RITA MARA SOARES GUTIÉRREZ EFEITO DA IRRADIAÇÃO DO
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RITA MARA SOARES GUTIÉRREZ EFEITO DA IRRADIAÇÃO DO LASER ARSENETO DE GÁLIO (GaAs; 904 nm) NA REGENERAÇÃO DE MÚSCULOS ESQUELÉTICOS DE CAMUNDONGOS UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO UNICID SÃO PAULO 2010 RITA MARA SOARES GUTIÉRREZ EFEITO DA IRRADIAÇÃO DO LASER ARSENETO DE GÁLIO (GaAs; 904 nm) NA REGENERAÇÃO DE MÚSCULOS ESQUELÉTICOS DE CAMUNDONGOS 1 Dissertação apresentada como exigência parcial para obtenção do Título de Mestre em Fisioterapia, na Universidade Cidade de São PauloUNICID, Sob a Co-orientação do Prof. Dr. Richard Eloin Liebano e a UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO Orientação da PAULO Profa. Dra. Elen Haruka UNICID Miyabara. SÃO PAULO 2010 Profa. Dra. Elen Haruka Miyabara (orientadora) __________________ Assinatura Profa. Dra. Sandra Regina Alouche __________________ Assinatura Prof. Dr. Marco Carlos Uchida __________________ Assinatura COMISSÃO JULGADORA 2 Elen, obrigada pela paciência, incentivo e amizade durante esses anos. Talita e Lígia obrigada pela grande ajuda no laboratório da USP. Agradeço a todos os meus colegas de trabalho do Centro Municipal de Saúde de Sardoá pelo incentivo. 3 Ao Jorge, obrigada pelo apoio, compreensão e carinho. Aos meus pais Hercílio e Geralda e aos meus irmãos Igor e Vanessa, obrigada pela preocupação e suporte durante toda a minha vida. 4 LISTA DE ABREVIATURAS AST – área de secção transversal AST/PC – razão entre a área de secção transversal das fibras musculares e o peso corporal ADP - adenosina difosfato ATP – adenosina trifosfato BMPs- bone morphogenetic proteins Ca2+ - Cálcio CTX – crotoxina DAB - diaminobenzidina FGF – fator de crescimento de fibroblastos GaAs – arseneto de gálio He-Ne – Hélio-neônio HGF - fator de crescimento de hepatócitos IGF-I - insulin-like growth factor I IGF – II IL-1 – interleucina 1 IL-6 – interleucina-6 J – joules LILT - low intensity laser therapy LIF – leukemia inhibitory factor MHCn – miosina de cadeia pesada neonatal MRFs – fatores regulatórios miogênicos NCAM - Neuronal Cell Adesion Molecule Pi – fosfato inorgânico PM/PC – razão entre peso muscular e peso corporal PB – tampão fosfato sPLA2 – fosfolipase A2 secretória TGF – fator de crescimento transformador-β TNF-α – fator de neucrose tumoral α 5 SUMÁRIO Aprovação do comitê de ética...............................................................vi Resumo..........................................................................................vii Abstract............................................................................................ viii 1. Introdução.................................................................................... 1 1.1. Músculo esquelético............................................................. 1 1.2. Lesão muscular e CTX......................................................... 6 1.3. Regeneração muscular esquelética....................................... 7 1.4. Características do laser de baixa intensidade....................... 14 2. Justificativa................................................................................. 20 3. Objetivo....................................................................................... 21 4. Metodologia................................................................................ 22 4.1.Protocolo para utilização de animais.................................... 22 4.2.Desenho experimental...........................................................22 4.3.Análise estatística................................................................. 26 5. Resultados...................................................................................27 6. Discussão.......................................................................................35 7. Conclusão.....................................................................................40 8. Referências Bibliográficas............................................................41 6 7 Resumo As lesões músculo-esqueléticas caracterizam um dos casos clínicos mais rotineiramente encontrados na prática fisioterapêutica. Logo após uma lesão muscular ocorre necrose tecidual e ativação de uma resposta inflamatória e na seqüência ocorre à ativação de células satélites que são as principais responsáveis pelo processo regenerativo do músculo esquelético. Apesar do processo de regeneração muscular esquelética ter sido amplamente estudado nas últimas décadas, ainda resta muitas questões a serem investigadas, especialmente aquelas que dizem respeito aos possíveis agentes terapêuticos capazes de melhorar a regeneração muscular. Nesse trabalho estudamos os efeitos do laser 904-nmGaAs, operando no modo pulsado, com uma potência média de 5 mW, potência de pico de 15W, densidade de potência de 71,43 mW/cm² e área do feixe de 0,07 cm². Foram utilizados 30 camundongos C57Bl6 machos com três meses de idade e pesando aproximadamente 25g. Os camundongos foram lesados através de uma injeção intramuscular (no músculo tibial anterior esquerdo, TA) de crotoxina e receberam a irradiação com laser GaAs nas doses de 1,5 J ou 3 J no músculo TA a partir do 3º dia após lesão e continuaram até o 8º dia, período este em que foram sacrificados. Um grupo de camundongos foi apenas injetado com CTX e avaliado após 8 dias. Além disso, foram executados os grupos controle apenas tratados com laser nas doses de 1,5 e 3 J e o grupo controle injetado com salina (NaCl 0,9%). Os músculos TA foram pesados, pré-congelados em isopentano e estocados em nitrogênio líquido, até o momento da análise. Os músculos lesados com CTX e tratados com laser na dose de 3 J apresentaram fibras musculares em regeneração com núcleo centralizado marcadas com MHCn cuja área de secção transversal foi maior do que a do grupo apenas lesado (45%, p<0,05). Nossos resultados sugerem que a dose de 3 J do laser GaAs 904 nm aplicado diretamente na pele do músculo esquelético lesado de camundongos; uma vez ao dia, iniciando no terceiro dia após a lesão, durante cinco dias consecutivos é um método eficiente para melhorar a regeneração muscular. 8 Abstract Musculoskeletal injuries are one of the clinical cases more routinely found in physical therapy practice. Soon after a muscle injury, there are tissue necrosis and activation of an inflammatory response and the following activation of satellite cells that are mainly responsible for the regenerative process of the skeletal muscle. Despite that regenerative process of the skeletal muscle has been widely studied for the past decades, there are still several points to be investigated, especially the ones regarding the possible therapeutic agents able to improve muscle regeneration. The goal of this work was to verify the effect of GaAs laser (904 nm) operating in pulsed mode with medium intensity of 5MW, peak power of 15 W, power density of 71.43 MW/cm2 and beam area of 0.07 cm2. Thirty C57B16 3-month-old male mice weighing approximately 25 g were used. The mice were injured after intramuscular injection (in the left anterior tibial muscle, TA) of crotoxin and received irradiation with GaAs laser at doses of 1.5 J or 3 J in the TA muscle from the 3rd day after the injury and went on to the 8th day, when they were sacrificed. A group of house mice was only injected with CTX and assessed after 8 days. Additionally, we performed the control groups only treated with laser at doses of 1.5 J and 3 J and the control group injected only with saline (NaCl 0.9%). The TA muscles were weighed, pre-frozen in isopentane and stored in liquid nitrogen until the analysis. The muscle injured with CTX and treated with laser at dose of 3 J showed muscle fibers in regeneration with centralized nucleus marked with MHCn and cross sectional area bigger than that from the group that was only injured (45%, p< 0.05). In summary, our results suggest that GaAs laser of 904 nm at the dose of 3 J applied once a day directly to the skin of the injured skeletal muscle of the mice, starting from the third day after the injury, during five consecutive days is an efficient method to improve muscle regeneration. 