Giulliana Martines Moralez ASSOCIAÇÃO DO VÍRUS EPSTEIN

Giulliana Martines Moralez
ASSOCIAÇÃO DO VÍRUS EPSTEIN-BARR
COM TUMORES EPITELIAIS AVANÇADOS DE COLO UTERINO.
RIO DE JANEIRO
2008
Livros Grátis
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ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
FACULDADE DE MEDICINA – UFRJ
DEPARTAMENTO DE CLÍNICA MÉDICA
ASSOCIAÇÃO DO VÍRUS EPSTEIN-BARR
COM TUMORES EPITELIAIS AVANÇADOS DE COLO UTERINO.
GIULLIANA MARTINES MORALEZ
Dissertação
submetida
ao
Corpo
Docente da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como parte dos requisitos necessários
à obtenção do Grau de Mestre em
Medicina.
Clínica
Área
Médica.
de
Linha
Oncologia.
Orientadores:
Dr. Carlos Gil Ferreira
Prof. Dr. Nelson Spector
RIO DE JANEIRO
2008
Concentração:
de
Pesquisa:
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
FACULDADE DE MEDICINA – UFRJ
DEPARTAMENTO DE CLÍNICA MÉDICA
ASSOCIAÇÃO DO VÍRUS EPSTEIN-BARR
COM TUMORES EPITELIAIS AVANÇADOS DE COLO UTERINO.
Giulliana Martines Moralez
Orientadores:
Dr. Carlos Gil Ferreira
Prof. Dr. Nelson Spector
Banca Examinadora:
Dra. Claudia Esther Alicia Rocio Hassan
Dra. Isabel Cristina Chulvis do Val Guimarães
Dra. Patricia Rieken Macêdo Rocco
Dr. Gutemberg Leão de Almeida Filho
Dr. Rony Schaffel
RIO DE JANEIRO
2008
iv
Ficha Catalográfica
Moralez, Giulliana Martines
Associação do vírus epstein-barr com tumores epiteliais avançados de
colo uterino / Giulliana Martines Moralez – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade
de Medicina, 2008.
xvi, 76 f. : il. ; 31 cm
Orientadores: Carlos Gil Ferreira e Nelson Spector
Dissertação (mestrado) -- UFRJ, Faculdade de Medicina, Programa
de Pós-graduação em Clínica Médica, 2008.
Referências bibliográficas: f. 54-65
1. Neoplasias do colo do útero – virologia. 2. Neoplasias do colo do útero
- diagnóstico. 3. Neoplasias do colo do útero – radioterapia. 4. Herpesvirus
humano 4 - patogenecidade. 5. Infecções por vírus epstein-barr – diagnóstico.
6. Infecções por vírus epstein-barr – patologia. 7. Prognóstico. 8. Reação em
cadeia da polimerase - métodos. 9. Hibridização in situ - métodos. 10.
Imunoistoquímica - métodos. 11. Oncologia - Tese. I. Ferreira, Carlos Gil. II.
Spector, Nelson. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de
Medicina, Programa de Pós-graduação em Clínica Médica. IV. Título.
v
DEDICATÓRIA
A todos os caminhos que me trouxeram até aqui.
vi
AGRADECIMENTOS
Sou sinceramente grata aos meus orientadores e colaboradores:
Ao Dr. Carlos Gil Ferreira, pelo exemplo profissional, pela confiança depositada
desde o início em meu trabalho e pelo apoio para esta conquista.
Ao Dr Nelson Spector, pela oportunidade oferecida, pelas correções, críticas e
estímulo incansáveis. Sinto-me honrada em tê-lo como orientador.
À Dra Maria da Glória Carvalho por ter aberto as portas do laboratório para
mim e por transmitir conhecimentos de forma tão competente. Este trabalho não teria
sido o mesmo sem a sua participação.
À Rocio Hassan, por ter abraçado este projeto, por sua dedicação, por seus
ensinamentos e pelo carinho.
Ao Dr. Otávio Baiocchi, pela disponibilidade e generosidade ao discutir os
resultados e nortear a discussão.
À enfermeira Roberta Lima e seus fiéis escudeiros, Alexandre e Fabrício, pela
amizade e disposição com que me auxiliaram desde os primeiros passos deste
trabalho.
À equipe de enfermagem do ambulatório de Ginecologia do Instituto Nacional
de Câncer: Anailde, Ana Maria, Juraci, Maria Teresa, Graça, por seu dinamismo e
alegria.
Aos colegas da Ginecologia e residentes do INCA, que direta ou indiretamente
participaram deste projeto.
Às secretárias da Ginecologia do INCA, Edna e Conceição, da UFRJ, Teresa
Gouda e Sônia e da Pesquisa Clínica do INCA, Thaís.
A toda a equipe da Anatomia Patológica do INCA, chefiada pelo Dr. Paulo, em
especial aos patologistas Inês e Fábio e às técnicas Adriana e Emília
vii
À equipe Dr. Fernando Soares, do Serviço de Patologia do Hospital “AC
Camargo”, pela preciosa colaboração na construção do TMA.
Aos colegas de Laboratório do INCA: Débora, Denise, Isabel, Fernanda, João e
Daniele, e da UFRJ: Juliana, Marcelo, André e Fernanda, que tão pacientemente
acolheram uma cirurgiã no laboratório.
À Isabelle Small, pela organização criteriosa dos dados e tratamento
estatístico.
À Dra Ligia Barros, pela revisão amorosa do texto e pelo apoio.
Ao meu amado Carlos Heitor, pelo estímulo e companheirismo que me
trouxeram até aqui.
Aos meus pais, pelo solo fértil e bem cuidado. Este é o fruto da árvore que
vocês plantaram.
Às mulheres da minha família: minha avó Nena, minha Mãe, minha irmã
Karina, pelo que são e pelo que representam para mim.
Às pacientes que aceitaram participar deste trabalho, pelo quanto nos ensinam
com sua capacidade de doação, mesmo num momento tão crítico de suas vidas.
viii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA
1
FIGURA
2
FIGURA
Carcinoma de colo uterino: estadiamento da FIGO.
(Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia).
Curva de Kaplan-Meier descrevendo a sobrevida,
de acordo com estádio clínico.
45
Fotografia de lâmina de TMA com resultados de EBER-ISH.
4
FIGURA
5
44
Gel de poliacrilamida, corado pela técnica da prata.
3
FIGURA
7
46
Fotografia de lâmina de caso de câncer de colo estudado
por imuno-histoquímica com marcação positiva para EBNA1.
47
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Carcinoma de colo uterino: Estadiamento da FIGO
(Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia).
6
Tabela 2: Resultados condensados dos cinco principais estudos
randomizados que embasaram a utilização da terapia combinada no
tratamento do carcinoma de colo uterino.
8
Tabela 3: Padrões de expressão gênica do EBV quanto aos
tipos de latência e tecido associado.
17
Tabela 4: Compilação dos resultados de DNA-PCR em estudos
envolvendo pesquisa de EBV em material proveniente de pacientes
com diagnóstico histológico de carcinoma de colo uterino.
20
Tabela 5: Compilação dos resultados de ISH em estudos
envolvendo pesquisa de EBV em material proveniente de pacientes
com diagnóstico histológico de carcinoma de colo uterino.
21
Tabela 6: Compilação dos resultados de estudos
envolvendo pesquisa de EBV em material proveniente de pacientes
com diagnóstico histológico de carcinoma de colo uterino em que
foram comparadas as técnicas de PCR e ISH.
22
Tabela 7: Composição da “Mistura de reação” utilizada para
amplificação por PCR do segmento do gene P53.
27
Tabela 8: Seqüência dos iniciadores utilizados para a
caracterização por PCR das amostras estudadas.
28
Tabela 9: Composição da “Mistura de reação” utilizada
para amplificação do segmento Bam M do EBV pela PCR.
29
Tabela 10: Composição do Gel de poliacrilamida utilizado
para eletroforese de DNA.
30
x
Tabela 11: Grau tumoral.
37
Tabela 12: Distribuição etária das pacientes.
38
Tabela 13: Distribuição quanto ao Status Menopausal.
38
Tabela 14: Diâmetro tumoral.
39
Tabela 15: Extensão tumoral.
39
Tabela 16: Estadiamento.
40
Tabela 17: História obstétrica.
40
Tabela 18: História ginecológica.
41
Tabela 19: Atividade sexual.
41
Tabela 20: Número de ciclos semanais de quimioterapia.
42
Tabela 21: Resultados de PCR, amplificação conforme
primer utilizado.
46
xi
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1
Termo de consentimento livre e esclarecido
67
ANEXO 2
Aprovação do Comitê de ética em pesquisa
74
ANEXO 3
Ficha Clínica
75
xii
LISTA DE SIGLAS E SÍMBOLOS
adeno
Adenocarcinoma
CEC
carcinoma epidermóide (carcinoma
espino celular)
CEMO
Centro de Estudos de Medula Óssea
CEP
Comitê de Ética em Pesquisa
DNA
Ácido Desoxirribonicleico
EBER
RNA não traduzidos
EBNA
proteínas nucleares
EBV
Vírus Epstein-Barr
FIGO
Federação Internacional de
Desoxirribonucleic Acid
Epstein-Barr Virus
Ginecologia e Obstetrícia
HPV
Vírus papiloma humano
Human Papilloma Virus
IARC
Agência Internacional para Pesquisa
International Agency for
em Câncer
Research on Cancer
IHQ
Imuno-histoquímica
INCA
Instituto Nacional de Câncer
ISH
Hibridização in situ
In situ Hibridization
LMP
Proteínas Latentes de Membrana
Latent Membrane Protein
NM
não mencionado pelo autor
Tp53
Proteína p53
PCR
Reação em Cadeia pela Polimerase
PET
Tomografia com emissão de positron
pRB
Proteína do retinoblastoma
Polimerase Chain Reaction
Positron Emission Tomography
Tissue Micro-array
TMA
TC
Tomografia Computadorizada
RNM
Ressonância Nuclear Magnética
xiii
RESUMO
O câncer de colo uterino, cuja origem está relacionada à infecção persistente
pelo papilomavírus humano (HPV), é a segunda neoplasia mais comum em mulheres
no mundo e uma das principais causas de morte em países em desenvolvimento,
como o Brasil. A associação com o vírus Epstein-Barr (EBV), ainda pouco estudada em
carcinoma de colo uterino, tem sido descrita em outros tumores epiteliais e explorada
como potencial agente causal e fator prognóstico.
