COLEÇÃO DE BACTÉRIAS DO AMBIENTE E SAÚDE (CBAS

Anais 5º Simpósio de Gestão Ambiental e Biodiversidade (21 a 23 de junho 2016)
COLEÇÃO DE BACTÉRIAS DO AMBIENTE E SAÚDE (CBAS/Fiocruz):
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE BACTÉRIAS E BIODIVERSIDADE
Izabel dos Santos Rodrigues; Érica Miranda Damasio Vieira; Talita Bernardes
Valadão; Verônica Viana Vieira
(Coleção de Bactérias do Ambiente e Saúde (CBAS); Laboratório Interdisciplinar de
Pesquisas Médicas/IOC – FIOCRUZ, Rio de Janeiro. [email protected])
RESUMO
Coleções microbiológicas são fundamentais para preservação de material testemunho da diversidade biológica. As coleções
são repositórios de cepas microbianas e a provisão de recursos microbiológicos para pesquisas são atualmente reconhecidos
como um componente essencial para as ciências da vida, e no desenvolvimento da bioeconomia. Estas possuem infraestrutura
para conservação de cepas microbianas que são fornecidas para várias finalidades como: garantir a qualidade e
reprodutibilidade da ciência, estudos taxonômicos, análises epidemiológicas de doenças infecciosas, desenvolvimento de
novos tratamentos, tais como terapia do fago, matéria-prima para obtenção de fármacos e bioprodutos utilizados como
insumos para diagnóstico, vacinas e medicamentos. A Coleção de Bactéria do Ambiente e Saúde (CBAS/Fiocruz) possui um
acervo constituído bactérias oriundas de distintos nichos ambientais, além das bactérias com impacto na saúde. Atualmente a
CBAS possui 5 subcoleções decorrentes de depósitos e projetos sobre biodiversidade bacteriana em diversos biomas e
pesquisa básica de bactérias de importância médica. Para assegurar a qualidade e autenticidade dos recursos biológicos, as
linhagens da CBAS foram caracterizadas utilizando a análise da sequência do gene 16S rRNA que proporcionou a
identificação inequívoca de 86 gêneros entre 1287 linhagens bacterianas. Os resultados da caracterização genética mostrou
que o acervo abriga ampla diversidade de bactérias cultiváveis preservadas.
Palavras-chave: Biodiversidade, Coleção Biológica, Gene 16S rRNA, Bactérias, Caracterização genética
INTRODUÇÃO
Coleções biológicas são conjuntos de organismos, ou partes destes organizados de
modo a fornecer informações sobre a procedência, coleta e identificação de cada um de seus
espécimes (Marinoni & Peixoto 2010; Smith 2012). As coleções microbiológicas possuem
infra-estrutura que as tornam um componente-chave para conservação e distribuição de
materiais biológicos. Estas são fundamentais como ferramentas de material testemunho da
diversidade biológica. As coleções são consideradas repositórios de cepas microbianas para
garantir a qualidade e reprodutibilidade da ciência, em estudos taxonômicos, na identificação
de patógenos e em ensaios de controle da qualidade de produtos. Além disso, podem atuar
como prestadores de serviços confidenciais de depósito de organismos-chave para a
investigação científica e da indústria (SIBBr 2015; Smith 2012). Estas coleções também
abrigam materiais biológicos com potencial biotecnológico, utilizados como matéria prima
para obtenção de fármacos, alimentos, substâncias orgânicas, bioprodutos utilizados na
produção de insumos para diagnóstico, vacinas e medicamentos entre outros (Aranda 2014;
Manual de Organização de Coleções Biológicas da Fiocruz 2015; Stackebrandt 2010). Diante
do cenário abordado, a provisão de recursos microbianos para pesquisa é atualmente
reconhecida como um componente essencial no avanço das ciências da vida, e no
desenvolvimento da bioeconomia (Smith et al. 2014; Boundy-Mills et al. 2015).
A Coleção de Bactéria do Ambiente e Saúde (CBAS) IOC/FIOCRUZ possui um
acervo constituído por bactérias oriundas de distintos nichos ambientais, além das que
possuem impacto na saúde. Atualmente a CBAS possui cinco subcoleções: Coleção de
Bactérias da Mata Atlântica (CBMA), Coleção de Bactérias da Amazônia Azul (CBAA),
Coleção de Vibrio do Ambiente e Saúde (CVAS), Coleção de Bactérias de Impacto na Saúde
(CBIS) e Coleção Geral de Bactérias do Ambiente (CGBA). A CBAS é filiada à World
Federation for Culture Collections, WFCC, sob o registro WDCM 958.
