detecção de leishmaniavírus em amostras de - pgbioexp

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2013
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LILIAN MOTTA CANTANHÊDE
DETECÇÃO DE LEISHMANIAVÍRUS EM AMOSTRAS DE PACIENTES COM
LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA ATENDIDOS NO CENTRO DE
MEDICINA TROPICAL DE RONDÔNIA- CEMETRON
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Biologia Experimental Stricto senso da
Universidade Federal de Rondônia, para obtenção do
título de Mestre em Biologia Experimental.
Aluna: Lilian Motta Cantanhêde
Orientador: Dr. Ricardo de Godoi Mattos Ferreira
Reitora: Prof. Dra. Maria Berenice Alho da Costa Tourinho
Diretora do Núcleo de Saúde: Prof. Dra. Ivete de Aquino Freire
Coordenador do Programa de Biologia Experimental: Prof. Dr. Alexandre de Almeida e Silva
FICHA CATALOGRÁFICA
BIBLIOTECA CENTRAL PROF. ROBERTO DUARTE PIRES
Cantanhêde, Lilian Motta.
C229d
Detecção de leishmaniavírus em amostras de paciente com
leishmaniose tegumentar americana atendidos no Centro de
Medicina Tropical de Rondônia - CEMETRON. / Lilian Motta
Cantanhêde. Porto Velho, Rondônia, 2013.
63f.: il.
Dissertação (Mestrado em Biologia Experimental) – Núcleo de
Saúde (NUSAU), Programa de Pós-Graduação em Biologia
Experimental, Fundação Universidade Federal de Rondônia, Porto
Velho, 2013.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo de Godoi Mattos Ferreira.
1. Leishmania. 2. Leishmaniavírus. 3. Leishmaniose Cutânea e
Mucosa. I. Título.
CDU: 616.993.161
Bibliotecária Responsável: Eliane Gemaque / CRB 11-549
DETECÇÃO DE LEISHMANIAVÍRUS EM AMOSTRAS DE PACIENTES COM
LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA ATENDIDOS NO CENTRO DE
MEDICINA TROPICAL DE RONDÔNIA- CEMETRON
Banca Examinadora:
_________________________________________
Dr. Ricardo de Godoi Mattos Ferreira
(Pesquisador - Fiocruz Rondônia)
_________________________________________
Dr. Luís Marcelo Aranha Camargo
(Professor – Universidade de São Paulo)
_________________________________________
Dr. Roberto Nicolete
(Pesquisador - Fiocruz Rondônia)
Suplentes:
_________________________________________
Dra. Carla Celedônio Fernandes
(Pesquisadora - Fiocruz Rondônia)
_________________________________________
Dr. Andreimar Martins Soares
(Pesquisador - Fiocruz Rondônia)
A todos os pacientes que colaboraram com a
realização deste trabalho e proporcionaram a mim, muito
além do conhecimento descrito nas próximas páginas.
O que que
eremos?
Mudanças no
Mundo!
Com
mo queremos?
?
Que elaas comecem
peloss outros!
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, pela oportunidade, apoio e conhecimentos compartilhados
durante esses dois anos.
Aos médicos, Dr. Cipriano Ferreira e Dr. Marcos Ito por colaborarem com o
estudo.
Aos diretores do Hospital CEMETRON, Dr. Sérgio Basano e Dra. Stella
Zimmerli e a equipe técnica do hospital que foram fundamentais para a execução do
trabalho.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Biologia Experimental,
Carla, Tony, Mauro, Rubiani, Manuela, Rodrigo, Fernando, Najla, Deusilene,
Alexandre e Juliana pela contribuição na minha formação acadêmica.
Aos colegas da turma de mestrado de 2011 da qual tenho orgulho de ter feito
parte, Andrea, Giseli, Roniele, Rafaela, Carina, Onássis, Marla, Nidiane, Renata,
Daniele e Josiane, boa sorte para todos nós!
Aos colegas do laboratório Iasmin, Paulo, Márlon, Nidi, Soraya, Micheles,
Marcos e Gabi pela convivência e auxílio.
Aos laboratórios da Fiocruz Rondônia que, sempre quando precisei, prestaram
apoio ao desenvolvimento deste trabalho.
À Fiocruz Rondônia por proporcionar e financiar parte da execução deste
trabalho.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Descrição dos primers utilizados para detecção de DNA de Leishmania _ 26
Tabela 2 – Protocolo utilizado nas reações de PCR - ITS1 _____________________ 27
Tabela 3 – Protocolo utilizado nas reações de RFLP - ITS1 ____________________ 28
Tabela 4 – Protocolo utilizado nas reações de PCR – hsp70 ____________________ 30
Tabela 5 – Protocolo utilizado para RFLP - hsp70 ___________________________ 31
Tabela 6 – Protocolo utilizado nas reações de PCR - kDNA ____________________ 33
Tabela 7 – Reagentes utilizados para a síntese de cDNA_______________________ 35
Tabela 8 – Distribuição geral dos resultados obtidos no trabalho, classificados pela
ausência ou presença do Leishmaniavírus, pelo tipo de lesão e pela espécie _______ 39
Tabela 9 – Frequência das espécies de Leishmania __________________________ 40
Tabela 10 – Distribuição das formas observadas da doença ____________________ 40
Tabela 11 – Detecção do Leishmaniavírus em amostras positivas para Leishmania sp.
por tipo de lesão ______________________________________________________ 41
Tabela 12 – Distribuição das frequências de LRV1 em pacientes incluídos conforme
critérios estabelecidos como “Estratégia 1” _________________________________ 42
Tabela 13 – Distribuição das frequências de LRV1 em pacientes incluídos conforme
critérios estabelecidos como “Estratégia 2” _________________________________ 43
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura dos Totivírus do tipo I e do tipo II ________________________ 20
Figura 2 - Estrutura dos vírus da Família Totiviridae _________________________ 21
Figura 3 - Escova cervical utilizada na coleta e foto de paciente com LTA ________ 25
Figura 4 - Região amplificada utilizando primers para o ITS1 __________________ 27
Figura 5 - Gel de agarose para ITS1 _______________________________________ 28
Figura 6 - Espécies identificadas e tamanho dos fragmentos de ITS1 após digestão com
HaeIII ______________________________________________________________ 29
Figura 7 - PCR RFLP para identificação de espécies de Leishmania por ITS1 ______ 30
Figura 8 - Gel de agarose para hsp70 ______________________________________ 31
Figura 9 - PCR RFLP para identificação de espécies de Leishmania por hsp70 _____ 32
Figura 10 - Gel de agarose para kDNA ____________________________________ 34
Figura 11 - Protocolo de síntese de cDNA __________________________________ 35
Figura 12 - Região amplificada para detecção do LRV e sequências dos primers
utilizados____________________________________________________________ 36
Figura 13 - Gel de agarose para LRV ______________________________________ 36
Figura 14 - Alinhamento múltiplo das sequências de LRV _____________________ 38
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Casos de Leishmaniose Tegumentar Americana no Brasil por Região no
período de 2000 a 2010 ________________________________________________ 15
Gráfico 2 - Casos de Leishmaniose Tegumentar Americana na Região Norte no período
de 2000 a 2010 _______________________________________________________ 15
Gráfico 3 - Casos de Leishmaniose Tegumentar Americana notificados no Estado de
Rondônia durante o período de 1990 a 2010 ________________________________ 16
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BsuRI
enzima de restrição Bacillus subtilis R
CCL5
quimiocina CCL5
CXCL10
quimiocina C X C 10
dNTP
desoxirribonucleotídeos trifosfatados
dsRNA
RNA dupla fita
HaeIII
enzima de restrição Haemophilus aegyptius
hsp70
Proteína do choque térmico 70
IC95%
Intervalo de confiança de 95%
IL
Interleucina
IFN-γ
Interferon gama
ITS1
Espaçado Interno Transcrito 1
kDNA
DNA do cinetoplasto
LC
Leishmaniose Cutânea
LCD
Leishmaniose cutâneo-difusa
LgM+
Cepa de L. guyanensis metastática
LM
Leishmaniose Mucosa
LRV1
Leishmaniavírus tipo 1
LTA
Leishmaniose Tegumentar Americana
ORF
Open Reading Frame
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
RPDR
RNA Polimerase Dependente de RNA
R.R.
Risco Relativo
SNP
Single Nucleotide Polymorphism
TCD4+
Células T do Tipo 4 ativadas
Th
Células T auxiliares
TNF-α
Fator de Necrose Tumoral Alfa
V
Volts
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ____________________________________________________ 12
1.1 LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA - LTA ______________________ 12
1.2 DADOS EPIDEMIOLÓGICOS DA LEISHMANIOSE _________________________ 14
1.3 EVOLUÇÃO DA DOENÇA ______________________________________________ 17
1.4 LRV: UM MEMBRO DA FAMÍLIA TOTIVIRIDAE __________________________ 19
1.5 RELAÇÃO LRV1 E HOSPEDEIRO HUMANO ______________________________ 23
2 OBJETIVOS ______________________________________________________ 24
2.1 GERAL ______________________________________________________________ 24
2.2 ESPECÍFICOS _________________________________________________________ 24
3 METODOLOGIA __________________________________________________ 24
3.1 CASUÍSTICA _________________________________________________________ 24
3.2 COLETA DA AMOSTRA _______________________________________________ 25
3.3 EXTRAÇÃO DE DNA __________________________________________________ 25
3.4 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE PARA DETECÇÃO DE DNA DE
Leishmania _______________________________________________________________ 26
3.4.1 Espaçador Interno Trancrito 1 – ITS1 ___________________________________ 27
3.4.2 Heat-Shock Protein – hsp70 ___________________________________________ 30
3.4.3 DNA do Cinetoplasto – kDNA _________________________________________ 32
3.5 EXTRAÇÃO DE RNA __________________________________________________ 34
3.6 SÍNTESE DE cDNA ____________________________________________________ 34
3.7 REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO DO LEISHMANIAVÍRUS ____________________ 36
3.8 ANÁLISES DOS DADOS _______________________________________________ 37
4 RESULTADOS ____________________________________________________ 37
5 DISCUSSÃO ______________________________________________________ 43
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS _________________________________________ 47
REFERÊNCIAS _____________________________________________________ 48 RESUMO
A Leishmaniose Tegumentar Americana-LTA é uma infecção causada pelo parasita
Leishmania e pode apresentar desde um envolvimento cutâneo (LC) até uma destruição
das mucosas (LM) sendo esta forma, considerada uma evolução da doença. Cerca de
10% dos pacientes assintomáticos ou com lesões cutâneas recuperadas, evoluem para a
forma mucosa e apresentam um quadro imunológico diferenciado com produção
exacerbada de citocinas inflamatórias. Os fatores que predispõem essa evolução estão
relacionados com a virulência do parasita, a resposta imune do hospedeiro e fatores
genéticos. Recentemente, a presença de um vírus denominado Leishmaniavírus 1
(LRV1) no interior do parasita da Leishmania vem sendo relacionado com a variação
da manifestação da doença. O objetivo do presente trabalho foi determinar se o LRV1
ocorre em pacientes com leishmaniose cutânea e mucosa do estado de Rondônia
atendidos no ambulatório do Centro de Medicina Tropical – CEMETRON, utilizando
técnicas de biologia molecular. Para coleta da amostra foi utilizado uma escova cervical
estéril em contato direto com a lesão, sendo o material coletado, acondicionado em
RNALater™ (Ambion®) para conservação dos ácidos nucléicos até o momento das
extrações de DNA e RNA utilizando-se kits comerciais. Para detecção de DNA de
Leishmania foram utilizados três pares de iniciadores (ITS1, kDNA e hsp70). Para
verificação da presença do LRV1 foi utilizado um par de iniciadores que amplificam
uma pequena região da ORF1. Foram analisados um total de 137 amostras, sendo 121
positivas para Leishmania sp.. A espécie mais frequente foi a L. braziliensis com 73
casos (60,3% - I.C.95% 51,4%...68,6%), seguida de L. guyanensis com 33 casos (27,3%
- I.C.95% 20,1%...35,8%). Foram identificados 4 casos de infecção mista, 3 causados
por L. braziliensis e L. guyanensis e 1 por L. guyanensis e L. amazonensis. Também
foram observados 2 casos de L. shawi e não foi possível determinar a espécie em 8
pacientes. O LRV1 foi detectado em 53 amostras (43,8% - IC95% 35,0%...52,6%),
sendo significativamente mais frequente em lesões mucosas do que em lesões cutâneas
(teste exato de Fisher, p=0,001; R.R.=2,810- IC95% 1,419...5,561). Não foi observada
diferença significativa estatisticamente entre a forma da lesão e a espécie causadora da
doença.
Palavras-chaves: Leishmania, Leishmaniavírus, Leishmaniose cutânea e mucosa.