9 1. INTRODUÇÃO 1.1. Músculo esquelético 10 O músculo esquelético é constituído por células poliédricas alongadas com grande quantidade de filamentos citoplasmáticos compostos de proteínas contráteis, geradoras de forças necessárias para a contração, utilizando como energia moléculas de adenosina trifosfato (ATP) (Junqueira & Carneiro, 2005; Junior et al., 2008). As células musculares têm origem mesodérmica e de acordo com suas características morfológicas e funcionais, distinguem-se três tipos de tecido muscular: o músculo estriado cardíaco apresenta contrações fortes, rápidas, contínuas e involuntárias e encontra - se presente exclusivamente no músculo cardíaco; o músculo liso é formado por aglomerado de células fusiformes e não possuem estrias transversais tem contrações fracas, lentas e involuntárias; (Charge & Rudnick, 2004; Jarvinen et al., 2005) já o músculo estriado esquelético é formado por feixes de células cilíndricas muito longas (até 30 cm) e multinucleadas que apresentam estriações transversais. Essas células têm contração rápida e vigorosa e estão sujeitas ao controle voluntário. Os componentes das células musculares recebem nomes especiais; a membrana celular é chamada de sarcolema; o citosol de sarcoplasma; e o retículo endoplasmático liso de retículo sarcoplasmático. (Fridén & Lieber, 2001; Junqueira & Carneiro, 2005). O tecido muscular esquelético estriado é formado por células musculares (miofibras) cilíndricas com diâmetro que varia de 10 a 100 µm e numerosos núcleos que se localizam na periferia das fibras, nas proximidades do sarcolema e possuem grande quantidade de mitocôndrias, retículo endoplasmático (retículo sarcoplasmático) desenvolvido e miofibrilas que são estruturas fundamentais para a contração e o relaxamento muscular (Grefte et al., 2007). Cada fibra muscular contém as miofibrilas que são estruturas cilíndricas que medem 1-2 µm de diâmetro e com o mesmo comprimento das fibras 11 musculares e consiste no arranjo repetitivo de sarcômeros que são unidades contráteis e que determinam as estriações transversais quando observadas ao microscópio óptico. Cada sarcômero mede cerca de 2,5 µm e é formado pela parte da miofibrila que fica entre duas linhas Z sucessivas e contêm uma banda A separando duas semibandas I. A banda A apresenta uma zona mais clara no seu centro, a banda H. As miofibrilas contêm quatro proteínas principais: actina, miosina, tropomiosina e troponina. Os filamentos grossos são formados de miosina e as outras três proteínas são encontradas nos filamentos finos (Schiaffino et al., 2002; Jarvinen et al.,2005). A molécula de miosina é composta por seis cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas e quatro cadeias leves. As duas cadeias pesadas se espiralam entre si, para formar uma dupla hélice, chamada cauda ou haste da molécula de miosina. Uma ponta de cada uma dessas cadeias é dobrada para um dos lados, formando a estrutura polipeptídica globular chamada cabeça da miosina (Guyton & Hall, 2006). As quatro cadeias leves também fazem parte da cabeça da miosina, sendo duas cadeias para cada cabeça. Essas cadeias leves ajudam a regular o funcionamento da cabeça da miosina durante a contração. Outra característica fundamental para a contração muscular é a atividade da ATPase da cabeça da miosina que cliva o ATP e utiliza a energia derivada das ligações de alta energia do fosfato do ATP para energizar o processo de contração (Stewart et al.,2009). O filamento de actina é formado por três componentes protéicos: actina, tropomiosina e troponina. O arcabouço de actina é formado por um filamento em dupla-hélice de actinaF que é composto por moléculas de actina-G polimerizadas. Ligada a cada molécula de actina-G existe uma molécula de ADP. As moléculas de tropomiosina se localizam espiraladamente nos sulcos da dupla hélice da actina-F de modo que durante o período de repouso, as moléculas de tropomiosina recobrem os sítios ativos da actina (Guyton & Hall, 12 2006). Já a troponina é um complexo de três subunidades protéicas frouxamente ligadas, cada uma com participação específica na regulação da contração muscular. Uma das subunidades (troponina I) tem afinidade com a actina, outra (troponina T) com a tropomiosina e a terceira (troponina C) com os íons cálcio (Stewart et al.,2009). A contração muscular inicia-se na banda A, onde os filamentos finos e grossos se sobrepõem. Quando há disponibilidade de íons Ca2+ estes se combinam com a subunidade C da troponina, isto leva a uma mudança na configuração espacial da tropomiosina deixando expostos os locais de ligação da actina e esta fica livre para interagir com a cabeça da miosina. Como resultado da formação da ponte entre a cabeça da miosina e a subunidade de actina G, o ATP é convertido em ADP, Pi (fosfato inorgânico) e energia. Esta atividade leva a um aumento na curvatura da cabeça e de parte da haste da miosina. Como a actina está combinada com a miosina, o movimento da cabeça da miosina empurra o filamento da actina, promovendo o seu deslizamento sobre o filamento de miosina. À medida que as cabeças de miosina movimentam a actina, novos locais para formação das pontes actina-miosina aparecem. As pontes só se desfazem no momento que a miosina se liga a uma nova molécula de ATP, esta ação determina também a volta da cabeça da miosina para sua posição inicial, preparando-se para novo ciclo (Antona et al., 2006; Junqueira & Carneiro, 2008; Stewart et al., 2009). As fibras musculares estão organizadas em grupos de feixes envolvidos por uma camada de tecido conjuntivo denominado epimísio que recobre o músculo inteiro. Do epimísio partem finos septos de tecido conjuntivo que se dirigem para o interior do músculo, separando e envolvendo os feixes. Esses septos constituem o perimísio que tem a função de proteção e trajeto para nervos e vasos sanguíneos (Fridén e Lieber et al., 2001; Junqueira & Carneiro, 2005). E cada fibra muscular é envolvida pelo endomísio que leva os 13 capilares e nervos a cada fibra muscular. As fibras musculares estão unidas através do tecido conjuntivo que permite que a força de contração gerada por cada fibra individualmente atue sobre o músculo inteiro e que seja transmitida a outras estruturas, como tendões e ossos (Jarvinen et al., 2005; Junqueira & Carneiro, 2008) A célula muscular esquelética produz trabalho mecânico necessitando de depósitos de compostos ricos em energia. Para que ocorra a contração muscular, a célula muscular depende da energia fornecida pelo ATP (Guyton & Hall, 2006). O ATP é clivado para formar ADP, o qual transfere a energia de suas moléculas para que ocorra o mecanismo de contração muscular (Antona et al., 2006). Em seguida, o ADP é refosforilado para formar novo ATP em fração de segundos, o que permite que o músculo continue a contração. Existem muitas fontes de energia para essa refosforilação (Frideân et al., 2001). A primeira fonte de energia utilizada para reconstituir o ATP é a fosfocreatina que é clivada instantaneamente, e sua energia liberada causa a ligação de novo íon fosfato ao ADP, para reconstituir o ATP (Guyton & Hall, 2006). A segunda fonte de energia é a glicólise do glicogênio previamente armazenado nas células musculares (Stewart et al., 2009). O rápido desdobramento enzimático do glicogênio a ácidos pirúvico e lático libera energia que é utilizada para converter o ADP em ATP. O ATP pode ser utilizado diretamente para energizar contrações musculares adicionais e também para reconstituir as reservas de fosfocreatina. A terceira fonte de energia utilizada é o metabolismo