservá-los e utilizá-los. Além dos prejuízos na biota local, a diminuição da diversidade microbiana pode causar danos em escala global. Segundo Gilbert et al. (1998), as bactérias metanotróficas oxidam mais da metade do metano produzido na Terra, para obtenção de energia e como fonte de carbono. Esses microrganismos impedem que o metano atinja altas concentrações, o que poderia resultar em um aumento da temperatura do globo e causar diversas alterações químicas na atmosfera. As bactérias metanotróficas estão presentes no solo e também colonizam os tecidos de plantas, como, por exemplo, plantas de arroz, sendo responsáveis pela oxidação de 10 a 50 % do metano produzido nos campos de arroz inundado. Sendo assim, as interações entre bactérias e plantas são de extrema importância para a manutenção do equilíbrio nos diversos ecossistemas. Há a necessidade de estudos contínuos para elucidar a dinâmica das diferentes associações entre plantas e microrganismos, gerando informações relevantes para o desenvolvimento de técnicas e estratégias aplicadas na agricultura e biotecnologia. 2.2. Interações entre plantas e bactérias Os fisiologistas e anatomistas vegetais, freqüentemente, consideram as plantas como organismos únicos, desconsiderando a existência de associações microbianas. Entretanto, o avanço da ciência vem demonstrando que as plantas podem abrigar microecossistemas complexos, possuindo diferentes habitats, explorados por uma ampla variedade de bactérias (Hallmann et al., 1997; KuklinskySobral, 2004). Os habitats incluem tanto a superfície externa do vegetal (rizoplano e filoplano), onde bactérias denominadas epifíticas predominam, quanto o interior das plantas, onde predominam bactérias endofíticas (Lodewyckx et al., 2002). Para Hallmann et al. (1997), essa distinção nem sempre é de fácil percepção, pois existe um gradiente entre esses grupos bacterianos, ou seja, há populações que podem flutuar entre a colonização epifítica e endofítica. Diversos fatores bióticos e abióticos, tais como: a presença de outros microrganismos associados à planta, presença de nematóides parasitas, características edafoclimáticas, tipo de tecido vegetal e características da própria bactéria, podem influenciar na colonização e distribuição de bactérias na planta hospedeira (Kuklinsky-Sobral, 2003). As bactérias utilizam várias estratégias para colonizarem os microecossistemas vegetais, incluindo interações benéficas, através de bactérias simbióticas e interações maléficas, causadas pela ação de bactérias fitopatogênicas (Montesinos et al., 2002). As bactérias fitopatogênicas são conhecidas pelos cientistas desde a segunda metade do século XIX, sendo consideradas importantes patógenos de plantas, pois provocam graves enfermidades em culturas exploradas economicamente e são de difícil controle (Romeiro, 1995). Para ocorrer a doença é necessário que se estabeleça uma interação dita compatível, na qual a bactéria é fitopatogênica, a planta é sua hospedeira suscetível e o ambiente apresenta condições favoráveis à interação (Romeiro, 1995; Agrios, 1997; Montesinos et al., 2002). O processo patogênico depende, primeiramente, que ocorra migração e adesão da bactéria à superfície da planta hospedeira, para posteriormente, ocorrer a infecção (Leite et al., 2001). A penetração ocorre principalmente de forma passiva, sem o rompimento mecânico ou enzimático do sistema de revestimento das plantas, podendo ser através de aberturas naturais, como estômatos, hidatódios, nectários, lenticelas, flores, ou através de ferimentos causados pelo vento, chuva, insetos, nematóides, fungos, abscisão de folhas, tratos culturais e durante a emergência de raízes laterais e adventícias. Tanto as substâncias secretadas pelas aberturas naturais como os exsudados de fluido intercelular dos ferimentos podem exercer quimiotactismo positivo sobre as bactérias (Ponte, 1980; Huang, 1986; Romeiro, 1995; Agrios, 1997). Segundo Romeiro (1995), a bactéria coloniza um determinado tipo de tecido vegetal, dependendo do tipo de interação bactéria-planta, do grau de susceptibilidade do hospedeiro, do grau de agressividade da bactéria, do modo e local de penetração e das condições ambientais. Porém, é consenso que as fitobactérias são parasitas extracelulares, colonizando preferencialmente os espaços intercelulares e os vasos do xilema. A colonização dos espaços intercelulares resulta em sintomas como manchas, podridão-mole, hipertrofia e morte dos meristemas apicais e a colonização dos vasos do xilema resulta em sintomas como murcha, morte dos meristemas apicais e cancros. As bactérias fitopatogênicas podem apresentar em seu ciclo de vida as fases patogênica, saprofítica, residente e latente. Na fase patogênica as bactérias demandam nutrientes dos tecidos vegetais vivos, resultando em doença no hospedeiro. Quando os nutrientes são obtidos de restos vegetais em decomposição, as bactérias são denominadas saprófitas. Na fase residente, as bactérias estão presentes na superfície das plantas, obtendo nutrientes dos exsudados de seus órgãos, sendo capazes de se multiplicarem sem infectar o hospedeiro. Na fase latente, as bactérias encontram-se no interior da planta, em baixas populações, tendo sua multiplicação paralisada e os sintomas não se evidenciam (Leben, 1981). A disseminação de doenças nas espécies vegetais é limitada, pois a interação patógeno-hospedeiro tende a ser específica e as plantas possuem diversos mecanismos de defesa contra os ataques microbianos (Mithöfer, 2002). A especificidade da interação entre bactérias patogênicas e planta hospedeira é explicada pela necessidade de um reconhecimento gênico mútuo. As bactérias possuem um gene avirulento (avr) homólogo ao gene de resistência (R) da planta. Uma combinação não complementar desses genes resulta na interação compatível denominada doença, enquanto a combinação complementar desses genes resulta na interação incompatível, na qual há o estímulo dos mecanismos de defesa da planta hospedeira (Montesinos et al., 2002). As plantas, durante sua evolução, vem desenvolvendo várias estratégias de adaptação e resistência às condições ambientais adversas (Margis-Pinheiro et al., 1999). Os mecanismos de defesa são classificados em constitutivos, expressos como uma característica inerente ao desenvolvimento do organismo, e induzidos, expressos em função do contato com o agente invasor. Ambos mecanismos podem atuar utilizando aspectos estruturais, baseados na anatomia e ultraestrutura vegetal e aspectos químicos, referentes aos compostos químicos com atividade biológica de defesa, sintetizados pelas plantas (Shewry & Lucas, 1997; Sticher et al., 1997; Mauch-Mani & Métraux, 1998; Montesinos et al., 2002). As defesas constitutivas ou preexistentes variam conforme a espécie vegetal, podendo ser reconhecida, por exemplo, pela presença de cutícula espessa. Segundo Kerstiens (1995), a cutícula pode atuar de forma direta contra a penetração de patógenos através da formação de uma barreira mecânica, e de forma indireta, reduzindo a retenção de água na superfície vegetal e protegendo a planta contra danos mecânicos. Outros caracteres anatômicos como a organização da parede periclinal externa, a periderme, a coifa, os apêndices epidérmicos, podem também dificultar a infecção, colonização e reprodução do patógeno no hospedeiro (Bergamin Filho et al., 1995). Assim como a presença de diversos metabólitos secundários, saponinas (Osbourn, 1996), compostos fenólicos (Beckman, 2000) e proteínas constitutivas (Shewry & Lucas, 1997) que possuem atividade antimicrobiana. Os taninos, por exemplo, um tipo de composto fenólico freqüentemente encontrado em tecidos vegetais, inibem enzimas extracelulares microbianas e diminuem as fontes nutricionais dos patógenos através da complexação de íons metálicos, sendo a concentração de tanino mínima inibitória para bactérias entre 0,012 e 1 g L-1 (Scalbert, 1991). A resistência induzida pode ser local ou sistêmica. A defesa local é reconhecida, por exemplo, pela reação de hipersensibilidade (HR), que é a morte rápida das células vegetais situadas no local de infecção, limitando a proliferação do patógeno e adicionalmente, produzindo moléculas sinalizadoras que induzem a ação de diversos genes relacionados com a defesa (Margis-Pinheiro et al., 1999; Cohn et al., 2001; Gara et al., 2003). Uma variedade de mudanças metabólicas pode ocorrer associadas com HR, incluindo a produção de espécies reativas de oxigênio, como os superóxidos (Gara et al., 2003), explosão oxidativa (Doke et al., 1996), mudança no fluxo iônico (Cohn et al., 2001), espessamento da parede celular perto do local de infecção (Margis-Pinheiro et al., 1999), síntese de fitoalexinas (Romeiro, 2001; Grayer & Kokubun, 2001), síntese de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR) (Shewry & Lucas, 1997; Loon & Strien, 1999; Okushima et al., 2000), e produção de moléculas sinalizadoras como o óxido nítrico (Cohn et al., 2001) e o ácido salicílico (Mauch-Mani & Métraux, 1998). A defesa induzida também pode ser sistêmica, através da resistência sistêmica adquirida sinalizada pelo ácido salicílico, ou através da resistência sistêmica induzida, que requer a presença de alguns microrganismos (Sticher et al., 1997; Mauch-Mani & Métraux, 1998). A resistência sistêmica protege a planta contra novos ataques de um mesmo patógeno, sendo na literatura, freqüentemente associada com o processo de imunização que ocorre em animais (Margis-Pinheiro et al., 1999). Sticher et al. (1997) relatam que rizobactérias promotoras de crescimento, localizadas na rizosfera, podem induzir SIR no caule e nas folhas, protegendo a planta de vários patógenos. Além das interações patogênicas citadas acima, as plantas se associam com vários microrganismos considerados simbiônticos, resultando em melhorias no seu crescimento e desenvolvimento. A simbiose pode ser definida como uma melhoria recíproca dos organismos, sendo que o fluxo bilateral de nutrientes não é uma característica requerida de forma exclusiva, qualquer efeito protetor entre organismos, que aumente a capacidade de sobrevivência ou reprodução, é suficiente para que se configure uma relação simbiôntica (Selosse et al., 2004). Uma simbiose, com relevante importância agronômica e ecológica, ocorre entre bactérias fixadoras de nitrogênio e leguminosas, por meio da formação de estruturas altamente especializadas denominadas nódulos. Dentro dos nódulos, as bactérias, principalmente Bradyrizobium, as Mesorhizobium, pertencentes aos Sinorhizobium e gêneros Rhizobium, Azorhizobium, transformam o nitrogênio atmosférico (N2) em amônia (NH3). A amônia é assimilada pela planta, que em contrapartida, supre a bactéria de fotoassimilados, estabelecendo uma interação mutuamente benéfica (Mithöfer, 2002). Djordjevic et al. (1987) consideram a associação rizóbio-planta como uma interação parasítica bastante evoluída, pois exibe seletividade ao hospedeiro e reconhecimento mútuo. Esses autores sugerem uma seqüência evolutiva na associação bactéria-planta, que se inicia por uma interação comensalista, na qual as bactérias se aproveitam dos exsudados vegetais, sendo denominadas saprófitas. Nessa interação primitiva, as bactérias produzem enzimas não específicas que destroem o tecido vegetal antes da colonização, logo há pouca seletividade e troca de sinais. A transição comensalista para parasítica ocorre quando as bactérias conseguem penetrar e colonizar tecidos vivos, se alimentando dos nutrientes da própria planta. De alguma maneira, ainda não completamente elucidada, as bactérias conseguem evitar ou inativar os mecanismos de defesa e colonizar todo o hospedeiro. O parasitismo mais evoluído é o que causa cada vez menos danos à planta, sendo a simbiose considerada a mais bem sucedida interação microrganismo-planta, uma vez que beneficia ambas as espécies através de mecanismos bastante regulados e específicos. Muitas espécies bacterianas tem sido isoladas de diferentes tecidos vegetais sadios (Hallmann et al., 1997; Baldani et al., 2002; Sturz et al., 2000; Lodewyckx et al., 2002). Essas bactérias, presentes endofiticamente, não são consideradas patogênicas, pois não provocam sintomas de doenças. Recentemente, foi descoberto que elas podem conferir vários benefícios ao seu hospedeiro, como promoção do crescimento vegetal e resistência contra patógenos e parasitas (Hallmann et al., 1997). Sendo assim, a definição literal de bactérias endofíticas (“endo” é derivado da palavra grega “endon” e significa posição interior, e “fito” é derivado da palavra grega “phyton” e significa planta) referente à localização do microrganismo no interior da planta evoluiu para descrever a natureza de uma associação entre bactérias que habitam o interior das plantas sem causar sintomas visíveis de doença (Baldani et al., 2002). Hallmann et al. (1997) sugerem que evolutivamente as bactérias endofíticas são intermediárias entre as bactérias saprófitas e patogênicas, além de especularem a possibilidade das bactérias endofíticas serem mais evoluídas que as patogênicas por se nutrirem do hospedeiro sem matá-lo. Essa especulação pode ser reforçada pela seqüência evolutiva proposta por Djordjevic et al. (1987), que contempla a idéia de que a mais bem sucedida interação entre microrganismo-planta não apenas explora os vegetais como fonte nutritiva, mas através do tempo causa menos danos a planta. Segundo Olivares (1997), os endófitos podem ter se tornado endossimbiontes pela coevolução. Um achado novo e relevante é o fato das rizobactérias possuírem genes em um plasmídeo simbiótico ou na ilha simbiótica dos cromossomos, homólogos aos genes do sistema de secreção tipo-III, utilizado pelas bactérias patogênicas na transferência dos fatores de virulência para as células hospedeiras (Freiberg et al., 1997; Göttfert et al., 2001). Resultados recentes demonstram que o sistema de secreção tipo-III em rizobactérias secretam proteínas específicas envolvidas no estabelecimento da simbiose (Bloemberg & Lugtenberg, 2001). Assim, as bactérias endofíticas talvez possam ser evolutivamente a transição entre as bactérias patogênicas e as bactérias simbiontes. 