ABSTRACT
The American tegumentary leishmaniasis (ATL) is a infectious caused by an parasite of
Leishmania genus. Clinical manifestation may range from a cutaneous form (CL) to the
destruction of the mucosal tissues. (ML), being the second considered a clinical
evolution of the disease. About 10% of asymptomatic or recovered CL patients
develops the ML form and presents a particular immunological response, with
exacerbated production of pro-inflammatory cytokines. The mechanisms that lead to
disease evolution might be related with parasite, host genetic factors and immune
response. More recently the presence a virus infecting the pathogen, named
Leishmaniavirus 1 (LRV1), has also been implicated in the development of ML. The
aim of the present study was to evaluate the occurrence of Leishmaniavirus among
patients with CL and ML attended at the Centro de Medicina Tropical – CEMETRON
Hospital using molecular biology methods. Sample collection was done using sterile
swabs directly from lesions, followed by immediate immersion of biological material in
RNATalerTM solution (Ambion ®) for nucleic acid preservation until DNA and RNA
extraction using commercially available kits. Leishmania detection were done using
three PCR primers (ITS1, kDNA e hsp70). LRV1 were detected using PCR primers that
hybridizes with the virus ORF1. Sample from 137 patients were analyzed. 121 were
positive for Leishmania sp.. The most frequent specie were L. braziliensis with 73 cases
(60.3% - 95%CI 51.4%...68.6%), followed by L. guyanensis with 33 cases (27.3% 95%CI 20.1%...35.8%). Also, 4 cases of mixed infections, 3 caused by L. braziliensis
and L. guyanensis and 1 by L. guyanensis and L. amazonensis. The LRV1 were detected
in 53 samples (43.8% - 95%CI 35.0%...52.6%), been significantly more frequent in ML
than CL (Fisher’s exact test p=.,001; R.R.=2.810- 95%CI 1.419...5.561). No statistically
significant association between disease form and species were found.
Key
words:
Leishmaniasis.
Leishmania,
Leishmaniavirus,
Cutaneous
and
Mucocutaneous
12
1 INTRODUÇÃO
A leishmaniose é uma infecção de manifestação cutânea (Leishmaniose
Tegumentar Americana – LTA) ou visceral (Leishmaniose Visceral – LV) que é
endêmica em 98 países (KAYE; SCOTT, 2011; ALVAR et al., 2012) . É causada por
um parasita intracelular obrigatório do gênero Leishmania e transmitido ao hospedeiro
mamífero pela picada de um flebotomíneo infectado (VERGEL et al. 2006). É
considerado pela Organização Mundial de Saúde um importante problema de saúde
pública mundial e classificada como uma doença negligenciada (WHO, 2011).
1.1 LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA - LTA
A principal característica da LTA é a sua diversidade de aspectos clínicos, as
quais permitem classificá-la em: leishmaniose cutânea (LC) e leishmaniose mucosa
(LM). A LC é caracterizada por lesões ulceradas que podem apresentar-se de forma:
localizada, a mais frequente, caracterizada por uma única lesão; disseminada, com
presença de várias lesões distribuídas em diversas regiões do corpo; e a forma difusa, a
mais grave, onde as lesões se apresentam de forma nodular, também chamada de forma
anérgica da doença, com evolução crônica (REY, 2001). A LM é a forma clínica mais
avançada da LC e ocorre meses ou anos após a cura espontânea ou terapêutica da lesão
cutânea, produzindo lesões que podem levar à destruição extensa das membranas
mucosas das cavidades do nariz, boca e garganta. (MARSDEN, 1986).
Vinte e duas espécies de Leishmania foram relatadas por causar infecções em
humanos. Estes protozoários são amplamente distribuídos em países situados em
regiões tropicais, subtropicais e de clima temperado (WHO, 1990; LAINSON, 1998;
CUPOLILLO, 2000). Segundo a Organização Mundial de Saúde, de 1,5 a 2 milhões de
novos casos ocorrem anualmente, embora apenas 600 mil sejam oficialmente
registrados. Aproximadamente 12 milhões de pessoas estão atualmente infectadas com
leishmaniose e 350 milhões de pessoas estão em risco de adquirir a infecção. A maior
parte dos países endêmicos está localizada na América Latina e são países
subdesenvolvidos ou em desenvolvimento (WHO, 2011).
O parasita Leishmania pertence ao Reino Protozoa; filo Mastigophora; ordem
Kinetoplastida; família Trypanosomatidae e gênero Leishmania. O gênero Leishmania é
dividido em dois subgêneros, Leishmania (Leishmania) e Leishmania (Viannia), de acordo
13
com o local de desenvolvimento das formas promastigotas no intestino do vetor
(LAINSON; SHAW, 1988). No Novo Mundo (Américas) são conhecidas onze espécies
de Leishmania causadoras de infecção em humanos e outras oito espécies já descritas
somente em animais. No Brasil, as três principais espécies de Leishmania responsáveis
pela LTA são: Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis e
Leishmania (Leishmania) amazonensis (MEDEIROS; ROSELINO, 1999; BRASIL,
2010).
Na Região Amazônica, sete espécies de Leishmania são responsáveis pelos
casos de LTA, sendo o subgênero Leishmania (Viannia) braziliensis a que apresenta o
maior potencial patogênico ao homem e está relacionada não só com a infecção cutânea,
mas também, com a forma clínica mais grave, de longa evolução, com lesões mucosas
destrutivas (LAINSON, 2000; SILVEIRA, 2002; VERGEL, 2006). Devido à complexa
interação entre as espécies de Leishmania que atuam como agentes etiológicos na região
amazônica, a diversidade de vetores e as diferentes manifestações clínicas da doença no
hospedeiro tornam o entendimento da patogenia da LTA nessa região um desafio.
De uma forma geral algumas características clínicas têm sido associadas às
espécies de Leishmania descritas no Brasil, a saber:
Leishmania (Leishmania) amazonensis: leishmaniose cutânea anérgica difusa
(LCAD), uma das formas mais graves da LTA associada ao polo imunológico
hiporreativo com fraca hipersensibilidade celular (SILVEIRA, 2008).
Leishmania (Viannia) braziliensis: o curso da infecção geralmente é irregular e
crônico. É caracterizada por sua associação com a leishmaniose mucosa, sendo de
grande interesse médico (LAINSON; SHAW, 1998).
Leishmania (Viannia) guyanensis: frequentemente produzem infecções múltiplas
na pele, comprometendo o sistema linfático, porém os casos de lesões mucosas parecem
ser bem raros (LAINSON; SHAW, 1998).
Leishmania (Viannia) naiffi: O parasita causa pequenas lesões cutâneas simples
e ulceradas, muitas vezes apresentando cura espontânea. Nenhum caso de lesões
mucosas foi atribuído a este parasita (LAINSON et al., 1990; DARIE et al., 1995).
Leishmania (Viannia) shawi: geralmente, causam lesões cutâneas simples, mas
foram observados também casos de múltiplas lesões ulceradas e nodulares. Não foi
observada associação com casos de lesões mucosas (LAINSON; SHAW, 1998).
14
Leishmania (Viannia) lainsoni: causam lesões cutâneas simples sem registro de
envolvimento das mucosas. Sua baixa prevalência, possivelmente, está associada ao fato
do seu vetor ser de baixa antropofilia (SILVEIRA et al., 1987; MARTINEZ et al.,
2001;).
Leishmania (Viannia) lindenbergi: causam lesões cutâneas simples e também
não foi atribuída associação com casos de lesões mucosas, a apresentação da infecção é
bastante similar a L. (V.) naiffi (SILVEIRA et al., 2002).
Durante o seu ciclo biológico, a Leishmania apresenta as formas promastigota e
amastigota. A forma promastigota caracteriza-se por ser flagelada, móvel e alongada,
desenvolvendo-se no tubo digestivo de flebótomos. A amastigota é a forma intracelular
obrigatória dos vertebrados, imóvel, ovalada ou arredondada (HOARE; WALLACE,
1966).
A infecção humana tem seu início logo após a inoculação das formas
promastigotas do parasito na pele, o que acontece durante a hematofagia pelas espécies
de flebótomos vetores (SILVEIRA et al., 2004)
Os insetos vetores são pequenos dípteros (2 a 3 mm de tamanho) pertencentes à
família Psychodidade e a diversos gêneros: Phlebotomus no Velho Mundo (Europa,
Ásia e África), Lutzomyia e, mais raramente Psychodopygus no Novo Mundo. Ainda
que grande parte das formas de transmissão da Leishmania seja zoonótica, as mudanças
ambientais causadas pela aproximação do homem com as florestas por meio de
desenvolvimento agrícola ou habitacional estão alterando esse quadro (MEDEIROS;
ROSELINO, 1999; CUNNINGHAM, 2002).
1.2 DADOS EPIDEMIOLÓGICOS DA LTA
Ao analisar a evolução da LTA no Brasil, observa-se uma expansão geográfica,
sendo que, no início da década de 80, foram registrados casos autóctones em 19
unidades federadas e, no ano de 2003, foi confirmada autoctonia em todas as unidades
federadas do país. Atualmente a LTA é endêmica em todos os estados do Brasil,
conforme mostrado no gráfico abaixo (gráfico 1). (BRASIL, 2010).
15
Gráfico 1 - Casos notificados de LTA no Brasil
16.000
Norte
Nordeste
Sudeste
Sul
Centro‐Oeste
Número de casos notificados
14.000
12.000
10.000
8.000
6.000
4.000
2.000
0
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Anos
Número de casos de LTA notificados no Brasil por Região no período de 2000 a 2010.
Fonte: Sinan/SVS/MS.
A Região Norte vem contribuindo com o maior número de casos (36,4% do total
de casos registrados, no período de 2000 a 2010) conforme demonstrado no gráfico 2, e
com os coeficientes médios mais elevados (80,0 casos por 100.000 habitantes), seguida
das regiões Centro-oeste (36,5 casos por 100.000 habitantes) e Nordeste (19,9 casos por
100.000 habitantes) (BRASIL, 2010).
Gráfico 2 - Casos notificados de LTA na região Norte
6.000
Rondônia
Acre
Amazonas
Roraima
Pará
Amapá
Tocantins
Número de casos notificados
5.000
4.000
3.000
2.000
1.000
0
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Anos
Casos de LTA na Região Norte por estado no período de 2000 a 2010.
Fonte: Sinan/SVS/MS.
16
Em 2004, casos de LTA eram registrados em todos os municípios do estado de
Rondônia, e o número total de casos registrados foram 2131 com incidência anual de
144 casos/100.000 habitantes, a terceira mais alta entre os estados brasileiros (ANON,
2006).
No estado de Rondônia, a incidência da LTA tem se mantido elevada, em parte
da década de 90 eram registrados cerca de 2500 casos por ano, entre os anos de 1996 a
2002 as notificações registram aproximadamente 1500 casos anualmente, e após um
surto no ano de 2004, as notificações têm se mantido em cerca de 1000 novos casos por
ano (Gráfico 3).
Gráfico 3 - Casos de LTA notificados no Estado de Rondônia
Número de casos notificados
3000
Rondônia
2500
2000
1500
1000
500
0
Anos
Casos de LTA notificados no Estado de Rondônia durante o período de 1990 a 2010.
Fonte: Sinan/SVS/MS.
Apesar da incidência relativamente elevada de LTA em Rondônia, pouco se sabe
sobre a patogenia dessa infecção, como fatores que predispõem a diversidade de
características clínicas e as espécies de parasitos que ocorrem nessa região. Alguns
parasitos foram isolados no meio da década de 1980, quando o desmatamento estava
apenas começando no estado (ARIAS et al., 1985). Três cepas de parasitos de pacientes
que contraíram LTA em Rondônia foram identificadas como L. guyanensis
(CUPOLLILO 1994). Em 2003, Shaw e colaboradores identificaram 12 cepas de
isolados de pacientes, sendo 7 da espécie L. braziliensis, 3 da espécie L. lainsoni e 1
isolado como L. guyanensis.
17
Relatos da literatura indicam que várias espécies de Leishmania estão associadas
à LTA na região e, aparentemente, L. braziliensis, L. guyanensis e L. amazonensis são
as mais frequentes, embora outros parasitas também tenham sido identificados. No
entanto, os dados não permitem o esclarecimento da frequência destas espécies com
relação aos casos de LTA diagnosticados devido ao pouco número de casos isolados.
1.3 EVOLUÇÃO DA DOENÇA
Normalmente, a espécie de Leishmania responsável pela infecção é que
determina a forma clínica da doença, porém algumas espécies podem levar a um
agravamento da infecção, como nos casos de infecção por L. (V) braziliensis, que pode
causar a leishmaniose de forma cutânea ou mucosa (GARCIA, 2001).
A LC apresenta-se de forma limitada a uma ou poucas úlceras na pele,
comumente nas áreas descobertas do corpo. O quadro imunológico é caracterizado por
uma resposta imune do tipo Th1 moderada e bem regulada contra a Leishmania
(SILVEIRA, 2002). As lesões cutâneas não se resolvem de forma rápida e muitas vezes
podem disseminar para outros locais. Na América do Sul, um pequeno número de
pessoas desenvolve uma das formas mais agressivas da doença (LM) após a resolução
de uma lesão primária (BARRAL, 1995).
O conjunto de pacientes que evoluem para a LM apresenta um quadro
imunológico diferenciado, sendo a resposta do hospedeiro aos antígenos do parasito
caracterizados pela produção exacerbada de citocinas inflamatórias, Fator de Necrose
Tumoral Alfa (TNF-α) e Interferon-gama (IFN-γ) (SILVEIRA, 2004; AXELROD,
1994).
A clínica da LM envolve a disseminação parasitária à nasofaringe e áreas da
face, levando a lesões secundárias e resposta imune exacerbada (MARTINEZ, 1992;
WEIGLE, 1996). Cerca de 10% dos indivíduos assintomáticos, com lesões de LC
recuperadas ou tratadas de forma inadequadas podem desenvolver LM (GAZE, 2006;
AVERALO, 2007; AMATO, 2008;).
Os determinantes que estão associados com a progressão da doença, além dos
fatores de virulência do parasita são a resposta imune do hospedeiro e fatores genéticos,
como
polimorfismo
de
TNF-
α
e
interleucina-6
(IL-6)
(BLACKWELL;
CASTELLUCCI, 2006). No entanto, outro fator tem sido relacionado com essa
evolução, a presença de Leishmaniavírus (LRV1) no interior do parasita Leishmania
18
pode exercer um importante papel na variação da manifestação da doença (STUART,
1992; CADD, 1993).