oxidativo, em que o oxigênio é combinado com os produtos finais da glicólise para liberar ATP (Antona et al.,2006; Guyton & Hall, 2006). De acordo com sua estrutura e composição molecular, as fibras musculares esqueléticas podem ser identificadas como tipo I, ou fibras lentas, e tipo II, ou fibras rápidas. As fibras tipo I são ricas em mioglobina contida no sarcoplasma e têm cor 14 vermelho-escura. Estas fibras têm a capacidade de executar contrações sustentadas de baixa potência por longos períodos e apresenta maior resistência a fadiga. Sua energia é obtida principalmente dos ácidos graxos que são metabolizados nas mitocôndrias (Junqueira & Carneiro, 2005). As fibras do tipo II contêm pouca mioglobina e, por isso, são de cor vermelho-clara, elas são adaptadas para contrações de maior potência por curtos períodos, e dessa forma resistem menos à fadiga. As fibras do tipo II podem ser subdivididas nos tipos IIA, IIB e IIC de acordo com suas características funcionais e bioquímicas. As fibras do tipo IIB são as mais rápidas e depende principalmente da glicólise como fonte de energia. Em mamíferos, cada músculo apresenta diferentes proporções desses tipos de fibras musculares. Por exemplo, em humanos o músculo sóleo possui 70% de fibras musculares do tipo I e 30% de fibras musculares do tipo II, o gastrocnêmio e o vasto lateral possuem 50% de fibras do tipo I e 50% de fibras do tipo II, já o bíceps braquial possui 42% de fibras do tipo I e 50% de fibras do tipo II (Schiaffino et al., 2002). 15 1.2. Lesão muscular e CTX As lesões musculares podem ser de origem mecânica, térmica ou química. As lesões musculares de origem mecânica são as mais comuns e ocorrem com freqüência no esporte. Apesar da importância clínica dessas lesões mecânicas, existem poucos estudos sistemáticos sobre o tratamento dessas lesões e muitas vezes o tratamento se baseia em achados testados empiricamente (Jarvinen et al.,2005). As lesões musculares de origem mecânica são causadas principalmente por contusões e distensões. A contusão ocorre quando o músculo é submetido a uma súbita e violenta força compressiva; que ocorrem normalmente em esportes de contato. Na distensão o músculo é submetido a uma força de tensão excessiva além do limite levando a uma ruptura próxima à junção miotendinosa (MTJ). A distensão ocorre freqüentemente nos esportes de saltos e corridas nos músculos que agem sobre duas articulações como, por exemplo, o reto femoral, o semitendíneo e o gastrocnêmio (Jarvinen et al.,2005). As lesões térmicas mais comuns são causadas por temperaturas extremas, em que ocorrem queimaduras por excesso de calor ou lesões por congelamento (Oliver et al., 2008; Miyabara et al., 2005). As lesões de origem química podem ser causadas por produtos químicos (etanol, metais pesados, etc) e por venenos de animais (répteis, insetos, etc) (Morini et al., 1998; Miyabara et al., 2005; Ryall et al., 2008; Conte et al., 2008). No presente estudo nós induzimos lesões musculares de origem química, através da crotoxina (CTX) que é uma neurotoxina, extraída do veneno da cascavel sul-americana Crotalus durissus terrificus. Sabe-se que a CTX provoca necrose através da rápida destruição da membrana plasmática, o que pode ser evidenciada histologicamente pela presença de hipercontração e destruição dos miofilamentos (Ownby et al., 1997; Conte et 16 al., 2008). A indução de mionecrose pela CTX ocorre através do seu principal componente lesivo, a sPLA2 (fosfolipase A2 secretória), que se liga ao receptor de membrana do tipo M, que por sua vez internaliza e distribui a sPLA2 para específicos compartimentos dentro da célula onde essa enzima provoca ruptura da membrana plasmática da fibra muscular levando a necrose e destruição tecidual (Fuentes et al., 2002). Independentemente do estímulo lesivo sobre o músculo esquelético, a resposta regenerativa muscular é estereotipada. 1.3. Regeneração muscular esquelética O músculo esquelético possui uma extraordinária habilidade para iniciar um processo de reparação de suas fibras musculares após uma lesão que produza destruição parcial do músculo esquelético (Meeson et al., 2004). A regeneração do músculo esquelético é um processo altamente sincronizado envolvendo a ativação de várias respostas celulares. A reparação muscular é inicialmente caracterizada por necrose do tecido lesado e ativação de uma resposta inflamatória (Charge & Rudnicki, 2004; Anderson, 2006). Em seguida, ocorre a ativação de células satélites que são responsáveis pela regeneração do músculo esquelético. Estas células são mononucleadas, fusiformes, estão situadas entre a lâmina basal e o sarcolema e permanecem em um estado mitoticamente quiescente. Após uma lesão, as células satélites tornam-se ativas, proliferam por divisão mitótica e se fundem umas as outras para reconstituir a fibra muscular previamente lesada (Ehrhardt & Morgan, 2005; Grand & Rudnicki, 2007; Shefer, 2008). 17 O processo de regeneração muscular pode ser dividido em três fases: 1) a fase degenerativa que é caracterizada pela ruptura e necrose da fibra muscular e reação de células inflamatórias; 2) a fase de reparação que consiste na fagocitose do tecido necrosado, na regeneração da fibra muscular, e concomitante na produção de tecido conjuntivo de cicatrização, bem como o crescimento de capilares para dentro da área lesada; e a 3) fase de remodelação, período durante o qual ocorre maturação da fibra muscular regenerada, reorganização do tecido de cicatrização e recuperação da capacidade funcional do músculo (Jarvinen et al., 2005). Estas fases parecem ser semelhantes entre os músculos de contração rápida ou lenta e entre os tipos de estímulos lesivos sendo eles de natureza química, mecânica ou térmica. Entretanto a amplitude e a duração de cada fase podem variar dependendo da extensão da lesão (Charge & Rudnicki, 2004). Logo após um estímulo lesivo sobre o músculo, ocorre necrose da fibra muscular, caracterizada pela ruptura do sarcolema resultando em aumento da permeabilidade da fibra muscular, aumentando os níveis plasmáticos de proteínas musculares, tais como a creatina kinase, que estão usualmente restritas ao citosol da fibra muscular (Charge & Rudnicki, 2004). Em humanos e modelos com animais, o aumento dos níveis plasmáticos de creatina kinase representa um indicador de lesão muscular (Charge & Rudnicki, 2004). Além disso, tem-se hipotetizado que o influxo aumentado de Ca2+ para o citosol da fibra muscular após ruptura do sarcolema resulta na perda da homeostase do Ca2+ e aumento de proteólise dependente de Ca2+, o que contribui para a degeneração da fibra muscular (Charge & Rudnicki, 2004). No local da lesão ocorre infiltração de células inflamatórias; primeiramente os neutrófilos são observados por volta de 1-6 horas após a lesão. Os neutrófilos liberam citocinas (IL-1, IL-6, TNF-α) que atraem os macrófagos que após 48 horas tornam-se a 18 célula inflamatória predominante no sítio da lesão para fazer a fagocitose da fibra lesada e concomitantemente é iniciada a formação de tecido conjuntivo cicatricial pelos fibroblastos (Contran et al, 2000). Por volta do terceiro dia, ocorre ativação das células satélites (Fig. 1) pelas citocinas (IGF-1, IGF-II, FGF, HGF, TGF-β) (Charge & Rudnick, 2004). Aproximadamente, no quinto dia ocorre fusão de células satélites em miotubos (Fig. 1); em torno do sétimo dia a célula muscular regenerada cresce em direção ao foco central da lesão; no décimo quarto dia a fibra muscular regenerada preenche quase completamente a área lesada (Fig. 1); no vigésimo primeiro dia ocorre a reconstituição estrutural das fibras musculares e do tecido conjuntivo que as envolve, de forma que a capacidade funcional do músculo seja restabelecida. (Dorit et al., 2005; Jarvinen et al., 2005; Charge & Rudnicki, 2004; Amaral et al., 2001; Shefer et al., 2002). 