estudo das propriedades cinéticas e de estabilidade da enzima

ESTUDO DAS PROPRIEDADES CINÉTICAS E DE ESTABILIDADE DA ENZIMA
TRIPSINA APÓS SUA IMOBILIZAÇÃO NO SUPORTE POLIANILINA
Luiza Luanna Amorim Purcena 1,4; Samantha Salomão Caramori2,4; Kátia Flávia Fernandes3,4
1
Curso de Ciências Biológicas (Licenciatura), UnUC ET, Universidade Estadual de Goiás.
Pesquisadora – Orientadora.
3
Pesquisadora – Co-Orientadora.
4
Laboratório de Química de Proteínas, Universidade Federal de Goiás.
2
RESUMO
O uso de enzimas na indústria e biotecnologia proporcionou um grande avanço na produção de novos
compostos e novos conhecimentos. Entretanto, esse avanço tem sido barrado pela desvantagem do alto custo de
produção e manipulação das enzimas em sua forma livre. A imobilização de biomoléculas é uma grande
ferramenta, e tem mostrado inúmeras vantagens. Dentre elas, pode-se destacar a redução no custo de manutenção
e produção, um aumento da estabilidade do sistema, além de proporcionar a sua reutilização.
O sistema proposto neste trabalho superou as vantagens da utilização da enzima livre,
principalmente no que diz respeito à estabilidade e à possibilidade de sua reutilização. Tais
vantagens poderão ser aproveitadas pelos setores industriais em que a enzima tripsina seja
utilizada.
Palavras-chave: tripsina, imobilização, uso repetido
Introdução
As enzimas são catalisadores das reações que ocorrem nos sistemas biológicos. Elas
têm eficiência catalítica extraordinária provocando um aumento da velocidade das reações
químicas (Nelson & Cox, 2003). Devido ao seu alto grau de especificidade ao substrato, as
enzimas são largamente utilizadas no setor industrial, como na produção de alimentos e
medicamentos, bem como no uso para diagnóstico laboratorial (Kaplan et al., 1989).
O custo de purificação, mesmo que parcial, ou ainda da produção desses catalisadores, tem barrado seu
uso disseminado e, algumas vezes, tornado seu uso proibitivo em processos industriais (Cheetam, 1985). Foi
neste contexto que surgiu a Tecnologia Enzimática.
Um dos avanços da Tecnologia Enzimática são as técnicas de imobilização de enzimas
(enzimas que estão confinadas em um espaço definido por conseqüência de uma ligação
química, interações físicas, ou por confinamento, e que podem ser usadas repetida ou
continuamente (Cheetam, 1985)).
Este trabalho propõe o estudo de uma enzima largamente utilizada em processos industriais, a tripsina,
após a sua imobilização a um suporte de baixo custo, a polianilina.
Metodologia
Síntese de Poli(Anilina) - A síntese de poli(anilina) foi feita seguindo a metodologia descrita por Fernandes et
al. (2003), usando persulfato de amônio.
1
Ativação do Polímero - A ativação do polímero foi feita pela ligação de poliglutaraldeído segundo modificação
da metodologia de Olsson & Ögren (1983), usando poliglutaraldeído.
Imobilização da Enzima - A enzima tripsina foi imobilizada, adicionando uma solução da enzima à polianilina.
A reação processou-se a uma temperatura de 4ºC sob agitação constante.
Parâmetros de Imobilização - Foram testados pH de imobilização nos valores de 6,0 a 8,6. Testou-se também
concentrações de enzima de 0,01 até 0,5 mg mL-1 , além do tempo de imobilização de 1h até over night.
Parâmetros de Reação - Para definir as condições ótimas para reação da enzima com o substrato testou-se o pH
de reação de 6,0 até 9,0, o tempo de reação de 20 min até 150 min, e a temperatura de reação de 30º C até 55º C.
Estabilidade Operacional - Foi realizada a medida da estabilidade da enzima imobilizada
após a sua reutilização, armazenada a uma solução tampão de fosfato de sódio pH 7,6.
Estabilidade ao Armazena mento - A fim de se estabelecer a melhor forma de
armazenamento, bem como a estabilidade do sistema com o decorrer do tempo, amostras
de PANIG-tripsina foram armazenadas a 4ºC, em tampão fosfato de sódio 0,1 mol L-1 , em
pH 7,6. A atividade enzimática foi testada conforme descrito anteriormente, após o
armazenamento em diferentes intervalos de tempo.
Resultados e Discussão
Concentração da enzima – A figura 1 representa o comportamento da tripsina a medida que se aumenta a
concentração de enzima ofertada. À partir do gráfico, observa-se que a atividade da tripsina aumenta a medida
que aumenta-se a concentração até atingir o máximo de atividade, com concentração 0,01mg mL-1 , a partir desse
valor, o aumento da concentração não corresponde ao aumento da atividade.
Figura 1: Atividade da enzima imobilizada em função da quantidade de enzima ofertada.
Atividade Enzimática (UE)
Atividade Enzimática (UE)
pH ótimo de imobilização - O gráfico 2 apresenta a atividade da enzima em função do aumento do pH.
14
12
10
8
6
4
2
12 0
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
11
10Concentação da enzima (mgmL- 1)
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
6,0 6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
pH
Observa-se que à medida que aumenta-se o pH há aumento na atividade enzimática (aumento na retenção de
enzima ativa). A atividade é máxima em pH 7,6, havendo decréscimo da atividade em seguida.