Uma característica comum aos casos de infecções mucosas que levam a
metástase é o aparecimento de uma inflamação destrutiva e resposta imunológica que se
caracteriza por um grande número de células do sistema imune ativadas, levando a um
inchaço e a destruição tecidual local (MARSDEN et al., 1986; RONET et al., 2010)
Esta reação é mais agravada, provavelmente por um fator do parasita. O
Leishmaniavírus foi relatado primeiramente há cerca de duas décadas, mas somente em
2011 foi evidenciado como um fator intrínseco de L. guyanensis que agrava a
inflamação e pode vir a ser um importante fator em parasitas do gênero Leishmania que
contribuem para o desenvolvimento de lesões mucosas (IVES et al., 2011; RONET et
al., 2011).
Assim, o LRV1 pode ter uma contribuição variável para este fenótipo,
isoladamente ou em conjunto com outros fatores, tais como características genéticas do
hospedeiro e/ou fatores de virulência espécie-específicos do parasita.
A resposta imunológica por parte do hospedeiro em decorrência da infecção por
Leishmania é caracterizada pelo aumento de células T CD4+ que podem apresentar um
perfil de citocinas Th1 ou Th2 (HOLZMULLER et al., 2006; REIS et al., 2006). Em
humanos, a resposta imune à infecção por Leishmania não é tão bem caracterizada
como em camundongos devido a sua complexidade (REIS et al., 2006). Em todas as
formas clínicas da LTA, a resposta imune é dependente de células T. e, classicamente,
se aceita que a diferença entre resistência e susceptibilidade à infecção também está
relacionada com o nível de expansão de células Th1 e Th2 (BACELLAR et al., 2002).
Em caso de resposta Th1, são produzidas citocinas que ativam os macrófagos (IL-2,
IFN-γ, TNF-α e IL-12) levando a destruição dos parasitos. Se a resposta for do tipo Th2
serão produzidos IL-4 e IL-10 que inibem a ativação dos macrófagos levando a
susceptibilidade à infecção. A Leishmania é capaz de direcionar a diferenciação de
células T para uma resposta do tipo Th2, caracterizada pela persistência da infecção
(REIS et al., 2006)
Enquanto o papel dos fatores do hospedeiro ainda não está esclarecido, a espécie
do parasita ainda é considerada uma ferramenta para prever o fenótipo clínico da
doença. No entanto, apesar da considerável diferença clínica da leishmaniose, análises
19
filogenéticas e genômicas mostram que apenas cerca de 200 genes, de um total
aproximado de 8.300, apresentam distribuição diferencial entre as espécies de L. major,
L. Infantum e L. braziliensis e que a espécie com maior diferenciação é a L. braziliensis
(IVENS et al., 2005; SMITH et al., 2007).
A ausência ou a baixa taxa de recombinação genética não é um obstáculo para a
identificação das espécies. A identificação de alterações mutacionais se torna uma
metodologia eficiente de determinação das espécies em Leishmania (CUPOLLILO,
1997).
A espécie L. braziliensis tem um número elevado de polimorfismos de
nucleotídeos simples (SNPs) e em conjunto com a perda de alguns genes, podem ser
fatores que contribuem para o seu tropismo à disseminação para as mucosas e a
virulência aumentada em relação às outras espécies (ROGERS et al., 2011).
De particular interesse são as diferenças genéticas envolvidas no controle do
estresse oxidativo. Sendo esta uma infecção intracelular, a destruição oxidativa nos
fagolisossomos é um dos principais mecanismos de eliminação do parasita. Evitar esta
morte pode ser uma forma de desenvolver a latência e mais tarde a metástase. L.
braziliensis é conhecido por conter um maior número de cópias de uma enzima
(NADPH fumarato redutase) que degrada metabólitos oxidativos produzidos pelos
macrófagos e está ausente no hospedeiro mamífero, embora ainda não seja conhecido se
essa enzima pode influenciar na sensibilidade de L. braziliensis ao estresse oxidativo
(HARTLEY et al., 2012). O sequenciamento do genoma de outras espécies de
Leishmania como L. guyanensis vão adicionar informações valiosas dos determinantes
genéticos para a resistência oxidativa e sua contribuição para a virulência à metástase.
No entanto, estas diferenças genéticas ainda não são suficientemente preditivas ou
explicativas para a diversidade da patologia. Além disso, a diversidade clínica poderia
estar relacionada com a expressão diferencial de proteínas por alterações na regulação
dos genes, o número de cópias ou a presença de pseudo genes (LYNN; MCMASTER,
2008; ROGERS et al., 2011).
1.4 LRV: UM MEMBRO DA FAMÍLIA TOTIVIRIDAE
Em 1974, partículas semelhantes a vírus foram descritas em Leishmania hertigi
(MOLYNEUX, 1974), mas somente na década seguinte foi publicada a primeira
descrição molecular de vírus de RNA em duas cepas de Leishmania guyanensis (TARR
20
et al.., 1988; WIL
LDMER et al., 1989; S
STUART ett al., 1992;)) e em seguiida em umaa cepa
de L.. braziliensiis (SALINA
AS et al., 19996).
Os
víruus
de
Leeishmania
foram
cllassificados na
famíília
Totiviiridae
(PAT
TTERSON, 1990; WE
EEKS et all., 1992) que
q englobaam vírus nnão envelop
pados,
form
mados por paartículas ico
osaédricas e estão pressentes em outros
o
protoozoários com
mo T.
vaginnalis e G. laamblia (WA
ANG; WAN
NG, 1991).
Vírus daa família To
otiviridae sãão formados por partícculas de 40nnm e genom
ma de
RNA
A dupla fita (dsRNA) não
n segmenntados com tamanho en
ntre 4 e 8 kkb que codificam
uma proteína doo capsídeo viral e um
ma RNA pollimerase deependente dde RNA (RD
DRP)
p
a repliicação dos vírus de RN
NA dupla fita
f e está ffusionada com
c
a
que é essecial para
proteeína do capssídeo viral (STUART,
(
1992).
O LRV parece seg
guir a connformação dos
d demaiss Totivírus descrita acima,
a
emboora haja um
ma variação no arranjo das sequên
ncias dos geenes entre oos tipos LR
RV1 e
LRV
V2 (Figura 1).
Figura 1 - Estrutura dos Totivírrus do tipo I e do tipo II
L
LRV1
Proteínaa do Capsíd
deo
RNA
R
Polim
merase
Local de enttrada do Ribosssomo
Início da trradução utilizand
do a
maquinaria de tradução do hosp
pedeiro
L
LRV2
Proteína do Capsídeeo
RNA Pollimerase
Fonte: adap
ptado de Hartley, 2012.
c
em
m um vírus dde RNA du
upla fita (dsRNA) e poossui um genoma
O LRV consiste
de aaproximadam
mente 5,3 kb (TARR
R, 1988). Já foi detectado em culturas de
d L.
braziiliensis, L. guyanensis
g
e um únicoo relato em uma cepa do
d velho muundo de L. major
m
(WID
DMER, 19995; SCHEFF
FTER et al. , 1995).
Analisanndo as sequeencias dos vvírus, foram
m identificad
das diferençças significaativas
entree os Leishm
maniavírus descritos, e por essse motivo, foram divvididos em duas
categgorias: LRV
V1 para cepas do Novoo Mundo e LRV2
L
para a cepa do V
Velho Mundo. A
21
compparação doss dois genom
mas dos priimeiros LR
RVs isoladoss de cepas ddo Novo Mundo
M
demoonstrou umaa similaridaade de 76% da sequênccia de 5283 nucleotídeo
n
os (SCHEFF
FTER
et al., 1994), seendo cada vírus
v
classifficado em duas
d
espécies diferentees, LRV1-1
1 para
um iisolado e LRV
L
1-4 paara o outro isolado. Devido a esssas diferençças, o LRV
V1 foi
posteeriormente subdividido em 13 espécies, classificadas
c
s de LRV11-1 a LRV
V1-13
(STU
UART, 1992; SCHEFF
FTER, 19944; 1995). O LRV isolaado de umaa cepa do Velho
V
Munndo foi classsificado com
mo LRV2-1 .
Estudos de filogenia mostraram
m que a disstância genéética entre L
LRV1 e LR
RV2 é
semeelhante às encontradas
e
s entre as eespécies do
o parasita e que esta similaridad
de foi
agruppada de acoordo com a origem geeográfica do parasita (SCHEFFT
(
TER et al., 1995;
WILDMER; DO
OOLEY, 19
995). Assim
m, a presença dos vírus nos parasittas Leishma
ania é
anterrior à diverggência entree as espécie s do Novo e Velho Mu
undo e pareccem ter evo
oluído
juntoo com seu hospedeiro
h
(SCHEFFT
TER et al., 1995; WIL
LDMER; D
DOOLEY, 1995).
1
Ao ccontrário doo LRV1 em
m Leishmaniia (Viannia)
a), a relação
o LRV2/L. m
major ainda não
foi explorada e não se sabee se esta deesenvolve allgum papel na gravidaade da doen
nça ou
prom
move alteraçção do fenóttipo clinico..
Do mesm
mo modo qu
ue outros Tootivírus, o LRV1
L
é um RNA duplaa fita envoltto por
um ccapsídeo e têm
t
o mRN
NA que sinttetiza a cad
deia polipeptídica viral (WEEKS et
e al.,
19922) (Figura 2)).
Figura 2 - Estrutura dos vírus da
d Família Totiviridaee
Fon
nte: Swiss Insstitute of Bioinformatics, 2008.
2
d 82 kDa (750 aa) e uma
Seu genoma codifica a proteíína do capssído viral de
sequêência conseervada de 99
9 kDa (8877 aa) conten
ndo uma região que coodifica a RPDR
R
do L
Leishmaniavvírus (STUA
ART, 1992;; SCHEFFT
TER, 1994; 1995). As partículas virais
detecctadas em L.
L guyanenssis demonstrraram ter attividade de RNA polim
merase, esseencial
22
para a replicação dos vírus de RNA (WILDER et al., 1990). De forma geral, o LRV
possui três regiões codificantes (ORF - Open Reading Frames), designadas de ORF1,
ORF2 e ORF3, sendo que as duas últimas codificam a proteína do capsídeo viral e a
RDRP respectivamente. A ORF 1 ainda não possui tradução e função conhecidos, e é
considerada uma proteína deduzida.
As sequências das proteínas previstas nas ORFs, até o momento, não mostraram
nenhuma homologia significativa com outras proteínas conhecidas (STUART et al.,
1992; SCHEFFTER et al, 1994).
Similar a outros Totivírus, a RDRP forma-se como uma proteína de fusão por
um “frameshift” ribossomal (MAGA et al., 1995). No caso do LRV2, o sítio de
codificação da RDPR não é sobreposto ao capsídeo e é separado por um único códon e,
por isso pode ser codificado de forma independente (Figura 1) (SCHEFFTER et al.,
1995).
A replicação do LRV1 é similar a de outros vírus de RNA dupla-fita, por esse
motivo foi classificado na família Totiviridae (CADD, 1994).
Móleculas dsRNA não são produzidas por hospedeiros eucarióticos, que
possuem vários mecanismos de detecção e inativação de moléculas dsRNA. Os vírus
dsRNA são replicados dentro do capsídeo, assim, o genoma do dsRNA nunca é exposto
no citoplasma, sendo este um importante mecanismo de evasão da ativação do estado
anti-viral da célula hospedeira em resposta ao dsRNA.
A transcrição do genoma do dsRNA pela RPDR ocorre no interior do virion. A
fita positiva atua como mRNA, dando origem a novas partículas virais, enquanto a fita
negativa serve de molde para a transcrição em mRNA.
A tradução dos vírus da família Totiviridae ocorre no citoplasma do hospedeiro,
produzindo um capsídeo que muitas vezes pode estar fusionado com a RDRP. Motivos
de aminoácidos importantes para a função da polimerase são conservados entre as
sequências de RDRP de diferentes membros da família Totiviridae sugerindo que os
vírus possuem mecanismos semelhantes para a trancrição. As partículas virais maduras
são transmitidas a novas células pela divisão celular (MAGA et al., 1995).
23
1.5 RELAÇÃO LRV1 E HOSPEDEIRO HUMANO
Já foi demonstrado que existe uma relação entre o vírus dsRNA de Leishmania e
o hospedeiro humano, com consequências importantes sobre a manifestação clínica da
leishmaniose. LRVs foram detectados em lesões ativas, curadas e cicatrizadas,
confirmando a presença do LRV em diferentes isolados (CADD et al., 1993; SALINAS
et al, 1996; SAIZ et al., 1998), entretanto, a sua prevalência e o significado clínico ainda
não são conhecidos. Em Leishmania, o papel do LRV1 no metabolismo do parasita e na
expressão de genes não foi estudado em detalhes e não há informações sobre por que
algumas cepas de Leishmania são capazes de manter a infecção de LRV1 e outras não
(HARTLEY et al., 2012).