19 Fig. 1. Esquema geral do processo de regeneração muscular. Na ausência de lesão as células satélites apresentam-se em estado quiescente. Após um estímulo lesivo sobre a célula muscular ocorre a ativação e proliferação da célula satélite por volta do 3° até o 5°dia, onde inicia o processo de diferenciação que permanece até que ocorre o processo de maturação por volta do14° dia (Shi e Garry, 2006). Atualmente existe grande interesse na identificação e caracterização de fatores celulares/moleculares envolvidos na modulação da resposta regenerativa. Fatores de crescimento como o insulin-like growth factor I, hepatocyte growth factor (HGF), fibloblast growth factor (FGF), transforming growth factors- β (TGF- β) e membros da família interleucina-6 tais como leukemia inhibitory factor (LIF) e interleucina-6 e fatores miogênicos (membros da família MyoD: MyoD, miogenina, MRF4 e Myf5) já foram identificados como grande facilitadores e reguladores da resposta regenerativa muscular (Hawke & Garry 2001). 20 O IGF-I (fator de crescimento semelhante à insulina), também denominado de MGF (mechano growth factor, isoforma muscular do IGF-I) é um fator de crescimento secretado pelo músculo esquelético em resposta a um estímulo lesivo ou sobrecarga mecânica capazes de regular a proliferação e diferenciação de células satélites (Engert et al., 1996) sendo, portanto, ativado durante os processos de regeneração (Jennische & Matejka, 1992). O HGF (fator de crescimento de hepatócitos) é uma citocina que estimula a mitose em células hepáticas adultas (Michalopoulos & Zarnegav, 1992). Suas funções relacionadas com a regulação das células satélites incluem atuação como potente fator quimiotático, ativação de células satélites, e inibição da diferenciação de mioblastos (Hawke & Garry, 2001). O FGF (fator de crescimento de fibroblasto) possui 9 isoformas, dentre as quais apenas o FGF-6 é exclusivamente expresso no músculo esquelético (Floss et al., 1997). Trabalhos têm demonstrado que o FGF-6 também é capaz de estimular a proliferação de células satélites (Sheehan & Allen, 1999) e atenuar a diferenciação de mioblastos (Clegg et al., 1987). A família TGF-β (fator de crescimento transformador) é composta por citocinas que incluem as BMPs (bone morphogenetic proteins) e fatores de crescimento/diferenciação, as quais transduzem seus sinais através das proteínas SMAD (Whitman, 1998). Os membros dessa família atuam como inibidores da proliferação e diferenciação muscular (Allen & Boxhorn, 1989) por silenciarem a ativação transcricional dos membros da família Myo-D (Martin et al., 1992). A família interleucina-6 (IL-6) é formada por citocinas, tais com LIF e IL-6, as quais são produzidas por vários tipos celulares, incluindo mioblastos e macrófagos. IL-6 é capaz de promover a degradação de tecido necrosado, sincronização do ciclo celular das células 21 satélites e indução de apoptose dos macrófagos após lesão muscular (Hawke & Garry, 2001). Além disso, LIF induz proliferação de células satélites (Kami & Senba, 1998). Além dos fatores de crescimento, fatores miogênicos também participam da resposta regenerativa muscular, retomando, dessa forma, alguns estágios da miogênese durante a ativação e diferenciação das células satélites. Estudos têm demonstrado que os fatores regulatórios miogênicos (MRFs) primários (Myo-D e Myf5) da família helix-loop-helix são altamente expressos durante a regeneração muscular nas células satélites ativadas e que os fatores secundários (miogenina e MRF4) dessa família são ativados durante a diferenciação terminal dos mioblastos (Braun & Henning, 1996; Hawke & Garry, 2001). Vários fatores de transcrição estão envolvidos no processo de regeneração muscular (Megeney et al., 1996; Seale e Rudncki, 2000; Carson et al., 2002). Nas células satélites quiescentes, a expressão de MRFs é muito baixa ou quase indetectável, mas uma vez que as células satélites são ativadas (entram no ciclo celular) devido a uma lesão muscular esquelética, a expressão de MRFs aumenta (Fisher et al., 1990; Grounds et al., 1992; Cornelison e Wold, 1997). A ativação das células satélites é controlada principalmente pelos fatores de transcrição Pax3, Pax7 e Myf5 (Relaix et al., 2006). Primeiro, a expressão de MyoD e de Myf5 é aumentada nas células satélites ativadas. Durante este estágio, as células satélites se proliferam e também são denominadas mioblastos. A diminuição da expressão de Pax3 (Relaix et al., 2006) e pax7 (Olguin e Olwin, 2004; Zammit et al., 2004), e o aumento da expressão dos fatores de transcrição miogenina e MRF-4 levam a uma diferenciação terminal destes mioblastos. Pax3 e Pax7 ativam a miogenina através do aumento da expressão de MyoD, e Myf5 é capaz de ativar a miogenina diretamente. Finalmente estes mioblastos diferenciados se fundem às fibras musculares previamente 22 lesadas levando à reparação muscular (Chen e Goldhamer, 2003; Charge e Rudnicki, 2004; Buckingham, 2006; Shi e Garry, 2006). A expressão de diversos genes se eleva durante a ativação e proliferação de células satélites, tais como Notch (Conboy et al., 2005), NCAM (Neuronal Cell Adesion Molecule), desmina ( Hawke & Garry 2001; Mitchell et al., 2002). Além disso, ocorre a reexpressão da miosina de cadeia pesada neonatal (MHCn) nas células musculares em regeneração, a qual constitui um excelente marcador de regeneração muscular (Duguez et al., 2003; Miyabara et al., 2005). Estudos recentes também mostraram que a via da calcineurina, uma fosfatase citosólica dependente de Ca2+/calmodulina, é fundamental para o processo de regeneração muscular esquelética (Irintchev et al., 2002; Sakuma et al., 2003). 23 1.4. Características do laser de baixa intensidade O termo laser é um acrônimo de ligth amplification by the stimulated emission of radiattion (amplificação da luz através da emissão estimulada de radiação) (Kitchen & Basin, 2003; Low & Reed, 2001). Embora Albert Einstein originalmente tenha esboçado os princípios básicos da geração do laser, foi somente em 1960 que Theodore Maiman produziu o primeiro disparo de luz de rubi no Hugles Laboratories, EUA (Kitchen & Basin, 2003). O laser difere da luz comum por possuir as seguintes propriedades: Monocromaticidade: os raios laser são de um comprimento de onda específico único e portanto, têm uma freqüência definida. No caso dos lasers visíveis é produzida uma única cor pura. A radiação laser com comprimento de onda único é também chamada monocromática nas regiões infravermelha e ultravioleta, apesar de invisível (Smith, 2005). Coerência: a radiação laser não tem apenas o mesmo comprimento de onda como também a mesma fase, ou seja, os picos e as depressões dos campos elétricos e magnéticos ocorrem ao mesmo tempo; o que é denominado de “coerência temporal”. Além disso, todos correm na mesma direção; o que é chamado de “coerência espacial”. À distância na qual os comprimentos de onda permanecem na mesma fase é chamada de “extensão da coerência” e varia de menos de um milímetro até centenas de metros (Karu et al., 2005; Low & Reed, 2001). Colimação: como conseqüência da coerência espacial os raios laser permanecem em um feixe paralelo. Como as radiações não divergem, a energia é propagada em distâncias muito longas. Essa propriedade torna o laser de grande valor para medições e localizações de alvos (Low & Reed, 2001). 