2.3. Bactérias endofíticas Bactérias endofíticas têm sido reconhecidas por mais de 50 anos em diferentes tecidos vegetais sem causar sintomas de doença (Terver and Hollis, 1948). Apesar das numerosas investigações a respeito desses microrganismos, muitos questionamentos e controvérsias ainda necessitam serem elucidados. O próprio conceito de bactéria endofítica (James & Olivares, 1997; Baldani et al., 2002; Sturz et al., 2000; LodewycKx et al., 2002) é bastante discutido e sujeito a diferentes interpretações na literatura. Kado (1992) definiu bactérias endofíticas como aquelas que colonizam os interior de plantas sem causar danos ou receber benefícios da interação. Esse conceito é bastante restritivo, pois desconsidera a possibilidade de ocorrerem associações simbióticas ou patogênicas entre endófito-planta. No entanto, Quispel (1992) considera como endofíticas apenas as bactérias que estabelecem uma endossimbiose com a planta hospedeira. Hallmann et al. (1997) agrupam essas definições considerando endofíticas as bactérias que podem ser isoladas de tecidos vegetais desinfetados superficialmente ou extraída do interior de plantas e que não causa mal ao hospedeiro. Essa definição inclui tanto as associações neutras quanto as benéficas. Não existe, portanto, um claro limite entre bactérias endofíticas, patogênicas e simbiontes. Conclui-se que o conceito de bactérias endofíticas não mais se refere à localização e sim a função que esses microrganismos exercem no ecossistema, estando em constante modificação, por depender de informações sobre a associação endófito-bactéria que ainda não estão completamente compreendidas. A origem, forma de penetração, colonização e transmissão de bactérias endofíticas ainda são bastante discutidas. Bactérias endofíticas provavelmente se originam de sementes, material propagado vegetativamente, rizosfera e filoplano (Hallmann et al., 1997). A penetração pode ocorrer por aberturas naturais, como estômatos, hidatódios, nectários, lenticelas e por ferimentos causados principalmente pela emergência de raízes laterais, sendo a penetração ativa relatada em bactérias que secretam celulases e pectinases (Hallmann et al., 1997; ReinholdHurek & Hurek, 1998; Sturz et al., 2000). A colonização de bactérias endofíticas pode ser local, em um tecido específico da planta, como o córtex, ou pode ser sistêmica, sendo transportada através dos elementos condutores ou via apoplástica (James et al., 1994). A colonização é preferencialmente intercelular, com apenas poucos relatos de colonização intracelular (Hallmann et al., 1997). O fato das bactérias serem capazes de colonizar o interior das plantas pode conferir uma vantagem ecológica e evolutiva comparado com a colonização epifítica. Os tecidos vegetais podem prover um ambiente mais uniforme e protegido para as bactérias que a superfície vegetal, por não estarem diretamente exposto às condições ambientais extremas como incidência de radiação ultravioleta, variação de temperatura e umidade. No entanto, fatores limitantes internos, como a presença de compostos com atividade antimicrobiana, existem, e as bactérias têm que ser hábeis para conseguirem colonizar as plantas endofiticamente (Sturz et al., 2000). O estudo de bactérias endofíticas, por muitos anos utilizou-se dos métodos de isolamento e contagem microbiológica. Amostras de plantas eram desinfestadas superficialmente, utilizando-se diferentes produtos químicos, como hipoclorito de sódio e peróxido de hidrogênio (Lodewyckx et al., 2002) e posteriormente, eram trituradas, ou centrifugadas, ou submetidas a vácuo para isolamento bacteriano. Essas bactérias eram cultivadas em meios artificiais e a população era estimada através da contagem das colônias, considerando o fator de diluição ou aplicando a técnica do número mais provável (Hallmann et al., 1997). Em várias espécies vegetais pertencentes a diferentes famílias botânicas, interações com bactérias endofíticas foram estudadas através dos métodos de isolamento aliados ou não com as técnicas de biologia molecular, sem a confirmação microscópica da presença bacteriana, conforme os exemplos da tabela 2. Tabela 2. Espécies vegetais que apresentam associações com bactérias endofíticas, constatadas através dos métodos de isolamento bacteriano aliados ou não as técnicas de biologia molecular, sem a confirmação microscópica. Família Apiaceae Nome científico (nome vulgar) Daucus carota L. Órgão vegetal Bactéria Referência Raiz Pseudomonas Surette et al., 2003 (cenoura) Staphylococcus Agrobacterium Asteraceae Areaceae Lactuca sativa L. Semente, raiz, (alface) caule, folha Cocos nucifera L. Folha, raiz (coqueiro) Bromeliaceae Fabaceae Enterobacter Fernandes et al., 2001 Ananas comosus L. Raiz, caule, Azospirillum Weber et al., 1999; Merril folha, fruto Burkholderia Tapia- Hernández et Herbaspirillum al., 2000 Pantoea Assis Jr & Adachi, Enterobacter 2003 Silveira et al., 2004 Ipomoea batatas Caule Lam. (batata-doce) Cucurbitaceae Gomes et al., 2003 Pseudomonas (abacaxi) Convolvulaceae Bacillus Cucumis sativus L. Semente, raiz, Bacillus (pepino) caule, folha Enterobacter Phaseolus vulgaris L. Raiz Rhizobium (feijoeiro) Gutiérerz-Zamora & Martínez-Romero, 2001 Malvaceae Gossypium hirsutum Semente, raiz, L. (algodoeiro) caule Não identificada McInroy & Kloepper, 1990; Adams & Kloepper, 2002 Continuação da Tabela 2. Musaceae Musa spp Raiz, caule, Azospirillum Weber et al., 1999; (bananeira). folha, fruto Burkholderia Martinez et al., 2003 Herbaspirillum Poaceae Brachiaria Raiz Herbaspirillum Olivares et al., 1996 Raiz Herbaspirillum Olivares et al., 1996 Raíz Herbaspirillum Olivares et al., 1996 Caule, raíz Azoarcus Stoltzfus et al., 1997; decumbens Stapf. (capim braquiária) Poaceae Digitaria decumbens Stents (capim pangola) Poaceae Melinis minutiflora Beauv. (capim gordura) Poaceae Oryza sativa L. (arroz) Poaceae Engelhard et al., 2000 Raíz Herbaspirillum Olivares et al., 1996 Pennisetum Raiz, caule, Azospirillum Olivares et al., 1996; purpureum folha Herbaspirillum Kirchhof et al., 1997 Saccharum sp. Raiz, caule, Glucanocetobacter Olivares et al., 1996; (cana-de-açúcar) folha Pantoea Reis Jr et al., 1999; Azospirillum Loiret et al., 2004 Panicum maximum Jacq. (capim colonião) Poaceae Schumach (capim elefante) Poaceae Herbaspirillum Poaceae Sorghum bicolor Raiz Herbaspirillum Olivares et al., 1996 Raiz, caule, Herbaspirillum Olivares et al., 1996 folha Rhizobium Raiz, caule Glucanocetobacter Jimenez-Salgado et (sorgo) Poaceae Rubiaceae Zea mays L. (milho) Coffea arbica L. (cafeeiro) al., 1997; FuentesRamírez et al., 2001 Solanaceae Solanum tuberosum L. (batata) Caule Curtobacterium Pantoea Pseudomonas Bacillus Clavibacter Agrobacterium Acidovorax Sturz et al., 1999 Apesar da importância que o método de isolamento adquiriu para identificar bactérias em diferentes órgãos vegetais, e mesmo aliado as novas técnicas moleculares, há certas limitações que o torna inviável para caracterizar a associação entre endófitos-planta. A desinfestação superficial não é totalmente eficaz, os produtos químicos utilizados podem penetrar nos tecidos vegetais e matar as bactérias endofíticas, subestimando o valor total de bactérias no interior da planta (Hallmann et al., 1997). Muitas bactérias epifíticas que estão envoltas por mucilagem ou aderidas fortemente à parede periclinal externa podem permanecer na planta após a desinfestação e serem consideradas erroneamente como endofíticas, superestimando o resultado (Reinhold-Hurek & Hurek, 1998). O cultivo em meios artificiais somente considera viáveis as bactérias capazes de utilizarem os nutrientes daquele meio, logo, os microrganismos contados podem representar apenas uma pequena fração do total da população endofítica (Halmann et al., 1997). O isolamento, portanto, caracteriza-se por ser um método indireto, gera evidências da colonização endofítica de bactérias em tecidos vegetais, porém há a necessidade da confirmação dessa interação através de estudos microscópicos (Reinhold-Hurek & Hurek, 1998). 2.4. Aplicação de bactérias endofíticas na agricultura e biotecnologia Segundo Azevedo (1999), o estudo da interação entre bactérias endofíticas e plantas tropicais é escasso, mas vem se desenvolvendo rapidamente, resultando em descobertas de interesse acadêmico e aplicado. As bactérias endofíticas podem ser utilizadas no manejo sustentável dos sistemas agrícolas tropicais, visando conferir ao seu hospedeiro, características como maior resistência a condições de estresse biótico e abiótico, promoção de crescimento vegetal e amplo uso biotecnológico (Whipps, 2001; Kuklinsky-Sobral, 2003; Zahir et al., 2003). Os mecanismos de promoção de crescimento vegetal incluem ações diretas como a fixação biológica de nitrogênio (Baldani et al., 1997; Reis et al., 2000; Kennedy et al., 2004), produção de reguladores de crescimento vegetal (Cassán et al., 2001; Kuklinsky-Sobral et al., 2004), solubilização de fosfato inorgânico (Verma et a., 2001; Kuklinsky-Sobral et al., 2004), e ações indiretas como o controle biológico (Benhamoul et al., 1998; Kloepper et al., 1999; Benchimol et al., 2000; Alström, 2001; Siddiqui & Shaukat, 2003; Schena et al., 2003), produção de sideróforos (Lodewyckx et al., 2002) e indução de resistência sistêmica no hospedeiro (Kloepper et al., 1999; Jetiyanon & Kloepper, 2002). O uso de bactérias endofíticas na biotecnologia é bastante amplo, incluindo a produção de antibióticos e outras moléculas bioativas (Strobel, 2002), aplicação nos processos de bioremediação (Lodewyckx et al., 2002) e nas técnicas de transgenia (Baldani et al., 2002). Todos esses mecanismos são potencialmente aplicáveis no campo, objetivando a melhoria quantitativa e qualitativa da produção agrícola. Segundo Kuklinsky-Sobral (2003) a utilização real dos endófitos na agricultura depende do conhecimento sobre os mecanismos de interação bactéria-planta e da habilidade de manter, manipular e modificar populações benéficas sob condições de campo. Portanto, torna-se fundamental a caracterização da interação endófitoplanta sob o enfoque estrutural, para gerar informações que possam auxiliar no desenvolvimento de técnicas e estratégias aplicadas à agricultura tropical. 2.5. Bactérias epifíticas e biofilme Bactérias epifíticas etimologicamente se referem às bactérias que habitam a superfície vegetal (“epi” é derivado da palavra grega “upon” e significa posição superior, e “fito” é derivado da palavra grega “phyton” e significa planta) (Jacques & Morris, 1995). Hirano & Uper (1983) definem bactérias epifíticas, como aquelas que podem ser removidas de superfícies de órgãos aéreos vegetais através de lavagens. Entretanto, Romantschuk (1992) sugere que as células mais bem adaptadas ao ambiente epifítico não são removidas facilmente por lavagens, pois a adesão representa uma vantagem seletiva nesse ambiente. Andrews & Harris (2000), definem microrganismos epifíticos como aqueles que habitam a superfície vegetal e não são patogênicos. Recentemente, tem sido descrito que as bactérias epifíticas podem ser benéficas as plantas como, por exemplo, através do controle biológico (Singh et al., 2004; Özaktan & Bora, 2004; Byrne et al., 2005; Han et al., 2005). Sendo assim, a definição literal de bactérias epifíticas referente à localização do microrganismo no exterior da planta também está evoluindo para descrever a natureza de uma associação entre plantas e bactérias que habitam a superfície das plantas sem causar sintomas visíveis de doença. O filoplano e o rizoplano são ambientes bastante distintos, que apresentam peculiaridades com relação à incidência luminosa, aeração, umidade, topografia, longevidade, forma e quantidade de nutrientes e de moléculas sinalizadoras entre planta-microbiota (Andrews & Harris, 2000). Jager & Korsten (2001), por exemplo, estudando o filoplano de mangueira observaram diferenças de densidade e diversidade microbiana dependendo do estágio de desenvolvimento e da posição da folha com relação à incidência luminosa. Mercier & Lindow (2000) constataram que a disponibilidade de carbono na superfície foliar é um fator limitante no estabelecimento de bactérias epifíticas do filoplano. Todas essas características propiciam diferenças na composição microbiana e sua dinâmica temporal e espacial, pois influenciam os processos de imigração, emigração, crescimento e morte de bactérias (Kinkel, 1997). As bactérias associadas às plantas podem ser observadas isoladas ou agrupadas na forma de agregados, microcolônias, simplamatas e biofilmes (Morris & Monier, 2003). Segundo Costerton et al. (1995), biofilme pode ser definido como uma população microbiana coberta por uma matriz extracelular, com bactérias aderidas umas as outras e a uma superfície ou interface, cuja formação pode ser influenciada por vários fatores como disponibilidade de nutrientes, temperatura, osmolaridade, pH, oxigênio (O’Toole et al., 2000). Para Jefferson (2004), quatro fatores principais direcionam as bactérias a formarem biofilmes: para se protegerem contra condições de estresse, para formarem uma comunidade e se beneficiarem dos processos de cooperação, para colonizarem uma área rica em nutrientes, ou é um modo de crescimento. A formação de biofilme é um evento dinâmico no qual microrganismos planctônicos adquirem a capacidade de viverem de forma séssil, logo, sua formação envolve as etapas de adesão celular em uma superfície, formação de microcolônia, maturação do biofilme, destacamento e posterior dispersão (Costerton et al., 1999). A primeira teoria proposta para formação de biofilme foi descrita por Marshall et al. (1971) (citado por Poulsen, 1999) e ressalta que a adesão é um processo tempo dependente que pode ser dividido em duas fases: reversível e irreversível. Na primeira fase, a reversibilidade é decorrente do processo de adesão do microrganismo na superfície ocorrer por interações a longa distância, como forças de Van der Walls e de atração eletrostática. Na segunda etapa, a irreversibilidade é decorrente de interações a curta distância, incluindo dipolo-dipolo, íon-dipolo, ligações covalentes, ligações hidrofóbicas e pontes de hidrogênio, portanto, há um aumento da interação química da célula com a superfície. Recentemente, diversos estudos (Pratt & Kolter, 1998; 1999; Stickler, 1999) vêm demonstrando que para algumas bactérias o estabelecimento do contato entre célula e superfície é depende da mobilidade flagelar e pilosa, pois, possivelmente, as forças geradas por esses