CAMPUS DE SETE LAGOAS Camila da Silva Fernandes Souza Seletividade do Baculovirus spodoptera (SfMNPV) às espécies de lagartas do milho Sete Lagoas –MG Abril/2013 Camila da Silva Fernandes Souza Monografia apresentada à Universidade Federal de São João Del Rei, como parte das exigências do Programa de Graduação do Bacharelado Interdisciplinar em Biossistemas, para a obtenção do título de Bacharel em Biossistemas. Orientador: Marcos Antônio Matiello Fadini Coorientador: Fernando Hercos Valicente Sete Lagoas-MG Abril/2013 DEDICO Aos meus pais pelo apoio nos estudos por extrema dedicação e incondicional amor. AGRADECIMENTOS Primeiramente à Deus por nunca me abandonar. A Universidade Federal de São João Del Rei pela oportunidade de ingressar no programa de Bacharelado Interdisciplinar em Biossistemas. A Embrapa Milho e Sorgo por ceder suas dependências para realização do trabalho. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico pela bolsa de iniciação científica. Ao Doutor Fernando Hercos Valicente pela dedicada orientação, importantes oportunidades, carinho, apoio, valiosos ensinamentos e ajuda de sempre. Ao Prof. Marcos Antonio Matiello Fadini pelo apoio, confiança, oportunidade, disponibilidade e dedicação. A Profa. Cidália Gabriela Santos Marinho pela presença na banca de qualificação, contribuindo grandemente com o trabalho. Aos amigos do Laboratório de Controle Biológico, da Embrapa Milho e Sorgo Celso, Osmar, Arthur, Rosane, Thaís, Donald pelas ajudas experimentais e grandes alegrias no convívio no dia-a-dia de trabalho. Ao André pela ajuda, apoio, carinho, companhia, exemplo e ajuda de sempre. Aos meus amados pais Ronaldo e Wania pelo grandioso apoio e enorme amor. Aos meus irmãos Raphael, Daniel e Bruno pelo grande apoio, carinho e paciência. Ao meu namorado Thiago pelo carinho, apoio, paciência, dedicação e amor. A todos os meus amigos pelos momentos de descontração, apoio e carinho. A Vania por contribuir para o meu futuro com importante ensinamento, grande apoio e carinho. A toda minha família, tios, tias, primos, primas, avós e agregados pelo apoio e torcida. Às minhas grandes amigas Débora, Kelly, Alessandra e Fernanda pela torcida, carinho, demonstração de verdadeira amizade, apoio e por estarem sempre presentes em minha vida. Aos meus amigos do curso de biossistemas Fabrício, Carine e Priscilla pelo apoio, momentos de descontração, companhia e ajuda nos estudos. Aos colegas, funcionários, professores e pesquisadores da Universidade Federal de São João Del Rei e Embrapa Milho e Sorgo. E a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho meus sinceros agradecimentos e reconhecimento. “A ciência sem consciência e amor é a ruína do homem.” Guimarães Rosa RESUMO Os baculovírus são um grupo de vírus que possui toxidade para insetos. Estes vírus são isolados de invertebrados, principalmente lepidópteros e são específicos. Objetivou-se avaliar a toxidade do Baculovirus spodoptera (SfMNVP) - 6NR a, lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda), a lagarta-daespiga (Helicoverpa zea) e a broca-do-milho (Diatraea saccharalis). Foram utilizadas como alimento para inoculação do baculovírus folhas de milho cortadas em discos para lagarta-do-cartucho e para lagarta-da-espiga. Para D. saccharalis foram utilizados pedaços cortados de cana-de-açúcar. As folhas de milho e os pedaços de cana foram imersos em solução viral de Baculovirus spodoptera (SfMNVP) - isolado 6NR em diferentes concentrações. As larvas foram deixadas em contato com o alimento contaminado por 48 horas. Após este período elas foram transferidas para dieta artificial, e acondicionadas em sala aclimatizada em temperatura de 25,0 1ºC, 50,0 ± 10% UR e 8 horas de fotofase. Após a avaliação da mortalidade das larvas, foi feito acompanhamento da segunda geração das lagartas sobreviventes. Foram avaliados, para ambas as gerações, nas três espécies a porcentagem de mortalidade e pupação e o número de massas de ovos na primeira geração. O baculovírus foi específico para S. frugiperda e inócuo tanto para H. zea quanto para D. saccharalis na primeira geração. Na segunda geração o B. spodoptera (SfMNVP) - isolado 6NR foi inócuo para as três espécies de lagartas. A porcentagem de pupação apresentou relação inversa à mortalidade para as três pragas nas duas gerações. O número de massas de ovos foi menor em S. frugiperda e não alterou para D. saccharalis e maior em H. zea. O B. spodoptera (SfMNVP) - isolado 6NR é seletivo para S. frugiperda. Palavras-chave: lagarta-da-espiga, lagarta-do-cartucho, broca-do-milho, vírus entomopatogênico. ABSTRACT The baculovirus are groups of virus which present toxicity to insects. These virus are isolated from invertebrate, mainly in Lepidoptera and they are specific. This study had as objective to assess the toxicity of Baculovirus spodoptera (SfMNPV) 6 NR on the species of insects, fallarmyworm Spodoptera frugiperda, earworm Helicoverpa zea and Diatraea saccharalis. Leaves of corn cut in disks were used as food for inoculation of baculovirus for fallarmyworm and earworm. It was used cut pieces of sugar cane to D. saccharalis. The leaves of corn and the pieces of sugar cane were emerged into a viral solution from Baculovirus spodoptera (SfMNPV) 6 NR in different concentrations. The larvae were left in contact with the contaminated food for 48 hours. After this period they were transferred to an artificial diet, and conditioned inside an acclimatized room in a temperature of 25.0 1ºC, 50.0 ± 10% UR e 8 hours of photophase. After evaluating the mortality of the larvae it was done an accompanying of the second generation of the survival larvae. There were assessed for both generations on three species the percentage of mortality and pupa phase and the number of the mass of eggs on the first generation. The results showed that the used baculovirus was specific related to S. frugiperda and innocuous as to H. zea as to D. saccharalis on the first generation. On the second generation the B. spodoptera (SfMNPV) – 6NR was innocuous for the three species of larvae. The percentage of pupa had an inverse relation to mortality to the three pests in both generations. And the number of mass of eggs was less in S. frugiperda did not alter for D. saccharalis and more in H. zea. The B. spodoptera (SfMNPV) – 6NR is selective to S. frugiperda. Key words: earworm, fallarmyworm, corn borer, entomopathogenie virus. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 10 2. REFERENCIAL TEÓRICO .......................................................................... 13 2.1. A CULTURA DO MILHO .......................................................................... 