24 Desde sua concepção, o laser tem encontrado aplicação na medicina, inicialmente foram utilizadas as interações fototérmicas e fotoablativas do laser com os tecidos, como por exemplo, a utilização do laser como alternativa aos bisturis metálicos, assim como ablação de tumores e remoção de tatuagens. Posteriormente, surgiu-se o interesse clínico em aplicar as interações não térmicas do laser nos tecidos com o intuito de modular certos processos biológico, principalmente para fotobioestimular os processos de regeneração dos tecidos (Kitchen & Basin, 2003; Low & Reed, 2001). Os lasers mais utilizados na prática clínica em fisioterapia são os lasers de hélioneônio e arseneto de gálio. O laser de hélio-neônio emite radiação na região visível (vermelha) com um comprimento de onda de 632,8 nm e atingem uma profundidade de 2 – 5 mm. O laser de arseneto de gálio é infravermelho, possui comprimento de onda de 904 nm e atinge uma profundidade de 1 - 2,5 cm. Além disso, existem outras modalidades de laser utilizadas na prática médica para procedimentos cirúrgicos e odontológicos (Kitchen & Basin, 2003; Low & Reed, 2001). A laserterapia de baixa intensidade ou de baixa potência (low intensity laser therapy; LILT) é um termo genérico que define a aplicação terapêutica de lasers superluminosos monocromáticos com potência relativamente baixa (< 500 mW) para tratamentos de doenças e lesões, utilizando dosagens (normalmente < 35 J/cm²) consideradas baixas demais para efetuar qualquer aquecimento nos tecidos irradiados. Portanto a LILT é uma modalidade de tratamento atérmica (Kitchen & Basin, 2003). A luz proveniente de um aparelho de laserterapia pode interagir com o tecido irradiado de duas maneiras: 1) Dispersão da luz incidente: mudança na direção de propagação da luz à medida que ela passa através dos tecidos, e é devido à variabilidade no índice de refração dos 25 componentes do tecido com respeito à água. Essa dispersão causa um alargamento do feixe à medida que esse passa através do tecido irradiado e resulta na perda rápida de coerência (Kitchen & Basin, 2003). 2) Absorção da luz incidente por um cromóforo: Um cromóforo é uma biomolécula que é capaz, através de sua configuração eletrônica ou atômica, de ser excitada pelos fótons incidentes. A luz nos comprimentos de onda empregados em LILT é prontamente absorvida por uma variedade de biomoléculas, incluindo melanina e hemoglobina. Deve-se salientar que a absorção e a profundidade de penetração dependem do comprimento de onda. Assim a interação e a absorção podem ser consideradas como a base fotobiológica mais importante da laserterapia (Kitchen & Basin, 2003; Mcleod, 2004). A dosagem e os parâmetros de irradiação, além do comprimento de onda que é determinado pelo aparelho; deve-se levar em consideração a potência de saída que é geralmente expressa em miliwatts (mW) e é geralmente fixa e invariável; a irradiância (densidade de potência) a potência por unidade de área (mW / cm²) é um parâmetro importante de irradiação, que é geralmente mantido o mais alto possível para uma determinada unidade através da chamada técnica de tratamento “com contato”; a energia é dada em joules e é calculada multiplicando-se a potencia de saída em watts pelo tempo de irradiação em segundos. A densidade de energia é dada em J/cm² e é calculada dividindo-se a energia em joules pelo tamanho da área de tratamento em cm (Kitchen & Basin, 2003; Albertini et al., 2007). O método de aplicação varia conforme a condição apresentada, porém sempre que possível à caneta ou sonda aplicadora deve ser utilizada com uma pressão firme sobre a área do tecido a ser tratada, com isso o tratamento a laser torna-se mais seguro evitando a visualização acidental intrafeixe; no entanto a razão principal da técnica “de contato” é 26 maximizar a irradiância ou densidade de potência na superfície do tecido e assim o fluxo de luz dentro são fatores importantes para assegurar a efetividade do tratamento (Kitchen & Basin, 2003). A replicação dos estudos já publicados com relação aos parâmetros de irradiação e protocolos de tratamento são freqüentemente mal especificados, dificultando a comparação entre resultados e a aplicação clínica dos mesmos. Além disso, quando os parâmetros de irradiação são especificados o grande número de possíveis permutações e combinações de comprimentos de onda, irradiância, freqüência de repetição de pulso etc., torna difícil a replicação precisa destes trabalhos (Kitchen & Basin, 2003). As aplicações mais comuns da LILT na prática clínica de fisioterapia têm o intuito de aliviar a dor em pacientes com artrite reumatóide, tendinopatias, artrose, nevralgia e pósoperatório. A LILT também é empregada como adjuvante na cicatrização em úlceras, feridas cirúrgicas (Beckerman et al., 1992; Bjordal et al., 2003; Bjordal et al., 2006; Christie et al., 2007; Fahimeh et al., 2007). A LILT também apresenta algumas contraindicações como: a aplicação direta nos olhos; pacientes com carcinoma ativo ou sob suspeita; irradiação sobre o útero em gestação, áreas de hemorragia, dificuldades cognitivas. E devem-se ressaltar alguns cuidados em situações como o tratamento de tecidos infectados; aplicação sobre os gânglios simpáticos, nervo vago e região cardíaca em pacientes com doença cardíaca e o tratamento sobre áreas fotossensíveis, pacientes com epilepsia e áreas de pele com sensibilidade alterada (Continenza et al., 1993; Kitchen & Basin, 2003). Apesar do processo de regeneração muscular esquelética ter sido amplamente estudado nas últimas décadas, ainda restam muitas questões a serem investigadas, especialmente aquelas que dizem respeito aos possíveis agentes terapêuticos capazes de 27 melhorar o processo regenerativo muscular. Nesse contexto, o laser de baixa potência tem sido amplamente utilizado na fisioterapia para o tratamento das lesões musculares, porém a sua eficácia ainda tem sido bastante controvertida. Nos últimos anos muitos estudos têm avaliado a irradiação do laser de baixa potência na regeneração de diversos tecidos como epitelial (Conlan et al., 1996), ósseo (Yaakobi et al., 1996), nervoso (Assia et al., 1989) e muscular esquelético (Weiss & Oron, 1992; Bibikova & Oron,1993). Os efeitos da laserterapia de baixa potência na regeneração dos tecidos dependem essencialmente do tempo de exposição, da dose, do comprimento de onda e da freqüência de irradiação utilizada (Karu, 2005; Bibikova & Oron,1994). Dentre os lasers de baixa potência mais utilizados na clínica fisioterapêutica, podemos destacar o laser hélio neônio (HeNe) e o arseneto de gálio (GaAs). O GaAs é um laser infravermelho pulsado (904 nm), cujo comprimento de onda é capaz de penetrar alguns centímetros (0,5 a 2,5 cm) a mais quando comparado ao laser HeNe (624 nm) (Basford, 1993). Portanto tem sido sugerido que o laser GaAs seja mais efetivo em penetrar tecidos mais profundos, como o músculo esquelético, e proporcione maior analgesia, enquanto que o HeNe seria mais efetivo no tratamento de úlceras da pele (Basford, 1993). Apesar de o laser HeNe atingir tecidos mais superficiais do que o GaAs, trabalhos têm evidenciado consistentemente apenas o papel do laser HeNe na melhora da regeneração muscular esquelética. Em músculos esqueléticos lesados de ratos e de sapos, a irradiação com HeNe melhorou eficientemente a regeneração muscular (Weiss & Oron, 1992; Bibikova & Oron, 1993). Resultado este que pode ser explicado pelo fato do laser HeNe ser capaz de induzir a expressão de proteínas reguladoras do ciclo celular e conseqüentemente acarretar na ativação das células satélites (Ben-Dov et al., 1999). 