a utilização do laboratório clínico na investigação das

A UTILIZAÇÃO DO LABORATÓRIO CLÍNICO NA INVESTIGAÇÃO
DAS ERITROENZIMOPATIAS
Fernando L. A. Fonseca*, Patrícia R. Barbosa#, Daniela Raguer#, Jorge Luiz Freire Pinto**, Roseli
Corazzini*** e Roberto Carlos Sallai****
*
Resumo
Abstract
As eritroenzimopatias são distúrbios
do metabolismo eritrocitário que
causam encurtamento da vida dessas
células compremetendo a sua forma e
a sua função. Exames de rotina
podem ser usados para o auxílio
diagnóstico dessas patologias , porém
exames
mais
elaborados
tecnicamente são poucos utilizados. O
artigo destina-se a informar as
principais alterações vistas nos
exames de rotina e ainda reúne os
métodos descritos na literatura para a
investigação
de
enzimas
do
metabolismo eritrocitário.
The red blood cells patologies are
diseases of the metabolism that
cause shortening of the life from
these cells and can impaire the
shape and function. Routine
examinations from clinical analyses
can be used to diagnostic of these
diseases,
however
elaborated
methods are little used. In this
report we proposed to inform the
main alterations in the routine
examinations and to organize the
described methods for searching
the enzymes from red blood cell
metabolism.
Palavras-chave: Eritrócitos.
Doenças do sangue - Anemia
hemolítica. Distúrbios do metabolismo
- Glicose-6-fosfato desidrogenase.
Distúrbios do metabolismo - Piruvatoquinase.
Keywords: Red blood cell.
Hematological diseases - Hemolytic
anemia. Metabolic disturbance Glucose-6-fhosfhate
desidroghenase. Metabolic
disturbance - Piruvato kinase.
Dr. em Hematologia pela FMUSP, Chefe do Lab. de An. Clínicas da FMABC, Prof. de Hematologia
do Curso de Ciências Farmacêuticas da FMABC.
#Serviço de Pós Graduação USP.
**Farmacêutico-Bioquímico do Lab. An. Clínicas da FMABC.
***Me. Em Patologia Geral pela FMVZ-USP, Profa. Do Curso de Ciências Biológicas do CUFSA,
Autora Coleção Biologia-Projeto Escola Cidadania, Editora do Brasil.
****Me. em Biologia Molecular – UNIFESP, Prof. do Curso de Ciências Biológicas do CUFSA.
As eritroenzimopatias são conhecidas por provocarem hemólise a partir da
alteração do metabolismo energético no interior das hemácias. Os distúrbios
metabólicos mais conhecidos ocorrem na via glicolítica de Embden-Meyerhof
(deficiência da enzima piruvato-quinase) e no shunt do monofosfato de hexose
(deficiência da glicose–6–fosfato–desidrogenase - G6PD). Dentre as enzimas
eritrocitárias reclamadas pela clínica , destacam-se as seguintes: hexoquinase (HK),
glicerofosfoisomerase, gliceraldeído-3 fosfatoisomerase, fosfofrutoquinase, pirivatoquinase
(PK),
glicose-6–fosfato-desidrogenase
fosfogliceratoquinase,
glutation
peroxidase,
(G6PD),
glutation
adenilatoquinase,
redutase,
triose
fosfato
isomerase, desidrogenase lática.
O encurtamento da vida do eritrócito pode ocorrer por defeito intra ou extra
corpuscular. Assim, dentre as anemias hemolíticas que ocorrem por anormalidades
intracorpusculares, estão as do grupo das anemias hereditárias não esferocíticas,
cujos defeitos se localizam em lesões bioquímicas ligadas à síntese deficiente de
enzimas da via glicolítica Embden-Meyerhor ou da vias das pentoses-fosfatos (via de
Warburg-Dickens-Lipman) envolvendo não só os níveis eritrocitários de enzimas
como também os níveis de metabólitos intermediários, coenzimas ou substâncias
indiretamente ligadas ao metabolismo da glicose, como é o caso do glutation.
A glicose-6-fosfato-desidrogenase é regulada por um gene situado no
cromossomo X. Além de ser ligado ao sexo, o defeito é incompletamente dominante:
expressa-se completamente nos homens e nas mulheres homozigotas e em grau
variável nas mulheres heterozigotas.