A CBAS está implementando um sistema de gestão da qualidade (SGQ) visando
garantir a qualidade dos seus serviços, materiais biológicos e informações associadas a estes.
A adoção de normas e padrões para garantir segurança, acessibilidade, qualidade, integridade
do acervo e dos dados das coleções biológicas é abordada na legislação brasileira e faz parte
da política institucional da Fiocruz. O SGQ da Coleção segue a Norma ABNT NBR ISO/IEC
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17025:2005 e o Guia de Boas Práticas para Centro de Recursos Biológicos da Organização
para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE).
Para complementar a garantia da qualidade dos materiais biológicos, as linhagens
bacterianas da CBAS foram caracterizadas e/ou autenticadas por metodologia molecular
utilizando a análise da sequência do gene ribosomal 16S rRNA. Este trabalho apresenta os
resultados da caracterização genética do acervo da CBAS com intuito de mostrar a
biodiversidade de bactérias cultiváveis preservadas na Coleção.
MATERIAL E MÉTODOS
As culturas bacterianas que compõem a CBAS foram caracterizadas pela análise da
sequência do gene ribossomal 16S rRNA. A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi
realizada para a amplificação do gene 16S rRNA utilizando os iniciadores universais PA (5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') e PH (5’- AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA 3'). O produto da PCR foi purificado e utilizado como molde de DNA para a reação de
sequenciamento com o sistema comercial BigDye Terminator (Cycle Sequencing Ready
Reaction Kit). Após a corrida no sequenciador (ABI PRISM 3730 Applied Biosystems DNA
Sequencer), as sequências nucleotídicas foram analisadas e editadas utilizando o programa
SeqMan versão 7.0 (DNASTAR Lasergene) e comparadas àquelas depositadas nos bancos de
sequências:
GeneBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
e
EzTaxon
(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A determinação da biodiversidade do acervo foi determinada pela caracterização
genética das linhagens bacterianas que compõem a CBAS. A análise da sequência do gene
16S rRNA identificou 86 gêneros bacterianos no total de 1287 linhagens, sendo alguns destes
compartilhados entre as subcoleções.
A subcoleção CBAS/CBMA é constituída por bactérias representantes da microbiota
do solo da Mata Atlântica que foram isoladas de amostras coletadas durante um projeto
realizado no Parque Nacional da Serra dos Órgãos (PARNASO), no Rio de Janeiro, um dos
ecossistemas da Mata Atlântica. Os trinta e três gêneros bacterianos identificados nesta
subcoleção foram: Alcaligenes sp., Acinetobacter sp., Amycolatopsis sp., Arthrobacter sp.,
Bacillus sp., Burkholderia sp., Collimonas sp., Cupriavidus sp., Dyella sp., Enterobacter sp.,
Herbaspirillum sp., Kitasatospora sp., Leifsonia sp., Leucobacter sp., Lysinibacillus sp.,
Microbacterium sp., Mycobacterium sp., Novosphingobium sp., Paenibacillus sp.,
Phyllobacterium sp., Pseudomonas sp., Pseudoclavibacter sp., Ralstonia sp., Raoultella sp.,
Rhodococcus sp., Serratia sp., Silvimonas sp., Sinomonas sp., Sphingomonas sp.,
Staphylococcus sp., Streptoacidiphylus sp. Streptomyces sp. e Variovorax sp. Vários gêneros
desta subcoleção apresentam potencial biotecnológico.
A subcoleção CBAS/CBAA é formada por bactérias isoladas da microbiota do
ecossistema que compreende a plataforma continental brasileira conhecida como Amazônia
Azul. A temática da biodiversidade microbiana marinha é importante para o melhor
entendimento de processos biológicos do meio marinho, mas também, devido a dinâmica dos
oceanos, pode servir como observatório da dispersão de patógenos importantes para humanos,
via oceanos. Os gêneros bacterianos detectados nesta subcoleção foram: Alteromonas sp.,
Endozoicomonas sp., Bacillus sp., Marinobacter sp., Micrococcus sp., Paenibacillus sp.,
Photobacterium sp., Pseudoalteromonas sp., Pseudovibrio sp., Ruegeria sp., Shewanella sp. e
Thalassobius sp.
Nos anos 90, em ocasião da epidemia de cólera na América Latina foi originada uma
coleção do gênero Vibrio composta principalmente pela espécie V. cholerae isolados de
infecções humanas e do ambiente em diferentes estados brasileiros. A subcoleção
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CBAS/CVAS abrange também as espécies: Vibrio alginolyticus, Vibrio mandracius, Vibrio
metschnikovii, Vibrio mimicus e Vibrio parahaemotyticus.