28 O papel do laser GaAs na regeneração muscular ainda não tem sido investigado de maneira sistemática. Poucos trabalhos têm tocado nessa questão. Cressoni, et al (2008) verificaram que a terapia a laser ALGaInP (alumínio-gálio-índio-fósforo) operando a 785 nm com dose de 2.7J por sessão (2 e 4 sessões) foi hábil para reduzir infiltrados inflamatórios e acelerar a regeneração de tecido conjuntivo por estimular a proliferação de fibroblastos, proporcionando assim condições para melhorar a organização e o alinhamento da fibra muscular em regeneração e os animais que receberam 4 sessões de tratamento apresentaram células musculares em um estágio mais avançado de maturação. Oliveira et al (1999) demonstraram que o tratamento com laser GaAs 904nm (dose 3 e 10 J/cm2) durante os 5 primeiros dias após lesão não causou qualquer efeito na regeneração de músculos avaliados 21 dias após injúria. Por outro lado, Dourado et al (2003) evidenciaram uma proteção muscular em situação aguda (3, 12 e 24 h) após lesão quando se administrou o laser GaAs na dose de 4 J/cm2. O fato de estes trabalhos terem avaliado tardiamente (21 dias) ou muito agudamente (3 a 24 h) após lesão, impossibilita a análise precisa do efeito do laser GaAs na regeneração muscular, pois 21 dias é um período caracterizado pelo completo restabelecimento da estrutura muscular previamente lesada e em torno de 24 h após lesão é uma fase em que se predomina o processo inflamatório. Nesse sentido, nós decidimos investigar o efeito do laser GaAs na regeneração de músculos esqueléticos de camundongos lesados com crotoxina (CTX), uma toxina extraída do veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus. Para tanto foram testadas as doses de 1,5 e 3 J de laser GaAs que foram aplicadas durante 5 dias consecutivos tendo como início o 3º dia após lesão, período de intensa ativação e proliferação de células satélites, e como término o 8º dia após lesão (período de franca regeneração), período este em que os animais foram sacrificados para análise muscular. 29 2. JUSTIFICATIVA Este estudo contribuirá para o melhor entendimento dos mecanismos de ação do laser GaAs sobre o tecido muscular esquelético em regeneração. Além disso, este trabalho servirá de base para a melhor utilização dos parâmetros de aplicação do laser GaAs na clínica fisioterapêutica e consequentemente contribuirá para a recuperação mais eficiente de pacientes com lesões musculares. 30 3. OBJETIVO O presente estudo tem por objetivo analisar os efeitos do laser GaAs como agente terapêutico no processo regenerativo do músculo esquelético de camundongos através do estudo de aspectos histológicos da regeneração muscular esquelética. 31 4. METODOLOGIA 4.1. Protocolo para utilização de animais Os experimentos realizados nesse trabalho foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Cidade de São Paulo - UNICID (protocolo. no. 13393873). 4.2. Desenho experimental Animais Foram utilizados 30 camundongos C57Bl6 machos pesando aproximadamente 25g, com três meses de idade. Os animais foram mantidos no biotério sob condições controladas. Os camundongos tiveram acesso ad libitum à ração e água. Os grupos experimentais foram organizados como descrito a seguir. Os animais foram divididos de forma aleatória em 6 grupos experimentais: - Grupo controle injetado com salina (NaCl 0,9%) (n=5); - Grupo lesado apenas com CTX (n = 5); - Grupo controle tratado com laser 1,5J (n = 5); - Grupo controle tratado com laser 3 J (n = 5); - Grupo lesado com CTX e tratado com laser 1,5J (n = 5); - Grupo lesado com CTX e tratado com laser 3 J (n = 5); 32 Os camundongos foram lesados através de uma injeção intramuscular (no ventre do músculo tibial anterior esquerdo, TA) de crotoxina (CTX; dose de 0,17 mg/Kg) e receberam a irradiação com laser GaAs nas doses de 1,5 J ou 3 J no músculo TA a partir do 3º dia após lesão e continuaram até o 8º dia (total de 5 dias de tratamento), período este em que foram sacrificados. O grupo controle foi injetado somente com o veículo salina (NaCl 0,9%). Um grupo de camundongos foi apenas injetado com CTX e avaliado após 8 dias. Além disso, foram executados os grupos controle apenas tratados com laser nas doses de 1,5 J e 3 J. No 8º dia após lesão, os animais foram pesados, sacrificados por deslocamento cervical e os músculos TA foram removidos, pesados, pré-congelados em isopentano e estocados em nitrogênio líquido, até o momento da análise. Procedimento com o laser Neste estudo foi utilizado o laser 904-nm-GaAs (modelo Laserpulse; IBRAMED, Cidade de Amparo, SP, Brasil), operando no modo pulsado, com uma potência média de 5 mW, potência de pico de 15W, densidade de potência de 71,43 mW/cm², área do feixe de 0,07 cm². Os animais foram anestesiados com injeção intraperitoneal de Ketamina e Xilazina (doses de 95 mg/kg e 12 mg/kg, respectivamente), em seguida, o laser foi colocado em contato direto com a pele de cada animal em um único ponto e foi posicionado perpendicularmente. O tempo da irradiação do laser GaAs foi de 5 minutos para os animais tratados com a energia de 1,5 J (densidade de energia de 21,43 J/cm² por sessão) e 10 minutos para os animais tratados com energia de 3 J (densidade de energia de 42,85 J/cm² por sessão de tratamento). O tempo de irradiação de 5 e de 10 minutos foram necessários para se obter a energia de 1,5 e 3J respectivamente, visto que o 33 aparelho emissor de raios laser utilizado opera somente no modo pulsado. A primeira sessão foi efetuada 3 dias após a lesão muscular com crotoxina, período de maior ativação de células satélites (Meeson et al., 2004) e foi continuada por mais 4 dias consecutivos, totalizando-se 5 sessões diárias de tratamento. Histologia Secções transversais (10 µm de espessura) foram geradas dos músculos congelados utilizando-se um criostato (IEC Minotome). Secções histológicas foram coradas com 1% de azul de toluidina/1% borax para se analisar a morfologia geral (Morini et al. 1998; Salvini et al. 1999). As secções transversais do músculo foram coradas com azul de toluidina por 3 min, na seqüência as lâminas foram incubadas por 12 min em álcool 96%, em seguida as lâminas foram incubadas por mais 3 min em álcool 96% em outra cuba e posteriormente foram incubadas por 3 min em álcool 100% e colocadas em outra cuba por mais 3 min em álcool 100%, na seqüência foram fixadas com xilol por 3 min e novamente fixadas no xilol em outro recipiente por mais 3 min. Finalmente as lâminas foram fechadas com lamínula e resina Entellan. Imunohistoquímica (para MHC): As secções transversais dos músculos destinados à imunohistoquímica foram incubadas com blocking serum por 20 minutos (de acordo com as recomendações do kit Vectastain Elite ABC-Vector), em seguida as secções foram incubadas com o anticorpo primário contra MHC neonatal (Novocastra) por 40 minutos (1:20 em tampão fosfato (PB) 0,1M), as 34 lâminas foram lavadas com PB 0,1M por 5 minutos e incubadas com o anticorpo secundário por 30 minutos. Após a incubação do anticorpo secundário, as lâminas foram lavadas por mais 5 minutos com PB 0,1M e incubadas por 30 minutos com o reagente ABC. Posteriormente, as lâminas foram lavadas por 5 minutos com PB 0,1M e em seguida incubadas com diaminobenzidina (DAB) por 15 minutos e lavadas com água destilada por 10 minutos. Subsequentemente, as lâminas foram contra-coradas com hematoxilina por 1 minuto e lavadas em água destilada por 10 minutos. Finalmente, as lâminas foram incubadas com etanol por 3 minutos, fixadas com xilol por mais 3 minutos e fechadas com resina entellan. Também foram utilizadas secções transversais dos músculos para a determinação da área de secção transversal das fibras musculares. Análise quantitativa e morfométrica Secções transversais dos músculos foram utilizadas para a determinação da área de secção transversal (AST) das fibras musculares que foi determinada através do programa Image Pro-Plus. A razão entre a área de secção transversal das fibras musculares e o peso corporal (AST/PC) dos animais foi obtida de aproximadamente 2000 fibras musculares. Nos grupos lesados as medidas de AST foram obtidas apenas das regiões que foram previamente lesadas. Aproximadamente, 3 a 4 secções transversais dos músculos de diferentes animais foram analisadas em todos os grupos. Fibras musculares positivas para o marcador MHCn foram quantificadas e expressas como uma porcentagem da área de secção transversal do músculo inteiro (Duguez et al., 35 2003). Cinco secções musculares inteiras de animais diferentes de cada grupo foram usadas para análises de MHCn. 4.3. Análise estatística A análise de variância (ANOVA) e o subseqüente teste de Tukey foram utilizados para a comparação das médias dos valores dos grupos experimentais. Para todas as comparações foi considerado como significante p<0,05. 