São variáveis os efeitos da G-6PD, dependendo não só do grau de expressão do
defeito como também da variante enzimática e da raça do indivíduo afetado. Há
casos onde não há presença de doença hemolítica ou apresentam hemólise crônica
de grau leve independente da ingestão de drogas ou a ocorrência de hemólise
relaciona-se com a ingestão de drogas (Quadro 1) ou de sementes de Vicia fava
(favismo).
Tipo
Medicamento
Cloranfenicol,
Antimicrobianos
furacina,
furadantina
Sulfanilamida,
Sulfonas/Sulfonamidas gantrisin,
dapsona.
Ácido
Analgésicos
acetilsalicílico,
acetaminofeno.
Antimaláricos
Primaquina,
atabrina.
Naftalina,
Miscelânea
vitamina K, ácido
ascórbico.
Quadro 1 - Lista Parcial de algumas substâncias que podem provocar crise
hemolítica aguda em pacientes com deficiência de G-6PD
A deficiência da G-6PD afeta mais de 200 milhões de pessoas no mundo, mas
felizmente apenas uma parcela delas tem manifestações clínicas. A doença foi
inicialmente descrita em negros norte-americanos que tomavam primaquina para o
tratamento ou profilaxia de malária. Embora a ocorrência esporádica deste defeito
tenha sido descrita em grande número de populações das mais diversas regiões do
mundo, a deficiência tem prevalência elevada e maior interesse populacional entre
negros e em certas regiões do Mediterrâneo. Sua prevalência em negros norteamericanos é de 12-15 %, entre italianos é de 1.3-2 % (mas atinge 14-48 % na
Sardenha). Como conseqüência desta distribuição, a doença ocorre no Brasil em
descendentes de mediterrâneo (especialmente italianos) e entre negros e pardos.
Distinguem-se três principais variantes clínicas da doença. O tipo “negro” foi o
primeiro descrito, sendo observado em soldados americanos de raça negra que
apresentavam anemia hemolítica de intensidade variável ao ingerirem primaquina ou
outras drogas antimaláricas. Observou-se depois que a deficiência de G-6PD, atingia
também outras raças e exibia larga distribuição geográfica (tipo “não negro”). Uma
terceira variante clínica é observada em lactentes homozigotos ou heterozigotos
para a deficiência de G-6PD, sob a forma de icterícia neonatal não relacionada com
ingestão de drogas.
Além da hemólise induzida por drogas, os indivíduos susceptíveis podem sofrer
hemólise aguda por infecções viróticas ou por acidose grave, clinicamente as causas
mais comuns.
A investigação laboratorial das anormalidades enzimáticas em geral compreende
a avaliação qualitativa (testes de Brewer, imunoflurorescência e ascorbato-cianeto) e
quantitativa da G-6PD (teste de Beutler). Além disso, deve ser feita a eletroforese da
G6PD em acetato de celulose e, nos casos que revelarem alteração, pode ser
realizado o estudo molecular desta enzima. Nos casos sem alteração, devem ser
avaliadas as demais enzimas eritrocitárias.
Quando a avaliação da atividade enzimática é realizada, quer seja quanti ou
qualitativamente, é necessário lembrar que os reticulócitos são mais ricos em
enzima; deste modo, se a avaliação for realizada após uma crise hemolítica, o
indivíduo pode apresentar reticulocitose, o resultado pode ser “normal”; da mesma
forma, em paciente com anemia hemolítica crônica, o resultado tem que ser
considerado em relação ao número de reticulócitos encontrados na circulação.
Finalmente é preciso enfatizar que a transfusão com hemácias normais pode elevar
artificialmente o resultado da dosagem de G-6PD de um indivíduo deficiente.
Avaliação Laboratorial :
Hemograma: As hemácias podem estar normais ou ligeiramente aumentadas de
tamanho. Reticulocitose pronunciada, mesmo em presença de anemia moderada.
Leucócitos e plaquetas normais. Muitas vezes podemos encontrar no sangue
periférico hemácias “mordidas” (bite cells), ou seja, que exibem uma ou mais falhas
em sua periferia. Estas células são possivelmente resultantes da remoção dos
corpúsculos de Heinz pelo baço.
Fragilidade Globular Osmótica: Normal.
Eletroforese da Hemoglobina: Normal.
Prova de Coombs: Normal.
Mielograma: Acentuadíssima hiperplasia da série eritróide.
Prova para Corpúsculos de Heinz: São grumos de hemoglobinas desnaturadas
que se precipitam dentro da hemácia, sendo facilmente demonstráveis com corantes
vitais (p.ex., violeta de metila). São vistos em muito maior número nos pacientes
esplenectomizados, pois são removidos do sangue pelas células macrofágicas do
baço.