Embora estudos moleculares sobre o LRV1 tenham mantido uma continuidade
desde a sua primeira descrição, o interesse no seu papel funcional e clínico permaneceu
desconhecido. Vários grupos especularam a influência da presença do LRV1 na
virulência do parasita e anos passaram sem grandes estudos sobre o impacto biológico
do LVR1 em parasitas Leishmania (HARTLEY et al., 2012). O interesse no LRV1
como um determinante para a virulência do parasita ressurgiu em 2011 através de um
estudo realizado por Ives e colaboradores em 2011 com o uso de clones de L.
guyanensis isolados de pacientes. As amostras foram previamente classificadas devido a
sua tendência a metástase, variando de altamente metastásico (M+) para não
metastásico (M-) utilizando como modelo hamsters infectados. O resultado mostrou
que L. guyanensis (L.g.M+) que resultavam em lesões mucosas, apresentavam o vírus
LRV1 e aumentavam a resposta imune endógena de forma não regulada, pois
promoviam o aumento de citocinas inflamatórias. Quando inoculados em camundongos,
esses clones resultaram em um fenótipo de grave destruição da mucosa nasofaríngea,
apesar da efetiva redução do número de parasitas. Os macrófagos infectados com o
vírus apresentaram um fenótipo semelhante ao de macrófagos infectados com parasitas
que levaram a metástase, com aumento da expressão de quimiocinas CXCL10, CCL5,
Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF- α) e interleucina 6 (IL-6) demonstrando também
que o LRV1 isoladamente, induz a amplificação da resposta inflamatória aos antígenos
da Leishmania (IVES, 2011).
Não se sabe como o LRV1 é mantido e transmitido em parasitas Leishmania. A
transmissão extracelular de Totivírus é rara, embora já foi documentada para vírus que
infectam G. lamblia (RO et al., 1997). Na família Totiviridae, a propagação viral é
24
vertical (de mãe para filha) ou horizontal (pela fusão de células) (DALZOTO et al.,
2006). A infecção de vírus livre de Leishmania falhou ou durou apenas transitoriamente
em estudo realizado por Armstrong em 1993, fato este descrito em outros trabalhos com
Totivírus. Assim, a transferência extracelular do vírus dsRNA provavelmente não
ocorre em Leishmania.
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
Determinar se o Leishmaniavírus ocorre em pacientes atendidos no ambulatório
do Centro de Medicina Tropical de Rondônia – CEMETRON, e averiguar se existe uma
possível relação entre a presença do vírus e a progressão para a forma mucosa da
doença.
2.2 ESPECÍFICOS
- Verificar se a presença do Leishmaniavírus está relacionada com o tipo de
lesão observada, cutânea ou mucosa;
- Determinar a frequência relativa das espécies de Leishmania em relação aos
casos de LTA atendidos no serviço de referência do estado de Rondônia;
- Verificar a relação entre as espécies identificadas e a presença/ausência do
Leishmaniavírus;
3 METODOLOGIA
O projeto foi aprovado no CEP/CEPEM no dia 28 de novembro de 2011 com o
número 0020.0.046.000-11 (Anexo I).
3.1 CASUÍSTICA
Foram analisadas 137 amostras de pacientes com suspeita clínica de
leishmaniose que foram atendidos no Centro de Medicina Tropical de Rondônia –
CEMETRON, localizado em Porto Velho. Todos os pacientes foram informados sobre a
pesquisa e sua participação formalizada com a assinatura do termo de consentimento
livre e esclarecido – TCLE (Apêndice A).
O início da coleta das amostras foi em 30 de março de 2012 e se estabeleceu
periodicamente até o dia 20 de dezembro de 2012. Além do TCLE os pacientes eram
submetidos a um questionário que tinha por finalidade investigar o possível local de
25
infeccção, anteceedentes ao aparecimennto da lesãão, dados socioeconôm
micos e pesssoais
(Apêêndice B).
LETA DA AMOSTRA
A
3.2 COL
Para coleeta do materrial foram uutilizadas du
uas estratégias de coletta:
1- Para as lesões cutâneas,
c
fooram utilizaadas escovaas cervicaiss (Figura 3) que
eram
m colocadas em contato direto com
m as bordas das
d lesões.
m
a coleta foi feita por um
u médico especialistta em
2- Para as lesões mucosas,
otorrrinolaringologia que ap
pós realizaçção da bióp
psia para o exame hisstopatológicco de
rotinna, colocavaa a escova cervical em
m contato com
c
a lesão
o e por vezzes enviavaa uma
biópssia da mucoosa para exaame molecuular.
Todas ass coletas eraam realizaddas em duplicatas, send
do uma desttinada à exttração
de D
DNA e outraa à extração
o de RNA. O materiall coletado era
e estocadoo imediatam
mente
em ssolução de RNALater®
R
® (Ambion) para preserrvar os ácid
dos nucleicoos e mantidas à 20º C até o mom
mento das an
nálises moleeculares.
Figura 3 - A: Escov
va cervical utilizada na
n coleta, B:
B Paciente com LTA
A
A
B
B
Fonte: A: im
magem googlee; B: Pacientee com LTA, arquivo
a
pessoal do Dr Ciprriano Ferreirra.
As amostras coletaadas foram
m estudadass somente para os prrocedimento
os da
pesquuisa e obedeceram aos critérios daa Resolução
o CNS 441/2
2011.
TRAÇÃO DE DNA
3.3 EXT
Para exttração de DNA
D
total ffoi utilizado
o o kit PureeLink Genoomic DNA Mini
Kit™
™ (Invitroggen®), seg
guindo as recomend
dações do fabricante com alg
gumas
adeqquações paraa o tipo de amostra.
a
26
Protocolo de extração de DNA de amostras coletadas com escova cervical:
Transferir a escova para um tubo de 1,5 mL e adicionar Digestion Buffer até o
recobrimento total da escova (~250µL) e 20 µL de Proteinase K. Vortexar por 15
segundos e colocar no banho maria à 55ºC por 20 minutos vortexando a cada 5 minutos.
Descartar a escova cervical, adicionar 200µL de Lysis Buffer e vortexar. Adicionar
200µL de Etanol 100%, vortexar e passar todo o líquido para a coluna. Centrifugar a
10.000 x g por 1 minuto. Descartar o filtrado e proceder com as lavagens com os
tampões disponíveis no kit.
A eluição do DNA foi realizada duas vezes com volume de 70µL de tampão de
eluição para o máximo aproveitamento do DNA. Após eluição, as amostras foram
estocadas em freezer -20ºC até o momento das análises.
3.4 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE - PCR - PARA DETECÇÃO
DE DNA DE Leishmania
Utilizando-se o DNA extraído de lesões de Leishmania, a PCR é capaz de
detectar a presença do DNA do parasita mesmo quando não são observadas as formas
amastigotas no exame microscópico de rotina (ROTUREAU et al, 2006;
CAVALCANTI et al, 2009).
Para detecção de DNA de Leishmania foram utilizados três pares de primers
para diferentes alvos, conforme descrito na Tabela 1 e somente após a confirmação do
diagnóstico para Leishmania, as amostras foram submetidas aos passos seguintes para
identificação do vírus.
Tabela 1 - Descrição dos primers utilizados para detecção de DNA de Leishmania.
Primer
Alvo Molecular
Referência
LITSR 5’-CTGGATCATTTTCCGATG-3’
L5.8S 5’- TGATACCACTTATCGCACTT-3’
Espaçador Interno Transcrito 1
(ITS1)
El Tail et al., 2000
kDNA F 5'-GAACGGGGTTTCTGTATGC-3'
kDNA R 5'-TACTCCCCGACATGCCTCTG-3'
Minicírculo do DNA do
cinetoplasto (kDNA)
Degrave et al., 1994
Hsp70cF 5-GGACGAGATCGAGCGCATGGT 3’
Hsp70cR 5´-TCCTTCGACGCCTCCTGGTTG-3’
Proteína de choque térmico 70
(hsp70)
da Graça et al., 2012
27
Em todas as reaçõess de PCR, fo
foram utilizaados como controles
c
poositivos cep
pas de
Leishhmania
a
amazonensi
is
(PH8--IFLA/BR/6
67/PH8),
Leishmaniia
guyan
nensis
(MH
HOM/BR/755/M4147) e Leishman ia brazilien
nsis (MHO
OM/BR/75/M
M2903), ceedidos
pelo laboratório de Biotecn
nologia Apliicada à Saud
de da Fiocru
uz Rondôniia.
3.4.1 Esppaçador Inteerno Trancrrito 1 – ITS1
O par dee primers LITSR e L5..8S amplificcam um fraagmento de 300 a 350 pares
de bases (Figurra 4) que pertencem
p
aao Espaçad
dor Interno Transcrito 1 – ITS1, uma
regiãão não codifficante pressente na subbunidade menor do ribossomo, esttão presentees em
multiiplas cópiass e são bem
m conservadoos para o gêênero em esstudo. Os geenes ribosso
omais
são aaltamente reepetidos no genoma de Leishmania
a (cerca de 100 cópias)) e consistem
m em
segm
mentos consservados sep
parados porr sequênciaas espaçado
oras variáveeis, ITS1 e ITS2
(LON
NG; DAWIID, 1980). Isso se tornna uma vantagem para a identificaação taxonô
ômica
deviddo às sequêências conseervadas e ass variações dos espaçaadores. Assiim, primerss para
essa região vêm
m sendo um
ma ferramennta útil paraa identificação ao níveel de espéccie de
Leishhmania.
Figu
ura 4 - Reg
gião amplifficada utilizzando primers para o ITS1
Fon
nte: Adaptado
o de Manual Molecular Prroducers, LeiishEpiNetSA
A, 2009.
dos os segu
uintes reaggentes com suas
Para a reação de PCR foraam utilizad
respeectivas conccentrações conforme
c
deescrito na taabela 2.
Tabeela 2 – Protoocolo utilizaado nas reaçções de PCR
R - ITS1
Componentte
Co ncentração
Quantidade/1
Q
reação
Primer ITS11
2µM
M
1 µL de cada pr
primer
dNTP Mix
10m
mM
1 µL
Tampão 10xx
10X
X
5 µL
MgCl2
25m
mM
1,5 µL
Taq Polimerrase
5U/
U/ µL
0,25 µL
DNA
--
6 µL
H 2O
--
Qsp
Q p/ 50µL
28
As condiições do PC
CR estão desscritas no essquema abaaixo:
94º C por 2 min
Desn
naturação Iniicial
94º C por 30 seg
55º C por 15 seg
30 ciclos
72º C por 30 seg
72º C por 10 min
Extensão Final
me final da reação
r
foi dde 50µL. Os produtos de PCR forram visualisados
O volum
em ggel de agaarose 1,5% corado coom GelRed
d™ (Ambio
on®) (Figuura 5) e ap
pós a
confi
firmação da infecção, uma
u
alíquotta do produ
uto de PCR
R foi utilizadda para dig
gestão
com a enzima dee restrição (Tabela
(
3).
Fiigura 5 - G el de agaro
ose para IT
TS1
M
1
2
3
5
4
6
3550pb
1000pb
5
50pb
M: marcador
m
de p
peso molecula
ar de 50 pb; 1 a 4: amostraas
posiitivas para Leeishmania sp; 5 e 6: controles positivo..
LP - ITS1
Tabeela 3 - Protoocolo utilizaado nas reaçções de RFL
Compon
nente
Produto de PCR
Tampão da enzima
HaeIII
H 2O
Conceentração
Qua
antidade/1 reaação
--
15 µL
10X
2 µL
5U/ µL
1 µL
--
µL
Qsp p/ 20 µ
A reaçãoo foi colocaada em banhho-maria po
or no mínim
mo duas horras a temperratura
de 337º C. Quaando necesssário, após o tempo mínimo paara digestãoo, a enzim
ma era
inativvada colocaando a amosstra no term
mociclador por
p 20 minu
utos a 80ºC.
Após a reação de PCR utilizzando os in
niciadores descritos
d
accima, é possível
identtificar 12 espécies de Leishmaniaa pela técniica de Polim
morfismo ddo Fragmen
nto de
Restrrição (RFLP
P) com a en
nzima HaeIIII (Figura 6)).
29
Figgura 6 - Esp
pécies identtificadas e tamanho dos
d fragmen
ntos de ITSS1 após dig
gestão
com HaeIIII
Digestão com
c
HaeIII
I
Espéciess
Tamanhho dos
fragmentoos após
digestãoo com
HaeIIII
Fonte: Man
nual Molecular Producerss.
Esse sisttema tem a vantagem de ser altaamente específico e iddentificar as três
princcipais espéccies de Leisshmania quue ocorrem
m na região (Figura 6,, destaque azul),
porém
m a diferennça no perfil de bandass das espéciies L. braziliensis e L. guyanensiss é de
apennas 6 paress de base (Figura
(
6, destaque vermelho)
v
o que dificcultou e caausou
confu
fusão na leeitura dos géis
g
(Figurra 7). Além
m disso, co
omo não sse sabe o perfil
epideemiológico da leishmaaniose em Rondônia, se fez necessário a uutilização de
d um
sistem
ma que idenntificasse as demais esspécies já descritas na Região Norrte, além dee uma
maioor diferenciação na ideentificação das mesmaas evitando
o possíveis erros. Paraa este
fim, foi utilizadoo o sistema hsp70.
30
Figgura 7 - PCR
R RFLP paara identifiicação de espécies de L
Leishmania
a
por IT
TS1
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
200 pb
150 pb
100 pb
50 pb
Geel de poliacrrilamida 12%
% corado com
m prata. PCR-RFLP ITSS1 digerido
coom HaeIII. M:
M marcadorr de peso mo
olecular 50 pb;
p 1: infecçãão mista L.
am
mazonensis e L. guyanens is; 2 e 5: L. guyanensis;
g
3:
3 L. amazoneensis; 4 e 6:
neegativo; 7: co
ontrole negati
tivo; 8 e 9: co
ontroles posittivos L. braziiliensis e L.
gu
uyanensis respectivamentee.