36 5. RESULTADOS A razão entre o peso do músculo TA e o peso corporal dos camundongos (PC/PM) foi similar para todos os grupos estudados (Tabela 1). Tabela 1: Razão entre o peso muscular e o peso corporal (PM/PC; mg/g) dos músculos TA dos grupos controle e tratados 8 dias após lesão muscular. PM/PC (mg/g) Controle 1,5 J 3J CTX CTX+1,5J CTX+3J 1,5±0,1 1,6±0,1 1,5±0,2 1,3±0,1 1,4±0,2 1,4±0,2 Os valores estão expressos como média ± desvio padrão; n= 5. Uma análise de variância (one way) seguida do teste de Tukey (paramétrico) foi aplicado para se testar às diferenças entre os vários grupos (Controle; 1,5 J e 3 J: tratado com laser GaAs nas doses de 1,5 e 3 J respectivamente; CTX: grupo lesado com crotoxina; CTX+1,5 J e CTX+3 J: grupo lesado com crotoxina e tratado com laser GaAs nas doses de 1,5 ou 3 J; respectivamente). 37 Tabela 2: Razão entre a área de secção transversal do músculo e o peso corporal (AST/PC; µm2/g) dos músculos TA corados com azul de toluidina dos grupos controle e tratados 8 dias após lesão muscular. 2 AST/PC (µm /g) – azul de toluidina Controle 1,5 J 3J CTX CTX+1,5J CTX+3J 19,4±0,7 16,2±1 23,2±2 3,7±0,4* 5,5±0,5* 8,3±2*a Os valores estão expressos como média ± desvio padrão; n= 5. Uma análise de variância (one way) seguida do teste de Tukey (paramétrico) foi aplicado para se testar às diferenças entre os vários grupos (Controle; 1,5 J e 3 J: tratado com laser GaAs nas doses de 1,5 e 3 J respectivamente; CTX: grupo lesado com crotoxina; CTX+1,5 J e CTX+3 J: grupo lesado com crotoxina e tratado com laser GaAs nas doses de 1,5 ou 3 J; respectivamente). Diferença significante em relação ao grupo controle: * p<0.05; diferença significante em relação ao grupo CTX: a p<0.05. (p < 0,05 foi considerado estatisticamente significante). 38 Tabela 3: Razão entre a área de secção transversal do músculo e o peso corporal (AST/PC; µm2/g) dos músculos TA submetidos à reação imunohistoquímica para MHCn dos grupos controle e tratados 8 dias após lesão muscular. 2 CTX AST/PC (µm /g) – MHCn CTX+1,5J CTX+3J 6±0,5 7,7±1,35 8,7±0,26 a Os valores estão expressos como média ± desvio padrão; n= 5. Uma análise de variância (one way) seguida do teste de Tukey (paramétrico) foi aplicado para se testar às diferenças entre os grupos (CTX; CTX+1,5 J e CTX+3 J: grupo lesado com crotoxina e tratado com laser GaAs nas doses de 1,5 ou 3 J; respectivamente). Diferença significante em relação ao grupo CTX: a p<0.05. (p < 0,05 foi considerado estatisticamente significante). 39 As secções transversais dos músculos que foram coradas com azul de toluidina mostram que no grupo controle o músculo TA apresentou morfologia normal com as fibras em formato poligonal sem sinais de lesão (fig. 2a). De forma similar os músculos TA tratados com laser GaAs nas doses de 1,5 J/cm2 (Fig. 2b) e 3 J/cm2 (Fig. 2c) também apresentaram morfologia normal. O músculo lesado com CTX e analisado após 8 dias apresentou fibras em regeneração com núcleo centralizado (Fig. 2d). As secções histológicas dos músculos tratados com as doses de 1,5 J/cm2 (Fig. 2e) e 3 J/cm2 (Fig. 2f) do laser GaAs e lesados com CTX e analisados após 8 dias apresentaram fibras em regeneração com o núcleo centralizado semelhante ao grupo apenas lesado. A CTX foi capaz de diminuir significativamente a razão entre a área de secção transversal das fibras musculares e o peso corporal dos camundongos (AST/PC; µm2/g) quando comparada à do grupo controle (81% de redução, p<0,05, Tabela 2). Apenas a dose de 3J foi capaz de aumentar a área de secção transversal da fibra muscular lesada com CTX quando comparada à do grupo apenas lesado com CTX (128,5 % de aumento, p<0,05, tabela 2). 40 Fig. 2: Características histológicas das secções transversais de músculos TA de camundongos. No grupo controle (a) o músculo TA apresenta morfologia normal com as fibras em formato poligonal sem sinais de lesão. b: Músculo TA tratado com laser GaAs na dose de 1,5 J/cm2. c: Músculo TA tratado com laser GaAs na dose de 3 J/cm2. d: Músculo lesado com CTX e analisado após 8 dias apresenta fibras em regeneração com núcleo centralizado (cabeça de seta). e: Músculo lesado com CTX e tratado com laser na dose de 1,5 J/cm2 apresentam fibras em regeneração com núcleo centralizado (cabeça de seta). f: músculo lesado com CTX e tratado com laser na dose de 3 J/cm2 apresentam fibras em regeneração com núcleo centralizado (cabeça de seta). Coloração azul de toluidina. Barra: 50 µm. 41 Em 8 dias após lesão muscular induzida por CTX, é possível visualizar nos músculos dos camundongos lesados a presença de fibras musculares de pequeno tamanho com núcleo centralizado tentando se regenerar coradas com MHCn (fig 3a, coloração marrom). De forma similar, o grupo lesado com a CTX e tratado com laser GaAs na dose de 1,5 J também apresentou fibras musculares em regeneração com diâmetro reduzido (fig 3b). O músculo lesado e tratado com laser GaAs na dose de 3J apresentou fibras em regeneração com tamanho maior quando comparado ao músculo apenas lesado com CTX (Fig. 3c). De fato, a análise da área de secção transversal das fibras musculares dos músculos TA mostra que apenas a dose de 3J foi efetiva em aumentar a área de secção transversal das fibras musculares lesadas com CTX quando comparada ao grupo apenas lesado com CTX (45% de aumento, p<0,05, tabela 3). Por fim, a porcentagem de fibras musculares em regeneração não foi alterada pelo tratamento com laser GaAs nas doses de 1,5J e 3J (CTX: 18,8% ; CTX+1,5J: 17%; CTX+3J: 18,7%; Fig. 4). 42 Fig. 3: Secções transversais de músculos TA de camundongo, submetidas à reação imunohistoquímica para MHC neonatal (marcador de fibras musculares em regeneração). No grupo lesado apenas com CTX e analisado após 8 dias (a) o músculo TA apresenta fibras musculares em regeneração (seta). Músculo previamente lesado com CTX e tratado com laser na dose de 1,5 J/cm2 (b) apresenta fibras em regeneração (seta) de tamanho similar ao grupo somente lesado (a). Músculo lesado com CTX e tratado com laser na dose de 3 J/cm2 (c) apresentam fibras em regeneração (setas) com diâmetro aparentemente maior do que o grupo apenas lesado (a). Barra: 50 µm. 43 % fibras musculares em regeneração MHCn 25 CTX CTX+1,5 CTX+3 20 15 10 5 0 grupos Fig.4. Incidência de fibras musculares em regeneração dos músculos TA dos grupos lesado com CTX (CTX), lesado com CTX e tratado com GaAs 1,5J (CTX+1,5J) e lesado com CTX e tratado com GaAs 3J (CTX+3J) e analisados 8 dias após lesão. Os valores são expressos em porcentagem de fibras musculares em regeneração avaliadas em toda área de secção transversal (%); n=5 por grupo. O teste ANOVA one-way seguido do teste de Tukey para comparações múltiplas foi aplicado. 44 6. DISCUSSÃO No presente estudo foram testadas as doses de 1,5 J e 3 J do laser GaAs durante 5 dias consecutivos, tendo como início o 3º dia após lesão, período de intensa ativação e proliferação de células satélites (Meeson et al., 2004). No entanto, ambas as doses de laser não alteraram a porcentagem de fibras musculares em regeneração e apenas a dose de 3J foi efetiva em aumentar a área de secção transversal dessas fibras musculares, sugerindo que a aplicação de 5 sessões do laser GaAs na dose de 3 J é um método efetivo na melhoria da regeneração muscular através da aceleração da recuperação de massa muscular após lesão sem alterar o número de fibras musculares em regeneração. Os resultados do presente estudo mostram que o modelo de lesão muscular através da injeção intramuscular de CTX foi eficiente na indução de lesão muscular e subseqüente regeneração muscular, como previamente demonstrado (Conte et al., 2008). É bem estabelecido que a CTX, cujo principal componente tóxico é a fosfolipase A2 secretória, induz lesão muscular através da ruptura da membrana plasmática da fibra muscular levando à necrose, destruição tecidual e edema (Salvini et al., 2001, Miyabara et al., 2004). Apesar da CTX e do laser GaAs 904 nm não terem alterado o peso do músculo TA em 8 dias após lesão, ambos induziram alterações significativas na área de secção transversal das fibras musculares. Como esperado, a CTX reduziu o tamanho das fibras musculares em 8 dias após lesão (Tabela 2), período este caracterizado por diferenciação das fibras musculares em regeneração e intensa síntese protéica na tentativa de recuperação das proteínas sarcoméricas previamente destruídas (Duguez et al., 2003). 