No
período
de
agosto
de
2003
a
janeiro
de
2006,
foram
avaliadas
prospectivamente 135 pacientes com diagnóstico histológico inicial de carcinoma de
colo uterino, e com estadiamento clínico de IIb a IVb. Foi realizada coleta de
fragmentos tumorais antes do início do tratamento e a pesquisa de EBV foi realizada
por Reação em cadeia pela polimerase (PCR), Hibridização in situ (ISH) e Imunohistoquímica (IHQ).
A idade variou de 23 a 77 anos, com mediana de 48 anos. Pela técnica da PCR,
o DNA do EBV foi encontrado em até 56% dos casos. Por ISH, não foram detectados
transcritos EBER. A pesquisa da proteína EBNA 1 por IHQ demonstrou positividade de
marcação em 17% e nenhum caso mostrou positividade por LMP 1.
Os estudos clínicos publicados sobre associação de EBV em carcinoma de colo
uterino são poucos e têm resultados heterogêneos. Considerando os critérios
propostos para determinar associação entre vírus e câncer, não se pode determinar
associação, tampouco causalidade, entre EBV e carcinomas de colo uterino na
população estudada.
xiv
ABSTRACT
Cervical cancer, whose origin is related to persistent HPV infection, is the
second most frequent cancer in women worldwide, and one of the main causes of
death in women in Brazil. The association with EBV is poorly evaluated in cervical
cancer, and has been described in other epithelial tumors as a potential causal agent
and prognostic factor.
Between August 2003 and January 2006, 135 patients with advanced cervical
cancer were evaluated. Surgical specimens were obtained before treatment, and
examined for EBV by PCR, ISH and IHQ techniques.
The median age was 48 years-old, varying between 23 and 77. EBV-DNA was
positive in 56% of cases. ISH did not detect EBER transcripts. The proteins EBNA1 and
LMP1 were positive by Immunohistochemical analysis in 17% and 0% of cases,
respectively.
The clinical studies published on EBV in cervical cancer are limited and present
heterogeneous results. Considering the proposed criteria to define that association, is
not possible to conclude association neither causality between EBV and cervix cancer
in this studied group.
xv
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
1
2. REVISÃO DA LITERATURA
4
2.1 Câncer de colo uterino
4
2.2 Vírus Epstein-Barr
10
2.3 Métodos para diagnóstico do EBV
14
2.4 Tumores associados ao EBV
16
2.5 EBV e câncer de colo uterino
18
3.OBJETIVOS
23
3.1 Objetivo Primário
23
3.2 Objetivos Secundários
23
4. MATERIAIS E MÉTODOS
24
4.1
Tipo de estudo, período e local
24
4.2
Pacientes
24
4.2.1 Critérios de inclusão e exclusão
24
4.2.2 Avaliação Clínica e Estadiamento
25
4.2.3 Tratamento e Seguimento
25
4.2.4 Avaliação de resposta clínica
25
4.3
26
Pesquisa do vírus Epstein-Barr
4.3.1 Obtenção e armazenamento das amostras
26
4.3.2 Avaliação histopatológica
26
4.3.3 Amplificação de DNA pela PCR
26
4.3.4 Hibridização in situ para EBER-1 (EBER-ISH)
32
xvi
4.3.5 Estudo Imuno-histoquímico
34
4.4
36
Análise estatística
5. RESULTADOS
37
5.1
37
Clínica
5.1.1 Pacientes
37
5.1.2 Tratamento
42
5.1.3 Resposta ao tratamento
43
5.1.4 Sobrevida
43
5.2
45
Pesquisa do vírus Epstein-Barr
5.2.1 Pesquisa de EBV pela técnica da PCR, usando diferentes primers
45
5.2.2 Pesquisa de EBV através da Hibridização in situ EBER-ISH
46
5.2.3 Pesquisa de EBV por Imuno-Histoquímica
47
6. DISCUSSÃO
48
7 . CONCLUSÕES
53
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
54
ANEXOS
66
2
1. INTRODUÇÃO
O câncer de colo uterino é o segundo câncer ginecológico mais freqüente no
1
mundo. Apesar de ser passível de prevenção, o carcinoma de colo uterino é uma das
principais causas de morte em países em desenvolvimento, como o Brasil. O número
de casos novos de câncer de colo do útero esperados para o Brasil em 2008 é de
18.680, com um risco estimado de 19 casos a cada 100 mil mulheres.2 Na região
Sudeste, câncer de mama, pele não-melanoma e cólon são os mais freqüentes em
mulheres, enquanto o câncer de colo do útero é o quarto mais freqüente.2
Países que implementaram sistemas de rastreamento por citologia com
ampla cobertura populacional obtiveram diminuição de incidência de câncer de colo
uterino em até 73%.3-5 Como o diagnóstico também passou a ser feito em estádios
mais iniciais,3 observou-se diminuição na mortalidade em até 80%. Já em países sem
sistemas de rastreamento populacional eficientes, a maioria dos casos é diagnosticada
em estádios avançados, o que diminui a possibilidade de cura para as pacientes, com
sobrevida média esperada de 49% em cinco anos em contraste com 59 a 69%
observados nos países com rastreamento abrangente.
2
A infecção persistente pelo vírus papiloma humano (HPV) é considerada um
passo necessário na gênese do câncer cervical.6-8 Mesmo modelos bem descritos de
carcinogênese, como associação de tabagismo com câncer de pulmão e hepatite B
crônica com câncer de fígado, não representam relações causais necessárias, como é
a
associação
de
HPV
com
carcinoma
de
colo
uterino.9
A
vacina
profilática
quadrivalente contra o HPV, aprovada para uso no Brasil em 2006, inclui partículas
semelhantes a vírus de dois subtipos que são responsáveis por até 70% dos casos de
câncer de colo uterino. Esta vacina é potencialmente eficaz no controle do câncer de
colo uterino, já que previne o surgimento e evolução das lesões precursoras.
A infecção persistente por HPV é necessária para a tranformação maligna
no colo uterino, embora a maioria das infecções seja eliminada sem tratamento.
Considerando-se que infecção pelo HPV não é suficiente para que uma célula cervical
normal se transforme numa célula maligna,10 vários cofatores envolvidos na
carcinogênese têm sido descritos,11 entre eles: tabagismo,12 imunossupressão,13 o uso
de anticonceptivos orais,14 nutrição,15 suscetibilidade genética aumentada,16 além de
presença de outros vírus, como o vírus Herpes Simplex e o vírus Epstein-Barr (EBV).17
3
A associação entre HPV e EBV é descrita em carcinomas nasofaríngeos em
diversas populações18,
19
e tem sido utilizada como marcador prognóstico20 para esse
tumor. Embora a identificação de EBV no carcinoma de colo uterino tenha possível
associação prognóstica, ainda dispomos de poucos estudos abordando este tema.21-39
Esta dissertação tem por fim descrever a presença do EBV em fragmentos
tumorais de uma série de pacientes com carcinoma avançado de colo uterino.
Inicialmente, enfocamos a detecção de genes de EBV e seus produtos em
tecido tumoral de colo uterino. Discutem-se as formas de avaliação da infecção por
EBV, considerando o potencial e limitações de cada teste diagnóstico. Os resultados
encontrados são comparados com os resultados de estudos anteriores. Finalmente,
exploramos as possíveis implicações dos nossos achados no desenvolvimento tumoral
e esclarecemos os motivos pelos quais não foi possível estabelecer as correlações
clínicas esperadas neste grupo de pacientes.
4
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Câncer de colo uterino
Carcinogênese
A infecção persistente pelo HPV é o principal fator de risco para o
desenvolvimento de lesões precursoras de câncer de colo uterino.
O HPV pode ser detectado em 5 a 40% das mulheres em idade
reprodutiva.40 HPV tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59 e 68 são
considerados de alto risco oncogênico em função de sua freqüente associação com
carcinoma cervical e com lesões precursoras de carcinoma cervical.41 Os demais tipos
são considerados de baixo potencial oncogênico, geralmente associados a lesões
celulares subclínicas ou verrugas genitais.42
A expressão dos oncogenes E6 e E7 dos HPVs de alto risco oncogênico está
relacionada ao desenvolvimento do carcinoma cervical.
O oncogene E6 se liga à
proteína Tp53 (proteína responsável pela iniciação de vias de reparo celular e
apoptose), aumentando a sua degradação pela via da ubiquitina.43 O oncogene E7
interfere no controle da proliferação celular, ao inativar a proteína do retinoblastoma
(pRB).44 E7 se liga à forma hipo-fosforilada da pRB, resultando em sua inativação
funcional e permitindo progressão para a fase S do ciclo celular. Dessa forma, a célula
acumula danos no DNA e fica suscetível a outras mutações.
O DNA do HPV pode ser encontrado em virtualmente todos os carcinomas
de colo uterino. Embora a infecção persistente pelo HPV de alto risco seja causa
central para o desenvolvimento do carcinoma de colo uterino,45 a maioria das
infecções é eliminada sem tratamento. As lesões precursoras (chamadas lesões
intraepiteliais) persistentes não progridem necessariamente para estádios invasivos,46
o que leva a considerar que co-fatores poderiam interferir no processo carcinogênico.
5
Estadiamento
Uma vez diagnosticado o câncer de colo uterino é imprescindível determinar
a extensão da doença. O estadiamento do câncer de colo uterino recomendado pela
Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO) inclui exame pélvico,
biópsias (quando houver lesão em vagina, reto ou bexiga), radiografia de tórax,
urografia excretora, cistoscopia e retossigmoidoscopia. Este sistema de estadiamento
permite selecionar a estratégia terapêutica mais apropriada e validar comparações
entre eficácia de tratamentos, mas tem limitações.