movimentos auxiliam a célula a sobrepor as forças repulsivas da superfície. Uma vez que ocorra contato entre bactéria e superfície, a adesão é estabelecida por proteínas extramembranares, as adesinas (Poulsen, 1999). Durante e pós a adesão, as bactérias secretam polisacarídeos extracelulares (EPS) formando uma matriz que recobre toda a microcolônia em formação. Os polisacarídeos extracelulares podem ser compostos de glicose, frutose, galactose, manose (Johansen et al., 1997). São várias as funções desses polisacarídeos como, por exemplo, facilitar a adesão bacteriana na superfície, formar e manter a estrutura do biofilme, aumentar a resistência do biofilme a condições de estresse ambiental e a antibióticos, facilitar a absorção de água e nutrientes (Poulsen, 1999). Os eventos responsáveis pela formação de biofilmes a partir de microcolônias produtoras de EPS ainda não estão completamente elucidados. Através de análises genéticas, alguns autores puderam inferir a existência de diferentes rotas para formação de biofilme dependendo do tipo de microrganismo e do ambiente (Pratt & Kolter, 1999; O’Toole et al., 2000). Sinais extracelulares e o sistema “quorum-sensing” foram confirmados, por Kjelleberg & Molin (2002), como essenciais para a diferenciação de microcolônias em biofilmes. Davies et al. (1998) ilustraram a importância de acil homoserina lactonas (acyl-HSLs), um tipo de molécula “quorum-sense”, na formação da estrutura tridimensional de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa. Nesse trabalho, mutantes lasI incapazes de sintetizarem N-(3-oxododecanoil)-L-homoserina lactona produziram biofilmes com estrutura tridimensional anormal. A estrutura tridimensional ou arquitetura do biofilme depende dos tipos de microrganismos presentes e do ambiente, porém é consenso que os biofilmes possuem uma estrutura porosa com canais na forma de capilares nos quais ocorre influxo de água e nutrientes e efluxo de excretas (Costerton et al., 1995; Pratt & Kolter, 1999). Segundo Kumar & Anand (1998), o destacamento e a dispersão do biofilme ocorre através de células isoladas ou pedaços de biofilme que são quebrados e podem ser transportados para colonizar novas superfícies. Para Costerton et al. (1999), o destacamento e dispersão de biofilmes devem envolver diversos mecanismos ainda não completamente conhecidos. As bactérias que estão crescendo em biofilmes apresentam características diferentes de quando estão crescendo em suspensão (Costerton et al., 1995; Stickler, 1999; O’Toole et al., 2000; Morris & Monier, 2003; Jefferson, 2004). Pois, ocorre nos biofilmes o aumento da síntese de exopolisacarídeos, desenvolvimento de resistência a antibióticos, aumento da resistência a radiações ultravioleta, aumento das trocas genéticas, alteração das capacidades biodegradativas e aumento da produção de metabólitos secundários (O’Toole et al., 2000). Todos esses fatores tendem a criar um ambiente seguro, protegendo as bactérias contra condições de estresses presentes na planta hospedeira. Jacobs et al. (2004) relatam que os mecanismos que aumentam a resistência a radiações ultravioleta incluem a pigmentação e mecanismos de reparação do DNA, que protegem as bactérias dos comprimentos de onda UVa (320 a 400 nm) e UVb (290 a 320 nm). Cada micro-ambiente da planta possui características próprias de radiação, disponibilidade de nutrientes, química de superfície, influenciando fortemente a forma e atividade de biofilmes (Morris & Monier, 2003). O filoplano, por exemplo, apresenta uma variabilidade de ambientes, que incluem variações topográficas como a superfície da base e do ápice dos tricomas, a superfície da nervura, os complexos estomáticos, hidatódios, nectários extraflorais, flanges cuticulares e a superfície da parede periclinal externa das células epidérmicas propriamente ditas, bem como variações na composição química desses ambientes. Além disso, as plantas apresentam diferenças morfológicas, como as várias filotaxias, aumentando a variabilidade de condições ambientais na superfície foliar (Esau, 1974; Cutter, 1986; Fahn, 1990). O rizoplano também apresenta uma grande variabilidade ambiental devido, principalmente, às diferenças físico-químicas no perfil do solo (aeração, umidade, concentração de gases, luminosidade, temperatura, pH, granulação), e às diferenças fisiológicas nas regiões radiculares (coifa, meristemática, alongamento, maturação, colo) que propicia uma heterogeneidade no processo de exsudação (Taiz & Zeiger, 1991; Walker et al., 2003). Através da exsudação de uma grande variedade de compostos, as raízes talvez possam regular a comunidade microbiana na rizosfera (Walker et al., 2003). Os flavonóides, por exemplo, exsudados pelas raízes de leguminosas ativam os genes responsáveis pelo processo de nodulação nas bactérias do gênero Rhizobium (Peters et al., 1986). Portanto, é necessário aprofundar os estudos relacionados à diversidade e localização das bactérias epifíticas do filoplano para gerar informações que possam auxiliar a compreensão das interações entre planta-microbiota. 2.6. Aplicação de bactérias epifíticas na agricultura e biotecnologia O estudo de bactérias epifíticas aplicado na agricultura tropical e na biotecnologia ainda é incipiente, porém, promissor. Bactérias epifíticas podem ser empregadas na promoção de crescimento e desenvolvimento vegetal, através da fixação biológica de nitrogênio (KuklinskySobral et al., 2004), produção de reguladores de crescimento vegetal como auxinas (Brandl & Lindow, 1998) e solubilização de fosfato inorgânico (Kuklinsky-Sobral et al., 2004). Muitas bactérias epifíticas também possuem atividade antagônica contra bactérias e fungos fitopatogênicos, podendo, potencialmente, serem empregadas como agentes de controle biológico (May et al., 1997; Postmaster et al., 1997; Benhamou et al., 1998; Stromberg et al., 2000; Özaktan & Bora, 2004; Singh et al., 2004; Byrne et al., 2005; Han et al., 2005). Um exemplo bem sucedido de controle biológico é a aplicação de preparações liofilizadas, já disponíveis no mercado americano, de Pseudomonas fluorescens estirpe A506 e Pantoea agglomerans C9-1, em flores de macieira e pereira inibindo a colonização epifítica da bactéria fitopatogênica Erwinia amylovora (Lindow & Leveau, 2002). A utilização dessa tecnologia reduz a necessidade de aplicações contínuas de agroquímicos. Outro exemplo, também aplicado na agricultura de clima temperado, é a utilização de bactérias epifíticas (ice- bactéria) que competem com bactérias nucleadoras de gelo (ice+ bactéria), evitando que as últimas incitem na planta hospedeira injúrias por baixas temperaturas (Lindow & Leveau, 2002). As bactérias epifíticas nucleadoras de gelo, como a Pseudomonas syringae, apresentam um alto valor biotecnológico, sendo utilizadas para produção artificial de neve, e são potencialmente aplicáveis em indústrias de alimentos e na climatologia objetivando aumento da pluviosidade e controle das chuvas de granizo (Drainas et al., 1995). Outro tipo de bactérias epifíticas que potencialmente podem ser empregadas na biotecnologia são as produtoras de biosurfactantes, que alteram a permeabilidade da superfície foliar, visando obter um ambiente mais úmido e propício ao desenvolvimento microbiano (Boureau et al., 2004; Schreiber et al., 2005). O estudo de bactérias epifíticas também é essencial para a sanidade alimentar, uma vez que diversas enfermidades que afetam os seres humanos são decorrentes da ingestão de frutas e verduras contaminadas superficialmente por bactérias. Albrecht et al. (1995) verificaram que amostras de alface, tomate, brócolis e couve-flor coletados em um mercado local apresentavam coliformes a 105 – 107 UFC por grama do produto. Brandl & Mandrell (2002) relataram a capacidade de Salmonella enterica persistir no filoplano de coentro (Coriandrum sativum L.). Rayner et al. (2004) confirmaram a prevalência de bactérias crescendo como biofilmes na superfície de alimentos frescos, como tomate, cenoura e cogumelos, logo, apresentando uma maior resistência aos processos de desinfecção e representando uma real preocupação para as indústrias de alimentos (Poulsen, 1999; Kumar & Anand, 1998). 2.7. Anatomia vegetal e microscopia aplicada ao estudo das interações entre plantas e bactérias A anatomia vegetal é o ramo da botânica que estuda a estrutura interna dos organismos vegetais (Esau, 1974; Cutter, 1986; Fahn, 1990; Appezzato-da-Glória & Carmello-Guerreiro, 2003), podendo ser uma ciência apenas descritiva, como também geradora de valiosas informações sobre o desenvolvimento vegetal e sobre as associações da planta com os fatores bióticos e abióticos. Logo, a anatomia vegetal, pode ser aplicada em diversos estudos, como, por exemplo, na taxonomia e sistemática. Os caracteres anatômicos podem se constituir em bons parâmetros taxonômicos, tanto pelo seu valor diagnóstico como unificador, dependendo do táxon analisado (Solereder, 1908; Metcalfe & Chalk, 1950). São muitos os trabalhos na literatura, que utilizam a anatomia como base para identificação de diversas famílias de plantas, como se verifica nos trabalhos mais recentes descritos para as Asteraceae (Sajo & Menezes, 1994; Castro et al., 1997), Eriocaulaceae (Castro & Menezes, 1995; Scatena et al., 1999; Coan et al., 2002), Lauraceae (Moraes & Paoli, 1999), Leguminosae (Mendes & Paviani, 1997), Orchidaceae (Oliveira & Sajo, 2001; Zanega-Godoy & Costa, 2003), Rubiaceae (Mantovani et al., 1995; Klein et al., 2004; Moraes, 2005); Simaroubaceae (Franceschinelli & Yamamoto, 1993), Xyridaceae (Sajo et al., 1995), entre outros. Além da identificação e descrição das espécies vegetais, a anatomia vegetal, aliada às técnicas microscópicas, pode ser utilizada de forma promissora para compreender as interações entre plantas e microrganismos. Diferente dos métodos de isolamento, que apenas geram evidências indiretas da presença de bactérias no interior das plantas, a microscopia pode ser considerada um método direto no estudo da interação entre plantas e microbiota, pois o microrganismo é visualizado em seu habitat natural. Geram-se informações sobre a quantidade, localização e dinâmica das bactérias nos microecosistemas vegetais, bem como a possibilidade de caracterizar a anatomia e ultraestrutura da associação bactéria-planta. Segundo Reinhold-Hurek & Hurek (1998), os melhores resultados microscópicos para caracterizar a interação endofítica são obtidos utilizando materiais embebidos em resina, nos quais as bactérias são fisicamente fixadas em sua posição original. Atualmente, com o avanço das técnicas imunológicas e de biologia molecular, há a possibilidade do microscópio gerar informações mais completas que a simples localização das bactérias no tecido vegetal, e envolvem o posicionamento taxonômico da bactéria in situ, detecção específica de uma estirpe ou da expressão de genes e biomacromoléculas envolvidas na interação endófito-planta (Baldani et al., 1998). 3. Objetivos 3.1. Objetivo geral O presente trabalho teve como objetivo caracterizar estruturalmente a associação natural epifítica e endofítica entre microrganismos e plantas de diferentes famílias botânicas, localizadas em um ambiente agrícola tropical. 3.2. Objetivos específicos - Descrever os locais preferenciais de colonização e distribuição de microrganismos associadas à superfície de raízes e da lâmina foliar de diferentes espécies de plantas. - Descrever a estrutura da associação endofítica entre microrganimos e os tecidos da raiz e da lâmina foliar de diferentes espécies de plantas. - Relacionar características anatômicas da lâmina foliar de diferentes espécies de plantas com o padrão de colonização, freqüência e ocorrência das bactérias. 4. Material e Métodos 4.1. Caracterização agroecológica do local de coleta As amostras foram coletadas na propriedade rural Pedra Lisa, localizada às margens da rodovia Alegre – Cachoeiro do Itapemirim (BR 482), município de Jerônimo Monteiro, ES (Fig.1), em Junho de 2004. Este município está situado na região sul do Estado do Espírito Santo a 20º 47’25’’ de latitude sul e 41º23’48’’ de longitude oeste, distando 147 km da capital Vitória. O clima da região segundo a classificação de Köppen é Aw, quente e chuvoso, sem estação fria e com período seco. A precipitação média anual é de 958,7 mm, apresentando uma estação chuvosa de Novembro a Abril e uma estação seca de Maio a Setembro. A temperatura média anual é de 23,2 ºC, sendo a média dos meses mais quentes, de Dezembro a Março, de 30 ºC, e a dos meses mais frios, de Junho a Agosto, de 18,1 ºC. Predominam, no município, os solos classificados como Latossolos Vermelho-Amarelos Distróficos, com fertilidade variando de baixa a média e pH em torno de 5,0 (ES/SAEP, 1993; EMBRAPA, 1999). A gênese dos solos nessa região também resulta, em alguns casos, na formação de outras classes de solos, principalmente através de cortes originados nos topos e encostas, pela ação do intemperismo, seguido de deposições. As deposições podem ocorrer nos fundos dos vales e sofrerem influência do lençol freático, originando solos Hidromórficos ou então serem depositados em áreas planas nas margens de rios ou córregos, ou ainda, formarem solos mais férteis, denominados “terraços” que podem originar a classe dos Argissolos como os Argissolos Vermelho-Amarelos Eutróficos (EMBRAPA, 1999). A região era originalmente coberta por Floresta Atlântica (Ombrófila Densa), tendo sido no século XIX, devastada para implantação de atividades agropecuárias, destacando-se a cafeicultura, pecuária e atualmente a fruticultura (Ambiente Brasil, 2004). A propriedade rural possui 497.557 m2 e é classificada como uma pequena empresa rural, sendo manejada pelos proprietários, juntamente com parceiros e trabalhadores sazonais, como a maioria das propriedades da região. Figura 1. Mapa do Estado do Espírito Santo, destacando o município de Jerônimo Monteiro, adaptado de GuiaNet (2005). Jerônimo Monteiro 4.1.1. Caracterização dos diferentes agroecossistemas As amostras foram coletadas de plantas cultivadas nos agroecossistemas: pomar, horta, encosta, pastagem, campos (milharal, cafezal), e também de plantas nativas (Tabela 3). Ressalta-se que não houve aplicação de agrotóxicos. O pomar foi implantado em solos de terraço, Argissolo Vermelho-Amarelo Eutrófico, realização de aplicação esporádica de adubos químicos e esterco, manejo de plantas concorrentes através de capinas, realização de poda quando necessário, relevo plano. Na horta, os canteiros foram construídos em Argissolo Vermelho-Amarelo Eutrófico, mantidos na capacidade de campo, realização de aplicação de esterco e palha de café, rotação de culturas, manejo de plantas concorrentes através de capina e catação, relevo plano. A encosta apresentava solo classificado como Latossolo Vermelho-Amarelo Distrófico, realização do preparo do solo para a implantação da cultura de eucalipto (abertura de covas, calagem, adubação química, controle de formigas), relevo íngreme. A pastagem nativa de capim pernambuco (Paspalum mandiocanum) foi substituída por capim braquiarão (Brachiaria brizantha) e colonião (Panicum maximum), presença esporádica de capim braquiaria (Brachiaria decumbens), capim jaraguá (Hyparrhenia rufa) e capim elefante (Pennisetum purpureum). Solos classificados como Argissolo Vermelho-Amarelo Eutrófico na parte mais baixa do terreno e Latossolo Vermelho-Amarelo Distrófico nas encostas e nos morros. O único manejo é a limpeza dos pastos. Lotação em torno de 5 a 10 unidades animal (gado) por hectare. O milharal foi implantado em Argissolo Vermelho-Amarelo Eutrófico, preparo do solo realizado apenas com grade aradora. Rotacionado com a cultura do feijão e consorciado com a cultura de abóbora. Aplicação de sulfato de amônio quando necessário. O cafezal foi implantado em Argissolo Vermelho-Amarelo Eutrófico. Cafeeiro conillon adulto, produção aproximada de 15 a 20 L de café cereja por planta. Poda de condução, 4 - 6 hastes por planta (multicaule). Realização de calagem, adubação química (NPK 25-05-20, contendo B e Zn) no início da estação chuvosa, retorno da palhada. 