Figura 2: pH ótimo de imobilização para o sistema tripsina-PANIG
2
Tempo de Imobilização - A figura 3 mostra a influência do tempo de imobilização da tripsina ao
suporte na atividade do sistema. Observa-se uma atividade enzimática maior entre os intervalos de 1h a 5h de
imobilização, seguindo de um decréscimo após este ponto. A redução da atividade observada após 1h de
imobilização pode ser decorrente de ação hidrolítica da tripsina sobre moléculas vizinhas no meio de reação,
Shah et al (1995).
Atividade Enzimática (UE)
Figura 3: Atividade do sistema tripsina imobilizada em PANIG em função do tempo de imobilização.
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
2
4
6
8
1 0 12
14 1 6 18
Tempo (h)
Parâmetros de Reação
pH ótimo de reação – A figura 4 mostra a variação na atividade da tripsina imobilizada de acordo com os
diferentes valores de pH para reação. Observa-se atividade crescente até o pH 7,6, alcançando a partir desse
Atividade Relativa %
ponto uma estabilidade alcalina, consequentemente, a enzima imobilizada pode ser usada em diferentes faixas de
tripsina-PANIG
tripsina livre
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,510,010,5
pH
pH alcalino.
Figura 4: pH ótimo de reação do sistema com o substrato
Tempo de Reação - O gráfico 5 representa a atividade da tripsina imobilizada, em função do tempo de contato
com o seu substrato. Observa-se grande similaridade cinética entre a enzima livre e a imobilizada, com
quantidades correspondentes de produto em função do tempo. Isso demonstra que após a imobilização a tripsina
continuou a atuar com atividade catalítica sem nenhum impedimento.
Atividade Relativa (%)
Tripsina-PANIG
Tripsina livre
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
3
0 20 40 60 80 100120 140 160 180200
Tempo de Reação (min)
Figura 5: Gráfico da atividade do sistema em relação ao tempo de reação
Temperatura de Reação - A figura 6 mostra que a tripsina imobilizada apresentou aumento na atividade
enzimática com o aumento da temperatura alcançando atividade máxima a 45º C e sofrendo uma pequena queda
em seguida (100% para 87%), diferente da enzima livre que após temperatura ótima sofre queda brusca de
temperatura.
Figura 6: Gráfico da temperatura ótima para reação do sistema tripsina-PANIG
Atividade Relativa (%)
Atividade Relativa %
Tripsina-PANIG
Tripsina livre
100
90
80
70
60
50
40
30
20
100
10
0
80
30
35
40
45
50
55
Temperatura C
60
40
20
0
5
10
15
20
25
30
Dias
Estabilidade ao Armazenamento - Analisando o gráfico 7, observa-se que a atividade inicial de 100% da
enzima foi conservada durante uma semana, havendo uma queda logo em seguida. Após 3 semanas o sistema
havia perdido metade da atividade chegando a 50%, ou seja, o sistema apresentou um período de meia vida de 3
semanas
Figura 7: Gráfico da atividade o sistema tripsina-PANIG ao armazenamento
Estabilidade Operacional - A figura 10 nos mostra que no segundo dia de reuso da enzima imobilizada houve
uma queda de 56% na atividade enzimática, sendo que na quinta utilização a atividade chegou aproximadamente
Atividade Relativa (%)
a zero, mostrando perda total da eficiência de hidrólise.
100
80
60
40
20
0
1
2
3
4
5
dias
Figura 8: Gráfico da atividade do sistema em relação à estabilidade operacional
Conclusão
4
Após a imobilização da tripsina no suporte de polianilina, observou-se que a enzima
imobilizada apresenta atividade ótima quando imobilizada em solução tampão fosfato de
sódio pH 7,6, durante 1h e com concentração da enzima igual a 0,1 mg mL-1 . Constatou-se
ainda que em relação aos parâmetros de reação, a enzima imobilizada apresentou atividade
ótima em pH 7,6, tempo de reação de 90 minutos e temperatura de 45º C.
Comparando-se os resultados obtidos com a atividade da enzima livre, percebe-se que alguns dos
parâmetros são melhorados, como estabilidade em pH alcalinos e estabilidade térmica em relação à enzima livre
Dessa forma, podemos concluir que a imobilização de tripsina em PANIG conferiu à
enzima vantagens na sua utilização comparada à enzima livre, possibilitando sua aplicação
biotecnológica .
Referências Bibliográficas
Cheetam, P. 1985. Principles of Industrial Enzymology. Basis of Utilization of Soluble and
Immobilized Enzymes in Industrial Processes. In: Wiseman, A. (ed), Handbook of Enzyme
Biotechnology, John Wiley & Sons: Nova Iorque. cap. 3, p. 55.
Fernandes, K.F.; Lima, C.S.; Pinho, H. & Collins, C.H. 2003. Immobilization of horseradish
peroxidase onto polyaniline polymers. Process Biochemistry, 38: 1379-1384.
Kaplan, L.A.& Pesce, A.J. 1989. Clinical Chemistry – theory, analysis and correlation.
New York: The C.V. Mosby Co. (2ª ed.) p.24.
Nelson, M. & Cox, M. 2003. Lehninger Princípios de Bioquímica. Sarvier. São Paulo, (3 ed) p.147.
Shah, B.; Kumar, S.R. & Devi, S. Immobilized Proteolytic Enzymes on Resinuous Materials
and their Use in Milk – Clotting. Process Biochemistry, Vol. 30, No. 1, pp. 63-68, 1995
Olsson, B. & Ogren, L. 1983. Optimization of peroxidase immobilization and of design of
packed-bed enzyme reactors for flow injection analysis. Analytica Chimica Acta, 145: 8799.
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