Estudos
de
imagem,
tais
como
a
tomografia
computadorizada,
a
ressonância nuclear magnética e a tomografia com emissão de pósitrons (“positron
emission tomography” - PET), assim como a cirurgia, auxiliam na determinação mais
precisa do tamanho e do grau de disseminação da doença.47 Esses exames têm sido
utilizados nos estudos mais recentes que compararam diferentes tratamentos, mas
ainda não constam no sistema de estadiamento da FIGO48 (Tabela 1 e Figura 1) e não
são realizados rotineiramente nas pacientes tratadas no Instituto Nacional de
Câncer.49
Tratamento
Câncer de colo uterino restrito ao colo e menor de quatro centímetros é
tratado preferencialmente com cirurgia e obtém-se cura em 5 anos em 90% dos
casos.50,51 Lesões maiores de quatro centímetros, com infiltração de estruturas
adjacentes (como vagina e paramétrio) ou invasão de linfonodos pélvicos são
consideradas “localmente avançadas”.52 Para estes casos, o papel da cirurgia é restrito
e o tratamento padrão era a radioterapia exclusiva (radioterapia seguida de
braquiterapia) até o início dos anos 90. Nesta época, foram concluídos cinco grandes
estudos
randomizados
envolvendo
1.894
mulheres
que
foram
53-57
radioterapia exclusiva ou associada à quimioterapia semanal.
tratadas
com
Estes estudos
mostraram benefício em 15% da sobrevida global quando associada quimioterapia
semanal ao tratamento radioterápico.52
Os resultados resumidos dos cinco estudos encontram-se na Tabela 2.
6
Tabela
1:
Carcinoma
de
colo
uterino:
estadiamento
da
FIGO48
(Federação
Internacional de Ginecologia e Obstetrícia).
ESTÁDIO
DESCRIÇÃO
0
Carcinoma IN SITU
I
Carcinoma restrito ao colo
IA1
Invasão do estroma menor que 03mm
com extensão superficial até 07mm
IA2
Invasão do estroma de 03 a 05mm
com extensão superficial até 07mm
IB1
Lesões maiores que IA com até 04 cm
IB2
Lesões maiores que 04 cm
II
Infiltração da vagina exceto terço inferior ou
involvimento paramétrial sem extensão a plano ósseo
IIA
Invasão do terço superior e médio da vagina
sem infiltração parametrial
IIB
Infiltração parcial do paramétrio
III
Invasão do terço inferior de vagina, extensão a plano
ósseo e hidronefrose
IIIA
Invasão do terço inferior da vagina
IIIB
Invasão do paramétrio até plano ósseo ou hidronefrose
IV
Extensão além do trato reprodutor
IVA
Infiltração da mucosa da bexiga ou reto
IVB
Metástase a distancia ou fora da pélvis verdadeira
7
Figura
1:
Carcinoma
de
colo
uterino:
Internacional de Ginecologia e Obstetrícia).
estadiamento
da
FIGO48
(Federação
8
Tabela 2: Resultados condensados dos cinco principais estudos randomizados que
embasaram a utilização da terapia combinada (quimioterapia e radioterapia) no
tratamento do carcinoma de colo uterino.
Estudo
GOG 8554
Número
total de
pacientes
368
GOG 12353
SWOG 879755
RTOG 900157
GOG 12056
Estádio
Quimioterapia
IIB – IVA
386
IB Bulky
243
IA2 – IIA
389
IIB – IVA
526
Sobrevida
em
Tipos de
IIB – IVA
3 anos (%)
1)Cisplatina/5-FU
1) 67%
2) Hydroxiuréia
2) 57%
1)Cisplatina
1) 83%
2)radioterapia isolada
2) 74%
91Cisplatina/5-FU
1) 87%
2)radioterapia isolada
2) 77%
1Cisplatina/5-FU
1) 75%
2)radioterapia isolada
2) 63%
1)Cisplatina
1) 65%
2)Cisplatina/5-FU/
Hidroxiuréia
2) 65%
3) 47%
3) Hidroxiuréia
Atualmente,
a
associação
de
quimioterapia
(cisplatina
semanal)
e
radioterapia pélvica é o tratamento padrão para pacientes com câncer de colo
localmente avançados (estádios IIb a IVa), desde que não haja contra-indicações à
quimioterapia, como insuficiência renal.
9
Fatores Prognósticos
Entre os fatores que interferem na resposta tumoral ao tratamento, temos:
tamanho tumoral, envolvimento de paramétrios até parede óssea bilateralmente,
presença de metástase linfonodal, hidronefrose, níveis de hemoglobina abaixo de 10
mg/dl.58
Além disso, tem sido demostrado que a duração do tratamento e o intervalo
entre o final da radioterapia externa e o início da braquiterapia interna, se
prolongados, afetam negativamente a sobrevida das pacientes com carcinoma de colo
uterino.
Greven59 sugere que o tempo total de tratamento não ultrapasse 8
semanas e a FIGO48 recomenda que o tratamento completo se dê em 6 a 7 semanas.
Perez60 estratificou recidiva pélvica conforme tempo de tratamento e
estádio clínico, observando que a taxa de recidiva (em dez anos) para estádio IIB foi
de 20%, 28% e 34% e para IIIb e 30%, 40% e 50% quando o tempo de tratamento
foi para menor de sete semanas, entre 7,1 e 9 semanas ou maior que 9 semanas,
respectivamente.
No estudo publicado por Chen,61 o tempo total de tratamento teve mediana
de 63 dias. Observou-se redução da taxa de controle pélvico em 0.57% para estádio
IIb e 0.73% para EC III por dia de atraso de tratamento quando este excedia 63 dias.
Petereit62 descreve uma série de pacientes com mediana de tempo de
tratamento de 55 dias. Houve diminuição de sobrevida 0.6% ao dia e recidiva pélvica
de 0,7% ao dia para cada dia adicional.
Girinsky63 descreve uma série de pacientes com câncer de colo IIb e IIIb
submetidas a radioterapia, observando que quando tempo de tratamento excede 52
dias há perda de controle pélvico em 1% por dia adicional.
O tempo total de tratamento radioterápico em tumores avançados de colo
uterino está claramente associado ao prognóstico da paciente e está associado a
aumento na recidiva pélvica e diminuição de sobrevida.
58-64
10
2.2 Vírus Epstein-Barr
O EBV é um γ−herpesvírus com um genoma de DNA duplo de 184 kpb,65
que infecta mais de 90% da população mundial.66-68 Dois tipos de EBV infectam
humanos: EBV-1 e EBV-2. Eles diferem na seqüência dos genes que codificam os
antígenos nucleares EBNA2 e 3.
69
EBV-1 é mais freqüente que EBV-2 na maioria das
populações, enquanto EBV-2 tem prevalência maior em Nova Guiné e África
equatorial.
70;71
A infecção ocorre freqüentemente na infância72 e a transmissão do EBV
ocorre por contato salivar, embora a transmissão sexual também seja possível.33;73-77
Durante a primoinfecção, o EBV ingressa através do epitélio escamoso estratificado da
orofaringe, por mecanismos ainda não bem definidos e infecta células B 78;79. O EBV é
encontrado em 1 em 105-106 linfócitos B de memória circulantes.68 Uma vez
colonizado o compartimento linfóide B, a reativação ocorre normalmente no epitélio da
orofaringe, mas pode ocorrer em qualquer mucosa onde haja linfócitos B (como colo
uterino, por exemplo).80
Após replicação lítica, o vírus silencia este programa, o DNA é circularizado
para formar um epissoma e se estabelece a latência viral, em que o vírus permanece
na célula B de memória, expressando um conjunto limitado de genes.66;68 Cerca de
100 genes virais são expressos durante a replicação, mas apenas 10 são expressos
nas células infectadas, latentes: seis proteínas nucleares (EBNAs), duas proteínas de
membrana (LMPs) e dois tipos de RNA não traduzidos (EBERs).
EBNA: Proteínas nucleares
Entre as proteínas nucleares mais estudadas do EBV, temos o EBNA1, o
EBNA2 e o EBNA-LP. A transcrição dessas proteínas é promovida por iniciadores
dependentes de polimerase II celular nas regiões BamHI C e BamHI W.81 EBNA-LP e
EBNA2 são as primeiras proteínas virais expressas em linfócitos B infectados.
EBNA1
A proteína do antígeno nuclear 1 do EBV (EBNA1) é necessária para a
replicação e segregação do genoma viral na latência e é também um fator regulador
na transcrição dos genes latentes.82
11
EBNA1 liga-se ao DNA viral de origem durante a replicação, fazendo com
que o genoma viral permaneça na célula infectada como um epissomo circular.83;84
Assim, é a única proteína viral associada com cromossomos durante a mitose,
garantindo a segregação dos epissomos para as células filhas.85 EBNA1 continua sendo
produzida durante a infecção lítica, garantindo sua presença na célula uma vez
reassumida a condição latente.68 EBNA1 desempenha, portanto, um papel central na
manutenção da infecção latente pelo EBV. Por isto, é expresso em todas as células
infectadas pelo EBV, independentemente do padrão de expressão e é esperado
encontrar sua expressão em qualquer situação benigna ou maligna associada ao
EBV.66;86;87
EBNA1 também participa da evasão do EBV à resposta imune do
hospedeiro. A proteína transcrita do EBNA1 possui um domínio N-terminal e um
domínio C-terminal, separados por uma seqüência repetitiva de glicina-glicina-alanina.
Essa
seqüência
inibe
a
apresentação
do
antígeno
ao
complexo
maior
de
histocompatibilidade.
EBNA2
A proteína EBNA2 se localiza em grandes grânulos nucleares88 e é o
principal regulador transcricional dos genes latentes do EBV77,78 durante a primeira
fase da infecção viral (programa transcricional de crescimento). EBNA2 também é um
transativador específico de genes marcadores de ativação de células B, como CD23 e
CD21 assim como das proteínas celulares que contribuem para o crescimento das
células B.89,90 Especificamente, regula a expressão das proteínas de membrana latente
LMP1 e LPM2.91,92 Como EBNA2 induz a ativação de genes envolvidos na proliferação
celular, sua expressão é essencial para a transformação neoplásica de linfócitos B.93
A seqüência de EBNA2 difere entre o EBV-1 e -2 e é o determinante
biológico relacionado à habilidade dos EBV tipo 1 em transformar linfócitos B com
maior eficiência.94
EBNA3
As proteínas EBNA3 também regulam a expressão de genes celulares,
aumentando a habilidade do EBNA2 em regular o oncogene viral LMP1. Existem 3
genes pertencentes a esta família: EBNA3a, EBNA3b e EBNA3c. Estes fornecem os
epítopos imunodominantes para a resposta T CD8+.