13 2.2. CONTROLE BIOLÓGICO ......................................................................... 13 2.3. LAGARTA-DO-CARTUCHO DO MILHO (Spodoptera frugiperda) ........ 14 2.4. LAGARTA-DA-ESPIGA (Helicoverpa zea). ............................................. 16 2.5. BROCA-DO-MILHO (Diatraea saccharalis) ............................................. 17 2.6. Baculovirus spodoptera ............................................................................... 19 3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 24 3.1. CRIAÇÃO DE INSETOS ............................................................................ 24 3.2. CONTAGEM DE ESPOROS ...................................................................... 27 3.3. INOCULAÇÃO DO BACULOVÍRUS ....................................................... 28 4. RESULTADOS .............................................................................................. 31 4.1. EFEITOS LETAIS ...................................................................................... 31 4.2. EFEITOS SUBLETAIS ............................................................................... 35 5. DISCUSSÃO .................................................................................................. 37 6. CONCLUSÃO ................................................................................................ 40 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................ 41 INTRODUÇÃO O milho é uma gramínea pertencente à família Gramineae/ Poaceae e um dos cereais mais produzidos do mundo. De acordo com o último levantamento da companhia Nacional de Abastecimento (Conab, 2012), houve um destaque na segunda safra de milho que apresenta crescimento de 29,9% (1,41 milhão de hectares) passando de 6,17 milhões para 7,58 milhões de hectares. A soma das duas safras de milho totalizaram 72,78 milhões de toneladas. Uma das principais limitações na produção do milho é a presença de insetos praga como as lagartas. A lagarta-do-cartucho Spodoptera frugiperda é a principal praga do milho no Brasil reduzindo a produção de grãos em até 34% (Carvalho, 1970). A medida que as lagartas crescem as injúrias aumentam, passando de folhas raspadas para orifícios maiores, podendo causar injúria às plantas. Podem ainda injuriar a base da espiga ou mesmo diretamente os grãos leitosos (Cruz et al., 1995). Em laboratório, S. frugiperda pode ser criada com dieta artificial a base de feijão carioca, germe de trigo e farelo de soja, em temperatura entre 25 e 28 °C (Busato, 2004). As perdas de milho podem variar de acordo com a fase de desenvolvimento da planta, com as práticas de cultivo e localização do plantio próximo a áreas adjacentes que podem apresentar foco da praga (Cruz, 1995). Diversos inseticidas são registrados para o controle da lagarta-do-cartucho. Entretanto, o agricultor deve priorizar a seletividade visando a manutenção de populações de inimigos naturais (Cruz et al., 1995). A lagarta-da-espiga, Helicoverpa zea é considerada praga chave do milho nos Estados Unidos, causando maior dano dentre os demais insetos. O controle é difícil devido ao seu hábito de se instalar dentro da espiga. Portanto, o controle químico não é eficiente, além de deixar resíduos principalmente para consumo in natura (Cruz et al., 1995). Uma das principais causas da baixa 10 produção e redução da qualidade dos grãos são as injúrias causadas pela lagartada-espiga que facilita a entrada de micotoxinas e fungos, provocando ocorrência de grãos ardidos e perda de valor no comércio (Luiz & Magro, 2007). Essa espécie é importante, por causar injúria direta ao milho, parte a ser comercializada. Por esse motivo deve ser controlada logo após o início das posturas (Cruz et al., 1995). A broca Diatraea saccharalis também é uma praga de grande importância no milho atacando o colmo. Quando a D. saccharalis está completamente desenvolvida, constrói uma câmara, alargando a galeria até o colmo. Através dessas galerias, a broca torna a planta suscetível á queda por ação do vento, podendo surgir prejuízos indiretos, que talvez sejam os mais importantes, pois quando a planta cai, a espiga fica em contato direto com o solo, favorecendo a germinação dos grãos, ocorrência de doenças e ação dos microrganismos (Cruz et al., 1995). O controle de pragas de milho é comumente feito com o uso de inseticidas organo-sintéticos, que podem impactar negativamente o agroecossistema (Machado, 2009). Devido a esses efeitos negativos, buscam-se formas alternativas como controle biológico, que pode ser utilizado em associação com outras táticas de controle. Assim, utilizam-se, com sucesso, agentes entomopatogênicos, como vírus, fungos, nematóides ou bactérias no controle microbiológico (Oliveira et al., 2006). Uma das opções de utilização destes organismos no controle biológico de lagartas no milho é os baculovírus, que pertencem a um grupo de vírus que possui patogenicidade aos insetos (Almeida, 2010). Os baculovírus são da família Baculoviridae, possuem DNA de fita circular e tem grande potencial de afetar artrópodes e possui os gêneros nucleopoliedrovírus (NPV) e granulovírus (Gv) os quais atuam no intestino médio dos insetos (Valicente & Tuelher, 2009). Como essa região do sistema digestivo dos insetos é alcalino, os corpos de 11 inclusão viral são dissolvidos, liberando os virions (nucleocapsídeo mais o envelope). Quando os baculovírus atingem a hemolinfa e o sistema traqueal do inseto, se espalham e provocam infecções, causando a ruptura das membranas celulares. Neste processo o inseto perde a capacidade de se alimentar e se locomover e ocorre também uma descoloração do corpo do inseto. A multiplicação e disseminação desse vírus é muito eficiente (Moscardi & Souza, 2002). Esse entomopatógeno eficiente controle da S. frugiperda, promovendo mortalidade superior à 80% (Valicente & Tuelher, 2009). Além de sua eficiência, o baculovírus não afeta inimigos naturais, como por exemplo, os parasitóides (Valicente et al., 1988), o que torna técnica vantajosa frente ao controle químico. Neste trabalho, objetivou-se avaliar a toxicidade do Baculovirus spodoptera isolado 6NR sobre as lagartas de S. frugiperda, H. zea e D. saccharalis. 