4.2. Material botânico Foram coletadas amostras de raízes e parte aérea de quarenta e sete espécies vegetais sem sintomas visíveis de doenças, pertencentes a vinte e oito famílias botânicas e identificadas conforme a tabela 3. As amostras foram retiradas de raízes com coloração clara, localizadas na profundidade entre 0 a 10 cm da superfície do solo. Para coleta da parte aérea, amostras do terço médio da lâmina foliar foram retiradas de folhas completamente expandidas localizadas no terceiro ou quarto nó. Durante a coleta, as amostras foram imediatamente seccionadas em segmentos de 1 a 2 cm de comprimento (raízes e lâmina foliar) por 0,5 a 1 cm de largura (lâmina foliar). As secções foram obtidas utilizando uma navalha de aço nova, através de cortes a mão livre sobre uma placa de parafina, estando as amostras imersas na solução fixadora. O fixador primário utilizado foi uma solução de glutaraldeído 2,5 %, formaldeído 4 %, em tampão fosfato 0,1 mol / L (pH 7,0). As amostras fixadas foram transportadas para o Laboratório de Biologia Celular e Tecidual do Centro de Biociências e Biotecnologia – UENF e foram mantidas a 4 ºC. Tabela 3. Descrição das espécies botânicas coletadas para análise de colonização microbiana. Família Botânica Nome Científico (nome vulgar) Observações durante a coleta Anacardiaceae Spondias mombin L. (cajazeiro) Arbórea, 3 m de altura, presença de frutos, cultivada no pomar Mangifera indica L. (mangueira haden) Arbórea, 2,5 m de altura, fase vegetativa, cultivada no pomar Annonaceae Annona muricato L. (graviola) Arbórea, 3,0 m de altura, presença de frutos, cultivada no pomar Apiaceae Petroselium crispum Hill (salsinha) Herbácea, 0,3 m de altura, cultivada na horta Arecaceae Cocos nucifera L. var. anã Arbórea, 2,0 m de altura, presença de (coqueiro anão) frutos, cultivada no pomar Colocasia antiquorum Schott. (taioba) Herbácea, 0,5 m de altura, fase vegetativa, cultivada no pomar Asteraceae Bidens pilosa L. (picão) Herbácea, 1,0 m de altura, presença de botões florais, nativa Chicorium intybus L. (almeirão roxo) Herbácea, 0,3 m de altura, fase vegetativa, cultivada na horta Lactuca sativa L. (alface americana) Herbácea, 0,3 m de altura, fase vegetativa, cultivada na horta Porophyllum ruderale (Jacq.) Cass. Arbustiva, 1,5 m de altura, fase Balsaminaceae Brassicaceae Caricaceae (arnica) vegetativa, nativa Impatiens walleriana L. Herbácea, 0,5 m de altura, fase (maria-sem-vergonha) vegetativa, planta ornamental Brassica oleraceae L. Herbácea, 0,3 m de altura, fase (couve manteiga) vegetativa, cultivada na horta Carica papaya L. (mamoeiro papaya) Arbustiva, 2,0 m de altura, fase vegetativa, cultivada na horta Crassulaceae Kalanchoë brasiliensis Camb. (saião) Herbácea, 0,5 m de altura, fase vegetativa, nativa Cucurbitaceae Cucumis sativus L. (pepino) Herbácea, 1,0 m de altura, presença de frutos, cultivada na horta Curcubita moschata (abóbora jacaré) Duchesne Herbácea, 0,5 m de altura, fase vegetativa, consorciada com milho Continuação da Tabela 3. Euphorbiaceae Fabaceae Lamiaceae Manihot esculenta Crantz Arbustiva, 1,5 m de altura, presença (mandioca cacau) de botões florais, horta Cajanus cajan (L.) Millsp. Herbácea, 1,0 m de altura, fase (feijão-guandu) vegetativa, nativa Leonurus sibiricus L. (macaé) Herbácea, 1,0 m de altura, fase vegetativa, nativa Plectranthus barbatus Andrews (boldo) Herbácea, 1,0 m de altura, fase vegetativa, nativa Liliaceae Allium schoenoprasum L. (cebolinha) Herbácea, 0,4 m de altura, fase vegetativa, cultivada na horta Malvaceae Abelmoschus esculentus (L.) Moench Herbácea, 1,5 m de altura, presença (quiabo) de frutos, localizada no pomar Hibiscus rosa-sinensis L. (hibisco) Arbórea, 2,0 m de altura, presença de flores, planta ornamental Malpighiaceae Malpighia glabra L. (acerola) Arbustiva, 2,0 m de altura, presença de frutos, cultivada no pomar Meliaceae Cedrela fissilis Vell. (cedro) Arbórea, 3,0 m de altura, fase de altura, fase vegetativa, nativa Myrtaceae Myrciaria cauliflora Berg. Arbórea, 1,5 m (jabuticabeira) vegetativa, cultivada no pomar Corymbia citriodora (Hook) Arbórea, (eucalipto citriodora) vegetativa, cultivada na encosta Psidium guajava L. (goiabeira) Arbórea, 2,0 m de altura, presença de 3,5 m de altura, fase frutos, cultivada no pomar Moraceae Morus nigra L. (amoreira) Arbustiva, 2,5 m de altura, fase vegetativa, localizada no pomar Musaceae Musa sp. cv nanica (bananeira nanica) Arbórea, 2,0 m de altura, presença de frutos, cultivada no pomar Oxalidaceae Averrhoa carambola L. (carambola) Arbórea, 1,5 m de altura, fase vegetativa, cultivada no pomar Poaceae Brachiaria brizantha (Hochst.) Staff Herbácea, 0,3 m de altura, fase (capim braquiarão) vegetativa, pastagem Brachiaria decumbens Staff Herbácea, 0,3 m de altura, fase (capim braquiaria) vegetativa, pastagem Hyparrhenia rufa (Nees.) Stapf Herbácea, 1,5 m de altura, fase (capim jaraguá) vegetativa, pastagem Panicum maximum Jacq. Herbácea, 0,3 m de altura, fase (capim colonião) vegetativa, pastagem Pennisetum purpureum Schumach Herbácea, 0,5 m de altura, fase (capim elefante) vegetativa, pastagem Continuação da Tabela 3. Rubiaceae Rutaceae Zea mayz L. var. palha roxa Herbácea, 1,5 m de altura, presença (milho palha roxa) de flores, milharal Coffea canephora Pierre var. conillon Arbustiva, 1,5 m de altura, fase (cafeeiro conillon) vegetativa, cafezal Citrus aurantifolia Swingle var. taiti Arbórea, 2,0 m de altura, presença de (limoeiro taiti) frutos, cultivada no pomar Citrus limonia Osbeck (limoeiro cravo) Arbórea, 1,5 m de altura, fase vegetativa, cultivada na encosta Solanaceae Citrus reticulata Blanco Arbórea, 1,5 m de altura, fase (tangerina poncã) vegetativa, cultivada no pomar Citrus sinensis L. Osbeck Arbórea, 2,5 m de altura, presença de (laranjeira pêra) frutos, cultivada no pomar Capsicum annum L. (pimentão) Herbácea, 0,15 m de altura, fase vegetativa, cultivada na horta Capsicum frutescens L. Arbustiva, 1,0 m de altura, presença (pimenta malagueta) de frutos, nativa Solanum gilo Raddi (jiló) Arbustiva, 1,5 m de altura, presença de frutos, pomar Verbenaceae Duranta repens L. (pingo-de-ouro) Arbustiva, 1,0 m de altura, fase vegetativa, planta ornamental Vitaceae Vitis vinifera L. (videira) Arbórea, 1,5 m de altura, presença de frutos, cultivada no pomar 4.3. Processamento de amostras para microscopia ótica As amostras foram processadas para microscopia ótica conforme James et al. (1994), com algumas modificações. Uma parte do material fixado foi transferida para microtubos de 2,0 mL e pós-fixado com tetróxido de ósmio 1 % em tampão fosfato 0,1 mol / L por 2 horas. As amostras foram lavadas 2 vezes por 15 minutos em tampão fosfato 0,1 mol / L e desidratadas em série etanólica ou acetônica crescente (30, 50, 70, 90, 3 x 100 % etanol ou acetona em água v/v), permanecendo 30 minutos em cada mistura. Após a desidratação as amostras foram embebidas em resina Unicryl ®, durante 7 dias, sendo mantidas em geladeira. Para as amostras das espécies Mangifera indica, Manihot esculenta, Plectranthus barbatus, Hibiscus rosa-sinensis, Malpighia glabra, Cedrela fissilis, Corymbia citriodora, Psidium guajava, Averrhoa carambola, Cocos nucifera, Hyparrhenia rufa, Panicum maximum, Coffea canephora, Citrus aurantifolia, Citrus reticulata, Citrus sinensis e Duranta repens, foi necessário substituir o álcool ou acetona gradualmente pela resina. Amostras individuais foram transferidas com pinça de ponta fina para cápsulas transparentes de gelatina contendo a resina e polimerizadas em estufa a 60º C por 12 horas. As cápsulas polimerizadas foram selecionadas, levadas à lupa do ultramicrótomo Reichert Ultracuts Ultramicrotome, lapidadas a mão livre utilizando lâminas de aço para obtenção de blocos trapezoidais contendo a amostra. A partir desses blocos foram obtidas seções semifinas (0,8 a 1,0 µm) utilizando facas de vidro. Os cortes semifinos foram colocados sobre lâminas de vidro contendo água, fixados em placa metálica aquecida e contrastadas com uma solução contendo azul de toluidina 1 %, tetraborato de sódio 0,1 % em água destilada, para observação no microscópio ótico Axioplan - Zeiss. As imagens foram capturadas em um microscópio ótico Axioplan – Zeiss, acoplado a um sistema de aquisição de imagem digital, câmera ZVS-47EC, utilizando o programa Analysis®. 4.4. Processamento de amostras para microscopia eletrônica de varredura As amostras foram processadas para microscopia eletrônica de varredura conforme James et al. (1994), com algumas modificações. Amostras de raízes e das lâminas foliares foram fixadas e pós-fixadas da mesma forma como descrito no item 4.3. Depois, foram lavadas por três vezes em tampão fosfato 0,1 mol / L e desidratadas em série acetônica crescente (30, 50, 70, 90, 3 x 100 % etanol ou acetona em água v/v), permanecendo 30 minutos em cada mistura. Em seguida, amostras selecionadas foram transferidas para o equipamento Critical Point Drying Apparatus (Mod CPD 030, Bal-tec) e após secagem, foram montadas em “stub” de alumínio e metalizadas com ouro utilizando o Automatic Sputter Coater (SCD 050, Bal-tec). As amostras foram observadas a 15 - 25 kv, no microscópio eletrônico de varredura DSEM 962 - Zeiss. Para cada amostra foliar foram observados fragmentos de 0,5 cm de largura por 1,0 cm de comprimento das superfícies adaxiais e abaxiais. As observações foram realizadas por toda superfície das amostras, gerando dados sobre ocorrência, freqüência e localização das bactérias sobre os diversos caracteres anatômicos foliares, assim como o modo de adesão, agregação e morfologia bacteriana. 5. Resultados Em todas as espécies vegetais coletadas, isentas de sintomas de doença, foi observada colonização microbiana. Dentre os microrganismos, as bactérias foram os colonizadores mais freqüentes, sendo observadas na superfície de todas as amostras das lâminas foliares. Fungos também foram observados no filoplano na forma de esporos e hifas fúngicas e nas raízes em associações micorrízicas. A colonização bacteriana variou entre as famílias botânicas, entre as espécies vegetais pertencentes ao mesmo táxon, entre os órgãos estudados (raiz, folha) de um mesmo sistema biológico e entre os tecidos vegetais de um mesmo órgão. A variação também ocorreu entre e dentro dos diferentes agroecossistemas (pomar, horta, encosta, pastagem, campos). No entanto, com relação à colonização e estabelecimento bacteriano epifítico no filoplano algumas semelhanças puderam ser constatadas, conforme será descrito. 