Os gêneros bacterianos provenientes de outros nichos ambientais não contemplados
nas demais subcoleções que vem sendo depositadas na CBAS foram alocados na subcoleção
CBAS/CGBA. Nesta subcoleção há bactérias isoladas de diferentes tipos de solos, de áreas
limpas industriais, do intestino do mosquito Aedes aegypti, de alimentos entre outros. Trinta
gêneros foram identificados nesta subcoleção: Agrococcus sp., Asaia sp., Arthrobacter sp.,
Barrientosiimonas sp., Brachybacterium sp., Brevibacterium sp., Bacillus sp.,
Chryseobacterium sp., Comanomas sp., Corynebacterium sp., Deinococcus sp., Enterobacter
sp., Erwinia sp., Flavobacterium sp., Gluconobacter sp., Herbaspirillum sp., Janibacter sp.,
Lactobacillus sp., Microbacterium sp., Nocardiopsis sp., Oenococcus sp., Paenibacillus sp.,
Pantoae sp., Pediococcus sp., Planococcus sp., Providência sp., Pseudomonas sp., Ralstonia
sp., Sphingobacterium sp., Sthaphylococcus sp.
A CBAS também contempla bactérias oriundas de casos de infecções humanas que
tem impacto na saúde. Foram caracterizados 16 gêneros bacterianos na subcoleção
CBAS/CBIS: Actinomadura sp., Acinetobacter sp., Agromyces sp., Bacillus sp., Bordetella
sp., Corynebacterium sp., Enterococcus sp., Klebsiella sp., Escherichia sp., Gordonia sp.,
Nocardia sp., Nocardioides sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Saccharopolyspora sp. e
Sphingomonas sp.
A análise da sequência do gene 16S rRNA, utilizada para caracterização e
autenticação das linhagens bacterianas do acervo da CBAS, permite a identificação
inequívoca do gênero bacteriano. Entretanto em alguns casos esta metodologia não diferencia
a espécie sendo necessário realizar a análise da sequência de outros genes conservados.
Apesar de algumas limitações da referida metodologia, está é a mais indicada para a
determinação de gêneros bacterianos oriundos do ambiente, uma vez que não há metodologia
fenotípica para a identificação correta da maioria dos gêneros que compõem a CBAS.
CONCLUSÃO
A caracterização genética das linhagens bacterianas da CBAS mostrou que o acervo
desta coleção abriga ampla diversidade de bactérias cultiváveis. Além da provisão de recursos
microbianos para diferentes áreas da ciência, e dos demais serviços (depósito e identificação
de linhagens bacterianas) oferecidos pela coleção, a CBAS também desenvolve estudos
taxonômicos e de caracterização genética e genômica de gêneros bacterianos que tem como
objetivos: ampliar o acervo, preservar parte da biodiversidade de bactérias cultiváveis de
diferentes nichos ambientais, além de bactérias com impacto na saúde e agregar valor
científico ao acervo.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Fiocruz e CNPq, pelo apoio às pesquisas e financiamento.
REFERÊNCIAS
Aranda, A. T. 2014. Coleções Biológicas: conceitos básicos, curadoria e gestão, interface com a biodiversidade e saúde pública: In: III
Simpósio sobre a biodiversidade da Mata Atlântica. Santa Teresa – ES, p. 45-56.
Boundy-Mills K; Hess, M.; Bennett, A.R.; Ryan, M.; Kang, S.; Nobles, D.; Inderbitzin, P.; Sitepu, I.R.; Torok, T.; Brown, D.R.; Cho, J.;
Mukherjee, S.; Cady, S.L. & McCluskey, K.. 2015. The United States Culture Collection Network (USCCN): Enhancing Microbial
Genomics Research through Living Microbe Culture Collections. Applied and Environmental Microbiology. 81:5671-4.
Manual de Organização de Coleções Biológicas da Fiocruz. 2015. Rev. 04. Rio de Janeiro: VPPLR/FIOCRUZ, 17p. (VPPLR-M-CB-001).
Marinoni, L. & Peixoto, A. L. 2010 As coleções biológicas como fonte dinâmica e permanente de conhecimento sobre a biodiversidade.
Revista Ciência e Cultura, vol. 62. n .3, p. 54-57.
Sistema de Informação Sobre a Biodiversidade Brasileira (SIBBr), 2015. Disponível em <http://www.sibbr.gov.br/areas/?area=colecoes>,
Acesso em 29 out 2015.
Smith, D. 2012. Culture collections. Advances in Applied Microbiology. 79:73-118.
Smith, D.; McCluskey, K.; Stackebrandt, E. 2014. Investment into the future of microbial resources: Culture Collection funding models and
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Stackebrandt, E. 2010. Diversification and focusing: strategies of microbial culture collections. Trends in Microbiology. 18: 283-7.
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