CB - Desenvolvimento de sensores de RNA para

ISSN 1808-4532
e-ISSN: 2179-443X
Rev Ciên Farm Básica Apl., Araraquara, v. 37 Supl. 1, Agosto 2016
BB. Identificação de sequências-alvo no genoma do vírus da Dengue para desenvolvimento de
Ribossensores
Vitória Fernanda Bertolazzi Zocca1, Gabriela Barbosa de Paiva1, Graciely Gomes Corrêa1, Milca Rachel da
Costa Ribeiro Lins1, Danielle Biscaro Pedrolli1.
1
Departamento de Bioprocessos e Biotecnologia, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP.
Introdução: A Dengue é uma doença causada pelo vírus da Dengue, um vírus de RNA que infecta cerca de
390 milhões de pessoas por ano no mundo todo. Atualmente, o tratamento desta doença é sintomático devido
à ineficácia dos medicamentos antivirais, e o diagnóstico preciso do vírus depende de procedimentos
laboratoriais demorados e caros. Uma alternativa é o desenvolvimento de um kit diagnóstico baseado em um
sistema de expressão in vitro composto pelos componentes comumente encontrados em kits comerciais de
transcrição e tradução extraídos de E. coli. O DNA molde para a reação contem o gene repórter amilCP
(cromoproteína azul) sob controle de um promotor forte e de um RNA regulatório do tipo Toehold Switch,
capaz de detectar a presença do RNA viral. Este sistema é composto de duas fitas de RNA denominadas switch
e trigger. Na primeira, encontram-se a sequência codificadora do gene repórter, a sequência conectora e a
sequência de ancoragem que servirá para o pareamento inicial do RNA trigger. Este último é uma sequência
de RNA fita simples capaz de ligar-se ao RNA switch, desestruturar o hairpin, e expor as sequências do RBS
e do códon inicial para a transcrição do gene repórter ser ativada. Objetivo: Este trabalho visa o
desenvolvimento de sensores de RNA para identificação do vírus dengue que possibilitem a criação de um
método para diagnóstico simples e rápido para a doença. Metodologia: Os genomas dos quatro sorotipos da
dengue foram alinhados com os genomas da Zika e Chikungunya e então escolhidas três sequências-alvo do
RNA do vírus da Dengue de aproximadamente 40 nucleotídeos que foram utilizadas como sequências de
ancoragem para construção dos sistemas de Toehold switch. Os sistemas foram desenhados in silico usando o
software NUPACK. As sequências projetadas foram compradas como oligonucleotídeos de DNA fita simples,
aneladas, clonadas sob controle do promotor T7 por reação cíclica da ligase (LCR - Ligase Cycling Reaction)
e fusionadas ao gene repórter. A funcionalidade do RNA switch será testada contra sequências sintéticas
correspondentes aos RNAs virais delimitados como sequências-alvo. Reações de transcrição e tradução in vitro
serão montadas com uma versão do RNA switch em plasmídeo mais o RNA-alvo sintético. O resultado
positivo será identificado pela alteração de cor na reação devido à síntese da cromoproteína azul. Resultados
e discussão: As sequências-alvo do RNA viral da Dengue escolhidas são significativamente diferentes dos
genomas da Zika e Chikungunya, mas idênticas entre os quatro sorotipos da Dengue, apresentando baixa taxa
de mutação. Isto permitiu o desenvolvimento de RNAs switch altamente específicos para a doença,
independente de seu sorotipo. Os resultados preliminares indicaram sucesso na transformação das células de
E. coli TOP10 com o plasmídeo contendo o RNA switch a ser testado. Conclusão: O trabalho está em fase
inicial e poucos resultados foram obtidos, porém, ao que tudo indica, os sensores de RNA apresentam alto
potencial como método diagnóstico.
Palavras-chave: Dengue, Sensores de RNA, Diagnóstico viral.
Apoio financeiro: FAPESP.