3.4.2 Heat-Shock Prrotein – hspp70
O ensaioo de PCR--RFLP paraa a proteín
na do choqu
ue térmico 70 (hsp70
0) foi
recenntemente deescrita como
o uma ferraamenta simp
ples e universal para a iidentificaçãão das
espéccies de Leisshmania do Novo e Veelho Mundo (MONTAL
LVO et al., 2010). Estee alvo
já foii utilizado com
c
sucesso
o para distinnguir espéciies de Leish
hmania circuulantes no Brasil
B
(da S
SILVA et all., 2010), po
orém a sua sensibilidaade era com
mprometida ppelo tamanh
ho do
fragm
mento ampllificado (14
400 pb). Em
m 2012, da Graça e co
olaboradoress desenvolv
veram
um ssistema que amplifica uma
u região m
g
hsp70 (hsp70c)
(
dee Leishmaniia sp.,
menor do gene
que ffoi utilizadoo neste trabaalho. Os fraagmentos am
mplificadoss variam de 243 a 384 pb de
compprimento e estes foram
m digeridoss com a enzima de restrição BsuR
uRI que posssui o
mesm
mo sítio de restrição
r
daa enzima HaaeIII.
Para as reações
r
de PCR
P
foram uutilizados os
o reagentess descritos nna tabela 4.
Tabeela 4 – Protoocolo utilizaado nas reaçções de PCR
R – hsp70
Componentte
Con
ncentração
Qua
antidade/1 reeação
Priimer hsp70
2µM
1 µL de cadaa primer
dN
NTP Mix
10mM
1 µLL
Taampão 10x
10X
5 µLL
MgCl2
25mM
1,5 µLL
Taqq Platinum®
5U/ µL
0,5 µLL
DNA
--
8 µLL
H 2O
--
Qsp p/ 500 µL
31
As condiições do PC
CR estão desscritas no essquema abaaixo:
94º C por 4 min
Desn
naturação Iniicial
94º C por 15 seg
58º C por 30 seg
33 ciclos
72º C por 30 seg
72º C por 6 min
Extensão Final
me final da reação
r
foi dde 50µL. Os produtos de PCR forram visualisados
O volum
em ggel de agaroose 2% corrado com G
GelRed™ que
q foram submetidos
s
a eletroforrese a
200V
V por 20 minutos (Figu
ura 8).
Fig
gura 8 - Geel de agarosse para hsp
p70
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0
2500 pb
1000 pb
50 pb
M: marccador de peso
o molecular 550 pb; 1, 3, 4,, 6 7 8: amosttras positivass para Leishm
mania
sp.; 2: am
mostra positiva para Leiishmania com
m espécie nã
ão identificadda por RFLP; 5:
amostra negativa
n
para Leishmaniaa; 9: controlee positivo pa
ara L. guyaneensis; 10: con
ntrole
negativo.
Uma alííquota do produto
p
am
mplificado foi
f utilizadaa para a reeação de RFLP,
R
confo
forme descriito na tabelaa 4.
Tabeela 5 – Protoocolo utilizaado para RF
FLP - hsp70
0
Componeente
Conccentração
Qu
uantidade/1 reação
Produto de
d PCR
--
10 µL
Tampão da
d enzima
10X
2 µL
µ
BsuRI
µL
5U/ µ
1 µL
µ
H2O
--
16 µL
32
As amosstras foram colocadas
c
eem banho-m
maria por du
uas horas a 337º C e aplicadas
em ggel de poliaccrilamida a 12% a 100V
V por 1 hora (Figura 9)).
Figura 9 - PCR RF
FLP para id
dentificação
o de espéciees de Leishhmania porr
hsp70
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
200pb
150pb
100pb
50pb
Gel de poliacrila
amida 12% ccorado com prata.
p
PCR-R
RFLP hsp70 digerido com
m
BsuR
RI. M: marca
ador de peso molecular dee 50 pb; Linh
ha 1: branco; Linhas 2, 5, 6
e 7: L. braziliensiis; Linhas 3 e 4: L. shawii; 3 e 8: L. sh
hawi; 8: contrrole negativo
o;
Linh
has 9, 10 e 11: Controlees positivos L. aamazoneensis, L. braaziliensis e L.
L
guya
anensis respectivamente.
3.4.3 DN
NA do Cinettoplasto – kkDNA
O DNA de cinetop
plasto (kDN
NA) de Leisshmania tem
m sido utiliizado como
o uma
ferraamenta de diagnóstico
o pela PCR
R, devido a capacid
dade de deetectar pequ
uenas
quanntidades de DNA do paarasito em m
materiais biológicos.
b
Representa
R
de 20 a 25% do
DNA
A do parassita e consiste em um
ma rede dee moléculaas circularees, divididaas em
maxiixírculos e minicírculo
os. Os maxxixírculos são
s molécu
ulas grandees com cercca de
20.0000 a 35.0000 pares de bases, que conttêm genes que codi ficam protteínas
mitoccondriais e o RNA rib
bossomal ((rRNA). São extremam
mente homoogêneas enttre os
diferrentes grupoos que comp
põe a ordem
m Kinetoplasstida, e estãão presentess em cerca de
d 2050 cóópias por cinetoplasto.. Os minicíírculos são moléculas menores,
m
appresentam-sse em
grandde quantidaade (10.000
0 unidades por cinetop
plasto) e co
om sequênccias heterog
gênias
entree os gruposs. Dessa maneira,
m
sãoo amplameente utilizad
dos para seeparar classes e
gêneros e poucoo utilizados para separaar espécies (TELLERIA
(
A et al., 20006).
Cada minicírculo dee Leishmannia é compo
osto de umaa molécula dde DNA cirrcular
de 5000 a 1000 pares de baases de com
mprimento. Apresenta uma regiãoo conservad
da de
aproxximadamennte 200pb contendo trêês blocos de sequênciaas conservaadas em tod
das as
espéccies de Leeishmania. O restantee da moléécula apresenta sequêências altam
mente
33
variáveis, contendo um grande número de nucleotídeos A e T. Portanto, nessa região,
podem-se encontrar sequências específicas para os diferentes grupos de Leishmania
(DEGRAVE et al., 1994). Os primers descritos na tabela 1 amplificam um fragmento de
90 pares de bases dos minicírculos do cinetoplasto.
A escolha desse alvo surgiu da necessidade de detectar os parasitas Leishmania
em lesões mucosas, onde é sabido que a parasitemia é baixa e a coleta poderia
apresentar baixa sensibilidade, porém não permite a identificação da espécie.
Tabela 6 – Protocolo utilizado nas reações de PCR - kDNA
Componente
Concentração
Quantidade/1 reação
Primer kDNA
2µM
0,5 µL de cada primer
dNTP Mix
10mM
1 µL
Tampão 10x
10X
5 µL
MgCl2
25mM
1,5 µL
Taq DNA Polimerase®
5U/ µL
0,25 µL
H 2O
--
7,75µL
DNA
--
4 µL
O volume final da reação era de 20 µL. As condições da PCR estão descritas no
esquema abaixo:
94º C por 2 min
Desnaturação Inicial
94º C por 15 seg
57º C por 15 seg
25 ciclos
72º C por 15 seg
As amostras amplificadas eram visualizadas em gel de agarose a 2% coradas
com GelRed™ (Figura 10).
34
Figura 10 - Geel de agaro
ose para kD
DNA
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
100 pb
50 pb
M: marccador de peso
o molecular d
de 50pb; Linh
has 1 a 7: amo
ostras positivvas para kDN
NA; 8:
con
ntrole positivoo de Leishma
ania; 9: controle negativo.
Após a detecção
d
e identificaçã
i
ão da espéciie de Leishm
mania, era ddado o segm
mento
de annálise do LR
RV.
3.5 EXT
TRAÇÃO DE RNA
A extraçção do RNA
A foi utilizaado o Kit de
d extração
o de RNA ttotal PureLink™
RNA
A Mini Kit, Ambion®,
A
com algum
mas adequaçõ
ões ao tipo de amostra..
Protocolo de extraçãão de RNA de Escova Cervical:
Transferrir a escova cervical paara um micrrotubo de 1,5 ml e adiccionar 500µ
µL do
tamppão de lisee. Homogen
neizar no vórtex até que as células pareecessem lissadas.
Centtrifugar o hoomogeneizaado a 10.0000 x g por 2 minutos. Adicionar 5500µL de etanol
e
70%. Vortexar por 15 segu
undos e obbservar a formação de precipitadoos. Transferrir até
µL da amosstra para a coluna
c
com
m o microtub
bo de coleta. Centrifuggar a 12.000 x g
700µ
por 15 segundoos a temperatura ambbiente (23º C). Descarrtar o filtraado e reinseerir a
colunna no microotubo de coleta. Efetuaar as lavageens com os tampões
t
dee lavagem (II e II)
centrrifugando a 12.000 x g por 15 ssegundos. Centrifugar
C
a coluna ppor 2 minu
utos a
12,0000 x g paraa secagem da membraana. Descarrtar o microtubo de ccoleta e inserir a
mem
mbrana no microtubo
m
dee eluição. A
Adicionar 30
0µL de águ
ua livre de R
RNAse no centro
c
da cooluna, incubbar por 1 miinuto a tempperatura am
mbiente e ceentrifugar a 12.000 x g por 2
minuutos. Estocaar o RNA em
m freezer -220ºC.
3.6 SÍNT
TESE DE cD
DNA
Para a sííntese de cD
DNA foi utillizado o kit SuperScrip
ptIII™, Inviitrogen® (T
Tabela
6).
35
Tabeela 7 – Reaggentes utilizzados para a síntese de cDNA
Compon
nente
Concentrração
Quantiddade
2µM
M
1 µLL
dNTP Mix
10mM
M
1 µLL
Tampão RT
10X
X
2 µLL
25mM
M
4 µLL
UT™
RNaseOU
40 U/ µL
µ
1 µLL
SuperScrript III™
200 U/ µL
1 µLL
2 U/ µL
µ
1 µLL
0,1 M
2 µLL
EPC
Água DE
--
3 µLL
RNA Tottal 5µL
--
5 µLL
Primer LRV
L
Forward
MgCl2
RNase H™
H
DTT
A reação foi realizzada de accordo com o protocollo descrito pelo fabriicante
(Figuura 10) com
m a substituiição do Ranndom primeer fornecido
o no kit peloo primer forrward
especcífico para amplicação
a
do LRV1 ((Figura 11)..
ura 11 - Prootocolo de síntese
s
de cDNA
Figu
36
AÇÃO DE AMPLIFICA
A
AÇÃO DO LEISHMANIAVÍRUSS
3.7 REA
Ao final da síntese de cDNA, uuma alíquotta de 5 µL foi
f retirada para a reaçção de
PCR
R.
Para a deetecção do LRV1,
L
foram
m desenhad
dos primers que amplifficam a regiião da
ORF
F1 do genom
ma do vírus (Figura 12)).
Figurra 12 - Região amplifiicada para detecção do
d LRV e seequências dos
d
primers uttilizados
mento amplifficado foi dde 245 parees de base. Os produtoos de PCR foram
f
O fragm
subm
metidos a um
ma eletrofo
orese por 200 minutos a 200V em gel de agaarose 2% co
orado
com GelRed™ (Ambion®)
(
) diluído connforme espeecificações do fabricannte (Figura 13).
Fig
gura 13 - G
Gel de agaro
ose para LR
RV
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 112
13
250 pb
50 pb
Gel de agarose
a
2% co
orado com G
GelRed™. M: marcador dee peso molecuular 50 pb; 1 a
11: amostras positivas para LR
RV1; 12: controle negativo; 13: controole positivo.
37
O controle positivo utilizado em todas as reações para detecção do LRV1 foi
uma cepa de L. guyanensis infectada com LRV1-4 (MHOM/BR/1975/M4147), cedido
pela Coleção de Leishmania do Instituto Oswaldo Cruz do Rio de Janeiro – CLIOC.
A cepa do controle positivo foi mantida em meio de cultura Schneider
suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2% de urina humana filtrada e antibióticos
até sua estabilização e após, mantida em freezer -80 C.
3.8 ANÁLISES DOS DADOS
A análise dos dados foi realizada utilizando o programa SPSS versão 19. Foi
realizada análise descritiva das frequências absolutas observadas bem como foram
calculadas as frequências relativas e seus respectivos intervalos de confiança de 95%.
Para avaliação de hipóteses de associação foi utilizado o teste exato de Fisher,
considerando 0,05 a probabilidade máxima para rejeição da hipótese nula (α = 0,05).
Foi utilizada a probabilidade unicaudal, considerando que e hipótese nula (H0) é a de
que não há relação entre a presença de LRV1 e o tipo de lesão e a hipótese alternativa
(Ha) é de que o LRV1 tem sua frequência aumentada em pacientes com lesão mucosa.
Em algumas tabelas foram calculados o risco relativo bem como os intervalos de
confiança de 95% da presença do LRV1 em pacientes com lesão mucosa. O risco
relativo é definido pela razão da probabilidade da presença do LRV1 em lesões mucosas
sobre a probabilidade da ausência do LRV1 em lesões mucosas:
(LRV1 + &Mucosa)
TotalLRV1 +
Riscorelativo = (LRV1 − &Mucosa)
TotalLRV1 −
4 RESULTADOS
Após a identificação das duas primeiras amostras positivas para o LRV1, as
bandas foram purificadas do gel de agarose e juntamente com o controle positivo
utilizado nas reações, enviadas para sequenciamento para a confirmação da detecção do
vírus.
O sequenciamento foi realizado pela Plataforma de Sequenciamento do Centro
de Pesquisa Gonçalo Moniz, Fiocruz-BA (RPT01B) que utiliza a metodologia de
sequenciamento descrita por Sanger, 1977.