12
LMP1 (Latent Membrane Protein – Proteínas Latentes de Membrana)
O gene que codifica LPM1 localiza-se na extrema direita do genoma viral
linear. RNA de LMP1 é o segundo transcrito viral mais abundante em células latentes
infectadas. Seu produto é uma proteína de membrana que contem 386 aminoácidos e
é considerada central no desenvolvimento dos mecanismos oncogênicos do EBV, por
sua capacidade de ativar vias de sinalização críticas para a célula, como NF-kB, MAPK
e JAK/STAT, assim, sua expressão têm efeito pleiotrópico na proliferação celular,
diferenciação, apoptose e ciclo celular. LPM1 atua como equivalente constitutivamente
ativado de CD40 e é o único gene do EBV conhecido por seu potencial de
transformação em fibroblastos.95 Quando expresso em células epiteliais, LMP1 inibe
diferenciação
celular
em
cultura
de
queratinócitos,96
causa
transformação
morfológica97 e induz expressão aberrante de queratina e hiperplasia severa de
epiderme em ratos transgênicos.98
EBER
EBER são RNAs nucleares pequenos e não poliadenilados. Estão entre os
transcritos mais abundantes em células transformadas por EBV. Eles são transcritos
por RNA polimerase III e localizam-se no núcleo, mas não são traduzidos. Não há
evidência de que EBERs tenham papel na transformação e crescimento tumoral, com
exceção do linfoma de Burkitt, em que, junto com EBNA1, são os únicos produtos
virais expressos.99
A resposta imunológica ao EBV
EBV infecta células epiteliais e linfócitos B. Os mecanismos imunológicos
responsáveis pela resposta a agentes virais incluem a fagocitose por monócitos e
macrófagos e a apresentação de antígenos no contexto de moléculas de classe II do
MHC para os linfócitos T helper, que produzem IL-2 e interfefon gama, recrutando
linfócitos T citotóxicos. Estes reconhecem os antígenos virais no contexto de moléculas
de classe I do MHC das células epiteliais e iniciando a resposta celular específica.
13
Os mecanismos de evasão da resposta imunológica
Um dos mecanismos que permitem ao EBV evadir-se da resposta
imunológica é pela produção de IL10. A interleucina 10 viral é produto da expressão
do gene BCRF-1 do EBV e tem 70% de similaridade com a IL10 humana.100 Ela é uma
citocina inibitória produzida durante a fase lítica da infecção pelo EBV, interferindo no
desenvolvimento de respostas específicas por linfócitos T helper.101 Interleucina10
afeta diretamente a função de linfócitos T helper por inibir a expressão de IL- 2, IL-5 e
fator de necrose tumoral (tumour necrosis factor -TNF). Ativação de células T na
presença de interleucina 10 pode induzi-las a anergia que não é revertida pela
estimulação por IL-2.102
14
2.3 Métodos para diagnóstico do EBV
Reação
em
cadeia
pela
polimerase
(PCR-Polimerase
Chain
Reaction)
A técnica da PCR, desenvolvida em 1985 por Kary Mulis,103 permite que o
ácido nucleico-alvo seja especificamente selecionado e amplificado. A especificidade
da PCR é obtida através do uso de um par de primers (iniciadores) compostos de
oligonucleotídeos que anelarão no DNA-alvo somente em uma seqüência específica. A
amplificação é exponencial e é obtida pelo emprego de polimerases de DNA
termoestáveis que, a partir do par de primers, copiam as regiões do DNA-alvo
múltiplas vezes, numa série de ciclos. O produto da PCR normalmente possui um
comprimento esperado que é visualizado através de eletroforese em gel. A presença
do segmento amplificado (banda) no gel indica a presença do DNA-alvo na amostra
clínica original.
Para aplicação diagnóstica nos cânceres associados ao EBV, a alta
sensibilidade alcançada pelas técnicas de PCR é considerada problemática, devido à
possibilidade de falsos positivos dado que, com estas técnicas, não é possível
identificar a fonte do DNA viral. Entretanto, são as únicas técnicas que permitem
caracterizar a heterogeneidade molecular no tecido, assim como a monitoração
molecular da doença.104;105 Assim, o papel da PCR é confirmatório de diagnóstico e
mais uma prova utilizada no estudo de associações.
Hibridização in situ (ISH)
Descrita pela primeira vez em 1969106 e utilizada com maior frequência a
partir da década de 80, a reação de hibridização in situ (ISH) possibilita localizar com
precisão no tecido, parafinado ou congelado, um gene específico ou seus transcritos.
Outras técnicas de biologia molecular, como a reação em cadeia pela polimerase
(PCR), permitem a detecção de DNA extraído de tecidos, mas não permitem observar
a distribuição dos transcritos ou DNA em um tecido.
A ISH se baseia na detecção de pequenos segmentos de DNA ou RNA, em
cortes de tecido ou preparados citológicos, utilizando-se uma seqüência complementar
de ácidos nucléicos marcados com sondas. Sob condições apropriadas, ocorre a
hibridização (através do estabelecimento de pontes de hidrogênio) da sonda com a
seqüência-alvo do DNA viral, que pode ser visualizada através de marcadores
15
fluorescentes ou radioativos ligados às sondas, permitindo a detecção e localização de
seqüências de ácidos nucléicos em material histológico.
Para a detecção do EBV, técnica de ISH com sondas específicas para os
RNAs virais EBER, expressos em altos níveis nas células latentes, é considerada o
“padrão ouro”, já que permite identificar as células que contem o EBV, eliminado a
possibilidade da detecção do EBV em linfócitos de memória.
104;107;108
Imuno-histoquímica (IHQ)
A imuno-histoquímica é uma técnica que utiliza determinados anticorpos
pré-definidos para identificação de uma proteína (antígeno) específica, reconhecendo
um determinado domínio desta proteína. O anticorpo liga-se ao antígeno específico,
que por sua vez é reconhecido por um anticorpo secundário ao qual se liga um
complexo enzimático revelador (estreptavidina-biotina-peroxidase). A peroxidase
transforma uma substância cromogênica, o que confere à reação positiva uma
coloração específica.
Para utilização da IHQ no diagnóstico do EBV, é importante conhecer o
padrão de latência característico do EBV no tecido estudado e escolher como alvo uma
proteína expressa pela totalidade dos casos, em níveis estáveis, por exemplo, LMP1 no
linfoma
de
Hodgkin.
Os
anticorpos
comerciais
disponíveis
para
técnicas
imunohistoquímica ou citoquímica são LMP1, EBNA2 e Zebra (DAKO). Existem também
anticorpos não comerciais, validados na literatura científica, contra EBNA1 e LMP2A. A
vantagem destas técnicas é a possibilidade de detectar a expressão proteica nas
células tumorais, a desvantagem é a baixa sensibilidade e a perda de antigenicidade
dos alvos durante o processamento histológico.
104;109
16
2.4 Tumores associados ao EBV
Além de ser o agente etiológico da mononucleose infecciosa e estar
associado a diversas doenças imunoproliferativas, especialmente em pacientes
imunossuprimidos110;111 o EBV foi o primeiro vírus diretamente implicado em
carcinogênese em humanos.112 A infecção latente pelo EBV está associada ao
desenvolvimento de diversos tumores malignos de origem linfóide e epitelial, como o
linfoma de Burkitt, o linfoma de Hodgkin, as linfoproliferações pós-transplantes e o
carcinoma nasofaríngeo. Há também evidências de que o EBV possa estar associado a
outras
neoplasias
malignas,
como
carcinomas
gástricos,113
carcinomas
mamários,114;115 leiomiossarcomas,116 linfomas T117 e carcinomas tipo linfoepitelioma
de glândulas salivares118 e pulmão.119
O EBV se comporta de três distintas formas no hospedeiro: induz
proliferação celular de linfócitos B infectados, entra em fase latente após essa fase
proliferativa e pode ser reativado com síntese de novos vírus e reinfecção de células
do mesmo indivíduo ou transmissão para outro indivíduo.120 Durante o seu ciclo de
vida latente, alguns genes são expressos preferencialmente, nas células normais e
também nos tumores associados ao EBV. Este padrão de expressão é denominado
“padrão de latência” e são úteis para caracterizar o papel do vírus na patogênese da
doença, assim como para orientar a identificação viral em fragmentos tumorais. A
tabela 3 mostra os principais padrões de latência, os tecidos em que são encontrados
e respectivos genes expressos.
17
Tabela 3: Padrões de expressão gênica do EBV quanto aos tipos de latência
e tecido associado. Adaptado de Lima, 2006.121
Genes expressos pelo EBV
Tipo
de
latência
Tecido associado
EBNA 1
EBNA 2
LMP 1
LMP 2a
EBER
I
Linfoma de Burkitt
+
-
-
-
+
II
Carcinoma de nasofaringe
Linfoma de Hodgkin
Linfoma de células T
+
-
+
+
+
III
Doença linfoproliferativa
pós-transplante
Linfoma não-Hodgkin
associado à AIDS
+
+
+
+
+
IV
Linfócitos B circulantes de
indivíduos sadios portadores
-
_
-
+
+
Hepatocarcinoma
+
_
_
-
-
Carcinoma de mama122
+
_
_
+
-
Outros
18
2.5 EBV e câncer de colo uterino
Existe a possibilidade de que o EBV possa colaborar com o HPV na
carcinogênese cervical, sugerida com base nos achados da natureza clonal de EBV em
células de carcinoma cervical e da presença de EBV em lesões precursoras de câncer
de colo, como descrito a seguir.123;124
A) Evidências provenientes de estudos in vitro
O EBV penetra nas células linfóides via CD21, considerado seu receptor
preferencial, que está também presente em células epiteliais ectocervicais. Culturas de
diferentes tipos de células epiteliais podem ser infectadas com EBV,125 inclusive
culturas de células epiteliais ectocervicais.33
B) Evidências provenientes de estudos envolvendo pacientes com
tumores epiteliais
Embora seja freqüentemente associado a tumores linfóides, o EBV também
é encontrado diversos em tumores epiteliais,126 sendo considerado um agente
carcinogênico tipo I pela IARC (International Agency for Research on Cancer)104. EBV
também é associado causalmente com o carcinoma indiferenciado de nasofaringe127;128
e já foi encontrado em tumores malignos de glândulas salivares,118 timo,129;130
estômago, carcinoma hepatocelular,
131
mama
132
e trato genital inferior.