5.1. Bactérias epifíticas nas amostras da lâmina foliar Através da microscopia ótica e microscopia eletrônica de varredura foi visualizado colonização bacteriana epifítica em todas as amostras das lâminas foliares. O sumário dos resultados obtidos através da microscopia eletrônica de varredura foram baseados em características microbiológicas da superfície abaxial, acrescentando-se as comparações realizadas entre ambas superfícies (Tab. 4 e 5), e em características anatômicas das lâmina foliares (Tab. 6 e 7). Foi possível separar dois grupos de plantas que apresentaram características distintas, um com uma baixa freqüência de bactérias colonizando o filoplano (Tab. 4 e 6) e outro com uma alta freqüência (Tab. 5 e 7). A separação desses dois grupos foi obtida observando-se toda superfície epidérmica foliar (de no mínimo 50.000.000 µm2 cada amostra adaxial e abaxial) através do microscópio eletrônico de varredura com aumento de 3000 x. Tabela 4. Características microbiológicas do filoplano das espécies vegetais com baixa freqüência de bactérias. Família botânica Fungo(4) Comparação com a superfície epidérmica adaxial Bactéria Espécie vegetal (1) Localização Apiaceae Petroselium crispum Araceae Colocasia antiquorum Arecaceae Asteraceae (2) Distribuição (3) Forma F, Ce S, M Ba + Similar - - - + M, F, Ba Cocos nucifera F, Ce S, M Ba + inclui F, N, S Chicorium intybus F, Ce S Ba + bactéria não observada F S Ba - Inclui M e T F, T S, M Ba + Similar F, Ce S Ba ++ Similar Lactuca sativa Porophyllum ruderale Balsaminaceae Impatiens walleriana Brassicaceae Brassica oleraceae F S Ba ++ bactéria não observada Caricaceae Carica papaya F S Ba + inclui M Crassulaceae Kalanchoë brasiliensis F S Ba - F, T, N S, M Ba - Euphorbiaceae Manihot esculenta bactéria não observada similar, inclui Co bactéria não observada bactéria não observada Liliaceae Allium schoenoprasum - - Ba + Myrtaceae Myrciaria cauliflora F S Ba +++ Musaceae Musa sp. F S Ba +++ Similar Oxalidaceae Averrhoa carambola F S Ba + bactéria não observada Poaceae Brachiaria brizantha Ce, T S, M Ba, Co + Inclui F F, T S, M Ba + somente F Hyparrhenia rufa F S Ba ++ Panicum maximum F S Ba + F, T S, M Ba, Co + F S Ba + inclui T F, Ce S Ba + Similar T S Ba ++ inclui F, M Brachiaria decumbens Pennisetum purpureum Zea mayz Solanaceae Capsicum annum Verbenaceae Duranta repens (1) bactéria não observada bactéria não observada bactéria não observada Localização: refere-se aos locais preferenciais de colonização bacteriana; F, flanges cuticulares; T, tricomas; Ce, complexo estomático; N, nervura. (2) Distribuição: distribuição das células bacterianas; S, solitárias; M, microcolônias; B, biofilmes. (3) Forma: forma da célula bacteriana; Ba, bastonete; Co, cocos. (4) Fungo: refere-se à freqüência fúngica; +++, alta freqüência; ++, média freqüência; +, baixa freqüência; -, ausente. Tabela 5. Características microbiológicas do filoplano das espécies vegetais com alta freqüência de bactérias. Família botânica Bactéria Espécie vegetal Fungo Localização(1) Anacardiaceae Spondias mombin Todos os locais Distribuição(2) Forma(3) (4) Comparação com a superfície epidérmica adaxial S, M, B Ba +++ similar S, M Ba +++ similar Ba +++ S e M em baixa frequência Mangifera indica F Annonaceae Annona muricata Todos os locais Asteraceae Bidens pilosa Todos os locais S, M Ba, Co + similar Cucurbitaceae Cucumis sativus F, T S, M Ba + similar Cucurbita moschata F, T, N S, M Ba +++ similar Fabaceae Cajanus cajan F, T, Ce S, M, B Ba - similar Lamiaceae Leonurus sibiricus Todos os locais S, M, B Ba + Plectranthus babatus Todos os locais S, M Ba + F, T, Ce S, M, B Ba + similar F, T S, M Ba + similar F, Ce, N S, M Ba ++ similar Ba, Co +++ similar Malvaceae Abelmoschus esculentus Hibiscus rosa-sinensis Malpighiaceae Malpighia glabra Meliaceae Cedrela fissilis Myrtaceae Corymbia citriodora Todos os locais M, B S, M, B baixa frequência baixa frequência F S, M Ba +++ inclui F, M, B Psidium guajava F, T, N S, M Ba, Co +++ similar Moraceae Morus nigra F, T, N S, M, B Ba +++ similar Rubiaceae Coffea canephora F, Ce S, M Ba, Co ++ similar Rutaceae Citrus aurantifolia F, Ce, N S, M, B Ba, Co ++ inclui B F, Ce S, M Ba +++ similar Citrus reticulata F M, B Ba +++ similar Citrus sinensis F, Ce S, M Ba +++ similar F, T S, M Ba +++ similar Solanum gilo T S Ba ++ inclui M, F Vitis vinifera F, Ce S Ba ++ inclui M Citrus limonia Solanaceae Vitaceae (1) Citrus frutescens Localização: refere-se aos locais preferenciais de colonização bacteriana; F, flanges cuticulares; T, tricomas; Ce, complexo estomático; N, nervura. (2) Distribuição: distribuição das células bacterianas; S, solitárias; M, microcolônias; B, biofilmes. (3) Forma: forma da célula bacteriana; Ba, bastonete; Co, coco. (4) Fungo: refere-se a freqüência fúngica; +++, alta freqüência; ++, média freqüência; +, baixa freqüência; -, ausente. Tabela 6. Características anatômicas foliares das espécies vegetais com baixa freqüência de bactérias. Epiderme Família botânica Espécie vegetal Contor(1) no Cera epicuticu(2) lar Indumento(3) Mesofilo Célula especia(4) lizada Estômato (5) (6) Forma Tecido vascular Tipo de (7) feixe Apiaceae Petroselium crispum Si - - - Anf Do Co Araceae Colocasia antiquorum R - - - Hip Do Co Arecaceae Cocos nucifera R + - - Hip Do Co Asteraceae Chicorium intybus Si plaquetas - - Anf Do Co Lactuca sativa Si - Tt, Ts - Anf Ho Co Porophyllum ruderale Si - Tt, Ts - Anf Do Co Balsaminaceae Impatiens walleriana Si - - - Hip Do Co Brassicaceae Brassica oleraceae R - - - Anf Do Co Caricaceae Carica papaya R plaquetas em rosetas - - Hip Do Co Crassulaceae Kalanchoë brasiliensis R - - - Hip Ho nd Euphorbiaceae Manihot esculenta R + em Eb Tt na nervura e Ts no limbo - Anf Do Co Liliaceae Allium schoenoprasum R plaquetas - - Anf Ho nd Myrtaceae Myrciaria cauliflora R - - - Hip nd nd Musaceae Musa sp. R + - Anf Do Co - Hip nd nd Oxalidaceae Averrhoa carambola R plaquetas Tt na nervura de Ed e Tt e Ts em Eb Poaceae Brachiaria brizantha R - Tt Cb, Cs Anf Ho Co Brachiaria decumbens R - Tt Cb, Cs Anf Ho Co Hyparrhenia rufa R + Tt Cb, Cs Anf Ho Co Panicum maximum R - Tt Cb, Cs Anf Ho Co Pennisetum purpureum R - Tt Cb, Cs Anf Ho Co Zea mayz R - - Cb, Cs Anf Ho Co Solanaceae Capsicum annum Si - - - Anf Do Co Verbenaceae Duranta repens R - Tt, Ts - nd Do (1) Co (2) Contorno: contorno das paredes anticlinais das células epidérmicas; R, reto; Si, sinuoso. Cera epicuticular: tipo de cera epicuticular; plaquetas; plaquetas em rosetas; +, cera epicuticular diferente de filme, porém não nomeada; -, cera epicuticular tipo filme ou ausente. (3) Indumento: Tt, tricoma tector; Ts, tricoma secretor. (4) Célula especializada: Cs, célula silicosa, Cb, célula buliforme. (5) Estômato: localização do complexo estomático; Anf, anfiestomático; Hip, hipoestomático. (6) Forma: forma do mesofilo: Do, dorsiventral; Ho, homogêneo. (7) Tipo de feixe: Co, colateral. Abreviações: Ed, epiderme adaxial; Eb, epiderme abaxial; nd, não disponível. Tabela 7. Características anatômicas foliares das espécies vegetais com alta freqüência de bactérias. Epiderme Família botânica Espécie vegetal Contorno(1) Spondias mombin R Mangifera indica R Annonaceae Annona muricata R Asteraceae Bidens pilosa Si Anacardiaceae Cucurbitaceae Cera epicuticular (2) Indumento(3) + - Célula especial -lizada(4) Tt, Ts (6) Forma Tipo de feixe(7) Do Co Hip Is Co Hip Do Co - Anf Do Co - Anf Do Co - Anf Do nd - Tt e Ts em Eb Tt, Ts (muito na N) Tt, Ts (muito na N) Estômato(5) Tecido vascular Anf (em Ed na N) - - Mesofilo - Cucumis sativus nd - Cucurbita moschata R - Fabaceae Cajanus cajan R - Tt, Ts - Hip Do Co Lamiaceae L.eonurus sibiricus Si - Tt, Ts - Hip Do Co Plectrnthus babatus nd - Tt, Ts - Hip Do Co Abelmoschus esculentus Hibiscus rosasinensis R - Tt, Ts Cm Anf Do Co R - Ts Cm Hip Do Co Malpighia glabra R - - - Hip Do Co Hip Do nd Malvaceae Malpighiaceae Meliaceae Cedrela fissilis R Myrtaceae Corymbia citriodora R - - - Anf Ho Ac, Co Psidium guajava R - Tt (em Ed só na N) - Hip Ho Ac Moraceae Morus nigra R Cm Hip Ho Co Rubiaceae Coffea canephora R - - - Hip nd nd Rutaceae Citrus aurantifolia R - - Cm Anf Do Ac, Co Citrus limonia R - - Cm Anf Do Co Citrus reticulata R - - Cm Hip Do Co Citrus sinensis R - - Cm Hip Do Co Citrus frutescens Si - Tt na N e Ts no limbo - Anf Do Ac, Co Solanum gilo Si - Tt, Ts - Anf Do Ac, Co Vitis vinifera R - Tt - Hip Do Solanaceae Vitaceae (1) - Tt, Ts (Ts em Eb) - Tt, Ts - Co (2) Contorno: contorno das paredes anticlinais das células epidérmicas; R, reto; Si, sinuoso. Cera epicuticular: tipo de cera epicuticular; +, cera epicuticular diferente de filme, porém não nomeada; -, cera epicuticular tipo filme ou ausente. (3) Indumento: Tt, tricoma tector; Ts, tricoma secretor. (4) Célula especializada: Cm, célula mucilaginosa epidérmica ou sub-epidérmica. (5) Estômato: localização do complexo estomático; Anf, anfiestomático; Hip, hipoestomático. (6) Forma: forma do mesofilo: Do, dorsiventral; Is, isobilateral; Ho, homogêneo. (7) Tipo de feixe: Co, colateral; Ac, anficrival. Abreviações: Ed, epiderme adaxial; Eb, epiderme abaxial; N, nervura; nd, não disponível. Apesar das variações estruturais e microbiológicas existentes entre, e mesmo dentro, desses dois grupos de plantas, semelhanças e padrões no estabelecimento bacteriano epifítico no filoplano puderam ser constatadas. Na superfície foliar de todas as espécies vegetais estudadas houve o predomínio de bactérias no formato de bastonete (Fig. 2A e B), seguido por 17 % das espécies vegetais colonizadas também por bactérias no formato de cocos (Fig. 3D) (Tab. 4 e 5). As bactérias epifíticas estavam aderidas à superfície foliar por adesão apolar (Fig. 2A e B), ou seja, paralela à superfície (Olivares, 1997). As bactérias epifíticas se apresentavam distribuídas pelo filoplano como células solitárias (Fig. 2A e B), ou formando microcolônias (Fig. 2C e D), ou estruturadas em biofilmes (Fig. 2E e F). Foram classificados como microcolônias, o conjunto de células espacialmente próximas, porém, não necessariamente, recobertas por uma matriz extracelular comum. As microcolônias variaram bastante quanto ao número de células presentes, estando na mesma classificação microcolônias mais populosas, como em Capsicum frutescens (Fig. 2C e D) e microcolônias menos populosas, como em Leonurus sibiricus (Fig. 3C). Apesar de algumas microcolônias não se apresentarem totalmente recobertas por uma matriz extracelular comum, as bactérias, muitas vezes, estavam em contato uma com as outras, e aderidas à parede periclinal externa das células e de apêndices epidérmicos, através de microfibrilas, como observado em Abelmoschus esculentus (Fig. 3A) e Brachiaria decumbens (Fig. 8A). Ressalta-se que a presença de uma matriz extracelular recobrindo as bactérias, ao invés de apenas microfibrilas, foi mais freqüente em microcolônias mais populosas. Foram classificados como biofilmes, populações microbianas numerosas, cobertas por uma matriz extracelular comum, com bactérias aderidas umas as outras e a superfície vegetal. As bactérias estruturadas em biofilmes foram visualizadas apenas nas plantas pertencentes ao grupo com maior freqüência de bactérias (Tab. 5), como, por exemplo, em Spondias mombin (Fig. 2E e F), Cucumis sativus (Fig. 7A), Cucurbita moschata (Fig. 6A), Leonurus sibiricus (Fig. 7C - E), Citrus aurantifolia (Fig. 9D, E), Citrus reticulata (Fig. 9A - C) e Citrus frutescens (Fig. 5A, B), enquanto no grupo de plantas com baixa freqüência de bactérias, células solitárias e microcolônias foram predominantes (Tab. 4). A maioria dos biofilmes estava localizada sobre a parede periclinal externa das células epidérmicas propriamente ditas, sendo formados por associações entre fungos e bactérias. Biofilme exclusivamente bacteriano também foi visualizado na base do tricoma secretor de Leonurus sibiricus (Fig. 7C - E). Em Citrus reticulata (Fig. 9A), os biofilmes foram formados sempre em locais onde hifas fúngicas estavam presentes, não sendo encontrado biofilme exclusivamente bacteriano. Com o auxílio da microscopia ótica e microscopia eletrônica de varredura, foi constatado que as bactérias epifíticas não se distribuem aleatoriamente no filoplano, existem locais preferenciais de estabelecimento e colonização microbiana que estão diretamente relacionados às características anatômicas foliares da planta hospedeira. As características micromorfológicas e anatômicas das lâminas foliares observadas no presente estudo foram: contorno das paredes anticlinais das células epidérmicas (reto ou sinuoso), tipo de cera epicuticular (classificada conforme Barthlott et al., 1998), presença de tricomas tectores e tricomas secretores, presença de células especializadas da epiderme (ex: silicosas, buliformes, mucilaginosas), localização dos estômatos na lâmina foliar (folha anfiestomática, hipoestomática e epiestomática), forma do mesofilo (dorsiventral, isobilateral, homogêneo), tipo de feixe vascular (colateral, bicolateral, anficrival, anfivasal) (Tabelas 6 e 7). As bactérias não estavam distribuídas homogeneamente no filoplano. A topografia foliar apresentava locais preferenciais de estabelecimento bacteriano, que incluiam as flanges cuticulares (Fig. 3A - D), os complexos estomáticos (Fig. 4A - D), as nervuras (Fig. 5A - F), os tricomas tectores (Fig. 6A - F) e os tricomas secretores (Fig. 7A - H). Em todas as amostras foliares foram visualizadas, em microscopia eletrônica de varredura, bactérias solitárias ou em microcolônias, colonizando as flanges cuticulares. Em Abelmoschus esculentus (Fig. 3 A) pode ser observado bactérias aderidas as paredes periclinais externas de células epidérmicas adjacentes e a outras bactérias através de microfibrilas. Tanto bactérias como fungos colonizavam as flanges como observado no filoplano de Vitis vinifera (Fig. 3B). Em Leonurus sibiricus (Fig. 3C) as bactérias foram visualizadas nas flanges, cujo contorno é sinuoso. Em Psidium guajava (Fig. 3D) tanto bactérias no formato de bastonete quanto no formato de cocos habitavam as flanges, cujo contorno é reto. Os complexos estomáticos também podem ser considerados microecossistemas explorados por diferentes microrganismos, como observado em Spondias mombin (Fig. 4B) e Petroselinum crispum (Fig. 4C e D). Na epiderme abaxial de P. crispum (Fig. 4D) o estabelecimento de microrganismos, principalmente hifas fúngicas próximo ao complexo estomático foi muito mais intenso que na epiderme adaxial, onde predominou a colonização bacteriana (Fig. 4C). Em outras espécies vegetais, também anfiestomáticas, como, por exemplo, Citrus citriodora, não foi constatado comportamento diferente de colonização bacteriana entre as superfícies adaxiais e abaxiais. Na maioria das espécies hipoestomáticas, a colonização microbiana foi mais intensa na superfície foliar abaxial. De modo geral, foi observada uma maior quantidade de microrganismos colonizando as superfícies foliares abaxiais. Mediante a utilização da microscopia ótica e da microscopia eletrônica de varredura, foi verificado que as nervuras também foram locais de colonização bacteriana, sendo visualizadas bactérias solitárias como em Impatiens walleriana (Fig. 2B), em microcolônias como em Manihot esculenta (Fig. 5C), estruturadas em biofilmes como em Capsicum frutescens (Fig. 5A e B) e associadas a fungos como em Malpighia glabra (Fig. 5D). Nas espécies vegetais, que apresentavam tricomas tectores e secretores nas nervuras, foi observada abundante colonização bacteriana, como exemplificado em Cucurbita moschata (Fig. 5E e F). Os tricomas tectores também apresentavam colonização microbiana. Em Psidium guajava (Fig. 6C e D), por exemplo, uma população microbiana diversificada, composta por cocos, bastonetes e hifas fúngicas, foi encontrada na base e sobre os tricomas tectores. Em Cucurbita moschata (Fig. 6A e B) e Bidens pilosa (Fig. 6E) a base dos tricomas tectores foi o microecossistema preferencial de estabelecimento epifítico, sendo encontrado biofilmes, microcolônias e esporos fúngicos. Em outras espécies de plantas, como Morus nigra (Fig. 6F) microcolônias foram constantemente observadas próximas a tricomas tectores. Os tricomas secretores também estavam colonizados por microrganismos. Em todas as espécies vegetais que apresentavam tricomas secretores, foram visualizadas bactérias na base dos mesmos. A