38
Foi reallizado um alinhamennto múltip
plo com as
a sequênccias obtidaas no
sequeenciamentoo (Figura 14), onde obbservamos alta similaaridade entrre as sequêências
compparadas.
Fiigura 14 - Alinhament
A
to múltiplo
o das sequên
ncias de LR
RV
Seq
quências obtidas no sequenciamento doo fragmento amplificado
a
do
d controle ppositivo e de duas
d
am
mostras posittivas para Leeishmaniavíru
us.
bém foram
m comparadas com as sequênciass depositadaas no
As sequuências tamb
banco de dados,, onde obserrvamos quee:
1- A sequência do
d controle positivo confirma
c
qu
ue a cepa utilizada estava
e
infecctada com o LRV1-44 (Apêndicce F), conforme foi informado pela
Coleeção de Leeishmania ddo Instituto
o Oswaldo Cruz do R
Rio de Jan
neiro–
CLIOC;
2- A seequência daa primeira aamostra possitiva para o vírus connfirma a infe
fecção
virall e apresentta maior sim
milaridade com
c
o subtiipo do LRV
V1-13 (Apêêndice
F) enquanto qu
ue a sequênccia da segu
unda amostrra indica maaior similarridade
com
m o subtipo LRV1-10
L
(A
Apêndice F)).
39
Os resultados observados podem ser resumidos na Tabela 8. Foram analisados
um total de 137 amostras de pacientes com suspeita clínica de leishmaniose tegumentar
americana, destas, 121 amostras foram positivas em pelo menos um dos alvos
moleculares testados (kDNA, Hsp70 e ITS1) e 16 foram negativas para os três testes
(Tabela 8). Devido a maior diferença no perfil de bandas visualizadas no gel de
poliacrilamida após a digestão enzimática, o sistema hsp70 foi o utilizado para
determinar a frequência das espécies de Leishmania descritas na tabela 9. O sistema
ITS1 não foi utilizado para identificação das espécies, pois a diferença no perfil de
bandas entre L. braziliensis e L. guyanensis é de apenas 6 pares de bases, conforme
demostrado na figura 7, o que poderia prejudicar e causar erros nas determinações das
espécies.
Três pacientes com lesão cutânea e LRV-; um paciente com lesão mucosa e
LRV- e um paciente com lesão cutânea e LRV+ apresentaram PCRs negativos
considerando apenas o sistema hsp70, porém positivos em um dos outros dois sistemas.
Para efeito de estimativas realizadas, esses pacientes foram tratados da mesma forma
que os pacientes classificados como “não identificados” para espécie.
Tabela 8 - Distribuição geral dos resultados obtidos no trabalho, classificados pela
ausência ou presença do Leishmaniavírus, pelo tipo de lesão e pela espécie conforme
detectado usando o sistema hsp70.
LRV1LRV1+
Espécie (hsp70) /Tipo de
lesão
LC LM LC e LM LC LM LC e LM LCD
Total
-
-
-
-
-
-
1
1
L. braziliensis
L. braziliensis e L.
guyanensis
L. guyanensis
27
8
3
17
17
1
-
73
1
1
-
-
1
-
-
3
16
5
-
9
3
-
-
33
L. guyanensis e L.
amazonensis
-
-
-
-
1
-
-
1
L. shawi
2
-
-
-
-
-
-
2
sp. não identificada
4
1
-
2
1
-
-
8
Negativo
13
3
-
-
-
-
-
16
59
18
3
32
23
1
1
137
L. amazonensis
Total
LRV1+: Leishmaniavírus positivo; LRV1-: Leishmaniavírus negativo; LC: Leishmaniose
cutânea; LM: Leishmaniose mucosa; LCD: Leishmaniose cutâneo-difusa.
Foram identificadas quatro espécies de Leishmania no total de amostras
analisadas, L. braziliensis, L. guyanensis, L. amazonensis e L. shawi (Tabela 8). As
40
espécies mais frequentes foram L. braziliensis (60,3%) e L. guyanensis (27,3%). Foram
identificadas quatro infecções mistas, três causadas por L. braziliensis e L. guyanensis e
uma causada por L. guyanensis e L. amazonensis (Tabela 9).
Tabela 9 - Frequência das espécies de Leishmania encontradas utilizando hsp70
Espécie
%
IC95%
L. amazonensis
0,8%
2,4%
1
L. braziliensis
60,3% 51,6% 69,0%
73
L. braziliensis e L. guyanensis
2,5%
5,2%
3
L. guyanensis
27,3% 19,3% 35,2%
33
L. guyanensis e L. amazonensis
0,8%
0,0%
2,4%
1
L. shawi
1,7%
0,0%
3,9%
2
Não identificado
6,6%
2,2%
11,0%
8
Total
0,0%
Frequência
0,0%
121
Do total de 121 (88,3%) amostras positivas no PCR para detecção do parasita
Leishmania, 78 (64,5%) eram de lesões cutâneas e 38 (31,4%) eram de lesões mucosas
(Tabela 10).
Tabela 10 - Distribuição das formas observadas da doença.
Resultado PCRs
Tipo de Lesão
Positivo
IC95%
Frequência
88,3%
82,9%
93,7%
121
Cutânea
64,5%
55,9%
73,0%
78
Cutânea e mucosa
3,3%
0,1%
6,5%
4
Difusa
0,8%
0,0%
2,4%
1
Mucosa
31,4%
11,7%
23,1%
6,3%
39,7%
17,1%
38
16
Cutânea
81,3%
62,1%
100,0%
13
Mucosa
18,8%
0,0%
37,9%
3
Negativo
Total
% Observada
137
O LRV1 foi detectado em 43,8% das amostras analisadas (Tabela 11), sendo
relativamente mais frequente em lesões mucosas do que em lesões cutâneas. Em relação
ao tipo de espécie, o LRV1 teve uma frequência maior em L. braziliensis (Tabelas 12 e
13).
41
Tabela 11 - Detecção do Leishmaniavírus em amostras positivas para Leishmania sp.
por tipo de lesão.
LRV
Tipo de Lesão
% Observada
IC95%
43,8%
35,0% 52,6%
53
Cutânea
52,8%
39,4% 66,3%
28
Cutânea e mucosa
1,9%
0,0%
5,5%
1
Difusa
1,9%
0,0%
5,5%
1
Mucosa
43,4%
30,1% 56,7%
23
56,2%
47,4% 65,0%
68
Cutânea
73,5%
63,0% 84,0%
50
Cutânea e mucosa
4,4%
0,0%
9,3%
3
Mucosa
22,1%
12,2% 31,9%
15
Positivo
Negativo
Frequência
Total
121
Visando evitar a influência de possíveis fatores de confusão, foram adotadas
duas estratégias de análise da associação entre a presença do LRV e a forma da lesão.
Em ambas as estratégias foram realizadas análises sem discriminação de espécie e
considerando apenas pacientes que apresentaram a doença causada por L. guyanensis e
L. braziliensis. A primeira estratégia (Tabela 12), mais restritiva, foi realizada utilizando
dados de pacientes (N= 108) que atendem aos seguintes critérios:
a) Apenas pacientes com lesões mucosas ou cutâneas (excluídos forma difusa ou
mista);
b) Apenas amostras obtidas de pacientes com lesão mucosa coletadas utilizando
biópsia;
c) Apenas amostras obtidas de pacientes com lesão cutânea coletadas utilizando
escova cervical;
O resultado obtido nas análises utilizando a “estratégia 1” foi estatisticamente
significativo (p= 0,001) e mostram que o LRV1 têm associação com o tipo de lesão
mucosa quando não é considerada a espécie em que o vírus foi detectado, com risco
relativo igual a 2,810 (IC95% 1,419...5,561).
Em relação a L. guyanensis, não foi possível detectar associação
estatisticamente significante do LRV com a forma mucosa (p= 0,237), entretanto, o
risco relativo (1,875 - IC95% 0,607... 5,790) da presença do vírus em lesão mucosa
causada por L. guyanensis seguiu a mesma tendência do observado na análise conjunta.
Este resultado pode estar relacionado com o pequeno número amostral observado (35
pacientes), que influencia diretamente no poder do teste de associação.
42
Já a relação do vírus com a L. braziliensis em lesões mucosas, mostra
associação significativa (p=0,007), e risco relativo igual a 2,747 (IC95% 1,226...6,156).
Tabela 12 – Distribuição das frequências de LRV1 em função do tipo de lesão,
agrupados e separados pelas espécies mais frequentes no estudo, com pacientes
incluídos conforme critérios estabelecidos como “Estratégia 1”.
Sem separação de
espécie
LM
N
%
LC
IC95%
N
%
IC95%
LRV1+
21 42,9% 35,8% 49,9% 28 57,1% 50,1% 64,2%
LRV19 15,3% 10,6% 19,9% 50 84,7% 80,1% 89,4%
Total
p=0,001; R.R.=2,810 (IC95% 1,419...5,561)
L. guyanensis
LM
N
%
LC
IC95%
N
%
IC95%
LRV1+
5 35,7% 22,9% 48,5% 9 64,3% 51,5% 77,1%
LRV14 19,0% 10,5% 27,6% 17 81,0% 72,4% 89,5%
Total
p=0,237; R.R.=1,875 (IC95% 0,607...5,790)
L. braziliensis
LRV1+
LRV1Total
LM
N
%
LC
IC95%
N
%
IC95%
16 48,5% 39,8% 57,2% 17 51,5% 42,8% 60,2%
6 17,6% 11,1% 24,2% 28 82,4% 75,8% 88,9%
Total
49
59
108
Total
14
21
35
Total
33
34
67
p=0,007; R.R.=2,747 (IC95% 1,226...6,156)
* Teste exato de Fisher considerando distribuição unicaudal; R.R. – risco relativo; LC –
lesão cutânea; LM – lesão mucosa; IC95% - intervalo de confiança de 95%.
A segunda estratégia de análise (Tabela 13) foi realizada utilizando dados de
pacientes (N= 116) que tinham lesões mucosas ou cutâneas (excluídos aqueles com
lesão difusa ou mista). Nesta estratégia, foram incluídos os pacientes com leishmaniose
mucosa sem lesão, coletados com escova cervical.
Nesta análise, observamos um resultado significativo, porém, menos
significativo (p=0,010) ao compararmos com a “estratégia 1”. Isso ocorreu pela inclusão
de 8 pacientes que tinham lesão mucosa e que não foram analisados na tabela 12 por
não obedecerem os critérios de inclusão. Desses 8 pacientes, somente 2 foram positivos
para o LRV1, enquanto que nos pacientes que foram coletados biópsias ou escova
cervical após a biópsia, foi observada maior frequência do LRV1 em lesões de mucosa.
Por esse motivo, levamos em consideração que o tipo de coleta para as lesões de
43
mucosa pode ter influenciado no resultado dos testes moleculares, pois não foi sensível
para detecção do vírus.
Tabela 13 - Distribuição das frequências de LRV1 em função do tipo de lesão,
agrupados e separados pelas espécies mais frequentes no estudo, com pacientes
incluídos conforme critérios estabelecidos como “Estratégia 2”.
Sem separação de
espécie
LM
N
%
LC
IC95%
N
%
IC95%
LRV1+
23 45,1% 38,1% 52,1% 28 54,9% 47,9% 61,9%
LRV115 23,1% 17,9% 28,3% 50 76,9% 71,7% 82,1%
Total
p=0,010; R.R.=1,954 (IC95% 1,142...3,344)
L. guyanensis
LM
N
%
LC
IC95%
N
%
IC95%
LRV1+
5 35,7% 22,9% 48,5% 9 64,3% 51,5% 77,1%
LRV16 26,1% 16,9% 35,2% 17 73,9% 64,8% 83,1%
Total
p=0,397; R.R.=1,369 (IC95% 0,512...3,660)
L. braziliensis
LRV1+
LRV1Total
LM
N
%
LC
IC95%
N
%
IC95%
18 51,4% 45,0% 57,8% 17 28,0% 21,6% 34,4%
9 25,7% 18,3% 33,1% 26 74,3% 66,9% 81,7%
Total
51
65
116
Total
14
23
37
Total
35
35
70
p=0,016; R.R. = 2,114 (IC95% 1,100...4.063)
* Teste exato de Fisher, considerando distribuição unicaudal. R.R. – risco relativo, LC –
lesão cutânea, LM – lesão mucosa, IC95% - intervalo de confiança de 95%.
5 DISCUSSÃO
Das sete espécies descritas na região amazônica como agentes etiológicos da
LTA, quatro foram identificadas neste trabalho. As espécies mais frequêntes foram
Leishmania braziliensis e Leishmania guyanensis, que também são as espécies mais
frequêntes no Brasil (SHAW, 1994), sendo a primeira de ampla distribuição em todo o
país e, a segunda, mais relatada na região Norte (LAINSON, 1994).
As infecções causadas por L. braziliensis ou L. guyanensis possuem diferentes
características clínicas como tamanho e localização das lesões cutâneas e envolvimento
linfático (ROMERO et al., 2001b). Também já foi demonstrado que os pacientes
infectados com uma dessas espécies apresentam uma baixa taxa de cura terapêutica
(ROMERO et al., 2001a). As características clínicas das lesões, bem como os fatores
relacionados ao tratamento e sua eficácia não foram foco desse trabalho. O hospital
44
CEMETRON, onde foi realizado o estudo, é um centro de referência em doenças
tropicais, onde idealmente os casos atendidos são os de maior complexidade. Essa
característica pode ter influênciado nos resultados obtidos, como a frequência das
espécies e o tipo de lesão. Porém, sabe-se que no estado, existem poucos locais onde o
atendimento para pacientes com leishmaniose é realizado, e por vezes utilizam o
CEMETRON para suprir a demanda de atendimentos.