133;134
Em estudo com pacientes com carcinoma de pênis tratados no Instituto
Nacional de Câncer, o EBV foi detectado pela técnica da PCR em 20 dos 21 casos
estudados.135
C) Evidências provenientes de estudos envolvendo pacientes com
carcinoma de colo uterino
Kim136 avaliou 41 pacientes coreanas com carcinoma escamoso de colo
uterino. Hibridização in situ para RNA (ISH) foi positiva para 14 casos enquanto PCR
detectou DNA de EBV em 15 dos 41 casos.
O estudo coreano conduzido por Seo137, em que foram avaliadas 36
pacientes com adenocarcinoma e 17 com carcinoma escamoso de colo uterino,
19
encontrou-se positividade para EBV em apenas 1 caso por PCR e nenhum por ISH.
PCR foi realizada em material proveniente de raspado cervical.
No estudo de Yang et al,39 envolvendo mulheres taiwanesas, a PCR não
identificou EBV nas 18 das amostras de carcinoma de colo uterino estudadas (14
estádio I, 3 estádio II e 1 estádio III). Foram examinados 18 casos em pacientes de
40 a 76 anos, tendo sido o DNA extraído de parafina. Esse estudo não menciona o tipo
histológico estudado.
Elgui de Oliveira138 pesquisou a presença de EBV em 24 escamosos e 30
adenocarcinomas de colo uterino de mulheres brasileiras por ISH. O EBV não foi
identificado em qualquer das amostras. O estadiamento das pacientes não foi descrito.
Landers,24 em estudo irlandês envolvendo 18 casos de pacientes com
carcinoma de colo uterino, cujo estadiamento não foi descrito, encontrou positividade
para EBV em 8 casos e por ISH em 5 casos.
Se Thoe134 encontrou presença de EBV em 5 de 8 amostras de carcinoma
de colo uterino de mulheres da Malásia por ISH.
O´Leary28
avaliou
11
casos
de
adenocarcinoma
de
colo
uterino,
encontrando EBV em 1 caso por PCR. Todas as amostras foram negativas por ISH.
Dessa forma, observa-se que discussão sobre a associação de EBV com
carcinoma de colo uterino tem se apoiado nos resultados dos poucos estudos clínicos
disponíveis, realizados em diferentes populações, com metodologia heterogênea e
resultados diversos.
24;26-28;32-34;37;39;139-148
20
Tabela 4: Compilação dos resultados de DNA-PCR em estudos envolvendo pesquisa
de EBV em material proveniente de pacientes com diagnóstico histológico de
carcinoma de colo uterino.
Autor
principal e
País
ano
Yang,
39
2004
Taiwan
Tipo
histológico
carcinoma
(parafina)
carcinoma
(a fresco)
Landers,
24
1993
O´Leary,
28
1997
Irlanda
Irlanda
CEC
(parafina)
Método
PCR
(Bam HI
"W")
PCR
(Bam HI
"W")
PCR
(Bam HI
W")
sonda/primer
5’TCGCGTTTGCTAGGCCACCTT3’
5’CTTGGAATGGCGGTCAGCG3’
5’TCGCGTTTGCTAGGCCACCTT3’
5’CTTGGAATGGCGGTCAGCG3’
CACTTTAGAGCGCGGGAGGA /
TAAAGATAGCAGCAGCGCAG
Adeno
PCR
ATCGTGGTCAAGGAGGTTCC /
(parafina)
(EBNA1)
ACTCAATGGTGTAAGACGAC
Kim, 2005149
N
Casos
positivos
%
18
0
0,0%
9
0
0,0%
NM
NM
43%
11
9,1%
PCR
Coréia
CEC
(EBNA1)
TGAGAACCATGGACGAGGAC /
(parafina)
Bam
CTTCAAGTTGCATTGGCTGC
41
15
36,6%
HIW
Hording,
150
2000
Danish
Greenland
Carcinoma
(parafina)
Carcinoma
(parafina)
Sasagawa,
2004151
Wong,
1993152
Japão
China
Carcinoma
(a fresco)
Carcinoma
Seo, 2005153
Coréia
CEC
(esfregaço)
Adeno
(esfregaço)
Shoji,
1997154
Japão
CEC
PCR
DNA
11
0
0,0%
PCR
DNA
11
0
0,0%
31
17
55%
40
20
50%
17
1
5,9%
36
0
0,0%
60
13
27%
PCR
DNA
EBER1
PCR
PCR
BaM HI
W
PCR
BaM HI
W
PCR
5'-AAAACATGCGGACCACCAGC3'
5'-AGGACCTACGCTGCCCTAGA3'
DNA
5’CACTTTAGAGCGCGGGAGGA
3’TAAAGATAGCAGCAGCGCAG e
5’TTGGACCCGAAATCTGAC
3’GGCCTTATTCCTCTTTTC
5’CACTTTAGAGCGCGGGAGGA
3’TAAAGATAGCAGCAGCGCAG e
5’TTGGACCCGAAATCTGAC
3’GGCCTTATTCCTCTTTTC
21
Tabela 5: Compilação dos resultados de ISH em estudos envolvendo pesquisa de EBV
em material proveniente de pacientes com diagnóstico histológico de carcinoma de
colo uterino.
Autor principal
e ano
de Oliveira, 1999138
País
Brasil
Tipo
Casos
Sonda
N
CEC
RNA- EBER 1
24
0
0,0%
Adeno
RNA- EBER 1
30
0
0,0%
NM
NM
28%
histológico
DNA- Bam HI
positivos
%
Landers, 199324
Irlanda
CEC
O´Leary, 199728
Irlanda
adeno
RNA- EBER
11
0
0,0%
Kim, 2005149
Coréia
CEC
RNA- EBER 1
41
14
34,1%
Sasagawa, 2004155
Japão
Carcinoma
RNA-EBER1
13
6
46%
13
11
84,6%
RNA-EBER
53
0
0,0%
RNA- EBNA2
16
14
87,5%
16
10
62,5%
8
5
62,5%
9
0
0,0%
15
0
0,0%
60
0
0,0%
Carcinoma
Seo, 2005153
Shimakage,
2001156
Coréia
Japão
Todos
Carcinoma
"w"
RNA-Bam HI
"w"
RNA – Bam-HI
W
Se Thoe, 1993134
Hilton, 1996
Malásia
Carcinoma
Inglaterra
Adeno
CEC
Shoji, 1997154
Japão
CEC
DNA-Bam HI
(mix)
RNA-EBER 1e
2
RNA-EBER 1e
2
EBER
22
Tabela 6: Compilação dos resultados de estudos envolvendo pesquisa de EBV em
material proveniente de pacientes com diagnóstico histológico de carcinoma de colo
uterino em que foram comparadas as técnicas de PCR e ISH.
Autor principal e
ano
Landers24, 1993
O´Leary28, 1997
Total
País
de
casos
Irlanda
Irlanda
18
11
6
Kim149,
2005
Coréia
41
Tipo
histológico
CEC
PCR
(parafina)
(BamH1”W")
CEC
ISH
Adeno
PCR
(parafina)
(EBNA1)
adeno
ISH
CEC
(parafina)
CEC
Sasagawa157,
2004
Seo
153
,
2005
Shoji, 1997154
Japão
Coréia
Japão
13
53
60
Método
N
Casos
positivos
%
NM
NM
43%
NM
NM
28%
11
1
9,1%
11
0
0,0%
41
15
36,6%
41
14
34,1%
31
17
55%
PCR
(EBNA1)
Bam H1W
ISH
Carcinoma
PCR
(a fresco)
EBER1
Carcinoma
ISH
13
6
46%
Carcinoma
ISH
13
11
84,6%
CEC
PCR
(esfregaço)
BaM HI W
17
1
5,9%
Adeno
PCR
(esfregaço)
BaM HI W
36
0
0,0%
Todos
ISH
53
0
0,0%
CEC
PCR
60
13
27%
ISH
60
0
0,0%
23
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Primário
Descrever a freqüência da detecção do EBV em câncer epitelial de colo
uterino avançado.
3.2 Objetivos Secundários
•
Aplicar e comparar as metodologias para o diagnóstico do EBV em
carcinoma de colo uterino.
•
Determinar a associação da presença de EBV com características clínicas
e histopatológicas em pacientes com câncer epitelial de colo uterino avançado.
•
Explorar a possível correlação entre a presença de EBV e os desfechos
clínicos no câncer epitelial de colo uterino avançado.
24
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Tipo de estudo, período e local
Este foi um estudo de coorte prospectivo, com análises transversais,
realizado no período de agosto de 2003 a janeiro de 2006.
O estudo foi realizado com pacientes tratadas no Serviço de Ginecologia
Oncológica do Instituto Nacional de Câncer - INCA, no Rio de Janeiro. A pesquisa de
DNA-EBV por PCR foi realizada no Laboratório de Controle da Expressão Gênica/
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, a
ISH no Laboratório de Biologia Molecular, CEMO, INCA, a IHQ no Laboratório de
Virologia, Hospital de Niños “Ricardo Gutierrez” Buenos Aires, Argentina e o TMA foi
construído pela equipe do Dr. Fernando Soares no Serviço de Patologia do Hospital
“AC Camargo”.
4.2 Pacientes
4.2.1 Critérios de inclusão e exclusão
Foram recrutadas todas as pacientes matriculadas no INCA no período do
estudo e que preenchiam os critérios de inclusão (135 pacientes).
Foram considerados critérios de inclusão: ter diagnóstico histológico de
carcinoma epidermóide de colo de útero, ter estadiamento IIb a IIIb estimado pelo
exame clínico (que após os exames de estadiamento poderia ser de IIb a IVb), ter
condições clínicas de receber tratamento radioterápico.