microscopia ótica permitiu a observação de biofilmes na base e próximos aos tricomas secretores de Cucumis sativus (Fig. 7A) e em microscopia eletrônica de varredura, foi confirmada a presença de bactérias habitando a células da cabeça e a base do tricoma secretor (Fig. 7B). Biofilmes também foram visualizados, em microscopia ótica, na base do tricoma secretor de Leonurus sibiricus (Fig. 7C), e através da microscopia eletrônica de varredura, foi confirmada a presença de bactérias cobertas por uma matriz extracelular comum, na base do tricoma (Fig. 7D e E). Em Hibiscus rosa-sinensis (Fig. 7F - H) microcolônias foram observadas na base do tricoma secretor, na flange entre a célula epidérmica propriamente dita e o tricoma. Ressalta-se que 58 % das espécies vegetais com alta freqüência bacteriana apresentavam tricomas secretores em pelo menos uma das superfícies da lâmina foliar, enquanto apenas 21 % das espécies vegetais com baixa freqüência possuíam essa característica anatômica em pelo menos uma das superfícies (Tab. 6 e 7). Apesar da amostragem empregada nesse estudo ter sido baseada em uma diversidade de famílias botânicas e não em uma variedade de espécies pertencentes a uma mesma família, semelhanças na associação bactéria-planta entre espécies pertencentes ao mesmo táxon foram observadas, como pode ser verificado nas famílias Poaceae e Rutaceae. Todas as seis espécies, Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Hyparrhenia rufa, Panicum maximum, Pennisetum purpureum, Zea mays, pertencentes à família Poacea, apresentaram baixa freqüência de bactérias e fungos, habitando as superfícies foliares abaxiais e adaxiais. As bactérias estavam presentes como células solitárias como pode ser observado em B. decumbens (Fig. 8A), ou formando microcolônias como em B. brizantha (Fig. 8C e D). Apesar da baixa freqüência de bactérias no filoplano, há uma diversidade microbiana, pois foram encontradas bactérias no formato de cocos (Fig. 8B e D) e no formato de bastonete (Fig. 8A e C) em ambas as espécies vegetais. Na superfície abaxial de B. decumbens (Fig. 8A), microfibrilas estavam presentes ancorando a bactéria na superfície foliar. Em B. brizantha (Fig. 8C) as bactérias provavelmente degradaram a cutícula presente ao redor da célula para obterem uma ancoragem mais eficiente. Em todas as espécies de plantas da família Poaceae foi visualizado células silicosas na epiderme (Tab. 6). Diferentemente da família Poaceae, a família Rutaceae apresentou uma alta freqüência de colonização microbiana nas superfícies adaxial e abaxial de todas as quatro espécies estudadas, Citrus aurantifolia, C. limonia, C. reticulata, C. sinensis. As bactérias estavam presentes como células solitárias, ou formando microcolônias, ou estruturadas em biofilmes na parede periclinal externa das células epidérmicas. Os biofilmes sempre eram compostos por hifas fúngicas e bactérias predominantemente no formato de bastonete, como pode ser visualizado no filoplano de C. reticulata (Fig. 9A, B). Através da microscopia ótica foi constatada a presença de células mucilaginosas e biofilme na lâmina foliar de C. aurantifolia (Fig. 9C). Com o auxílio da microscopia eletrônica de varredura, foi confirmada a presença de bactérias e fungos estruturados em biofilme (Fig. 9D, E). Todas as espécies de plantas pertencentes à família Rutaceae apresentavam células mucilaginosas na lâmina foliar (Tab. 6). Células mucilaginosas também estavam presentes em outras espécies vegetais com alta freqüência de bactérias como Morus nigra, Abelmoschus esculentus e Hibiscus rosa-sinensis (Tab. 6). No entanto, nas espécies de plantas com baixa freqüência de colonização microbiana não foi constatada a presença desse caracter anatômico (Tab. 7). Algumas similaridades na microbiota epifítica puderam ser verificadas em espécies vegetais pertencentes a diferentes famílias botânicas, mas que apresentavam características anatômicas semelhantes. Nas espécies vegetais Averrhoa carambola (Oxalidaceae), Chicorium intybus (Asteraceae) e Carica papaya (Caricaceae), por exemplo, que apresentaram cera epicuticular do tipo plaquetas, não foi visualizado com freqüência colonização microbiana. Em A. carambola, a cera epicuticular em plaquetas (Fig. 10A), provavelmente dificultou a colonização microbiana e foi rara a presença de bactérias e de hifas fúngicas (Fig. 10B). Em C. intybus bactérias foram visualizadas apenas onde as plaquetas (Fig. 10C) não estavam presentes, como por exemplo, no complexo estomático (Fig. 10D). Em C. papaya, ocorreu o mesmo padrão de colonização, microcolônias foram visualizadas apenas onde a cera epicuticular, plaquetas no formato de rosetas (Fig. 10E), estavam ausentes (Fig. 10F). A presença de cera epicuticular do tipo plaqueta foi mais intensa nas espécies vegetais com baixa freqüência de bactérias (Tab.6). Entre todas as características anatômicas analisadas, aquelas que não tiveram influência no padrão de distribuição das bactérias epifíticas no filoplano foram o contorno das paredes anticlinais das células epidérmicas, forma do mesofilo e tipo de feixe vascular. As demais características parecem influenciar o estabelecimento bacteriano (Tab. 6 e 7). 5.2. Fungos epifíticos nas amostras de tecidos foliares Na maioria das espécies vegetais estudadas foram observadas estruturas fúngicas na forma de esporos ou de hifas. O filoplano da nervura central de Corymbia citriodora, por exemplo, apresentou, em microscopia ótica, intensa colonização microbiana (Fig.11A), sendo confirmada, por microscopia eletrônica de varredura, a presença de estruturas fúngicas (Fig. 11B). Os fungos além de colonizarem a parede periclinal das células epidérmicas, também foram visualizados colonizando os locais preferenciais de estabelecimento bacteriano, como, por exemplo, a base dos tricomas tectores e secretores (Fig. 11C), as flanges cuticulares de Abelmoschus esculentus (Fig. 11D), a nervura central de Mangifera indica (Fig. 11E) e os complexos estomáticos de Impatiens walleriana (Fig. 11F). Ressalta-se que a alta freqüência bacteriana estava associada à alta freqüência fúngica (Tab. 6 e 7). 5.3. Microrganismos epifíticos nas amostras de tecidos radiculares A observação das amostras de raiz foi dificultada em microscopia eletrônica de varredura pela presença de material mucilaginoso, partículas de solo, e principalmente devido ao rompimento das células epidérmicas e peridérmicas. Em microscopia ótica foi visualizada, no rizoplano, a presença de material mucilaginoso de diferentes espessuras, como observado em Lactuca sativa (Fig. 12A), Chicorium intybus (Fig. 12B), Carica papaya (Fig. 12E e F) e Citrus limonia (Fig. 12G e H). Material mucilaginoso também foi observado próximo aos pêlos radiculares como, por exemplo, em Brachiaria decumbens (Fig. 12C) e Hibiscus rosa-sinensis (Fig. 12D). 5.4. Microrganismos endofíticos Nas secções transversais radiculares foram observados, com freqüência, estabelecimento fúngico endofítico na forma de associações micorrízicas, como pode ser verificado, por exemplo, no córtex das espécies Capsicum frutescens (Fig. 13A e B), Annona muricato (Fig. 13C e D), Vitis vinifera (Fig. 13E) e Brachiaria decumbens (Fig. 13F). Com o auxílio da microscopia ótica, foi constatado que a maioria das micorrizas são do tipo endomicorrizas. Em Capsicum frutescens (Fig. 13B), por exemplo, características das endomicorrizas vesicular-arbusculares puderam ser identificadas, tais como a formação de arbúsculos através da ramificação de hifas nas células do córtex e a preservação estrutural da parede celular. Colonização bacteriana endofítica não foi visualizada nas amostras de raízes e lâminas foliares estudadas. Figura 2. Microscopia eletrônica de varredura (MEV). Padrões de distribuição de bactérias epifíticas no filoplano: (A e B) solitárias, (C e D) microcolônias e (E e F) biofilmes; (A) bactérias solitárias em adesão apolar na superfície abaxial de Brachiaria brizantha (Poaceae) e (B) na nervura central de Impatiens walleriana (Balsaminaceae); (C e D) microcolônia na flange de Capsicum frutescens (Solanaceae); (E e F) bactérias e outros microrganismos estruturados em biofilme no filoplano de Spondias mombin (Anacardiaceae). Abreviações: Eb, epideme abaxial; Ce, complexo estomático; seta, bactérias; estrela, hifa fúngica. Figura 3. MEV. Flanges cuticulares, local de colonização bacteriana epifítica; (A) bactérias nas flanges da superfície adaxial da lâmina foliar de Abelmoschus esculentus (Malvaceae), presença de microfibrilas de adesão; (B) bactérias e hifa fúngica nas flanges de Vitis vinifera (Vitaceae); (C) microcolônia na flange de Leonurus sibiricus (Lamiaceae); (D) cocos e bastonetes na flange de Psidium guajava (Myrtaceae). Abreviações: Ed, epiderme adaxial; Eb, epiderme abaxial; seta fina, bactérias na forma de bastonete; seta grossa, bactérias na forma de cocos; estrela, hifa fúngica. Figura 4. Microscopia ótica (MO) (A) e MEV (B, C e D). Complexo estomático local de colonização bacteriana epifítica; (A e B) Spondias mombin (Anacardiaceae), (A) seção transversal da lâmina foliar evidenciando complexo estomático na epiderme abaxial, (B) bactérias e hifas fúngicas próximas ao complexo estomático; (C e D) Petroselinum crispum (Apiaceae), (C) microcolônia sobre o complexo estomático na epiderme adaxial, (D) agregado fúngico e bacteriano sobre o complexo estomático na epiderme abaxial. Abreviações: Pl, parênquima lacunoso; Eb, epiderme abaxial; Ed, epiderme adaxial; asterisco, complexo estomático; seta, bactéria; estrela, hifa fúngica. Figura 5. MO (A e B) e MEV (C, D, E, F). Nervura, local de colonização bacteriana epifítica; (A e B) seção transversal da lâmina foliar de Capsicum frutescens (Solanaceae) mostrando biofilme bacteriano sobre a nervura; (C) microcolônia sobre a medula de Manihot esculenta (Euphorbiaceae); (D) bactérias e fungos sobre a medula de Malpighia glabra (Malpighiaceae); (E e F) bactérias colonizando a nervura de Cucurbita moschata (Cucurbitaceae) próximo aos tricomas. Abreviações: Co, colênquima; P, parênquima; Ed, epiderme adaxial; Eb, epiderme abaxial; Tt, tricoma tector; Ts, tricoma secretor; seta, bactérias; estrela, hifa fúngica. Figura 6. MO (A) e MEV (B, C, D, E, F). Tricoma tector, local de colonização bacteriana epifítica; (A e B) Cucurbita moschata (Cucurbitaceae), (A) seção transversal da lâmina foliar evidenciando biofilme bacteriano sobre o tricoma tector, (B) detalhe do agregado bacteriano na base do tricoma tector; (C e D) Psidium guajava (Myrtaceae), (C) diversidade microbiana (cocos, bastonete, fungos) estruturada em biofilme na base do tricoma tector, (D) microcolônia sobre tricoma tector; (E) esporos fúngicos na base e bactérias sobre o tricoma tector de Bidens pilosa (Asteraceae); (F) microcolômia próximo ao tricoma tector de Morus nigra (Moraceae). Abreviações: P, parênquima; Tt, tricoma tector; Eb, epiderme abaxial; Ed, epiderme adaxial; seta preta, biofilme; seta fina, bastonete; seta grossa, cocos; estrela, hifa fúngica; triângulo, esporo fúngico. Figura 7. MO (A, C, F) e MEV (B, D, E, G, H). Tricoma secretor, local de colonização bacteriana epifítica; (A e B) Cucumis sativus (Cucurbitaceae), (A) seção transversal da lâmina foliar mostrando biofilme no filoplano próximo ao tricoma secretor, (B) colonização bacteriana sobre a cabeça e na base do tricoma secretor; (C, D, E) Leonurus sibiricus (Lamiaceae), (C) seção transversal da lâmina foliar mostrando biofilme na base do tricoma secretor, (D, E) confirmação da presença de biofilme bacteriano na base do tricoma secretor; (F, G, H) Hibiscus rosa-sinensis (Malvaceae), (F) seção transversal da lâmina foliar mostrando tricoma secretor, (G, H) microcolônia na base do tricoma secretor. Abreviações: Ts, tricoma secretor; Eb, epiderme abaxial; P, parênquima; Tt, tricoma tector; seta, bactérias. Figura 8. MEV. Poaceae, família botânica com baixa freqüência de observações bacterianas; (A e B) Brachiaria decumbens, (A) bactérias no formato de bastonete aderidas na parede periclinal externa das células epidérmicas abaxiais, presença de microfibrilas de adesão, (B) bactérias no formato de cocos aderidas na parede periclinal externa das células epidérmicas adaxiais; (C e D) epiderme abaxial de B. brizantha, (C) bactérias no formato de bastonete aderidas na superfície foliar, (D) cocos localizado no filoplano. Abreviações: Eb, epiderme abaxial; Ed, epiderme adaxial; seta fina, bastonete; seta grossa, cocos. Figura 9. MO (C) e MEV (A, B, D, E). Rutaceae, família botânica com alta freqüência de observações bacterianas; (A e B) bactérias e fungos estruturados em biofilme na epiderme abaxial de of Citrus reticulata; (C) corte transversal da lâmina foliar de C. aurantifolia evidenciando a presença de células mucilaginosas e biofilme no filoplano, (D e E) confirmação da presença de bactérias e fungos estruturados em biofilme. Abreviações: Eb, epiderme abaxial; Ed, epiderme adaxial; seta grossa, biofilme; seta fina, bactéria; estrela, hifa fúngica. Figura 10. MEV. Cera epicuticular do tipo plaquetas dificulta a colonização bacteriana no filoplano; (A e B) epiderme abaxial de Averrhoa carambola (Oxalidaceae), (A) cera epicuticular do tipo plaquetas e (B) rara presença de bactérias e hifas fúngicas sobre a superfície epicuticular; (C e D) epiderme abaxial de Chicorium intybus (Asteraceae), (C) cera epicuticular do tipo plaquetas e (D) bactérias colonizando o complexo estomático, onde as plaquetas estão ausentes; (E e F) epiderme adaxial de C. papaya (Caricaceae), (E) cera epicuticular do tipo plaquetas no formato de rosetas, (F) microcolônia localizada onde as plaquetas no formato de rosetas estão ausentes. Abreviações: Eb, epiderme abaxial; Ed, epiderme adaxial; Ce, complexo estomático; seta, bactérias; estrela, hifa fúngica. Figura 11. MO (A) e MEV (B, C, D, E, F). Presença freqüente de estruturas fúngicas no filoplano das espécies vegetais estudadas; (A e B) epiderme adaxial de Corymbia citriodora (Myrtaceae), (A) seção transversal da nervura central da lâmina foliar evidenciando a presença de biofilmes microbianos no filoplano e (B) a confirmação da presença de estruturas fúngicas; (C e D) Abelmoschus esculentus (Malvaceae), (C) superfície foliar contendo hifas fúngicas sobre as células epidérmicas propriamente ditas e próximas aos tricomas tectores e secretores, (D) hifa fúngica presente nas flanges , assim como bactérias; (E) presença de hifas fúngicas na nervura central de Mangifera indica (Anacardiaceae); (F) colonização fúngica sobre o complexo estomático de Impatiens walleriana (Balsaminaceae). Abreviações: Ed, epiderme adaxial; Eb, epiderme abaxial; Co, colênquima; Es, esclerênquima; Ce, complexo estomático; Tt, tricoma tector; Ts, tricoma secretor; seta, bactéria; estrela, hifa fúngica. Figura 12. MO. Presença de material mucilaginoso no rizoplano de diferentes espécies vegetais; (A) Lactuca sativa (Asteraceae); (B) Chicorium intybus (Asteraceae); (C) Brachiaria decumbens (Poaceae); (D) Hibiscus rosa-sinensis (Malvaceae); (E e F) Carica papaya (Caricaceae); (G e H) Citrus limonia (Rutaceae). Abreviações: Ep, epiderme; Co, colênquima; P, pêlo radicular; seta, mucilagem. Figura 13. MO. Presença de fungos micorrízicos em diferentes espécies vegetais; seção transversal da raiz evidenciando a presença de micorrizas no córtex de (A e B) Capsicum frutescens (Solanaceae); (C e D) Annona muricato (Annonaceae); (E) Vitis vinifera (Vitaceae); (F) Brachiaria decumbens (Poaceae). Nota-se em C. frutescens (B) a ramificação de hifas para formação de arbúsculo na célula cortical. Abreviações: Co, colênquima; seta, micorriza; estrela, mucilagem. 