12 REFERENCIAL TEÓRICO A cultura do milho O milho (Zea mays L.) é uma gramínea muito cultivada em todo o mundo, e isso se deve ao fato de ser um produto agrícola utilizado na alimentação humana e animal. Ápos o processo de seleção natural e domesticação, foi possível produzir uma planta anual, vigorosa e ereta de até quatro metros de altura e uma maior eficiência na produção de grãos (Magalhães et al., 2002). Dentre os fatores que contribuem para redução da produção do milho, o ataque de pragas é um dos mais importantes. Para o controle dessas, utilizam-se tradicionalmente inseticidas organo-sintéticos. Esta prática, entretanto, quando mal utilizada por impactar negativamente o agroecossistema, reduzindo a população de inimigos naturais ou proporcionando o surgimento de populações de pragas resistentes. Assim, estimula-se a utilização de métodos de controle alternativo. Dentre esses, têm-se o controle biológico microbiológico é opção ao controle químico de pragas por reduzir riscos à saúde humana e ao meio ambiente (Cruz, 1995). Controle Biológico O controle biológico é uma das bases do manejo integrado de pragas e é definido como “a ação de inimigos naturais sobre uma população de pragas resultando numa posição geral de equilíbrio mais baixa do que prevaleceria na ausência destes” (Gravena, 1992). Esse tipo de controle vem sendo cada vez mais utilizado uma vez que a sociedade está mais consciente, sendo um importante passo para uma agricultura mais sustentável (Parra et al., 2002). Existem três tipos de agentes para o controle biológico, os predadores, os parasitoides e os microrganismos. Tais agentes podem ser empregados em 13 estratégias de controle biológico como: A introdução de inimigos naturais, chamado (controle biológico clássico); o natural que consiste em favorecer as populações de inimigos naturais, e (controle biológico aplicado) que é a multiplicação dos inimigos naturais em laboratório e aplicação no campo (Gravena, 1992). A agricultura causa impacto ambiental pela remoção da vegetação nativa e implementação de outra que exige o fim do processo de sucessão natural (Machado, 2009). Dentre as pragas, se destacam os insetos, que possuem sucesso habitacional, vivem praticamente em todos os locais e se adaptam facilmente às diversidades ambientais. Portanto, há necessidade de controle de populações de insetos praga de forma eficiente e sustentável. Em busca deste objetivo, atualmente utilizam-se com sucesso, agentes entomopatogênicos, sendo eles vírus, fungos, nematoides ou bactérias. Esses indivíduos são os mais usados nos métodos de controle biológico (Oliveira et al. 2006). Existem alguns exemplos de sucesso no controle biológico com entomopatógenos como: o fungo Beauveria bassiana que ataca coleopteros (e.g. moleque-da-bananeira), o fungo Insectonrum sporothrix que ataca hemípteros (e.g. percevejo-da-renda). Entre os vírus, além do Baculovirus spodoptera que controla a lagarta-docartucho, tem o vírus Baculovirus anticarsia que controla a lagarta-da-soja, e o vírus granulose que atua sobre o madorová-da-mandioca. O nematoide Deladendus siridicola controla a vespa-da-madeira e outro agente de sucesso é a bactéria Bacillus thuringiensis que atua em lagartas desfolhadoras (Oliveira, 2006). Lagarta-do-Cartucho (Spodoptera frugiperda) A lagarta-do-cartucho S. frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), foi reconhecida como praga do milho em 1797, na Geórgia, Estados Unidos (Cruz, 1995). Foi primeiramente nomeada Phalaema frugiperda. Desde então, mudou 14 de nome várias vezes, até a denominação atual (Cruz, 1995). A lagarta-docartucho é considerada a principal praga da cultura do milho no Brasil reduzindo a produção de grãos em até 34% (Carvalho, 1970). Seu controle é feito essencialmente com inseticidas organo-sintéticos, sendo que existem vários programas de controle biológico para o controle desta e outras pragas para minimizar os danos causados ao meio. O inseto adulto é uma mariposa com aproximadamente de 3,5 cm de comprimento, coloração pardo-escura nas asas anteriores e branco-acinzentada nas posteriores. As posturas são feitas em massa, com média de 150 ovos. O período para eclosão das larvas é de aproximadamente três dias. As larvas recém-eclodidas alimentam-se da própria casca do ovo e, posteriormente, as lagartas se alimentam das partes áreas da planta, provocando o sintoma conhecido como “folhas raspadas”. O que é um sintoma da presença da lagarta na cultura. A medida que as lagartas crescem, começam a fazer orifícios nas folhas, podendo causar severas injúrias às plantas. É comum também o ataque na base da espiga ou nos grãos leitosos (Cruz et al., 1995). As perdas no milho podem variar de acordo com a fase de desenvolvimento da planta, práticas de cultivo, presença da praga em áreas adjacentes, entre outros (Cruz et al., 1995). Diversos inseticidas são registrados para o controle da lagarta-do-cartucho. Deve-se, entretanto, preocupar-se com a sustentabilidade, priorizando a escolha da seletividade para que não afete os inimigos naturais, tenha alta eficiência e não interfira na saúde humana (Cruz et al., 1995). A utilização de inimigos naturais também é de grande ajuda no controle da lagarta-do-cartucho, onde não há a presença dos inimigos naturais a intensidade dos danos no milho é elevada (Figueiredo et al., 2006). A produtividade das lavouras pode aumentar em até 75 Kg/ha, em média, nas áreas onde é liberado o parasitóide Trichogramma pretiosum, inimigo natural da 15 lagarta-do-cartucho (Luiz & Magro, 2007), demostrando a magnitude do dano causado pelas lagartas. Lagarta-da-espiga (Helicoverpa zea) A Lagarta-da-espiga Helicoverpa zea (Lepidopetera: Noctuidae) possui como hospedeiro, além do milho, outras gramíneas, leguminosas e hortaliças. A lagarta-da-espiga é uma das mais importantes pragas de milho nos Estados Unidos (Cruz et al., 1995). O controle é difícil pelo seu hábito de alojar-se dentro da espiga. Assim, o controle com inseticidas não é eficiente. Por isso, fazse necessário a implementação de métodos de controle que sejam mais efetivos (Cruz et al., 1995). O ovo da H. zea mede aproximadamente 1 mm de diâmetro. Após a eclosão, as lagartas se deslocam para dentro da espiga deixando um característico orifício, o que facilita a sua identificação na planta (Cruz et al., 1995). A fêmea pode ovipositar em qualquer parte da planta, mas o faz com maior frequência no cabelo do milho. Cada fêmea oviposita em média mil ovos durante seu ciclo. Os ovos são depositados separadamente e geralmente um ou dois por planta (Cruz et al., 1995). A lagarta desenvolvida mede aproximadamente 3,5 cm e possui coloração variável de verde claro, rosa, marrom a levemente escura, com partes mais claras. As asas anteriores são de coloração amarelo-parda e as asas posteriores são mais claras, com uma faixa nas extremidades. Na fase do milho verde, como a lagarta possui comportamento canibal, encontra-se geralmente uma lagarta por espiga, na ponta desta. O período larval é de 13 a 25 dias e se aproxima da fase de pupa, as larvas vão para o solo para ocorrência do processo pupal. Este período necessita de 10 a 15 dias para se completar (Cruz et al., 1995). Uma das principais causas da baixa produção e baixa