Nesse trabalho, a espécie mais frequênte foi Leishmania (Viannia) braziliensis
(60,3%). Na região Norte de forma geral, com excessão do Amazonas, esse é o principal
agente etiológico da LTA e é considerada a espécie com o maior potencial patogênico
ao homem, uma vez que tem ampla associação com a leishmaniose mucosa. Bacha em
2009, no município de Santarém no Pará identificou o parasito L. braziliensis em 57%
das amostras. Em Rondônia, a epidemiologia das espécies foi pouco estudada. Shaw e
colaboradores em 2007 identificaram a espécie de Leishmania de 12 pacientes no
municípo de Monte Negro, e destas, 7 foram identificadas como L. braziliensis.
Em relação ao tipo de lesão das infecções causadas por L. braziliensis, nossos
resultados confirmam que esta espécie é a principal responsável pelos casos de
leishmaniose mucosa na região, onde do total de 38 lesões mucosas, 25 eram causadas
por L. braziliensis. Em lesões cutâneas (n=78), 44 eram causadas por L. braziliensis.
A segunda espécie mais frequente foi a L. guyanensis (27,3%). Esta espécie
possui alta frequência na região amazônica, Ela é predominante ao norte do Rio
Amazonas, incluindo os estados do Acre, Amapá, Roraima, Amazonas e Pará
(GRIMALDI et al., 1989). Em algumas regiões da Amazônia, esta espécie é mais
frequente que a L. braziliensis. Naiff e colaboradores em 1999 relatam que, das espécies
de Leishmania identificadas de 65 pacientes com LTA na região amazônica, a L.
guyanensis foi encontrada em 83% dos casos, e destes, 91% apresentavam lesão
cutânea.
Os casos de envolvimento mucoso causado por essa espécie eram considerados
raros (SANTRICH et al., 1990), porém, nos últimos anos essa espécie vêm sendo
associada com a forma de destrutiva da doença (GUERRA et al., 2011). Cinco isolados
de leishmaniose mucosa de Rondônia foram descritos por Guerra e colaboradores em
2011, sendo 4 classificadas como L. braziliensis e 1 como L. guyanensis, os demais
isolados da região Norte relatados por Guerra, mostraram uma alta frequência de lesões
45
mucosas causadas por L. guyanensis (16 casos), sendo este o primeiro relato de
leishmaniose mucosa causado por L. guyanensis em Rondônia.
Os nossos resultados mostraram que além da L. braziliensis, a L. guyanensis
também está associada aos casos de leishmaniose mucosa em Rondônia. De um total de
33 L. guyanensis, 8 foram detectadas em lesões mucosas. Guerra em 2011 relatou que
em 41 lesões mucoas, 26 eram causadas por L. braziliensis e 8 por L. guyanensis, o que
muito se assemelha aos nossos resultados.
L. braziliensis possui elevada diversidade genética e isolados da região
amazônica apresentam uma maior variabilidade que os isolados de outras regiões do
Brasil (CUPOLILLO et al., 2003) e supõe-se que há uma relação entre a variação
genética do parasito e a forma clínica apresentada pelo paciente (SCHRIEFER et al.,
2009) sendo esta a principal espécie relacionada com a forma mucosa. No presente
trabalho, observamos que a espécie de L. guyanensis teve uma frequência elevada em
lesões mucosas, sugerindo que esta espécie também pode estar relacionada com a
evolução da doença.
Um dos pontos interessantes que foi observado foram os casos de infecção mista
(n=4). Três pacientes apresentavam lesão mucosa, dois causados por L. braziliensis e L.
guyanensis e um por L. guyanensis e L. amazonensis, e um apresentava lesão cutânea
única causada por L. braziliensis e L. guyanensis. Nos casos de leishmaniose mucosa,
podemos sugerir que os pacientes, por residirem em área endêmica e já possuírem uma
lesão cutânea anterior ao desenvolvimento da lesão mucosa, foram infectados duas
vezes por diferentes parasitos, porém, o paciente com lesão cutânea única sugere
também que a infecção ocorreu simultaneamente pelos dois diferentes parasitos. Um
estudo para avaliar a infecção de flebotomíneos dessas áreas seria interessante a fim de
esclarecer as infecções mistas.
As Leishmanias do subgênero (Viannia) parecem não possuir um único fator
para o risco de desenvolvimento de metástase e/ou lesões complicadas e de difícil
tratamento. Fatores secundários como fatores intrínsecos do parasita e o tipo de resposta
imune desenvolvida pelo hospedeiro parecem contribuir de forma conjunta para a
evolução da doença.
A frequência do vírus em relação ao tipo de lesão foi superior em lesões
mucosas quando comparamos a sua frequência em lesões cutâneas. Em 78 lesões
46
cutâneas, o vírus foi detectado em 28 amostras, e em 38 lesões mucosas, 23 foram
positivas para o LRV1. Esse resultado sugere que o vírus pode ser um dos fatores
envolvidos na evolução da leishmaniose cutânea para a mucosa.
Os trabalhos que buscam estudar a epidemiologia do LRV1 são escassos e até o
momento se restrigem apenas a alguns países da América do Sul. O primeiro relato do
LRV1 em culturas de isolados clínicos foi descrito por Saiz em 1998, onde dois
pacientes (18%) de um total de 11 foram positivos para o LRV1. Em 2003, Ogg e
colaboradores detectaram o vírus em 12 amostras (25,5%) de 47 positivas para
Leishmania na cidade de Caratinga, Minas Gerais, porém, destas, somente uma era de
lesão mucosa, obtendo resultados inconclusivos da relação do vírus com a evolução da
doença.
Este trabalho é o segundo realizado com amostras clínicas do Brasil para
detectar o LRV1 e com o maior número de casos investigados até o momento. Os
resultados obtidos mostram que o vírus foi positivo em 53 (43,8%) de um total de 121
amostras positivas para Leishmania sp.. Outro aspecto interessante do presente trabalho
é de que a detecção do LRV foi feita em amostras obtidas diretamente dos pacientes,
sem que fosse realizada a cultura. É possível que no processo de estabelecimento de
cultura haja algum fator que dificulte a obtenção de linhagens positivas.
O LRV1 já foi relatado em cepas de Leishmania guyanensis, Leishmania
braziliensis e Leishmania major (TARR et al., 1988; STUART et al., 1992; WILDMER
et al., 1989; SALINAS et al., 1996; SCHEFFTER et al., 1995). Este é o primeiro relato
do LRV1 em parasita da espécie L. amazonensis, bem como o trabalho que investigou a
presença do vírus no maior número de casos (n=137) de acordo com as fontes
depositadas em bancos de dados. Os trabalhos citados que pesquisaram a presença do
vírus em amostras clínicas, não relacionaram a espécie do parasita com a presença do
vírus.
Nas nossas análises, o vírus foi mais frequênte em L. braziliensis, de 73 parasitas
dessa espécie, 34 foram positivos para o vírus. Em L. guyanensis (n=33), o vírus foi
detectado em 12 amostras. A relação do vírus com a espécie do parasita deve ser
avaliada com um maior número de casos de L. guyanensis.
A metodologia utilizada no trabalho demostra também que para fins de
identificação da espécie do parasita, a coleta realizada nas lesões cutâneas foi eficiente,
47
sensível e não invasiva, podendo ser realizada por técnicos que já realizam os exames
de rotina para detecção do parasita (exame parasitológico para pesquisa de Leishmania).
Em casos de lesão mucosa, onde a parasitemia normalmente é baixa, a coleta com a
escova cervical, sem lesão, não demostrou tanta sensibilidade se comparado às lesões
cutâneas.
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A identificação das espécies de Leishmania que circulam em determinado foco
de transmissão, particularmente em regiões onde as diferentes formas clínicas ocorrem
simultaneamente, é muito importante para o conhecimento da epidemiologia das
leishmanioses e planejamento de estratégias de controle. No estado de Rondônia, este
foi o estudo que analisou o maior número de casos, obtendo resultados significativos
para as espécies circulantes na região.
As espécies mais frequentes foram L. braziliensis, responsável por 60,3% dos
casos identificados e L. guyanensis com 27,3%. A relação destas espécies com a
evolução da leishmaniose cutânea para a mucosa justifica o fato de que na região em
estudo, um maior número de pacientes evolui para a forma mucosa da doença.
Em relação à presença do vírus e a espécie de Leishmania, esta relação teve
associação com a Leishmania braziliensis em lesões mucosas, onde o risco relativo de
quem tem LRV1 e L. braziliensis ter a lesão mucosa foi de 2,747 (IC95%
1,226...6,156). Podemos observar que a evolução da doença para a forma mucosa, não
está relacioanada somente com a presença do LRV1, uma vez que existem lesões
mucosas sem o vírus, e também que a virulência do parasita faz parte do arranjo de
fatores que favorecem o agravamento da infecção.
Embora o LRV provavelmente não seja o único fator envolvido, a sua presença
pode explicar as diferenças nos resultados clínicos observados entre as espécies de
Leishmania e tem um grande potencial como novo alvo para estratégias de tratamento.
Há a possibilidade terapêutica tendo como alvo o próprio LRV.
A possibilidade de que o desenvolvimento para a LM é influênciado por uma
resposta imune contra o patógeno viral pode ser utilizado como prognóstico para o
desenvolvimento do risco de lesão mucosa com a identificação do vírus nas lesões
primáriase e a perspectiva de um novo tratamento que evite a evolução da doença.
48
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55
APÊ
ÊNDICE A – TERMO
O DE CONS
SENTIMEN
NTO LIVR
RE E ESCL
LARECIDO
O
NÚ
ÚMERO DO
PA
ACIENTE:
RMO DE CONSENTIIMENTO LIVRE
L
E ESCLAREC
CIDO
TER
VOC
CÊ ESTÁ SENDO CONVID
DADO (A)) COMO VOLUNT
TÁRIO (A
A) A
PAR
RTICIPAR DA PESQUISA:
VE
ERIFICAÇÃ
ÃO DA PRE
ESENÇA D
DE LEISHM
MANIAVÍR
RUS EM AM
MOSTRAS DE
PACIEN
NTES COM
M LEISHMA
ANIOSE CU
UTÂNEA E MUCOCU
UTÂNEA
ATENDIDOS NO CENTRO
C
D
DE MEDICIINA TROPICAL-CEM
METRON
I) JU
USTIFICAT
TIVA: A leisshmaniose ttegumentar,, conhecida popularmeente como feeridabravaa é uma inffecção de manifestaçã
m
ão cutânea apresentand
a
do feridas inndolores naa pele
e/ou mucosas (boca,
(
narizz) do pacieente. É um
ma doença transmitida
t
pela picad
da do
mosqquito infecttado e tem maior ocorrrência em áreas ruraiss, próximass a florestass, e é
consiiderada um
m problema de saúde pública mundial
m
pelaa Organizaçção Mundiial de
Saúdde. Em todaas as regiõees brasileiraas, a leishm
maniose estáá presente, sendo a Região
R
Nortee responsáável pela maior
m
partee dos caso
os. Alguns pacientes que trataraam a
leishhmaniose cuutânea, anoss após cura aparente daas feridas, apresentam
a
uma formaa mais
gravee da doençaa que atingee as mucosaas. Os motivos que lev
vam ao aparrecimento dessas
d
lesõees não são totalmente esclarecidoos. Um estu
udo recentee sugere quue um vírus que
infeccta a Leishm
mania, conh
hecido comoo Leishman
niavirus (LR
RV1) pode eestar relacio
onado
com esse agravoo. Até o momento, nãão existem dados
d
do Leishmaniavvirus na Am
mérica
do Suul. Um núm
mero maior de casos deeve ser pesq
quisado paraa avaliar a hhipótese de que a
preseença do víruus está asso
ociada com
m o desenvolvimento su
ubseqüente de leishmaaniose
mucoosa, e se coonfirmada a hipótese, os pacienttes infectad
dos com o Leishmaniaavirus
podeerão ser trratados de forma esspecífica paara preven
nir o desennvolvimentto da
leishhmaniose muucosa.
II) O
OBJETIVO
O: Determin
nar se o Leishmaniaavirus (LR
RV1) ocorree em paciientes
atenddidos no am
mbulatório do
d Centro dde Medicin
na Tropical (CEMETRO
RON) e averriguar
se exxiste uma possível
p
relaação entre a presença do vírus e a progresssão para a forma
f
mucoocutânea daa doença.
III) P
PROCEDIM
MENTOS: Após
A
o aceeite do volu
untário em participar dda pesquisaa, este
recebberá o TCL
LE e os escclarecimentoos sobre a pesquisa. Serão
S
coletaados biópsiias de
teciddo do local da
d lesão e 5 ml de sanggue perifériico sob condições de aassepsia de rotina
r
hospitalar. A biópsia será coletada
c
poor um profisssional com
mpetente parra tal funçãão. As
lesõees que apreesentarem perfil
p
caractterístico parra o estudo
o, poderão sser fotograffadas,
podeendo o volunntário limitaar-se a forneecer somente as amostrras.
Existte um descconforto, e será de levve sensação
o dolorosa no momennto da coleeta de
sanguue por punçção justificaada para quee se possa reealizar o pro
ocedimentoo.