45 As secções transversais dos músculos que foram coradas com azul de toluidina mostram que no grupo controle o músculo TA apresentou morfologia normal com as fibras em formato poligonal sem sinais de lesão. De forma similar os músculos TA tratados apenas com laser GaAs nas doses de 1,5 J e 3 J também apresentaram morfologia normal, mostrando que essas doses do laser GaAs não alteram a estrutura muscular (fig.2). A reação imunohistoquímica para MHCn, marcador de fibras musculares em diferenciação/regeneração muscular (Duguez et al., 2003), foi utilizada em nosso estudo no intuito de avaliar de forma mais específica as fibras musculares em regeneração e, de fato essa técnica confirmou os resultados obtidos com a análise histoquímica com azul de toluidina que mostrou aumento da área de secção transversal das fibras musculares em regeneração com núcleo centralizado irradiadas com o laser GaAs na dose de 3J (fig.3). Trabalhos que avaliaram o efeito de outros tipos de laser de baixa potência após lesão muscular esquelética também apresentaram resultados semelhantes aos nossos. Weiss & Oron (1992) estudaram o efeito da irradiação do laser He-Ne (632.8 nm) na regeneração do músculo gastrocnêmio de ratos após excisão parcial e concluíram que o laser promoveu a maturação da fibra muscular durante o processo de regeneração. Bibicova & Oron (1993), testaram o efeito do laser He-Ne no processo de regeneração muscular após criolesão do músculo gastrocnêmio de sapos e verificaram que durante a regeneração muscular o laser intensificou a maturação da fibra muscular. Cressoni et al (2008), utilizaram a terapia com o laser ALGaInP 785 nm na dose de 2.7 J por sessão (1,2 e 4 sessões) e verificaram que o laser foi hábil em reduzir o infiltrado inflamatório e acelerar a regeneração do tecido conjuntivo por estimular a proliferação de fibroblastos, desta forma promovendo condições para o alinhamento e a organização da fibra muscular em regeneração; além disso, análises 46 dos cortes dos tecidos dos animais que receberam 4 sessões de tratamento indicaram que as fibras musculares em regeneração estavam em um estágio mais avançado de maturação do que as fibras musculares do grupo controle. Os nossos resultados demonstrando o efeito benéfico do laser GaAs sobre a regeneração muscular, provavelmente deve estar envolvido com a ativação do processo de síntese protéica muscular pelo laser GaAs. De fato, trabalhos utilizando baixas doses do laser GaAs no tratamento de feridas da pele têm promovido a estimulação da síntese de colágeno, sugerindo que a aplicação do laser de baixa intensidade poderia ser utilizado no intuito de se modular vários processos biológicos. Um estudo (Dourado et al., 2003) que administrou o laser GaAs na dose de 4 J/cm² no músculo esquelético em tempos agudos (3, 12 e 24 h) após lesão mostrou que o laser GaAs induziu o aumento do conteúdo da proteína de choque térmico HSP70i, corroborando para a nossa hipótese. Outro trabalho recente demonstrou que o tratamento com o laser Ga-Al-As (830 nm) foi capaz de aumentar o diâmetro da fibra muscular que sofreu atrofia (Nakano et al., 2009). Além disso, foi demonstrado que o laser He-Ne está envolvido na regulação de proteínas envolvidas na etapa inicial do processo de síntese protéica de mioblastos (Shefer et al., 2003). Nesse sentido, futuros estudos seriam necessários para se investigar o efeito direto do laser GaAs sobre o processo de síntese protéica durante a regeneração muscular. Outro efeito benéfico do laser GaAs sobre a regeneração muscular poderia estar relacionado com a estimulação da proliferação de células satélites, uma vez que em nosso estudo nós iniciamos o tratamento com laser no 3º dia após lesão, período caracterizado por intensa proliferação de células satélites (Hawke e Garry, 2001). Além disso, trabalhos têm 47 demonstrado que o laser He-Ne é capaz de ativar células satélites quiescentes a entrarem no ciclo celular e iniciarem a proliferação (Shefer, 2002; Oron, 2006). Além dos efeitos benéficos do laser sobre o processo de regeneração muscular, ele também é capaz de reduzir a necrose e elevar o conteúdo total de antioxidantes (Dourado et al., 2003). Iyomasa et al. (2009), estudaram os efeitos da terapia a laser de baixa intensidade no músculo tibial anterior de roedores e concluíram que as doses do laser de He-Ne (633 nm) de 5 e 10 J/cm² aplicadas durante 7 dias consecutivos aumentou a atividade mitocondrial na fibra muscular, ativou fibroblastos e macrófagos e estimulou a angiogênese. Nakano et al. (2009) também evidenciaram maior angiogênese em músculos esqueléticos atrofiados quando submetidos ao tratamento com o laser Ga-Al-As (830 nm). Portanto tais efeitos também poderiam contribuir para a melhor recuperação da estrutura muscular após a irradiação com o laser GaAs na dose de 3J como demonstrado neste estudo. Diante do exposto, esse estudo mostra que 5 sessões consecutivas de tratamento com o laser GaAs aplicado sobre a pele da região muscular lesada numa dose diária de 3 J, iniciando-se no terceiro dia após lesão é um método eficaz na melhoria da regeneração muscular. Portanto, este trabalho contribui para a clínica fisioterapêutica, pois esclarece que o tratamento com o laser GaAs, cuja dose é muitas vezes utilizada de forma empírica em sessões de tratamento, é de fato eficaz quando utilizado nas doses em torno de 3 J, enquanto que doses por volta de 1,5 J não causam quaisquer efeitos biológicos. Dessa forma, a utilização do laser GaAs na dose de 3 J poderia ser empregada desde períodos bem agudos após lesão (horas após lesão) no intuito de tratar a necrose e reduzir o edema e continuar por até 8-10 dias após lesão, no intuito de estimular a proliferação de células satélites (3 48 dias) e a formação de miotubos (período de diferenciação, por volta de 7-10 dias), levando assim a uma potencialização dos efeitos benéficos do laser GaAs sobre a recuperação de músculos esqueléticos lesados. 49 7. CONCLUSÃO O nosso trabalho demonstra que cinco sessões consecutivas de tratamento com o laser GaAs aplicado sobre a pele da região muscular lesada numa dose diária de 3 J, iniciando-se no terceiro dia após lesão é um método eficaz na melhoria da regeneração muscular. Futuros estudos utilizando curva de doses crescentes do laser GaAs no tratamento de lesões musculares seriam necessárias para se definir de forma sistemática qual seria a faixa de dose em que o efeito da irradiação do laser GaAs seria terapêutica. 50 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: Albertini R, Villaverde AB, Aimbire Fl. Anti – inflammatory effects of low – level therapy (LLLT) with two different red wavelengths (660 nm and 684 nm) in carrageenan – induced rat paw edema. Journal of Photochemistry and Photobiology B Biology 2007;12;89(1):5055 Allen RE, Boxhorn LK. Regulation of skeletal muscle satellite cell proliferation and differentiation by transforming growth factor-beta, insulin-like growth factor I, and fibroblast growth factor. Journal of Cellular Physiology 1989;138:311-315 Amaral AC, Parizotto NA, Salvini TF. Dose-dependency of Low-energy HeNe Laser Effectin Regeneration of Skeletal Muscle in Mice. Lasers in Medical Science 2001;16:44– 51 Anderson JE. 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