qualidade dos grãos são as injúrias causadas pela lagarta-da-espiga, que facilita a entrada de 16 micotoxinas e fungos, provocando a ocorrência de grãos ardidos, reduzindo valor no comércio (Luiz & Magro, 2007). O controle dessa praga deve ser feito após o início das posturas, e a utilização de cultivares com bom empalhamento, pode diminuir a incidência. O controle biológico dessa praga pode ser feito através de parasitoides, predadores e entomopatógenos o que pode proporcionar melhor produção do milho (Cruz et al. , 1995). Além do prejuízo direto causado pela lagarta-da-espiga, seu ataque favorece a infestação de outras pragas importantes, como o caruncho Sitophilus zeamais e a traça Sitotroga cerealella (Cruz et al., 1995). Luiz & Magro (2007) verificaram aumento na massa específica e no peso de mil sementes do milho para aquelas áreas onde foram liberados inimigos naturais. Atingiram-se valores de 514,6 g e 347,5 g, respectivamente, para massa específica e peso de 1000 sementes, comparados com os 505,2 g e 327,8 g obtidos nas áreas de manejo convencional das pragas. Isto mostra aumento na produtividade, havendo um acréscimo médio de 75 kg/ha. Foi observada também uma redução de cerca de 40% de incidência de grãos ardidos, nas áreas onde se utilizou o controle biológico. Broca-do-milho (Diatraea saccharalis) O inseto adulto da Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Pyralidae) é uma mariposa de coloração amarelo-palha de 20 mm de envergadura. Os ovos tem aspecto de escamas e são colocados nas folhas do milho, inicialmente possuem coloração amarelo-claro a alaranjado, que escurece quando se aproxima da eclosão. A eclosão das lagartas ocorre entre quatro a nove dias, sendo que inicialmente as larvas se alimentam da folha do milho, e depois se deslocam para a bainha, entrando no colmo, fazendo galerias ascendentes. A fase larval dura cerca de 70 dias, dependendo da temperatura. As lagartas possuem cabeça 17 marrom e o corpo esbranquiçado com certa transparência, com muitos pontos escuros. Quando as lagartas estão desenvolvidas, com o consumo do colmo, causam alargamento da galeria, este comportamento é característico quando se aproxima do período de pupa que varia de 9 à14 dias (Cruz et al., 1995). A ocorrência da broca pode ser constatada pela abertura do colmo do milho e da galeria deixada pela lagarta (Cruz et al. ,1995). Com o objetivo de implementar o manejo dessa praga utilizando o controle biológico, trabalhos são realizados primeiro em condições de laboratório. Por exemplo, D. saccharalis tem melhor eficiência de conversão de alimento ocorre em temperatura entre 25 e 30 ºC em laboratório com dieta artificial (Souza et al., 2001). As galerias provocadas por D. saccharalis deixam a planta mais vulnerável à queda pela ação do vento, o que é um prejuízo indireto (Cruz et al., 1995). Guevara (1980) em condições de laboratório, a fim de liberar machos estéreis no campo para diminuir a copulação das fêmeas de D. saccharalis, observou que os machos nunca copularam mais de uma vez com mesma fêmea, somente um macho copulou duas fêmeas diferentes. Nas mesmas condições, nenhuma fêmea foi copulada mais de uma vez, nem mesmo quando confinada com até quatro machos. Em condições de campo, as fêmeas podem copular até quatro vezes. Tornam-se necessários mais estudos, para verificação do número de cópulas do macho. Oliveira et al. (2008) confirmaram a eficiência do controle desta praga utilizando o fungo como agente entomopatogênico. Utilizaram-se fungos Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae com viabilidade de 95%. A média da viabilidade larval decresceu significativamente de acordo com a concentração utilizada. A menor viabilidade foi de 56% com a concentração de 105 conídios por ml. Em todos os parâmetros verificados obteve-se sucesso, e mesmo quando 18 não houve mortalidade, comprometeu as características da praga com fecundidade longevidade e viabilidade dos ovos. Baculovirus spodoptera Os baculovírus pertencem a um grupo de vírus que possui toxidade para insetos. Estes vírus são isolados de invertebrados, principalmente lepidópteros e são bem específicos. Os baculovírus não causam prejuízo à saúde humana nem ao ambiente, o que torna o seu uso vantajoso (Almeida, 2010). Os baculovírus são da família Baculoviridae, composta por vírus com DNA de uma fita dupla circular e possui dois gêneros: nucleopoliedrovírus (NPV) e granulovírus (GV). Os baculovírus possuem uma estrutura básica com um capsídeo coberto de uma forma arredondada. O nucleocapsídeo é um “core” cilíndrico de DNA e proteína, internamente a fita de DNA associa-se com uma proteína básica. Os nucleocapsídeos são organizados de formas diferentes dentro de cada envelope protéico, o que faz com que se dividam em dois grupos diferentes de acordo com a forma. Dentro do gênero nucleopoliedrovírus (NPV) tem os “vírus de simples nucleocapsídeo” – SNPV, o qual possui somente um capsídeo por envelope, e nos “vírus de múltiplos nucleocapsídeos” – MNPV, são encontrados vários nucleocapsídeos por envelope (Valicente & Tuelher, 2009). Esses vírus produzem dois tipos de fenótipos o “budded vírus” (BVs) e vírus derivados de corpos de oclusão (ODV). Os corpos proteicos de inclusão do baculovírus ficam expostos nas folhas pulverizadas, e a lagarta quando se alimenta, proporciona a entrada dos corpos de inclusão (CPIs) virais no sistema digestivo. Como o intestino médio dos insetos é alcalino, os CPIs são dissolvidos liberando os vírions. Então as membranas se fundem às membranas das microvilosidades das células epiteliais do intestino médio. Logo, os 19 nucleocapsídeos passam pelo citoplasma da célula e penetram nos poros nucleares até chegar ao núcleo e liberar o DNA viral, ocorrendo a transcrição dos genes do vírus e a replicação. Esses nucleocapsídeos que se formaram no núcleo passam pela membrana nuclear e atravessam a membrana basal da célula, adquirindo um novo envelope. Quando os BVs chegam à hemolinfa e ao sistema traqueal do inseto, se espalham e provocam infecções secundárias em outros tecidos do corpo do inseto. Nas células destes tecidos formam-se BVs e ocorre a disseminação célula á célula. Quando o estágio da infecção já está avançado, ocorre a oclusão dos vírions. Os núcleos dessas células tornam-se repletas de CPIs, liberando esses na hemolinfa do hospedeiro e causando a ruptura das membranas celulares. Neste processo de infecção, o inseto perde a capacidade de se alimentar e se locomover, se posicionando nas partes mais altas da planta onde morre entre cinco e oito dias, com descoloração do corpo (Moscardi & Souza, 2002). Nas duas últimas décadas, os baculovírus tem sido exportados para várias partes do mundo, a fim