GAR
RANTIA DE ESC
CLARECIM
MENTO, LIBERDA
ADE DE RECUSA
A E
GAR
RANTIA DE
D SIGILO
O:
Vocêê será esclarrecido(a) so
obre a pesquuisa em quaalquer aspeccto que deseejar. Você é livre
para recusar-se a participar, retirar seeu consentim
mento ou in
nterromper a participaação a
56
qualquer momento. A sua participação é voluntária e a recusa em participar não irá
acarretar qualquer penalidade ou perda de benefícios.
O(s) pesquisador (es) irá (ao) tratar a sua identidade com padrões profissionais de sigilo.
Os resultados dos testes que serão realizados dentro de laboratório de pesquisa serão
guardados e enviados para você e permanecerão confidenciais. Seu nome ou o material
que indique a sua participação não será liberado sem a sua permissão. Você não será
identificado (a) em nenhuma publicação que possa resultar desse estudo. Uma cópia
deste consentimento informado será arquivada na Fundação Oswaldo Cruz – FIOCRUZ
RO e outra será fornecida a você.
CUSTOS DA PARTICIPAÇÃO, RESSARCIMENTO E INDENIZAÇÃ O POR
EVENTUAIS DANOS:
A participação no estudo não acarretará custos para você e não será disponível nenhuma
compensação financeira adicional.
DECLARAÇÃO DO (A) PARTICIPANTE (A) OU DO SEU RESPONSÁVEL:
Eu, __________________________________________, fui informada(o) dos objetivos
da pesquisa acima, de maneira clara e detalhada e esclareci minhas dúvidas. Sei que a
qualquer momento poderei solicitar novas informações e motivar minha decisão se
assim o desejar. O Professor Orientador Ricardo de Godoi Mattos Ferreira certificoume de que todos os dados desta pesquisa serão confidenciais.
Também sei que caso existam gastos adicionais, estes serão absorvidos pelo orçamento
da pesquisa. Em caso de dúvidas poderei chamar a estudante Lilian Motta Cantanhêde
e/ou o professor Orientador Ricardo de Godoi Mattos Ferreira, nos telefones (69) 3219
6008,
(69)
32196003
ou
nos
e-mails
[email protected]
e
[email protected]
Declaro que recebi uma cópia deste termo de consentimento livre e esclarecido e me foi
dada a oportunidade de ler e esclarecer as minhas dúvidas.
_________________________________, ________ de _____________de _____
___________________________________________________________________
Assinatura do Voluntário
______________________________________________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsável
Pesquisador Responsável:
Dr. Ricardo de Godoi Mattos Ferreira
Vice-diretor de Gestão e Desenvolvimento Institucional
Fiocruz Rondônia
BR 364, Km 3,5, Lagoa - Porto Velho – RO
57
APÊ
ÊNDICE B – FICHA DE
D ENTRE
EVISTA
NÚM
MERO DO
PAC
CIENTE:
FICH
HA DE EN
NTREVISTA
DADO
OS DA COL
LETA
LOC
CAL: ( ) CE
EMETRON
N ( ) OUT
TRO:
DAT
TA:
/
/
HORA:
:
min.
TIPO
O DE AMO
OSTRA: ( ) SWAB ( ) BIÓPSIA
OBS
S.:
( ) OUTRO::
DA
ADOS PES
SSOAIS DO
O PACIENT
TE
NOM
ME:
SEX
XO: ( ) F ( ) M
IDADE:
END
DEREÇO AT
TUAL: Ruaa
Nº
Bairro:
Estaddo:
NAC
CIONALIDA
ADE:
NA
ATURALID
DADE:
OBS
S.:
DADOS
D
SÓ
ÓCIO – ECO
ONÔMICOS
S
OCU
UPAÇÃO PR
RINCIPAL
L:
GRA
AU DE INST
TRUÇÃO:
TIPO
O DE CONS
STRUÇÃO (MORADIIA):
ABA
ASTECIME
ENTO DE ÁGUA/ENE
Á
ERGIA: ( )SIM
)
( )N
NÃO
OBS
S.:
ANT
TECEDENT
TES
TIPO
O DE LESÃ
ÃO:
LOC
CAL DA LE
ESÃO:
TRA
ATAMENTO
O: ( )SIM ( )NÃO
JÁ T
TEVE LEISH
HMANIOS
SE ANTES?? SIM ( ) NÃO ( )
RESP
PONSÁVE
EL: LILIAN
N MOTTA C
CANTANH
HÊDE
2012
Cid
dade:
58
APÊNDICE C – RESUMO APRESENTADO NO XVIII INTERNATIONAL
CONGRESS FOR TROPICAL MEDICINE AND MALARIA, SETEMBRO DE
2012
DETECTION OF THE LEISHMANIAVIRUS IN PATIENTS WITH CUTANEOUS AND
MUCOCUTANEOUS LEISHMANIASIS IN RONDONIA, WESTERN AMAZONIAN
REGION.
Cantanhede, LM1,2; Silva-Júnior, CF1; Ito, MM1; Custódio, MGF2, Alves, PH2, AragãoMacedo, SR1,2; Nicolete, R2; Salcedo, JMV1,2; Garrido, LM3; Pescarini, JM3; Krieger, H3;
Ferreira, RGM1,2.
1 Universidade Federal de Rondônia, UNIR
2 FIOCRUZ Rondônia, Porto Velho, RO, Brazil
2 Universidade de São Paulo, USP
Leishmaniavírus (LRV) is a dsRNA virus that infects the protozoa Leishmania and has been
detected in L. braziliensis and L. guyanensis. The presence of virus in the parasites was
recently associated with mucosal form of infection. The authors proposed that the virus
modifies the host immune response to the parasite and induce to destruction of the mucous
membranes. The largest number of cases of cutaneous leishmaniasis in Brazil occurs at the
Amazon region, caused by seven species of the parasite. The mechanisms that lead to
disease progression in mucosal form in about 10% of patients treated or under treatment
remain unclear, which led us to investigate whether the virus occurred in the region. We
collect swabs from lesions of 31 patients with clinical suspicion of leishmaniasis and two
patients with mucosal leishmaniasis. All samples were subjected to PCR amplification and
species identification by RFLP, resulting in 27 patients positive for leishmaniasis. RNA was
extracted from the positive samples and cDNA synthesized for PCR amplification using
primers specific for the virus genome, where nine patients were positive, including 2
patients with mucosal lesions. Two samples from subjects infected by L. guyanensis were
found to be positive for LRV infection, confirmed by capillary DNA sequencing. Other
seven samples, two from subjects infected by L. amazonensis, three infected by L.
guyanensis and two infected by non-identified Leishmania specie. To the authors’
knowledge, this is the first report of L. amazonensis infected by LRV and also the study
with the greatest number of subjects. 59
APÊNDICE D – RESUMO
BRASILEIRO DE GENÉTICA
APRESENTADO
NO
58º
CONGRESSO
LEISHMANIA SPECIES IDENTIFICATION ON CLINICAL SAMPLES FROM
CUTANEOUS AND MUCOCUTANEOUS LEISHMANIASIS PATIENTS IN
RONDÔNIA, WESTERN AMAZONIAN REGION.
Cantanhede, LM1; Silva-Júnior, CF2; Ito, MM2; Custódio, MGF1, Alves, PH1, Pimentel,
IF1; Ferreira, RGM1.
1
2
Fundação Oswaldo Cruz, Rondônia
Secretaria de Saúde do Estado de Rondônia, SESAU
[email protected]
Keywords: leishmania species, cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis.
The Cutaneous Leishmaniasis is endemic throughout the Amazon region and the state of
Rondonia is the third Brazilian state in number of reported cases, with an average of
1000 new cases per year. In Amazonia, seven different species of Leishmania, the
etiologic agent of human Cutaneous Leishmaniasis, have been described. The objective
of the present study was to identify the Leishmania species causing ACL in Rondonia,
Brazilian western Amazonian region. Until now, 38 samples were collected from
patients attended at the Centro de Medicina Tropical de Rondonia (CEMETRON) with
clinical suspicion of leishmaniasis, and 3 patients diagnosed with mucocutaneous
leishmaniasis. Samples were collected on cytology brush cotton swabs that were passed
over the scar/lesion, stored immediately in 1 ml of RNALater for conservation of
material, kept in temperature of the fridge until analysis. DNA was extracted by DNA
kit MagMAx Multi-Sample (Ambion ®) following the manufacturer's instructions.
Polymerase chain reaction (PCR) was performed using Leishmania-specific ribosomal
internal transcribed spacer 1 (ITS1-PCR) and the amplicons were digested with HaeIII
for subsequent restriction fragment length polymorphism (RFLP) species identification.
The PCR, performed on samples of 38 patients, was positive in 28 individuals, but in 8
samples it was not possible to characterize the species. Of the 20 species identified, 12
cases were caused by L. (V.) guyanensis, 5 cases by L. (V.) braziliensis and 2 cases by
L. (L) amazonensis. Only one of the 3 patients diagnosed with mucocutaneous
leishmaniasis was found to be infected by L. (V) guyanensis, the other two species were
not identified. The results found are different from the previous ones related on the area,
were the most frequent etiologic agent of the Cutaneous Leishmaniasis is L. (V)
braziliensis. Further sequencing analyses will be conducted to evaluate the present
results.
Financial Support: Capes and Fiocruz.
60
APÊNDICE E – RESUMO ACEITO PARA APRESENTAÇÃO NO FIFTH
WORLD CONGRESS OF LEISHMANIASIS
LEISHMANIA SPECIES IDENTIFICATION AND LEISHMANIAVIRUS DETECTION ON
CLINICAL SAMPLES FROM CUTANEOUS AND MUCOCUTANEOUS LEISHMANIASIS
PATIENTS IN RONDÔNIA, WESTERN AMAZONIAN REGION.
LILIAN MOTTA CANTANHEDE1; CIPRIANO FERREIRA DA SILVA JÚNIOR2; MARCOS
MASSAYUKI ITO3; MÁRLON GRÉGORI FLORES CUSTÓDIO4; PAULO HENRIQUE
ALVES5; ROBERTO NICOLETE6; JUAN MIGUEL VILALOBOS SALCEDO7; LEANDRO
MAZZA GARRIDO8; JÚLIA MOREIRA PESCARINI9; HENRIQUE KRIEGER10; RICARDO
DE GODOI MATTOS FERREIRA11.
1,4,5,6,7,11.FIOCRUZ RONDÔNIA, PORTO VELHO - RO - BRASIL;
2,3.UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA, PORTO VELHO - RO - BRASIL;
8,9,10.UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO, SÃO PAULO SP - BRASIL.
Keywords: leishmania species; leishmaniavirus; cutaneous and mucocutaneous
leishmaniasis.
The American tegumentary leishmaniasis (ATL) is endemic throughout the Amazon
region and the state of Rondonia is the third Brazilian state in number of reported cases,
with an average of 1000 new cases per year. In Amazonia, seven different species of
Leishmania have been described. Clinical manifestation may range from a cutaneous
form to the destruction of the mucosal tissues. The mechanisms that lead to disease
progression to the mucosal form in about 10% of patients treated or under treatment
remain unclear and might be related with parasite and host genetic factors, immune
response and more recently the presence a virus infecting the pathogen, named
Leishmaniavirus (LRV). The objective of the present study was to identify the
Leishmania species causing ACL in Rondonia, Brazilian western Amazonian region, as
well as verify if the LRV could be detected among studied patients and its possible
association with the presented clinical form. Cytology brush cotton swabs were
collected from lesions of 137 patients with clinical suspicion of leishmaniasis and stored
immediately in 1 ml of RNALater®. All samples were subjected to PCR amplification
and species identification by RFLP with primers to the internal transcribed spacer 1
(ITS1), to the heat shock protein (HSP70) as well as kinetoplastide DNA (kDNA) –
only for leishmaniasis diagnosis. 121 patients presented positive results for at least one
of the molecular tests applied. The most frequent species found using HSP70 was
Leishmania braziliensis 73 (60.3%), followed by Leishmnia guyanensis 33 (27.3%),
Leishmania shawi 2 (1.7%), Leishmania amazonensis 1 (0.8%) and mixed infection was
L. guyanensis and L. braziliensis 3 (2.5%), L. guyanensis and L. amazonensis 1 (0.8%).
Species from 8 (4.2%) patients were not identified. The cutaneous form was found on
78 patients, mucous form on 38, both forms on 4, and 1 patient presented the diffuse
form. For LRV detection, RNA was extracted from the positive samples and cDNA
synthesized for PCR amplification using primers specific for the virus genome. The
virus was detected in 57 patients (47.1% - 95%CI 38.1%...56.0%). A border line
association (p = 0.074, Fisher’s exact test) was found between the presence of LRV and
the form of the lesion (excluding the diffuse and mixed forms patients). Overall, the risk
of been positive for LRV among cutaneous form patients was 0.772 (95%CI
0,591…1.007) and among mucous for patients was 1,702 (95%CI 0.992…2.915)
61
APÊ
ÊNDICE
F
–
SEQ
QUENCIAM
MENTO.
BLAST
DAS
SEQUÊNC
S
CIAS
OB
BTIDAS
NO
Resultado da busca utillizando o BLA
AST da sequência obtida no
o sequenciame
mento do fragm
mento de PCR
R
do controlle positivo parra LRV.
Resultado da busca utillizando o BLA
AST da sequêência obtida no sequenciam
mento do fragm
mento de PCR
R
de uma am
mostra positivaa para LRV.
62
Resultado da busca utiliizando o BLA
AST da sequên
ncia obtida no sequenciameento do fragmeento de PCR
mostra positivaa para LRV.
de uma am
63
AN
NEXO I – PARECE
ER DO C OMITÊ DE ÉTICA
A PARA APROVA
AÇÃO DO
PR
ROJETO