Foram considerados critérios de exclusão: revisão de lâmina da primeira
biópsia ou nova biópsia não confirmar carcinoma epidermóide, sorologia positiva para
HIV, gestação, tratamento prévio para câncer de colo uterino.
Todas as pacientes concordaram em participar do estudo e assinaram o
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. (ANEXO 1)
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do INCA em 28 de
abril de 2003 sob o número 20/03. (ANEXO 2 )
25
4.2.2 Avaliação Clínica e Estadiamento
As
pacientes
foram
avaliadas
clinicamente
(exame
físico
geral
e
ginecológico) e os procedimentos de estadiamento seguiram as recomendações da
Federação Internacional de Ginecologia Oncológica (FIGO)48, de forma que após
cistoscopia, retossigmoidoscopia e radiografia de tórax, evidenciamos que em sete
casos havia infiltração de reto e vagina (estádio IVa), enquanto em quatro casos havia
metástase pulmonar (estádio IVb). Foi utilizado um formulário de avaliação clínica em
que constavam dados relacionados a: estadiamento clínico, idade, status menopausal,
história ginecológica e obstétrica, início da atividade sexual e número de parceiros,
uso de anticonceptivos hormonais, tabagismo, sorologia para HIV, sintomatologia.
4.2.3 Tratamento e Seguimento
Para pacientes com tumor restrito à pelve (IIb e IIIb), o tratamento foi
radioterapia exclusiva ou radioterapia associada à quimioterapia, o tratamento padrão
para
carcinomas
de
colo
uterino
nesse
estádio
desde
início
dos
anos
2000.53;54;56;57;158;159
Para as pacientes estadiadas como IVa, o tratamento empregado foi a
radioterapia pélvica. Para as pacientes estadiadas como IVb, o tratamento empregado
foi a quimioterapia. (ANEXO 4)
4.2.4 Avaliação de resposta clínica
Após o tratamento, as pacientes foram acompanhadas com intervalos
máximos de seis meses entre as consultas. Foram avaliadas conforme as rotinas do
INCA49 e as fichas clínicas eram preenchidas com informações sobre resposta à
terapêutica. (ANEXO 3)
Neste estudo, os exames realizados para avaliação inicial e seguimento
pós-tratamento foram os exames preconizados pela FIGO e utilizados rotineiramente
pelo Instituto Nacional de Câncer. Portanto, a avaliação da resposta ao tratamento foi
baseada no exame físico, radiografia de tórax, ultrassonografia abdominal. No INCA,
por questão de custos, em pacientes tratadas por carcinoma avançado de colo uterino,
exames para avaliação objetiva de resposta ao tratamento como TC e RNM só são
feitos para comprovar recidiva em casos onde se considera a possibilidade de resgate
cirúrgico e em protocolos de pesquisas clínicas.
26
A resposta ao tratamento foi confirmada em um intervalo mínimo de quatro
semanas. As respostas foram divididas em: resposta completa (ausência de qualquer
evidência
clínica
ou
radiológica
de
tumor),
doença
estável,
resposta
parcial
(diminuição da lesão em pelo menos de 30% do diâmetro), progressão (aumento da
lesão após o tratamento em pelo menos 20% do diâmetro ou aparecimento de lesão
metastática) e óbito precoce (óbito ocorrido durante o tratamento ou antes da
primeira avaliação). Recidiva foi definida por: confirmação de doença após pelo menos
duas consultas sem evidências clínico-radiológicas de tumor.
4.3 Pesquisa do vírus Epstein-Barr
4.3.1 Obtenção e armazenamento das amostras
Foi realizada biópsia tumoral antes do início do tratamento. Para cada
fragmento biopsiado, metade foi imediatamente armazenada em nitrogênio líquido e a
outra metade foi fixada em formalina tamponada a 10%.
4.3.2 Avaliação histopatológica
Os fragmentos tumorais foram incluídos em parafina e cortes de 5 µm
corados por hematoxilina-eosina. O estudo histopatológico foi realizado, de maneira
independente, por dois anátomo-patologistas e foram avaliados: tipo histológico, grau
tumoral e presença de invasão linfovascular.
4.3.3 Amplificação de DNA pela PCR
Extração do DNA
O DNA foi extraído dos fragmentos de tecido tumoral.160 Para cada amostra,
aproximadamente 50 mg do fragmento foram incubados em 300 µl de salina contendo
2% sodium dodecyl sulfate (SDS) e 7,5 µl de proteinase-K (Sigma Chemical Co. St
Louis, MO) a 37° C por 18 horas. Foi adicionado fenol-clorofórmio em igual volume
(1:1) ao lisado. A mistura extraída foi centrifugada por 5 minutos e a fase aquosa
(superior) foi cuidadosamente transferida para outro frasco. Seguiu-se uma extração
com volume igual de clorofórmio, repetindo o procedimento de centrifugação.
27
Precipitação de DNA por etanol
O DNA (contido na fase aquosa) foi precipitado com dois volumes de etanol
absoluto (Merck, 1:10 volumes de Acetato de Sódio pH 5.0) e então deixado à
temperatura de -20° C por 18 horas. O DNA precipitado foi centrifugado por 15
minutos a 10.000 RPM e lavado duas vezes com etanol a 80%. O DNA foi precipitado
novamente, seco a temperatura ambiente por 24 horas e ressuspenso em 50 µl de
água destilada, diluído a 1:10, e então armazenado a -70° C antes de ser testado.161
Reações de PCR
Controle de amplificabilidade: para confirmar a integridade do DNA de cada
amostra, foi utilizado um par de oligonucleotídeos iniciadores para amplificação de
uma seqüência de 300-bp do gene TP53. (Tabela 7).
Dois µl (entre 200-500 ng de DNA) de cada amostra foram adicionados a
11 µl de mistura para PCR e recobertos com óleo mineral. (Tabela 7)
Tabela 7: Composição da “Mistura de reação” utilizada para amplificação por PCR do
segmento do gene P53.
Mistura de reação para PCR – P53
10x tampão de PCR
(tris-HCl 200mM pH 8,4 e KCl 500 Mm)
5 µl
25 mM MgCl2
3 µl
25 mM dNTPs
0,4 µl
Taq DNA polimerase (5U/µl)
0,2 µl
Primer F
1 µl
Primer R
1 µl
Água
35,4 µl
28
Trinta e cinco ciclos de amplificação foram feitos com desnaturação a 95° C
por 30 segundos, anelamento a 60° C por 30 segundos e extensão a 72° C por 1 min.
Como controle positivo, foi utilizado DNA amplificável previamente estudado e, como
controle negativo, tampão de lise e água.
Detecção do EBV pelo método de PCR
Para pesquisa de EBV por PCR foi utilizado um conjunto de 4 reações de
PCR com alvos e sensibilidades diferentes.
PCR Bam M
Foram utilizados oligonucleotídeos iniciadores que amplificam um segmento
de 288 pares de bases da porção Bam M do EBV.162 (Tabela 8)
Tabela 8: Seqüência dos iniciadores utilizados para a caracterização por PCR das
amostras estudadas
Iniciador
Gene alvo
Seqüência (5’-3’)
GGAATTCTGTTCACTTGTGCCCTGACTTTCACC
P53-F
P53
GCAACCAGCCCTGTCGTGTCTCCA
P53-R
CAGGCTTCCCTGCAATTTTACAAGCGG
BamM-F
Bam M
CCCAGAAGTATACGTGGTGACGTAGA
BamM-R
CCAGAGGTAAGTGGACTT
BamW-F
Bam W
GACCGGTGCCTTCTTAGG
BamW-R
CCCTAGTGGTTTCGGACACA
EBER-F
EBER2
EBER-R
ACTTGCAAATGCTCTAGGCG
EBNA2-C
AGGGATGCCTGGACACAAGA
EBNA2-G
EBNA2-B
EBNA2
GCCTCGGTTGTGACAGAG
TTGAAGAGTATGTCCTAAGG
29
Dois µl (entre 200-500 ng de DNA) de cada amostra foram adicionados a
11 µl de mistura para PCR e recobertos com óleo mineral. (Tabela 9)
Tabela 9: Composição da “Mistura de reação” utilizada para amplificação do
segmento Bam M do EBV pela PCR.
Mistura de reação para PCR – Epstein-Barr
10x tampão de PCR
(tris-HCl 200Mm pH 8,4 e KCl 500 Mm)
5 µl
25 mM MgCl2
3 µl
100 mM dNTPs
0,396 µl
Taq DNA polimerase (5U/µl)
0,2 µl
Primer F
1 µl
Primer R
1 µl
Água
35.4 µl
Trinta e cinco ciclos de amplificação foram feitos com desnaturação a 94° C
por 1 minuto, anelamento a 55° C por 2 minutos e extensão a 72° C por 1 min. Como
controle positivo, foi utilizado material previamente estudado e, como controle
negativo, tampão de lise e água.
Eletroforese de DNA em gel de poliacrilamida
Após PCR, uma alíquota de 10 µl do produto de PCR de cada amostra foi
adicionada a 2 µl de tampão contendo 30% de ficoll, EDTA 0,35 M e azul de
bromofenol 0,2%. Esta mistura foi aplicada em gel de poliacrilamida a 4% (Tabela 10)
e submetida a eletroforese para separar os fragmentos de DNA. A eletroforese foi
realizada em tampão TBE 1X, a 110 W por 2 horas à temperatura ambiente em uma
cuba com placas medindo 7,25 x 10,25 cm e 8,25 x 10,25 cm de 0,75 mm. O gel era
polimerizado entre placas de vidro e a corrida feita em cubas verticais.
30
Tabela 10: Composição do Gel de poliacrilamida utilizado para eletroforese de DNA
Gel de poliacrilamida para DNA
volume
Tampão TBE 1X (tris-borato-EDTA)
20,52 mL
Acrilamida-bisacrilamida (30:0,8)
7,68 mL
AMP 10% (persulfato de amônio)
0,72 mL
TEMED (N,N,N´,N´-etrametiletilenediamina)
0,08 mL
Coloração do gel para identificação do material amplificado.