de controlar diversas pragas, como Spodoptera exigua (SeNPV), Helicoverpa zea e Heliothis virescens (HzNPV), Orgyia pseudosugata (OpNPV), entre muitas outras. Para classificação do baculovírus é necessária a purificação das partículas virais do corpo do inseto. Estes processos de purificação são realizados em ciclos de centrifugação em alternadas velocidades para separar os vírus de outras misturas e impurezas. Quando é necessário um maior grau de pureza, utiliza-se centrifugação em gradiente de sacarose. Depois das partículas purificadas, é possível fazer a classificação morfológica, bioquímica, molecular e biológica, cada classificação é feita por um processo diferente. Através da microscopia eletrônica é possível verificar a morfologia, que é de acordo com o número de capsídeo por vírion, podendo ser múltiplo ou simples e pela forma poliédrica ou ovalada. Na análise bioquímica, podem ser determinadas proteínas estruturais, identificadas através da 20 eletroforese com gel de poliacrilamida, separando as proteínas de acordo com o tamanho. A técnica de análise por endonuclease de restrição (REN) é usada para diferenciar ou identificar isolados de baculovírus e caracterizar a variação genotípica entre eles. Um gene específico pode permitir a identificação de um isolado viral particular, isto pode servir como monitoramento no campo após a liberação do vírus. Através de bioensaios pela sua dose letal média (DL50) é avaliado a patogenicidade do vírus em seu hospedeiro, e o tempo letal médio (TL50), também é um parâmetro importante para verificar o tempo de ação do vírus em seu hospedeiro (Souza et al., 2002). Foram encontrados na Colômbia três baculovírus isolados de Spodoptera frugiperda NPV003-Córdoba, NPYPP9-Meta e NPV011-Tolima. Eles foram isolados, identificados e caracterizados como vírus de múltiplos nucleocapsídeos, contendo de 1 à 8 vírions por nucleocapsídeo. Estes mostraram a mesma atividade em larvas recém-eclodidas, levando a aproximadamente 95% de mortalidade (Valderrama et al., 2010). Para a aplicação do baculovírus em campo é necessário a produção do inseticida biológico em laboratório. Neste processo utilizam-se lagartas sadias criadas com dieta artificial para serem utilizadas como hospedeiros. O tamanho das lagartas devem ser uniformes e com idade entre 5 e 7 dias para uma melhor eficiência na coleta das lagartas infectadas e mortas para multiplicação do vírus em maior escala. A temperatura e a umidade devem ser controladas. No caso de S. frugiperda, como é uma espécie canibal, após o quinto dia as lagartas devem ser separadas e confinadas em copos plásticos contendo dieta artificial até o término do ciclo da infecção para realização do processo de produção, que consiste na purificação e obtenção do produto final que é o pó molhável para aplicação no campo. Uma alternativa para eficiente produção, é utilização de um hospedeiro alternativo não canibal, que facilita o processo, reduzindo o tempo de produção (Valicente & Tuelher, 2009). 21 O inseto depois da morte rompe o corpo liberando vários vírus no ambiente, o que faz com que outro inseto possa também ser infectado após a ingestão desses. Foi encontrado em Cascavel, PR, um Baculovirus spodoptera que não rompe o tegumento da lagarta após sua morte, o isolado 6NR. Isto faz que não tenha a necessidade de congelar as lagartas antes da coleta para realização do processo de manipulação e produção, o que reduz a mão de obra, deixando valor do produto final mais baixo (Valicente et al., 2008). Como a multiplicação e disseminação do vírus são muito eficientes, a aplicação deste inseticida a base de baculovírus pode ser utilizado no campo em menor número, comparado ao inseticida químico (Moscardi & Souza, 2002), o que torna a técnica vantajosa. A determinação do tempo de viabilidade do produto biológico utilizado é muito importante para que a utilização no campo seja eficiente. Valicente & Tuelher (2009) avaliaram o tempo de prateleira do Baculovirus Spodoptera com caolin e zeólita. Após um ano de armazenamento não houve diminuição da eficiência no controle de S. frugiperda. Os autores também afirmam ser importante a adição de adjuvantes e proteção contra a luz ultravioleta para uma melhor eficiência do uso no campo. A adição de espalhante adesivo garante melhor aderência e cobertura nas folhas. Recomendase a sua aplicação no campo, após 16h para que não tenha uma menor incidência de radiação solar. Em experimento realizado para avaliar a interação do Baculovirus spodoptera em uma alta concentração e os inimigos naturais da S. frugiperda, foi observado que, após a aplicação do inseticida biológico a porcentagem de plantas atacadas caiu até 14,5%, e a presença de parasitóides e inimigos naturais como a tesourinha que preda os ovos foi significativa (Figueiredo et al., 2009). Bolonheiz et al. (2010) observaram o controle do Baculovirus spodoptera e um inseticida químico no controle da lagarta-do-cartucho, obtendo um resultado eficiente em ambos produtos. Mas o inseticida químico houve um 22 controle positivo independente do instar em que a lagarta se encontrava agindo em menor tempo depois da aplicação. Já o baculovírus houve uma eficiência em maior tempo depois da aplicação. Os autores concluem que o baculovírus pode ser utilizado juntamente com inseticidas químicos seletivos em subdosagens, para uma ação sinérgica e também evitando uma superdosagem de produtos químicos. Gomez et al. (1999) avaliaram a viabilidade de isolados geográficos em diferentes regiões do mundo e observaram que não houve diferença significativa do tempo letal entre os isolados, mostrando que a região não interfere e sim a suscetibilidade de cada inseto a determinado baculovírus. Polanczyk & Alves (2005) concluíram que quanto maior a concentração do vírus, melhor é sua interação com outros agentes de controle, neste caso utilizando a lagarta-docartucho. Almeida (2010) afirma que mesmo os isolados sendo do mesmo baculovírus podem apresentar diferentes modos de ação, diferente produção de corpos de oclusão mesmo submetidos ao mesmo processo de infecção De acordo com Valicente & Costa (1995) a eficiência na mortalidade das larvas de S. frugiperda, foi diretamente proporcional com a dosagem do vírus aplicado no campo, alcançando até 90,7% da mortalidade. Valicente et al. (1988) observaram um decréscimo na mortalidade de larvas de S. frugiperda, quando a infecção com baculovírus foi em lagartas mais velhas. Figueiredo (2004) observou que na aplicação do baculovírus não diminuiu a ocorrência dos inimigos naturais de S. frugiperda pela sua seletividade. Já depois da aplicação de inseticidas químicos, houve uma diminuição da presença dos inimigos naturais, provando a importância do uso do controle biológico para o equilíbrio ambiental. De acordo com os trabalhos citados pode-se constatar que a utilização do Baculovirus spodoptera constitui uma ferramenta alternativa ao controle de S. frugiperda. 