6. Discussão 6.1. Microrganismos epifíticos nas amostras de tecidos da lâmina foliar Mediante a utilização da microscopia ótica e da microscopia eletrônica de varredura foram visualizados microrganismos habitando todas as espécies vegetais assintomáticas, sendo as bactérias, os habitantes mais freqüentes e numerosos. Esse fato, aliado aos estudos de Azevedo (1999) e Manfio (2003), os quais relatam que são pouquíssimas as espécies bacterianas atualmente conhecidas em relação às estimadas, reforçam a importância e necessidade de estudos contínuos sobre as interações entre bactéria-planta para real compreensão, macro e micro, dos agroecossistemas tropicais. A presença de uma maior colonização bacteriana, seguida por fungos, no filoplano das espécies tropicais estudadas, coincide com os dados encontrados na literatura para ambientes temperados. Karamanoli et al. (2000), por exemplo, estudando as plantas aromáticas do mediterrâneo (Lavandula angustifolia, Rosmarius officinalis, Salvia fruticosa e Origanum vulgare) estimaram através das técnicas microbiológicas uma população bacteriana epifítica no filoplano entre 4 x 102 a 5 x 105 UFC / g de folha. Krimm et al. (2005), estudando o filoplano de morango (Fragaria ananassa cv. Elsanta), identificaram por sequenciamento gênico do 16S rRNA, 324 estirpes bacterianas, pertencentes principalmente aos gêneros Pseudomonas, Stenotrophomonas, Bacillus e Arthrobacter. Independentemente da técnica utilizada, micromorfológica, microbiológica, ou de biologia molecular, os dados indicam uma abundância de bactérias colonizando as superfícies foliares. O filoplano se constitui em um extenso habitat bacteriano. Segundo Morris & Kinkel (2002), é estimado que a superfície foliar terrestre colonizada por microrganismos seja de aproximadamente 6,4 x 108 km2. Esses autores também estimaram que a população bacteriana epifítica global pode ser maior que 1026 células, devido ao grande número de bactérias já relatadas no filoplano de plantas de ambientes temperados, somado a população bacteriana de ambientes tropicais. Apesar de serem observadas bactérias na superfície vegetal de todas as espécies estudadas, o filoplano, aparentemente, possui características bastante hostis para a colonização de microrganismos, como uma alta incidência de radiações ultravioleta, rápidas flutuações de temperatura e umidade relativa, limitada disponibilidade de nutrientes, impactos mecânicos freqüentes ocasionados, por exemplo, por partículas presentes no vento e gotas de chuva. Para sobrepor essas barreiras, as bactérias utilizam mecanismos do próprio sistema biológico, aliado a mecanismos da comunidade microbiana, além de colonizarem nichos específicos na topografia foliar. As bactérias associadas às plantas são freqüentemente visualizadas reunidas em comunidades denominadas agregados, microcolônias e biofilmes (Morris & Monier, 2003). O biofilme pode ser definido como microrganismos aderidos uns aos outros e a uma superfície através de uma matriz extracelular comum (Costerton et al., 1995; Donlan, 2002; Morris & Monier, 2003). Porém, para descrever agrupamentos bacterianos menores e não necessariamente recobertos por uma matriz extracelular comum, os termos agregados e microcolônias se confundem, representando comunidades bacterianas com tamanhos variados. No presente estudo, foram visualizadas bactérias como células únicas, classificadas como solitárias, reunidas em grupos de tamanhos variados e não necessariamente recobertos por uma matriz extracelular, classificadas como microcolônias e grupos mais populosos, com microrganismo unidos uns aos outros e à superfície foliar por uma matriz extracelular comum, classificados como biofilmes. Bactérias em microcolônias foram freqüentemente observadas aderidas umas as outras e à superfície foliar através de microfibrilas. Essas estruturas filamentosas são provavelmente formadas pela secreção bacteriana de polissacarídeos extracelulares (EPS). Como o processamento para microscopia eletrônica de varredura envolve várias etapas de lavagem e desidratação, muitos microrganismos epifíticos e principalmente muitos polissacarídeos extracelulares podem ter sido extraídos. Essas microfibrilas talvez representem o remanescente desidratado de uma matriz extracelular que originalmente recobria toda a célula ou até mesmo toda comunidade bacteriana. Portanto, nem sempre é possível, através da microscopia eletrônica de varredura, distinguir biofilmes de microcolônias. A produção de EPS é considerada um fator essencial para o estabelecimento dos agregados bacterianos, pois protege as bactérias da dessecação, concentra minerais e nutrientes, reduz o contato bacteriano com compostos tóxicos, aumenta a aderência bacteriana na superfície foliar e pode estar envolvida com os processos patogênicos (Denny, 1995). Kemp et al. (2004) constataram que mutantes de Xanthomonas axonopodis pv. manihotis não produtores de xantana (EPS) possuíam patogenicidade severamente atenuada, sendo mais suscetíveis a toxidade por peróxido de hidrogênio e possuindo dificuldade de dispersão no interior da planta. Esses autores também constataram que esses mutantes possuíam reduzida sobrevivência epifítica, pois eram mais vulneráveis às radiações ultravioleta. As bactérias presentes em agregados, portanto, apresentam uma maior persistência no ambiente comparado com as células isoladas, como confirmado pelo experimento de Monier & Lindow (2003). Estudando a colonização de Pseudomonas syringae no filoplano de feijão submetido a diferentes condições de umidade, esses autores constataram que as bactérias presentes em agregados apresentaram uma maior sobrevivência comparada com as bactérias solitárias, concluindo que a agregação aumenta a resistência das bactérias a estresses hídricos, possivelmente devido à presença de uma matriz de EPS. Por meio da microscopia eletrônica de varredura foi constatado que microcolônias mais populosas apresentavam, com mais freqüência, uma matriz extracelular recobrindo as células, ao invés de microfibrilas, refletindo o conceito de densidade-dependente. As bactérias através do sistema “quorum sensing” percebem e respondem a densidade populacional, através da produção e difusão de moléculas sinalizadoras, sendo a síntese de EPS um dos fatores regulados por esse mecanismo (Whitehead et al., 2001; Bodman et al., 2003). Como o presente estudo não possui escala temporal, pode se supor que essas microcolônias talvez estejam evoluindo para formação de biofilmes através da contínua produção de EPS e crescimento do agregado (Pratt & Kolter, 1999; O’ Toole et al., 2000; Sutherland, 2001). Os biofilmes foram visualizados em várias espécies vegetais, pertencentes a diferentes famílias botânicas, na superfície epidérmica abaxial e adaxial. A maioria dos biofilmes era composta por bactérias associadas a estruturas fúngicas, sendo observado poucos biofilmes exclusivamente bacterianos. Watnick & Kolter (2000) e Sutherland (2001) citam que em ambientes naturais, biofilmes monoespecíficos são raros, a maioria são multiespecíficos, compostos por uma mistura de microrganismos. Os biofilmes visualizados podem ser considerados comunidades microbianas complexas, onde ocorrem interações interespecíficas e intraespecificas (Andrews & Harris, 2000) ainda não completamente compreendidas. Vale ressaltar, que em algumas espécies vegetais estudadas, como por exemplo, Citrus reticula, foram observados vários biofilmes e também agregados microbianos compostos sempre por fungos e bactérias e distribuídos sistematicamente por todo filoplano. A formação dessas comunidades microbianas estruturadas parece depender de modificações microambientais realizadas pelas espécies fúngicas. As hifas fúngicas juntamente com a planta hospedeira, talvez, ao liberarem nutrientes no filoplano, estejam sustentando o estabelecimento bacteriano e em contrapartida criando um microambiente mais protegido para o crescimento fúngico. Ou o contrário pode estar ocorrendo, modificações microambientais provocadas pelas bactérias talvez estejam influenciando a colonização fúngica. Estudos posteriores sobre sucessão ecológica são necessários para elucidar essa questão. Através dessas observações surgem alguns questionamentos, como: quais os eventos que levam a formação de biofilmes multiespecíficos? Quais as interações que ocorrem entre esses diferentes microrganismos? E entre biofilme multiespecífico e a planta hospedeira? As bactérias usufruem de vários processos cooperativos quando presentes em comunidade (O´Tole et al., 2000; Jefferson, 2004), logo a formação de biofilme pode ser bastante vantajosa para o estabelecimento e sobrevivência bacteriana na superfície hostil das folhas. Os resultados obtidos mostram que para sobrepor aos estresses presentes no filoplano, as bactérias além de formarem comunidades, colonizavam locais específicos na topografia foliar, como as flanges cuticulares, os complexos estomáticos, as nervuras, os tricomas tectores e secretores. As razões pelas quais as bactérias habitam preferencialmente esses locais, ainda não estão completamente identificadas. Apesar de não serem comuns dados em escala micrométrica sobre a incidência de radiação ultravioleta, disponibilidade de nutrientes, umidade relativa e físico-química de superfície desses locais, provavelmente, são esses os fatores que diferenciam esses microecossistemas do restante da superfície foliar, apresentando características mais propícias para o estabelecimento e colonização bacteriana. As fontes de nutrientes no filoplano podem ter origem exógena, como grãos de pólen, poeira, fragmentos de inseto, ou origem endógena, através da exsudação de substâncias do interior foliar. Mesmo plantas saudáveis exsudam carboidratos, ácidos orgânicos e aminoácidos no filoplano, sendo a quantidade exsudada variável conforme a espécie vegetal, idade da folha, fisiologia e condições ambientais (Taiz & Zeiger, 1991). A disponibilidade de carbono é considerada um dos fatores mais limitantes na colonização bacteriana epifítica (Mercier & Lindow, 2000). Leveau & Lindow (2001) observaram que o consumo de frutose e sacarose por Erwinia herbicola ocorre preferencialmente nas flanges cuticulares, nervuras, complexos estomáticos e ferimentos localizados na superfície foliar de Phaseolus vulgaris. Esses dados indicam que os nutrientes não estão uniformemente distribuídos no filoplano, influenciando diretamente a dinâmica da microbiota epifítica. Em todas as amostras foliares foram visualizadas bactérias colonizando as flanges cuticulares, ou seja, as junções das paredes periclinais externas das células epidérmicas das superfícies adaxiais e abaxiais. As paredes celulares estão em contato uma com as outras através da lamela média, uma camada cimentante que apresenta natureza péctica (Apepezzato-da-Glória & Carmello-Guerreiro, 2003). As pectinas formam um grupo heterogêneo de polissacarídeos ramificados constituídos por unidades de ácido galacturônico unidos através de ligações α 1 – 4 e carregados negativamente. Devido às cargas negativas, as pectinas são altamente hidratadas e se associam ao Ca2+, adquirindo consistência gelatinosa e propiciando uma união das paredes celulares vegetais adjacentes (Raven et al., 2001). Talvez, essa maior disponibilidade de Ca2+ nas flanges , seja um fator favorável ao estabelecimento bacteriano, pois auxiliaria no processo de adesão celular. O cálcio faria a mediação entre as superfícies negativamente carregadas da bactéria e da superfície foliar. Esse mecanismo de adesão microrganismo-planta já foi descrito para a bactéria fixadora de nitrogênio Rhizobium leguminosarum (Smit et al., 1989) e para o fungo Colletrotrichum graminicola (Leite et al., 2000). Através da microscopia eletrônica de varredura, foi observado que as flanges formam depressões na superfície foliar. Portanto, os nutrientes lavados do filoplano pela chuva podem se depositar juntamente com a água, nesses locais, propiciando um ambiente mais adequado ao estabelecimento microbiana. Além disso, é provável que essas depressões estejam menos expostas aos efeitos do vento e da radiação incidente, sendo um ambiente mais protegido para as bactérias. Os complexos estomáticos já foram relatados como locais preferenciais de colonização de bactérias fitopatogênicas e como um tipo de abertura natural por onde pode ocorrer à penetração das mesmas (Huang, 1986). A preferência bacteriana por esse microecossistema pode ser devido a maior umidade desses locais comparado ao restante da lâmina foliar. Os complexos estomáticos estão relacionados com as trocas gasosas entre planta-atmosfera e com a saída de água pelo processo transpiratório (Taiz & Zeiger, 1991), apresentando-se como um local mais úmido e propício para o estabelecimento de microrganismos. A presença de bactérias nos complexos estomáticos também pode estar relacionada com a presença de estruturas fúngicas. Foram visualizados fungos habitando os complexos estomáticos e penetrando na