Após eletroforese, para identificação de DNA amplificado, cada gel foi
corado pela técnica da prata, como descrito a seguir: o gel de DNA foi fixado em
solução contendo 10 mL de etanol, 0,75% de ácido acético glacial e água para volume
final de 100 mL, agitado por 15 minutos e retirado da solução. Foram adicionados 0,2
g de nitrato de prata dissolvidos em 100 mL de água e agitados por 10 minutos. A
solução de prata foi descartada e o gel foi lavado com água corrente por duas vezes.
Adicionou-se a solução de NaOH 3%, formaldeído 0,3% e água para volume final de
100 mL. Após a revelação, a solução foi descartada e adicionou-se solução fixadora,
contendo 65 mL de metanol, 0,5 mL de glicerol e água para volume final de 100 mL.
Descartada a solução, o gel foi colocado em papel celofane previamente tratado com
solução secante.
PCRs EBER e Bam W
Os métodos de PCR para amplificar estas duas regiões, com os iniciadores
descritos na tabela 11, foram realizados com as mesmas condições térmicas e de
reação.
As reações foram realizadas em 50 µl de volume final, utilizando tampão de
PCR (Invitrogen) (50 mM KCl; 10 mM Tris H-Cl pH 8,3); dNTPs (mistura equimolar de
dATP, dTTP, dCTP e dGTP; Pharmacia), 200 µM cada um; 2,5 mM de MgCl2;
coadjuvante gelatina 0,01%, 0,4 µM de cada iniciador e 1U de Taq DNA polimerase
Platinum®. O perfil térmico consistiu de uma etapa de desbloqueio da Taq (95ºC por 5
31
minutos), seguido de 35 ciclos de 94°C por 45 segundos; 52°C por 60 segundos y
72°C por 45 segundos. Os produtos de PCR foram submetidos a eletroforese em gel
de agarose 3% com brometo de etídeo, e marcador de peso molecular de 100 pb (100
bp ladder, Invitrogen). A sensibilidade analítica destes métodos encontra-se entre 10-4
(PCR-EBER) e 10-5 (PCR Bam W), quando resolvida em géis de agarose.
PCR EBNA2
A PCR para o gene EBNA2 foi desenhada para amplificar a região que
discrimina o EBV-1 e -2, em reações separadas (Primers EBNA2-C e G para EBV-1 e
EBNA2-C e B para o EBV-2). O DNA (200-500 ng) foi amplificado em reações de 50 µl
de volume final, utilizando tampão de PCR (Invitrogen) (50 mM KCl; 10 mM Tris H-Cl
pH 8,3); dNTPs (mistura equimolar de dATP, dTTP, dCTP y dGTP; Pharmacia) a 200
µM cada um; 1,5 mM MgCl2 e 1U de Taq DNA polimerase Platinum (Invitrogen). O
perfil térmico consistiu de 35 ciclos de 94°C por 30 segundos; 52°C por 60 segundos y
72°C por 2 minutos, precedidos pelo desbloqueio da Taq a 95ºC por 5 minutos.
Os produtos de PCR foram submetidos a eletroforese em géis de agarose
2% com brometo de etídeo e marcador de peso molecular de 100 pb (100 bp ladder,
Invitrogen).
A sensibilidade máxima deste método, quando avaliado em géis de
agarose, foi estimada em 5x10-3. Este método é utilizado rotineiramente no
diagnóstico rápido de associação do EBV com linfomas não-Hodgkin pediátricos, em
que uma baixa sensibilidade diminui a possibilidade de resultados falsos positivos.
Em cada reação foram incluídos os seguintes controles: EBV tipo 1
(linhagem celular BC2), EBV tipo 2 (linhagem BC1), Controle negativo (linhagem
Ramos) e controle de PCR (sem DNA). Todas as reações de PCR foram realizadas em
termocicladores Flexigene (Techne).
32
Técnica de TMA (Tissue MicroArray)
A
investigação
da
expressão
do
EBV
por
hibridização
in
situ
e
imunoistoquímica foi realizada em dois experimentos independentes, utilizando
controles adequados em lâminas de TMA (Tissue MicroArray).
TMA é uma técnica que foi descrita em 1998163 que possibilita o estudo de
várias amostras de tecido em uma única lâmina, com as vantagens de abreviar o
tempo de preparo, diminuir a quantidade de reagentes utilizados para as reações e
consumir menos tecido no processamento.164
De um bloco de parafina sem tecido fixado foram retirados cilindros de
0,6mm de diâmetro (tamanho considerado representativo quando se trata de
amostras de tecido tumoral),165 utilizando-se pequenas agulhas. Nesses espaços,
foram inseridos fragmentos cilíndricos de mesmo diâmetro de fragmentos tumorais
previamente fixados em parafina,166 transformando o primeiro bloco em uma peça
única contendo fragmentos de 102 amostras teciduais.
Essas amostras, devidamente identificadas e aplicadas em duplicada no
bloco de TMA, foram processadas para os estudos de ISH e IHQ.
4.3.4 Hibridização in situ para EBER-1 (EBER-ISH)
A infecção pelo EBV foi investigada nas amostras de tumor fixadas e
incluídos em parafina (FIP), pela técnica de Hibridização in situ, utilizando sondas
biotiniladas para o RNA EBER-1 conforme os passos descritos a seguir:
1) Desparafinização dos cortes: estufa a 60°C por 30 minutos, seguida por
2 banhos em xilol de 10 minutos cada um;
2) Hidratação dos cortes através de banhos sucessivos de 5 minutos em
concentrações decrescentes de etanol e água destilada (etanol 100%, etanol 95%,
etanol 70%, água destilada);
3) Incubação dos cortes com proteinase K (20µg/ml) em câmara úmida a
65º C por 30 minutos, seguido de duas lavagens dos cortes em água destilada, por 3
minutos;
4) Desidratação dos cortes através de banhos sucessivos de 5 minutos em
concentrações crescentes de etanol (etanol 70%, etanol 95%, etanol 100%) e
secagem dos cortes em temperatura ambiente;
33
5) Hibridização: os cortes foram cobertos com 10µl da sonda biotinilada
EBER-1 (Kit de Hibridização in situ para o vírus Epstein-Barr, Novocastra). Em
seguida, as lâminas cobertas com lamínulas foram incubadas por 15 minutos a 65º C
em câmara úmida para o bloqueio da fosfatase alcalina endógena e posteriormente
em estufa a 37º C por 2 horas;
6) Após a hibridização, as lâminas foram lavadas em TBS 0,1D% Triton X100, três banhos de 3 minutos cada um e acondicionadas em câmara úmida e escura;
7) Adicionou-se 100µl de solução tampão composta por TBS 0,1% Triton X100 e BSA a 3%. Após 10 minutos, o excesso da solução foi eliminado e adicionou-se
100 µl do anticorpo anti-FITC conjugado com fosfatase alcalina diluído 200x em
solução tampão (Kit de Hibridização in situ para o vírus Epstein-Barr, Novocastra);
8) Após 20 minutos, as lâminas foram lavadas em dois banhos de 3
minutos de TBS, e em seguida incubadas na solução de fosfatase alcalina pH 9,0 por 5
minutos;
9) A detecção foi realizada em câmara úmida e na escuridão, pela adição de
100 µl da solução de detecção preparada no momento e composta por 1ml de solução
de fosfatase alcalina, 8 µl do BCIP/NBT e 1 µl de Levamisole (Kit de Hibridização in
situ para o vírus Epstein-Barr, Novocastra). Posteriormente, os cortes foram cobertos
por lamínulas e a incubação seguiu por 16 horas a temperatura ambiente;
10) Após a incubação com a solução de detecção, as lâminas foram lavadas
em água corrente por 5 minutos e contra-coradas com solução de hematoxilina de
Harris por 30 segundos, sendo posteriormente lavadas em água corrente por 5
minutos;
11) As lâminas foram desidratadas através de banhos sucessivos de 5
minutos em etanol em concentrações crescentes, seguido por banho em xilol e
posteriormente montadas e cobertas com lamínula utilizando meio de montagem nãoaquoso (Glycergel, DAKO).
Utilizou-se para cada reação, como controle positivo, uma lâmina contendo
corte de linfoma de Burkitt EBV-positivo. A reação foi considerada positiva quando se
observou a marcação nuclear de cor preto. Os casos seriam considerados positivos
para o EBV nas células tumorais que exibissem a marcação nuclear.
34
4.3.5 Estudo Imuno-histoquímico
A investigação da expressão das proteínas EBNA1 (Epstein-Barr nuclear
antigen 1) e LPM1, foi realizada por IHQ.
O estudo imunohistoquímico foi realizado conforme a técnica do complexo
peroxidase-anti-peroxidase (PAP), seguindo os passos:
1) Desparafinização dos cortes em estufa a 60°C por 30 minutos, seguida
por 2 banhos em xilol de 10 minutos, cada um;
2) Hidratação dos cortes através de banhos sucessivos (5 minutos) em
etanol em concentrações decrescentes (etanol 100%, etanol 70%), seguido de
lavagem das lâminas em água corrente por 5 minutos;
3) Recuperação antigênica realizada no forno de microondas em potência
máxima, com tampão citrato (pH 6,0) por 15 minutos. Após a recuperação, as lâminas
imersas na solução foram deixadas à temperatura ambiente por 20 minutos e
posteriormente lavadas em água corrente por 5 minutos;
4) Bloqueio da peroxidase endógena através 3 banhos de 5 minutos com
peróxido de hidrogênio 10 volumes. Após esta etapa, as lâminas foram lavadas em
água corrente por 5 minutos;
5) Bloqueio de proteínas inespecíficas com solução tampão (BSA em
tampão);
6) Incubação do anticorpo primário, pela adição de 100 ul da solução de
anticorpo primário diluído em BSA, seguido por incubação em câmara úmida por 16
horas na geladeira;
7) Após a incubação do anticorpo primário, as lâminas foram lavadas com
tampão PBS, três banhos de 5 minutos cada um;
8a) Para os anticorpos anti-EBNA1, construídos em rato, o processo
continuou-se pela incubação com 100 ul de um anticorpo secundário anti-rato
marcado com peroxidase por 20 minutos (Dako), passando depois disto diretamente
para a etapa 10.