Técnica:
Reativos:
Cristal violeta........................2.0 g
Água destilada ..................100 mL
Cloreto de sódio ..................0.73 g
Água destilada ..................100 mL
Para uso, mistura-se pequenas porções das soluções, em partes iguais.
Procedimento:
•
Mistura-se uma gota de sangue (0.1 mL), sobre uma lâmina, com 0.025 mL de
cristal violeta.
•
A mistura é feita com os cantos de uma lamínula, que cobrirá a preparação.
•
A leitura pode ser realizada após 5 minutos.
Interpretação:
Os corpúsculos de Heinz aparecem como pequenas inclusões purpúricas na
margem das células vermelhas, não corando os reticulócitos.
Certas drogas e a presença de hemoglobinas instáveis são responsáveis pelo
aparecimento dos corpúsculos de Heinz.
Testes de Triagem para Deficiência de G6PD
1 Teste do Ponto Fluorescente (BEUTLER, 1979).
Reagentes:
D-glicose-6-fosfato (G6P), 10 mmol/L. Dissolva 305 mg do sal dissódico, ou a
quantidade equivalente ao sal potássico em 100 mL de água.
NADP +, 7.5 mmol/L;
Saponina, 750 mmol/L
Tampão Tris-HCl, pH 7.8;
Glutationa oxidada (GSSG), 8mmol/L. Dissolva 49 mg de GSSG em 10 mL de
água.
Sangue total (EDTA), 10 mL.
Mistura-se os reagentes na seguinte proporção:
2 volumes de G6P;
1 volume de NADP +;
1 volume de saponina;
3 volumes de tampão;
1 volume de GSSG;
2 volumes de água.
A solução é estável a –20ºC por ± 2 anos e por 2 meses se conservado a 4ºC.
Aliquotar a solução (100 µL) em tubos e manter a –20ºC.
Princípio:
A formação de NADPH no sangue, em presença deG6PD pode ser visível sob
luz UV.
Método:
Adiciona-se 10 µL do sangue total a uma alíquota (100 µL) da solução de G6P
e NADP e homogeneíza-se. Aplica-se uma gota desta solução num papel de filtro
(Whatman Nº 1) logo após a mistura e após 5-10 minutos. Colocar sob luz UltraVioleta (UV). Se houver presença de G6PD, o NADP é convertido a NADPH. Este é
fluorescente sob luz UV, enquanto que o NADP não.
Interpretação:
Ponto fluorescente – Presença de G6PD.
Ponto não fluorescente – ausência ou pouca G6PD.
2 Teste da Redução da Metahemoglobina (BREWER, 1962) – Teste qualitativo
para deficiência de G6PD.
Reagentes:
Nitrito de Sódio, 180 mmol/L;
Dextrose, 280 mmol/L. Dissolva 5 g de dextrose e 1.25 g de NaNO2 em 100
mL de água.
Azul de Metileno, 0.4 mmol/L. Dissolva 150 mg de cloridrato de metiltionina
em 1 litro de água.
Sangue total (EDTA), 0.5 mL.
Princípio:
O nitrito de sódio converte a hemoglobina a metahemoglobina. Quando o azul
de metileno é adicionado à reação e incubado, este estimula a via da pentose
fosfato em indivíduos que apresentam níveis normais de G6PD, reconvertendo a
metahemoglobina a hemoglobina.
Método:
Marca-se 3 tubos de ensaio grandes como positivo, negativo e teste.
Procede-se da seguinte forma:
Solução
de
Nitrito/Glicose
Solução de Azul de
Metileno
Sangue em EDTA
Positivo Negativo
Teste
10 mL
-------
10 mL
-------
10 mL
10 mL
100 mL
100 mL
100
mL
Incuba-se a 37ºC por 3 horas. Adicionar 10 mL de água destilada. Fazer a
leitura entre 5 e 10 minutos comparando o tubo teste com os demais.
O
tubo
positivo apresentará coloração acastanhada pela formação de metahemoglobina. O
tubo negativo apresenta coloração avermelhada (vermelho vivo), uma vez que o azul
de metileno reconverteu a metahemoglobina a hemoglobina novamente.
Interpretação:
Amostra normal – coloração vermelha;
Amostra deficiente em G6PD – coloração castanha.
3 Teste do Ascorbato-Cianeto (JACOB, 1966).
Reagentes:
Ascorbato de Sódio, 10 mg. Dispense 10 mg de ascorbato de sódio e 5 mg de
glicose num determinado número de tubos. Os tubos devem ser tampados e
estocados por tempo indeterminado a –20ºC.