23 MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi realizado na Embrapa Milho e Sorgo, Sete LagoasMG. O baculovírus utilizado foi o isolado 6 NR que foi retirado da lagarta Spodoptera frugiperda e não rompe o tegumento após a morte. O baculovírus foi retirado do banco da Embrapa Milho e Sorgo, purificado em gradiente de sacarose para retirada impurezas e aumento do grau de pureza do vírus. Criação de inseto As espécies testadas foram Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea e Diatraea saccharalis, provenientes da criação do laboratório de controle biológico, criadas em copos descartáveis de 50 ml com tampa de acrílico. As lagartas D. saccharalis foram depositadas em placas de petri e alimentadas com dieta artificial da eclosão até a fase de pupa. Após a emergência, os adultos foram alojados em gaiolas de PVC contendo papel ofício para oviposição. Utilizou-se como alimento solução açucarada (açúcar e ácido ascórbico), com exceção de D. saccharalis. As lagartas foram acondicionadas em sala aclimatizada em temperatura de 25,0 1ºC, 50,0 ± 10% UR e 8 horas de fotofase, onde também foram acondicionadas durante o experimento. Para a S. frugiperda foi usada a dieta artificial de acordo com Parra (1996) (Tabela 1). 24 Tabela 1: Dieta artificial usada na criação de lagartas S. frugiperda (PARRA,1996). INGREDIENTES QUANTIDADE Feijão (carioca) 333,0 g Ágar Puro 45,0 g Germe de Trigo 158,4 g Levedura de Cerveja 101,4 g Ácido Ascórbico (99%) 10,2 g Ácido Sórbico (99%) 3,3 g NIPAGIN (Metil-parahidroxibenzoato) 6,3 g Formol (Formaldeído 36,0%) 8,3 mL Sol. Inibidora (Ác. Propiônico 41,8%; Ác. Fosfórico 4,2%; Água 54,0%) 8,3 mL Água* 2.400,0 mL * Total de água suficiente para cozinhar o feijão, o ágar e triturar os demais ingredientes da dieta. 25 Para H. zea, foi utilizada a dieta artificial modificada de Grenne et al. (1976) ( Tabela 2). Tabela 2: Dieta artificial utilizada na criação de lagartas H. zea (GRENNE et al. 1976). INGREDIENTES Feijão Branco Farelo de soja Leite em pó QUANTIDADE 103,0 g 82,0 g 62,0 g Ágar Puro 35,0 g Germe de Trigo 164,0 g Levedura de Cerveja 103,0 g Ácido Ascórbico (99%) 9,8 g Ácido Sórbico (99%) 5,0 g NIPAGIN (Metil-parahidroxibenzoato) Solução vitamínica Tetraciclina 11,6 g 16,0g 0,2 g Formol (Formaldeído 36,0%) 10,0 mL Sol. Inibidora (Ác. Propiônico 41,8%; Ác. Fosfórico 4,2%; Água 54,0%) 8,3 mL Água* 2.400,0 mL * Total de água suficiente para cozinhar o feijão , o ágar e triturar os demais ingredientes da dieta. 26 Para D. saccharalis, utilizou-se a dieta artificial modificada de Hensley & Hammond (1968) (Tabela 3) Tabela 3: Dieta artificial utilizada na criação de lagartas D. saccharalis (HENSLEY & HAMMOND 1968). INGREDIENTES QUANTIDADE 2,0 g Cloreto de Colina Ágar Puro 70,0 g Germe de Trigo 90,0 g Sacarose (açúcar) 270,0 g Ácido Ascórbico (99%) Ácido Sórbico (99%) 4,0 g 3,0 g Farelo de Soja 400,0 g NIPAGIN (Metil-parahidroxibenzoato) 23,0 g Formol (Formaldeído 36,0%) Solução vitamínica Vita Gold Ampicilina (antibiótico) 5,0 mL 30,0 ml 2,0 ml 5,0 ml Ácido acético 30,0 mL Água* 3.900,0 mL * Total de água suficiente para cozinhar o ágar e triturar os demais ingredientes da dieta. Contagem de esporos Antes da inoculação, foi realizada contagem de poliedros/ml, em cada diluição utilizada: 5º Diluição- 10-5, 4º Diluição- 10-4, 3º Diluição- 10-3, 2º Diluição- 10-2,1º Diluição- 10-1 e testemunha, utilizando 10 ml por concentração. Para a inoculação foi adicionado 2 gotas de “tween” 20, para cada 10ml, que é 27 um detergente para melhor dispersão da solução viral nas folhas, utilizado como espalhante adesivo. A diluição foi seriada 1 para 9, a cada 9 ml de água 1 ml de vírus. A contagem de poliedros foi feita em microscópio óptico 40x em fase 2, através da câmara de Neubauer, utilizando 10 microlitros da solução em cada lado da câmara. A contagem foi realizada nos 4 campos laterais e no campo central, fezse a média dos 2 lados e multiplica pela constante que é 50.000 e então encontrase a concentração de poliedros no isolado em cada diluição. A concentração de poliedros/ml viáveis utilizados na inoculação para S. frugiperda na quinta diluição foi 5,0x104, 2,0x105 na quarta diluição, na terceira foi 2,4x106, 1,77x107na segunda e na primeira diluição foi 1,8x108. Na condução do experimento com a espécie H. zea, as concentrações utilizadas foram as seguintes em cada diluição: Quinta diluição: 5,0x104 Quarta diluição: 1,0x105 Terceira diluição: 1,25x106 Segunda diluição: 1,33x107 Primeira diluição: 1,8x108 A concentração de poliedros/ml obtidos na quinta diluição para inoculação em D. saccharalis na quinta diluição foi 5,0x104, na quarta 2,0x105, 2,4x106 na terceira, 1,22x107 na segunda e 1,26x 108 na primeira diluição. Inoculação do baculovírus Para a inoculação do baculovírus em S. frugiperda e H .zea, foram utilizadas folhas de milho, cortadas em discos e mergulhadas com auxilio de uma pinça na solução contida com o vírus em cada diluição. 28 As folhas foram transferidas, após retirar-se o excesso, em copos descartáveis de 50 ml, onde foram acondicionadas lagartas de 6 dias (ideal para o uso com baculovírus), sendo uma larva por copo (Figura 1). Figura 1: Larvas de S. frugiperda transferidas para ingestão do baculovírus. Para as larvas de D. saccharalis, a inoculação foi semelhante, mas como esta praga em outros experimentos utilizados não se desenvolveu bem em folhas de milho, foram utilizados pedaços de cana-de-açúcar, umedecidos na solução viral da mesma forma. As larvas foram acondicionadas em placas de Petri, da mesma forma como foram criadas (Figura 2). 29 Figura 2. Larvas de D. saccharalis inoculadas para ingestão do baculovírus. Para cada concentração continham 4 suportes de isopor que comportam 24 copos cada um, totalizando em 4 repetições com 24 lagartas em cada. Da mesma forma, as placas de Petri, 4 placas em cada concentração com 24 larvas em cada placa, totalizando 5 variáveis e a testemunha (água destilada e “tween” 20). Após 2 dias da inoculação, as larvas foram transferidas para se alimentarem de dieta artificial, utilizadas na criação. Cada praga em sua dieta específica e recipiente adequado. A partir do quinto dia após a inoculação, as larvas foram avaliadas todos os dias, e verificada a ocorrência de morte ou fuga, até a formação de pupas para as que não sofreram infecção. As lagartas que não foram susceptíveis ao vírus 30 foram acompanhadas, até a emergência dos adultos e realizada a segunda geração, para observação de possível alteração causada pelo baculovírus passados para os descendentes. Os adultos foram acondicionados em gaiolas de PVC revestidos por papel ofício, para depositarem os ovos. As larvas eclodidas foram repicadas em dieta e recipientes de acordo com cada espécie até a formação de pupas e novos adultos, a fim de observar o desenvolvimento da segunda geração. A segunda geração foi acompanhada da mesma forma que o experimento foi conduzido, 4 repetições com 24 lagartas para cada variável: 5º, 4º, 3º, 2º, 1º diluições e testemunha, em sala aclimatizada em temperatura de 25,0 1ºC, 50,0 ± 10% UR e 8 horas de fotofase. Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado (DIC) para a montagem dos experimentos. Foram ajustados modelos não-lineares aos dados obtidos, sendo a variável independente (x) a concentração de poliédros Baculovirus spodoptera (SfMNPV) 6- NR e as variáveis dependentes (y) a porcentagem mortalidade, porcentagem pupação e número de massa de ovos. Os modelos foram avaliados quanto à significância de seus parâmetros (Crawley 2007). Utilizou-se o programa estatístico R para o ajuste e avaliação dos modelos (R Development Core Team, 2011). RESULTADOS Efeitos Letais O Baculovirus spodoptera (SfMNPV) 6- NR aumentou a mortalidade de Spodoptera frugiperda na primeira geração. Entretanto, foi inócuo à Helicoverpa zea e Diatraea saccharalis. Em uma relação inversa, já esperada, a porcentagem de pupação de S. frugiperda foi reduzida pelo baculovírus e não se alterando para H. zea e D. saccharalis (Figura 1). Este último resultado foi 31 consequência do primeiro. Ou seja, a maior mortalidade de indivíduos leva, necessariamente, à menor porcentagem de pupação, pelo fato das lagartas estarem mortas. Na segunda geração, diferente do que foi observado na primeira, o B. spodoptera (SfMNPV) 6- NR foi inócuo tanto para S. frugiperda quanto para H. zea e D. saccharalis . A pupação, por sua vez, tanto para S. frugiperda quanto para H. zea e D. saccharalis não foi alterada (Figura 2). Este resultado, como o observado na primeira geração, foi uma correlação entre número de indivíduos mortos e pupação. Ou seja, quanto menor o número lagartas mortas pelo B. spodoptera (SfMNPV) 6- NR, maior a chance de se desenvolverem e passarem para a fase de pupa. 32 B) Pupação (%) Mortalidade (%) A) 100 80 60 40 20 0 0.0e+00 100 80 60 40 20 0 1.0e+08 0.0e+00 Concentração de Baculovirus C) ) 100 80 60 40 20 0 0.0e+00 Pupação (%) Mortalidade (%) Concentração de Baculovirus 0.0e+00 E) 1.0e+08 Concentração de Baculovirus 1.0e+08 Concentração de Baculovirus Pupação (%) Mortalidade (%) Concentração de Baculovirus 0.0e+00 D) 100 80 60 40 20 0 1.0e+08 100 80 60 40 20 0 1.0e+08 F)) 100 80 60 40 20 0 0.0e+00 1.0e+08 Concentração de Baculovirus Figura 1. Mortalidade de lagartas de A) Spodoptera frugiperda, C) Helicoverpa zea e E) Diatraea saccharalis e pupação de lagartas de B) Spodoptera frugiperda, D) Helicoverpa zea e F) Diatraea saccharalis da primeira geração expostas a concentrações de Baculovirus spodoptera (SfNPV) 6- NR. Sete lagoas, MG, 2012. 33 0.0e+00 5.0e+07 1.0e+08 Pupação (%) Mortalidade (%) A) ) 100 80 60 40 20 0 B) 100 80 60 40 20 0 1.5e+08 0.0e+00 C) ) 100 80 60 40 20 0 0.0e+00 5.0e+07 1.0e+08 D) )) 0.0e+00 E) 5.0e+07 1.0e+08 1.5e+08 Concentração de Baculovirus 5.0e+07 1.0e+08 1.5e+08 Concentração de Baculovirus Pupação (%) Mortalidade (%) Concentração de Baculovirus 0.0e+00 1.5e+08 100 80 60 40 20 0 1.5e+08 100 80 60 40 20 0 1.0e+08 Concentração de Baculovirus Pupação (%) Mortalidade (%) Concentração de Baculovirus 5.0e+07 F) 100 80 60 40 20 0 0.0e+00 5.0e+07 1.0e+08 1.5e+08 Concentração de Baculovirus Figura 2. Mortalidade de lagartas de A) Spodoptera frugiperda, B) Helicoverpa zea e C) Diatraea saccharalis e pupação de lagartas de B) Spodoptera frugiperda, D) Helicoverpa zea e F) Diatraea saccharalis da segunda geração expostas a concentrações de Baculovirus spodoptera (SfNPV) 6 -NR. Sete lagoas, MG, 2012. 34 Efeitos subletais O Baculovirus spodoptera (SfMNPV) 6- NR reduziu o número de massas de ovos de S. frugiperda e não afetou o número de massas de D. saccharalis. Inesperadamente, o B. spodoptera (SfMNPV) 6- NR aumentou o número de massas de ovos de H. zea (Figura 3). 35 Número de massas de ovos 60 50 40 30 20 10 0 A) ) 0.0e+00 5.0e+07 1.0e+08 1.5e+08 Número de massas de ovos Concentração de Baculovirus 60 50 40 30 20 10 0 B) 0.0e+00 5.0e+07 1.0e+08 1.5e+08 Número de massas de ovos Concentração de Baculovirus 60 50 40 30 20 10 0 C) 0.0e+00 5.0e+07 1.0e+08 1.5e+08 Concentração de Baculovirus Figura 3. Número de massas de ovos de mariposas de A) Spodoptera frugiperda, B) Helicoverpa zea e C) Diatraea saccharalis da primeira geração expostas a concentrações de Baculovirus spodoptera (SfNPV) 6- NR. Sete lagoas, MG, 2012. 36 DISCUSSÃO Os resultados confirmam a especificidade do Baculovirus spodoptera (SfMNPV) 6- NR, para a lagarta-do-cartucho, assim como outros baculovírus isolados de artrópodes são específicos. Na primeira geração o baculovírus foi eficiente para Spodoptera frugiperda, apresentando efeito letal. Foi possível observar também que a mortalidade aumentou com a concentração chegando á 100% na concentração mais elevada. A medida que a concentração diminuía, a mortalidade era reduzida, pelo fato de conter menor quantidade de poliedros. Este fato é relevante, pois a partir da ingestão dos poliedros é que a matriz proteica do intestino médio é dissolvida, e partir disto são liberados os vírions, onde as partículas infectivas irão penetrar na célula ocasionando a morte. Os baculovírus estão em um grande grupo entre insetos específicos, como por exemplo, o Baculovirus anticarsia que é eficiente contra a lagarta-dasoja Anticarsia gemmatalis (AGMNPV) (Castro et al., 1999). Com o uso do B.anticarsia (AGMNPV) para o controle de A. gemmatalis, Nohatto et al. (2010), obtiveram eficiência de 55,26% contra a lagarta-da-soja. Sujiiet al. (2002), obtiveram taxa de mortalidade superior á 76% no controle da lagarta da soja utilizando o B. gemmatalis. Com a pulverização do Baculovirus erinnyis em mandioca para o controle de Erinnyis ello, não atingiu o nível de dano, mostrando ser um eficiente auxiliar no controle do mandarová da mandioca (Aguiar et al., 2010). Foram encontrados vírus da família Baculoviridae em Perigonia lusca, em folhas de erva mate e foi comprovada a patogenicidade com os sintomas típicos da ação do baculovírus. (Alves et al., 2001). Este fato pode ser estendido para o controle desta lagarta na erva mate e provavelmente também seja específico para esta espécie no seu controle. Portanto, estes resultados mostram que outros baculovírus isolados de artrópodes são também específicos para espécie em que foram isolados. 