Aline Marie Fernandes Otimização do cultivo de células

Aline Marie Fernandes
Otimização do cultivo de células-tronco embrionárias humanas
e corpos embrióides envolvendo sistemas agitados e esfingosina
1-fosfato como agente anti-apoptótico
Tese de Doutorado - agosto/2009 - PCM, ICB, UFRJ
Resumo
Células-tronco embrionárias humanas (hES) derivadas da massa celular interna de
blastocistos, caracterizam-se pela capacidade ilimitada de auto-renovação e diferenciação
em todos os tipos celulares. São essas propriedades que fazem das hES importante
ferramenta para o estudo da biologia do desenvolvimento, testes de eficácia de novos
fármacos in vitro e eventualmente terapia celular (Pouton and Haynes, 2007).
Revisão de 51% da literatura sobre a manutenção das hES indicou grande
variedade de protocolos utilizados (95 para uma mesma linhagem), o que dificulta a
comparação entre os resultados publicados por diferentes grupos de pesquisa. Desta
forma, iniciamos o trabalho estabelecendo condições adequadas para o cultivo de hES em
nosso laboratório. Como resultado, obtivemos protocolo que pode ser utilizado em
diferentes linhagens de hES (HUES, H9 e BR1), as quais se mantiveram pluripotentes
após longos períodos em cultura.
Apesar dos avanços obtidos nos últimos 10 anos, existem obstáculos em relação
ao uso de hES em testes clínicos: i) quantidade limitada de células obtida em placas
estáticas, visto que em muitos casos o número de células deverá ser equivalente a
107/Kg/paciente; ii) sobrevivência inferior a 20% da população celular a ser transplantada
no caso de doenças neurodegererativas (Mountford, 2008, Oh and Choo, 2006). Por essas
razões, testamos a hipótese de que hES poderiam ser escalonadas em sistemas agitados
do tipo spinner, aderidas a microcarregadores. Obtivemos concentração final de 1,8x106
células/mL, representando aumento de ~30% em relação ao cultivo em placas estáticas
com custos reduzidos pela metade. Quanto ao aumento da sobrevivência celular, foi
utilizada esfingosina 1-fosfato (S1P) como agente protetor. Nossos dados indicaram
proteção de 50% sobre insulto com anisomicina. Tanto o tamanho dos EBs quanto a
proliferação foi significativamente maior nos grupos tratados com S1P. Análise dos
receptores de S1P nas células pré-diferenciadas indicou a presença de quatro dos cinco
receptores de S1P com aumento significativo de expressão do receptor S1PR1 nos grupos
tratados com anisomicina e anisomicina + tratamento prévio de S1P (4 e 8 vezes maior,
respectivamente). A ativação da via ERK ½ parece ser o alvo do S1P nos corpos
embrióides.
Esta tese contribuiu não só para o estabelecimento do cultivo das hES em
sistemas agitados, mas também sugere o uso de S1P como agente protetor contra morte
celular em corpos embrióides, o qual poderá ser usado em estratégias envolvendo a
aplicação de terapia celular em doenças degenerativas.