Cianeto de Sódio, 500 mg pH 7.0. Dissolve-se 500 mg de NaCN em 50 mL de
água e adicione 20 mL de tampão fosfato iso-osmótico, pH 7.4. Neutralize-se a
solução (para pH 7.0) com 2 ml/L HCl e o volume é acertado para 100 mL. Esta
solução é estável indefinidamente a 20ºC.
Sangue total (EDTA), 5 mL.
Princípio:
Quando o cianeto de sódio e o ascorbato de sódio são adicionados à amostra
de sangue, a catalase é inibida pelo cianeto e há a formação de peróxido de
hidrogênio pela oxidação do ascorbato e da oxihemoglobina. O peróxido gerado,
converterá a oxihemoglobina a hemicromo e metahemoglobina, a menos que este
seja reduzido pela glutationa peroxidase. A reação requer a glutationa como doador
de prótons. Em deficientes de G6PD há diminuição da glutationa.
Método:
Em um tubo de ensaio contendo o ascorbato, coloca-se 2,0 mL de sangue e
adiciona-se 2 gotas da solução de cianeto. Mistura-se por inversão e incuba-se a
37ºC por 4 horas.
O tubo é Invertido e observa-se a coloração na parede do tubo. A cor escura
do sangue está relacionada à deficiência de G6PD. Amostras normais, mantém sua
coloração avermelhada.
*OBS.: Método não específico para G6PD.
Testes para Detecção de Deficiência de G6PD
1 Teste Quantitativo de G6PD (BEUTLER, 1984).
Reagentes:
Tampão TRIS-HCl 1M, EDTA 5mM, pH 8.0;
MgCl2, 0.1 M;
NADP2 mM;
Hemolisado 1:20;
G6P 6 mM;
Água bi-destilada.
Método:
Prepara-se o hemolisado utilizando-se 3 mL de sangue colhido em 1 mL de
ACD. Determina-se a concentração da hemoglobina no hemolisado.
A amostra é preparada da seguinte forma:
Incuba-se a 37ºC por 10 minutos. Acrescenta-se 100 mL de G6P 6mM ao
tubo de amostra, para desencadear a reação. A variação da densidade óptica (DO)
por minuto é acompanhada em espectrofotômetro, em 340 nm a 37ºC.
Branco
Amostra
TRIS-HCl 1M, EDTA 5mM, ph 8.0 100 µL
100 µL
MgCl2, 0.1 M
100 µL
100 µL
NADP 2 mM
100 µL
100 µL
Hemolisado 1:20
100 µL
100 µL
Água bidestilada
680 µL
580 µL
Incuba-se a 37ºC por 10 minutos. Acrescenta-se 100 mL de G6P 6 mM ao
tubo de amostra, para desencadear a reação. A variação da densidade óptica (DO)
por minuto é acompanhada em espectrofotômetro, em 340 nm a 37ºC.
Cálculo:
AE = D DO/min x 10 5 > UI/gHb/min. a 37ºC
E x V x Hb
Onde:
AE – Atividade Enzimática
DO/min – Variação da densidade óptica por minuto;
Hb – concentração da hemoglobina no hemolisado em g/dL;
E – coeficiente de extinção molar da coenzima NADP+ (6.22);
V – volume de hemolisado em mL, utilizado no sistema;
5
10 – correção da hemoglobina no hemolisado em gramas por 100 mL de sangue.
VALORES DE REFERÊNCIA:
12.1 ± 2.09 UI/gHb/min. a 37ºC.
Teste de Triagem para Piruvato Quinase (PK)
1 Teste do Ponto Fluorescente (BEUTLER, 1984).
Princípio:
A piruvato quinase catalisa a fosforilação do ADP em ATP pela
fosfoenolpiruvato (PEP) com a formação do piruvato. Este reduz o NADPH presente
a NAD com a formação de lactato. A diminuição da fluorescência sob UV indica a
presença de PK.
Teste para Detecção de Deficiência de Piruvato Quinase (PK)
1 Teste Quantitativo de PK (BEUTLER, 1984)
Reagentes:
Tampão TRIS-HCl 1M, EDTA 5mM, pH 8.0;
KCl, 1M
MgCl2, 0.1 M;
NADH 2 mM;
ADP 30mM;
LDH 60U/mL;
PEP 50 mM;
Hemolisado 1:20;
Água bi-destilada.