37 As espécies Helicoverpa zea e Diatraea saccharalis ao morrerem não apresentaram sintomas característicos da ação dos baculovírus, cabendo isto apenas a S. frugiperda. O fato do B. spodoptera (SfMNPV)- 6 NR ter sido inócuo às outras espécies em estudo, pode ser explicado pelo fato desta especificidade. As partículas infectivas entram nas células do intestino médio através de receptores específicos. Então é possível que a H. zea e D. saccharalis não possuem estes receptores para que ocorra a infecção. Isto explica a inocuidade do B. spodoptera (SfMNPV)- 6 NR nestas espécies. Quanto à pupação, foi observado o efeito inverso ao da mortalidade, pois as larvas que não morreram, chegaram à fase de pupa, porque não foram susceptíveis ao Baculovirus spodoptera (SfMNPV)- 6 NR. Por isso, as larvas de S. frugiperda tiveram a pupação reduzida, uma vez que a mortalidade aumentou, e as larvas que foram tolerantes ficaram em menor número para alcançarem a fase de pupa. O mesmo foi para H. zea e D. saccharalis, não alterando a porcentagem de pupação, pois a mortalidade foi baixa, restando às larvas não susceptíveis para chegarem à fase de pupa. O efeito inócuo nas três espécies testadas na segunda geração pode ser explicado, pelo fato de nos parentais o vírus não conseguir gerar o ciclo infeccioso, portanto não houve toxidade e consequentemente não foram transmitidos aos descendentes na segunda geração. Para S. frugiperda, na concentração maior foi tóxico a 100 % da população na primeira geração. Portanto, não foi possível observar uma possível influência na segunda geração. Nas outras concentrações utilizadas, a lagarta-do-cartucho pode ter criado uma resposta imunológica, contra a infecção e isto foi transferido para sua segunda geração. Mas para H. zea e D. saccharalis como não foi inócuo nem mesmo na primeira geração, esperava-se que também não seria na segunda. Uma vez que os parentais não transferem para segunda geração o que não possuem, neste caso a suscetibilidade ao baculovírus utilizado. Portanto, o estudo dos hemócitos é 38 importante para a compreensão das interações entre hospedeiro e patógeno, já que o conhecimento das respostas imunológicas que estão presentes na hemolinfa dos insetos pode fornecer informações valiosas para o estudo de novas formas de controle biológico (Silva, 2002). A não alteração na pupação para as três espécies na segunda geração, é explicado pelo fato da mortalidade ter sido baixa. Então foi possível as larvas tolerantes ao vírus passarem para fase pupal. A pupação é inversa à mortalidade como já foi justificado na segunda geração. Nos efeitos subletais, em relação o número de massas de ovos, pode ser explicado, pelo fato da mortalidade ter sido maior em S. frugiperda. Portanto, restou menor número de larvas por isso estas copularam menos e ovipositaram menor número de massas de ovos. Para D. saccharalis o número de massas de ovos não foi alterado, porque se manteve constante de acordo com o número de larvas sobreviventes, do mesmo modo que chegaram à fase pupal. Mas, para H. zea houve um aumento no número de massas de ovos, isto pode ser explicado, talvez por uma característica da espécie de colocar os ovos individualmente. O que ocasiona maior número de reboleiras na contagem, pois há uma dificuldade de amostrar os ovos para uma contagem homogênea então pode haver uma superestimação. Para melhor explicação da especificidade do baculovírus é necessário trabalhos de caracterização de enzimas digestivas (proteases) que compõe o sistema digestivo a fim de entender as estratégias de controle realizadas no intestino, sua ação em pH alcalino, e possível resistência em cada espécie (Reis, 2009). Uma hipótese para explicar os resultados é a diferença nas enzimas digestivas chamadas proteases, que interfere na ação do baculovírus no intestino. Morris & Miller (1992) sugeriram que as diferenças específicas que impedem a infecção dos baculovírus são particulares de cada linhagem celular. Para uma melhor compreensão da especificidade do baculovírus é necessário um estudo 39 biomolecular das células ou da hemolinfa dos insetos, para caracterizar as linhagens celulares como permissivas ou não permissivas para replicação viral. Outra hipótese explicativa pode ser que além das espécies H. zea e D. saccharalis não possuírem os receptores específicos necessários para que as partículas infectivas entrem nas células, elas também não possuam os genes essenciais à replicação do DNA do baculovírus, ou os sítios de ação necessários. Portanto um sequenciamento dos genes poderá mostrar e confirmar a especificidade do B. spodoptera (SfMNPV)- 6 NR. Por ser altamente específico o baculovírus é um excelente agente de controle a ser utilizado no manejo integrado de pragas, priorizando a presença dos inimigos naturais não alvos e a preservação do meio ambiente. Por isso seria interessante ampliar a especificidade do baculovírus para que estenda sua patogenicidade a outras espécies de interesse. Deve-se atentar, entretanto, para responsabilidade ambiental de preservação das outras espécies desejadas como os inimigos naturais. Baculovírus recombinantes têm sido construídos, como uma maneira de melhorar a virulência dos baculovírus com a inserção de genes de hormônios e /ou proteases no genoma dos baculovírus contra seus hospedeiros. A introdução dos genes das proteases ScathL e queratinase no genoma do baculovírus Autografha californica multiple núcleo polyhedrovirus (AcMNPV) é capaz de aumentar a virulência do baculovírus contra a lagarta-docartucho, demonstrando um tempo de morte reduzido (Gramkow, 2010). Portanto esta técnica pode ser uma alternativa para aumentar a propriedade bioinseticida do B. spodoptera (SfMNPV) 6 NR. CONCLUSÃO O Baculovirus spodoptera (SfMNPV) 6 NR possui toxicidade contra Spodoptera frugiperda, mas é inócuo tanto para Helicoverpa zea quanto para Diatraea saccharalis. 40 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGUIAR, E.B.; LORENZI, J O.;MONTEIRO, D.A.; BICUDO, S.J. Monitoramento do mandarová da mandioca (Erinnyis ello L. 1758) para o controle com baculovirus (Baculovirus erinnyis). Revista TrópicaCiências Agrárias e Biológicas, v.4, p. 55, 2010. ALMEIDA, A.F. Estratégias de produção in vitro de bioenceticida viral: Influências do isolado, da cinética e do modo de operação. 2010. 133p Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Rio Grande Do Norte, Natal. ALVES, L.F.A.; BRANCALHÃO, R.M.C.; SANTANA. D.L.Q. Ocorrência de Baculovírus em lagartas Pirigonia lusca (Fabr. Lep., Sphingidae) no Brasil. Neotropical entomology, v.30, p.493-494, 2001. BOLONBHEIZ, H.; OLIVEIRA, N.C. 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