planta através do ostíolo. Freqüentemente, bactérias foram observadas associadas a essas estruturas fúngicas. Apesar do estudo das interações entre fungos e bactérias epifíticas se restringirem às interações maléficas, visando desenvolvimento de técnicas e estratégias aplicadas no controle biológico (Postmaster et al., 1997; Abanda-Nkpwatt et al., 2006; Singh et al., 2004), supõe-se que interações benéficas entre esses microrganismos também ocorram com freqüência nas superfícies foliares. De modo geral, a colonização microbiana foi mais abundante na superfície epidérmica abaxial, o que pode ser o reflexo da presença mais freqüente dos complexos estomáticos. Outros fatores, como: menor incidência de radiação ultravioleta, diferenças na composição das paredes periclinais externas das células epidérmicas e características da própria bactéria, podem estar envolvidos. Kemp et al. (2004), por exemplo, constataram que Xanthomonas axonopodis se estabelece preferencialmente na superfície epidérmica adaxial das folhas anfiestomáticas de mandioca, provavelmente devido à alta hidrofobicidade da cera presente sob a superfície epidérmica abaxial. As nervuras da lâmina foliar foram observadas como locais de estabelecimento bacteriano, sendo visualizadas bactérias solitárias, microcolônias e biofilmes. Brandl & Mandrell (2002), ao estudarem a colonização de Salmonella enterica no filoplano de Coriantrum sativum, também observaram, por microscopia confocal, a tendência de bactérias colonizarem, como agregados, as nervuras das lâminas foliares. A nervura representa o local no qual está situado a maior quantidade de elementos celulares do sistema vascular da lâmina foliar, possuindo as funções de transportar água e solutos dissolvidos na corrente transpiratória e translocar os produtos da fotossíntese para outras partes da planta (Appezzato-da-Glória & Carmello-Guereiro, 2003). A preferência bacteriana por esse local talvez esteja relacionada à maior presença de água e nutrientes translocados do sistema vascular para o exterior foliar. As paredes periclinais externas das células epidérmicas presentes nas nervuras podem apresentar características físico-químicas diferentes das paredes periclinais externas das células que compõem o restante da lâmina foliar, refletindo em uma superfície mais propícia para a adesão e colonização microbiana. Em algumas espécies vegetais, a nervura apresenta diferentes tricomas tectores e secretores, o que pode influenciar no estabelecimento microbiano. Os tricomas podem ser considerados locais de colonização bacteriana. A grande diversidade existente de tricomas tectores e secretores, com diferentes características estruturais e químicas, produzindo, acumulando e secretando diferentes compostos do metabolismo primário e secundário (Metcalfe & Chalk, 1950; Ascensão & Pais, 1997; Ascensão et al., 1999), pode se refletir em uma diversidade de associações entre microbiota-planta, variando entre interações benéficas a maléficas. Monier & Lindow (2004) observaram por microscopia epifluorescente, agregados da bactéria fitopatogênica Pseudomonas syringae habitando a base dos tricomas de Phaseolus vulgaris, confirmando a preferência das bactérias fitopatogênicas de colonizarem esse sítio. As bactérias fitopatogênicas, além de colonizarem, também podem penetrar na planta através de aberturas que surgem por injúrias e por ferimentos dos tricomas (Huang, 1986). No entanto, visando impedir o estabelecimento da doença, as plantas possuem mecanismos de defesa que incluem a secreção através dos tricomas secretores de metabólicos secundários com atividade antimicrobiana (Karamanoli et al., 2000; Proestos et al., 2006). São vários os tipos de substâncias sintetizadas nos tricomas secretores através do metabolismo secundário, incluindo os grupos dos terpenos, dos compostos fenólicos e dos compostos nitrogenados (Taiz & Zeiger, 1991). A função desses compostos na dinâmica da microbiota benéfica epifítica ainda é pouco compreendida, pois por muito tempo os estudos foram focados em compostos com atividade antifúngica e antibacteriana (Croft et al., 1993; Kalemba & Kunicka, 2003). Recentemente, Abanda-Nkpwatt et al. (2006), observaram que bactérias epifíticas dos gêneros Pseudomonas, Stenotrophomonas, Bacillus, Arthrobacter são capazes de metabolizarem compostos voláteis produzidos pelos tricomas secretores de morango, ao contrário do fungo fitopatogênico Botrytis cinerea que apresentou inibição de crescimento. Logo, os metabólicos secundários secretados pelos tricomas atuam diretamente na dinâmica da microbiota epifítica, possuindo diferentes efeitos dependendo do tipo de substância e microrganismo. Semelhanças na associação bactéria-planta entre espécies pertencentes ao mesmo táxon foram observadas, refletindo a importância e influência que as características botânicas exercem na microbiota epifítica. Todas as espécies vegetais pertencentes à família Poaceae apresentaram uma baixa frequência de colonização bacteriana, ao contrário do observado na família Rutaceae. Provavelmente as características da parede periclinal externa das células epidérmicas, como presença de sílica e alta hidrofobicidade, seja um dos fatores determinantes da baixa freqüência de colonização bacteriana na família Poaceae, pois dificultaria o processo de adesão celular. A presença de células mucilaginosas na lâmina foliar das espécies vegetais da família Rutaceae talvez exerçam influência positiva no estabelecimento bacteriano epifítico, ao exsudarem mucilagem para o filoplano, que serviria como fonte de água e nutrientes. Estudos mais aprofundados são necessários para compreender esses diferentes padrões. A presença de cera epicuticular do tipo plaqueta pode ser considerado uma característica anatômica determinante na dinâmica da microbiota epifítica, influenciando negativamente o estabelecimento bacteriano. Esses resultados estão de acordo com os dados obtidos por Kinkel et al. (2000) que utilizando métodos microbiológicos obtiveram um maior número de bactérias culturáveis de folhas de Cucumis sativus e Phaseolus vulgaris comparado com folhas cerosas de gramíneas. A interação entre bactéria e cutícula ou cera epicuticular ainda é pouco compreendida. Alguns estudos indicam que algumas bactérias são capazes de influenciar as propriedades da cutícula, como a permeabilidade, para obterem água e nutrientes do interior foliar (Knoll et al., 2000, Schreiber et al., 2004, Singh et al., 2004, Krimm et al., 2005). No presente estudo foram visualizadas por microscopia eletrônica de varredura bactérias aderidas ao filoplano em “cavidades” que provavelmente surgiram pela digestão da cutícula ou cera epicuticular através de substâncias secretadas pelas bactérias, como biosurfactante (Knoll et al., 2000, Schreiber et al., 2004). moléculas com atividade Através da comparação dos resultados obtidos no presente estudo com os dados encontrados na literatura, pode se inferir que o comportamento bacteriano epifítico é bastante semelhante em ambientes temperados e tropicais (Andrews & Harris, 2000; Lindow & Leveau, 2002; Lindow & Brandl, 2003). Logo, as caraterísticas intrínsecas das plantas hospedeiras (ex: presença de tricomas, presença de cera epicuticular do tipo plaqueta) supostamente exercem uma maior influência na colonização bacteriana epifítica que as condições ambientais. A microscopia eletrônica de varredura convencional, aliada a microscopia ótica, foi utilizada nesse estudo com eficácia para descrever as interações epifíticas entre bactéria-planta, devido principalmente, a possibilidade de observar toda a morfologia da superfície epidérmica da lâmina foliar, ao alto poder de resolução do equipamento e a facilidade de descrição das imagens bidimensionais com aspecto tridimensional. Porém, algumas difilcultadas metodológicas foram constatadas, como por exemplo, a geração de artefatos, que pode dificultar e até mesmo gerar equívocos na interpretação dos resultados. O processamento envolve várias etapas de desidratação que podem gerar perdas de bactérias, redistribuição de células e destruição ou desidratação das microfibrilas e da matrix extracelular. A microscopia eletrônica de varredura convencional também gera limitadas informações sobre viabilidade e identidade celular e é um método essencialmente qualitativo ou semiquantitativo. Logo, estudos posteriores devem ser realizados aliando a microscopia eletrônica de varredura a outras técnicas microscópicas, microbiológicas e moleculares, para propiciar uma compreensão integral das interações epifíticas entre microbiota e planta hospedeira. 6.2. Microrganismos epifíticos nas amostras de tecidos da raiz Por meio da microscopia ótica, foi observada intensa presença de material mucilaginoso no rizoplano das quarenta e sete espécies de plantas sem sintomas de doença. A mucilagem da raiz possui as funções de reduzir o atrito entre as raízes e as partículas do solo, evitar a dessecação e melhorar o contato entre a raíz e a solução do solo (Rougier & Chabound, 1985). Além disso, a mucilagem afeta diretamente a microbiota benéfica do solo como fungos micorrízicos (Bansal & Mukerji, 1994), bactérias simbióticas (Bacilio-Jiménez et al, 2003) e também microrganismos patogênicos (Hawes, 1990). As células da raiz secretam para o rizoplano, passivamente e ativamente, diversas substâncias que atuam diretamente na dinâmica microbiana, atraindo ou repulsando bactérias e criando um microambiente mais úmido e nutricionalmente rico para o estabelecimento epifítico (Nehl et al., 1996; Sturz & Nowak, 2000; Bacilio-Jiménez et al, 2003; Walker et al., 2003). 6.3. Microrganismos endofíticos No presente estudo foram visualizados, com bastante freqüência, fungos endofíticos no córtex radicular como associações micorrízicas. De acordo com Wilcox (1991), as micorrizas ocorrem em 83 % das dicotiledôneas, 79 % das monocotiledôneas e em praticamente todas as gimnospermas, sendo considerada a associação simbiótica mais comum entre microrganismos e espécies vegetais (Trappe, 1987). Os fungos micorrízicos beneficiam a planta hospedeira através do aumento da habilidade das raízes em absorverem água e nutrientes, principalmente o fósforo (Sylvia et al., 1999) e também ao aumento da resistência da planta a doenças (Pfleger, 1994). Em contrapartida, o vegetal supre a micorriza de fotoassimilados (Siqueira & Franco, 1988). Foram observadas, principalmente, micorrizas denominadas endomicorrizas, que são caracterizadas morfoanatomicamente pelo estabelecimento inter e intracelular, ausência de manto e de modificações morfológicas nas raízes, sendo as ericóides, as orquidóides e as arbusculares os tipos mais estudados (Sylvia et al., 1999). Cortes transversais das raizes foram observados em microscopia ótica, possibilitando identificar as estruturas típicas dos fungos micorrízicos arbusculares, que são: os arbúsculos, com função de transferência de nutrientes entre os simbiontes (Gianinazzi-pearson & Gianinazzi, 1983); as vesículas, com a função de reserva e armazenamento (Harley & Smith, 1983); e as hifas, responsáveis pela absorção e transporte de água e nutrientes (Siqueira & Franco, 1988). A avaliação rotineira da presença de fungos micorrízicos arbusculares por microscopia ótica é realizada seguindo o protocolo proposto por Grace & Stribley (1991). Tal protocolo consite em clarificar as raízes com KOH e, posteriormente, contrastar com azul de metil para visualização em microscopia ótica de campo claro. Essa metodologia é rápida e eficaz para confirmar a presença de fungos micorrízicos arbusculares e a porcentagem de micorrização em raízes finas que se tornam translúcidas com o processamento. Porém, para a identificação de micorrizas em raízes mais grossas e também para um estudo mais refinado sobre morfologia e anatomia da micorrização a metodologia empregada nesse estudo pode ser considerada uma alternativa promissora. No presente estudo não foi possível visualizar bactérias endofíticas. Segundo James & Olivares (1997) a colonização bacteriana endofítica não ocorre por todo o interior dos vegetais. Para tal, existem locais específicos de estabelecimento bacteriano que incluem principalmente os espaços intercelulares e os vasos xilemáticos. Esses dados, assim como a maioria dos estudos envolvendo caracterização estrutural da associação endofítica, foram obtidos através de estudos microscópicos de plantas inoculadas em laboratório, onde se presupõe a existência de elevada população bacteriana. No presente estudo, foram coletadas pequenas amostras das lâminas foliares e das raizes visualmente sadias de plantas adultas cultivadas no campo, objetivando através de cortes micrométricos, observados em microscopia ótica, caracterizar associações naturais endofíticas entre bactéria e planta hospedeira. Porém, não foi possível visualizar bactérias endofítica, pois a diluição da colonização endofítica foi maior que a eficiência da amostragem. 7. Conclusões - A microscopia eletrônica de varredura, aliada à microscopia ótica, pode ser considerada importantes ferramentas para o estudo estrutural da associação epifítica entre microrganismos e planta hospedeira. - Microrganismos habitam plantas saudáveis. As bactérias foram os colonizadores mais abundantes do filoplano, seguido por fungos, na forma de esporos e de hifas fúngicas. - Predominaram no filoplano bactérias no formato de bastonete, seguido por coco, aderidos à parede periclinal externa das células epidérmicas ou tricomas por adesão apolar. - As bactérias estavam presentes no filoplano como células solitárias, ou formando microcolônias ou estruturadas em biofilmes. - Houve o predomínio de biofilmes multiespecíficos, constituídos por bactérias e fungos. - Os locais preferências de estabelecimento bacteriano epifítico no filoplano foram as flanges cuticulares, os tricomas secretores, os tricomas tectores, os complexos estomáticos e as nervuras. - Os caracteres anatômicos influenciaram no estabelecimento da microbiota epifítica, sendo a presença de tricomas uma característica favorável e a presença de cera epicuticular do tipo plaqueta uma característica desfavorável à interação bactériaplanta. - Fungos endofíticos estavam presentes nas amostras radiculares como associações micorrízicas. 8. 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