Princípio:
A PK catalisa a fosforilação da adenosina difosfato (ADP) a adenosina
trifosfato (ATP) pelo fosfoenolpiruvato (PEP). A velocidade de formação do piruvato
é medida pela oxidação do NADH na reação da lactato desidrogenase.
Método:
Prepara-se o hemolisado utilizando-se 3 mL de sangue colhido em 1 mL de ACD.
Determina-se a concentração da hemoglobina no hemolisado.
Procede-se à amostra da seguinte forma:
Branco
Amostra
TRIS-HCl 1M, EDTA 5mM, ph 8,0
100 µL
100 µL
KCl, 1 M
100 µL
100 µL
MgCl2 , 0.1 M
100 µL
100 µL
NADH, 2 mM
100 µL
100 µL
ADP neutralizado, 30mM
------
50 µL
LDH 60U/mL
100 µL
100 µL
Hemolisado 1:20
20 µL
20 µL
Água bidestilada
380 µL
330 µL
Incuba-se a 37ºC por 10 minutos. Acrescenta-se 100 mL de PEP 50mM a
ambos os tubos. A variação da densidade óptica (DO) por minuto é acompanhada
em espectrofotômetro, em 340 nm a 37ºC.
Cálculo:
AE = D DO/min x 10 5 > UI/gHb/min
E x V x Hb
37ºC
Onde:
DO/min – Variação da densidade óptica por minuto;
Hb – concentração da hemoglobina no hemolisado em g/dL;
E – coeficiente de extinção molar da coenzima NADH (6.22);
V – volume de hemolisado em mL, utilizado no sistema;
10 5 – correção da hemoglobina no hemolisado em gramas por 100 mL de sangue.
VALORES DE REFERÊNCIA:
15.1 ± 1.96 UI/gHb/min. a 37ºC.
Detecção Molecular para G6PD e PK
O material utilizado para este tipo de detecção é o DNA genômico isolado de
leucócitos do sangue periférico por procedimento padrão. Inicialmente são
pesquisadas as principais mutações, já que a nossa população possui um alto índice
de miscigenação tornando praticamente impossível determinar a origem dos
pacientes.
Já foram descritas aproximadamente 78 variantes relacionadas diretamente
relacionadas com as mutações da G6PD. As principais variantes são:
Variante Mediterrâneo
O principal estudo da variante mediterrâneo se dá através da análise da
substituição de uma citosina por uma timina (CÆT) levando à substituição de uma
serina (Ser) por uma fenilalanina (Phe) na posição 188.
Variante AO principal estudo da variante A se dá através da análise de duas substituições
uma guanina por uma adenina e uma adeninda por uma guanina, nas posições 202
e 68 respectivamente.
Para a Piruvato Quinase foram detectadas cerca de 47 mutações e a análise é
baseada pricipalmente em deleções de bases ou mutações por splicing. A principal
mutação encontrada está relacionada com a deleção de uma citosina (C) na
isoenzima L da piruvato quinase.
Além da análise do DNA genôminco diretamente por PCR (reação em cadeia da
polimerase), as mutações podem ser estudadas por clonagem de cDNA,
sequenciamento e SSCP. De acordo com a necessidade de diagnóstico será
empregado uma ou mais técnicas.
REFERÊNCIAS
BEUTLER, E. G6PD deficiency. Blood, New York, v. 84, n. 11, p. 3613-3636, Dec.
1994.
DACIE, J. V.; LEWIS, S. M. Investigation of the hereditary haemolytic anemias. In:
PRACTICAL haematology. 6. ed. New York: Churchill Livingstone, 1984, p. 159-168.
LUKENS, J.N. Anemias hemolíticas hereditárias associadas a anormalidades da
glicólise anaeróbica dos eritrócitos e metabolismo dos nucleotídeos. In: Lee, G.R. et
al. Wintrobe hematologia clínica. São Paulo: Manole, 1998, v. 1. p. 1084-1100.
___________ . Deficiências de glicose-6-fosfato desidrogenase e deficiências
relacionadas que envolvem a via da pentose fosfato e metabolismo da glutationa. In:
Lee, G.R. et al. Wintrobe hematologia clínica. São Paulo: Manole, 1998, v. 1. p.
1101-1119.
LORENZI, T. F. et al. Manual de hematologia: propedêutica e clínica. 3. ed. Rio de
Janeiro: Medsi, 2003.
MIWA, S.; FUJII, H. Molecular basis of erythroenzymopathies associated with
hereditary hemolytic anemia: tabulation of mutation enzymes. American journal of
hematology, v. 151, p. 122-132, 1996.