8b) Para o anticorpo anti-LMP1, as lâminas foram incubadas com 100 ul do
anticorpo secundário (Kit LSAB+, HRP DakoCytomation V.G.) por 20 minutos. Após
este tempo, as lâminas foram lavadas com PBS, três banhos de 5 minutos cada um;
35
9) Incubação da streptavidina (visualização) pela adição de 100 ul da
streptavidina peroxidase (Kit LSAB+, HRP DakoCytomation V.G.) por 20 minutos. Após
este tempo, as lâminas foram lavadas com PBS, três banhos de 5 minutos cada um;
10) Revelação: 100 ul da solução substrato-cromógeno (Cromógeno DAB
DakoCytomation) foram aplicados em cada corte, por até 5 minutos. As lâminas foram
colocadas em água corrente quando os cortes adquiriram a coloração acastanhada ou
após o término dos 5 minutos de incubação;
11) Após o término da revelação, as lâminas foram lavadas em água
corrente por 5 minutos.
12)
Contra-coloração:
as
lâminas
foram
colocadas
em
solução
de
hematoxilina de Harris por 30 segundos, sendo posteriormente lavadas em água
corrente por 5 minutos;
13) As lâminas foram desidratadas através de banhos sucessivos de 5
minutos em etanol em concentrações crescentes, seguido por banho em xilol e
posteriormente montadas e cobertas com lamínula.
Os seguintes anticorpos e diluições foram utilizados:
EBNA1: anticorpos 2B4 e 1H4 (construídos em rato), gentilmente cedidos
pela
Dra.
Elizabeth
Kremmer
(Institut
für
Klinische
Immunologie,
GSF
Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, Munique, Alemanha). Diluição 1:100.
Marcação positiva nuclear.
LMP1: Pool de anticorpos CS 1-4 (Dako), diluição 1:50, marcação positiva
na membrana celular o citoplasma das células tumorais.
Utilizou-se para cada reação, como controle positivo, uma lâmina contendo
corte de linfoma de Hodgkin EBV-positivo previamente estudado.
A interpretação dos resultados do estudo imunoistoquímico de EBNA1 foi
definida com base no cruzamento dos resultados de IHQ dos dois anticorpos (1H4 e
2B4), de acordo aos seguintes critérios:
•
Na discordância, primou o resultado de 1H4.
•
Os casos sem material tumoral no core de tecido foram considerados
inconclusivos.
•
Casos sem tecido tumoral representado em 2B4 e um critério de
positividade no 1H4, deveriam ser interpretados em relação aos resultados de PCR.
36
•
Casos sem tecido tumoral representado em 1H4 e um critério de
positividade no 2B4 deveriam ser interpretados com cuidado em relação aos
resultados de PCR.
Foram utilizados os anticorpos 1H4 e 2B4, porque o último tem pouca
especificidade para EBV, ele também pode produzir marcação nuclear inespecífica, por
reagir com a proteína MAGE4, como demonstrado em células EBV negativas de
carcinoma hepatocelular167 e leucoplasia pilosa oral168. Dessa forma, só foram
considerados positivos casos confirmados por 1H4.
4.4 Análise estatística
Trata-se de estudo descritivo, cuja amostra foi selecionada por método
não-probabilístico (amostra de conveniência): foram incluídas todas as pacientes
matriculadas pelo Serviço de Ginecologia do INCA entre agosto de 2003 e janeiro de
2006 no INCA que preenchiam os critérios de inclusão já citados e aceitaram participar
do estudo.
Variáveis qualitativas foram descritas com medidas de freqüência. Foram
estudadas como variáveis qualitativas: grau tumoral, status menopausal, extensão
tumoral, estadiamento, variáveis relacionadas à história ginecológica, história de
tabagismo, tipo de tratamento recebido, tipo de resposta ao tratamento, tipo de
recidiva, resultado de pesquisa de EBV por PCR, ISH e IHQ.
Variáveis quantitativas foram estudadas com técnicas de estatística
descritiva: medidas de tendência central (média e mediana) e medidas de dispersão
(amplitude). Foram descritos como variáveis quantitativas: faixa etária, idade,
diâmetro tumoral, variáveis relacionadas à história obstétrica e atividade sexual,
número de ciclos de quimioterapia, número de frações de radioterapia, dose de
radioterapia, tempo total de tratamento, intervalo entre tratamento radioterápico
externo e braquiterapia, tempo de seguimento, tempo de sobrevida.
As medianas de sobrevida e as curvas de sobrevida foram estimadas pelo
método não-paramétrico de Kaplan e Meier e comparadas pelo teste de log-rank.169
Foi testada a associação entre as variáveis dicotômicas IHQ-EBNA e PCRBamM pelo teste qui-quadrado de Pearson.
37
5. RESULTADOS
5.1 Clínica
5.1.1 Pacientes
Foram avaliadas 135 pacientes, com vistas à inclusão no estudo. Foram
excluídas duas pacientes com sorologia positiva para HIV e duas pacientes cuja
revisão anatomo-patológica mostrou tratar-se de tumor de origem neuro-endócrina,
além de 3 casos de adenocarcinoma e 6 casos de carcinoma adenoescamoso. Dessa
forma, o grupo final para análise foi de 122 pacientes.
Na avaliação do grau histológico nos 122 casos com diagnóstico confirmado
de carcinoma epidermóide, observamos uma predominância do grau intermediário
(Tabela 11).
Tabela 11: Grau tumoral
Número de pacientes
%
Grau 1
5
Grau 2
92
76
Grau 3
20
16
Indefinido
Total
5
122
4
4
100
38
Características das pacientes
A idade variou de 23 a 77 anos, com mediana de 48 anos. A distribuição
etária das pacientes e status menopausal estão descritos nas tabela 12 e 13,
respectivamente.
Tabela 12: Distribuição etária das pacientes
Faixa
etária
Número de pacientes
%
20-29 anos
11
9
30-39 anos
22
18
40-49 anos
41
34
50-59 anos
26
21
60-69 anos
18
15
>70
4
3
Total
122
100
Tabela 13: Distribuição quanto ao Status Menopausal
Status menopausal
Número de pacientes
%
Pré-menopausa
80
66
Pós-menopausa
41
33
Indefinido
1
Total
122
1
100
39
Estadiamento
As lesões no colo uterino mediram entre 3 e 10 cm, com mediana de 5 cm.
A tabela 14 descreve o diâmetro tumoral, estimado pelo toque vaginal e a tabela 15, a
extensão tumoral para paramétrios, estimada pelo toque retal.
Tabela 14: Diâmetro tumoral.
número de
pacientes
%
Menor 3 cm
14
12
Entre 3 e 6 cm
53
43
Maior 6 cm
21
17
Não descrito
34
28
122
100
Diâmetro Tumoral
Total
Tabela 15: Extensão tumoral
Extensão do tumor
Envolvimento parcial de paramétrios
Fixo a uma parede pélvica
Fixo a uma parede pélvica e parcial
Pacientes
%
49
40
9
7
28
23
34
28
2
2
122
100
contralateral
Fixo a ambas paredes pélvicas
Não relatado
Total
40
Após os exames de imagem e cistoscopia, o estadiamento (que havia sido
estimado clinicamente)
foi
alterado em
11
casos (8,4%). A
distribuição do
estadiamento foi a seguinte: 50 casos IIb, 61 casos IIIb, 7 casos IVa e 4 casos IVb
(Tabela 16).
Tabela 16: Estadiamento.
Estadiamento
Número de pacientes
%
IIb
50
41
IIIb
61
50
IVa
7
6
IVb
4
3
122
100
Total
As tabelas 17, 18 e 19 se referem à história obstétrica, ginecológica e à
atividade sexual, respectivamente.
Tabela 17: História obstétrica.
História obstétrica
Mediana
Variação
13
9-18
Número de gestações
4
0-28
Número de partos
3
0-25
Número de abortos
0
0-11
Idade da primeira menstruação
41
Tabela 18: História ginecológica.
História ginecológica
Número
%
67
55
Dispositivo intra-uterino
4
3
Terapia de Reposição Hormonal
8
7
Anticonceptivos hormonais
Tabela 19: Atividade sexual
Atividade Sexual
mediana
Idade da primeira relação sexual
17 anos (12 a 32)
Intervalo, em anos, entre a primeira menstruação
e a primeira relação sexual
4 anos (-3 a 18)
Total de parceiros sexuais ao longo da vida
2 (1 a 17)
Tabagismo
Cinqüenta
pacientes).
e
uma
pacientes
afirmaram
ser
tabagistas
(41,8%
das
42
5.1.2 Tratamento
Para as pacientes estadiadas como IIb e IIIb (111 casos), o tratamento
proposto foi radioterapia exclusiva em 17 casos (entre as quais, 6 não foram tratadas)
ou quimioterapia associada à radioterapia (93 casos). Não temos informação sobre o
tratamento de uma paciente.
O número de ciclos de quimioterapia é descrito na tabela 20. Entre as 93
pacientes que fizeram quimioterapia, 81 (86,5%) receberam 4 ou mais ciclos
semanais.
Tabela 20: Número de ciclos semanais de quimioterapia.
Número de ciclos
de quimioterapia
Número de pacientes
%
1
4
4
2
1
1
3
7
8
4
18
19
5
31
33
6
28
30
Sem informação
4
4
Total
93
100
Entre 104 pacientes que receberam radioterapia externa, 89 (86%)
pacientes completaram o tratamento recebendo braquiterapia, 4 (4%) receberam
reforço com radioterapia externa e 11 (11%) não tiveram tratamento completo.
O número de frações de radioterapia externa variou de 2 a 35 frações, com
mediana de 25.
43
A dose de radioterapia externa variou de 2760 a 8500 cGy, com mediana
de 7033 cGy. A dose total de radioterapia no ponto A (definido como 2cm acima e
2cm lateral ao colo uterino) variou de 6900 a 9400 cGy, com mediana de 7175 cGy.
O tempo total de tratamento de tratamento variou de 60 a 258 dias, com
mediana de 140 dias. O intervalo entre o final da radioterapia externa e início da
braquiterapia variou de 0 a 176 dias, com mediana de 78 dias.
5.1.3 Resposta ao tratamento
Sessenta (54,1%) pacientes entre as 111 pacientes estadiadas como IIb e
IIIB obtiveram respostas completas. Para este grupo, o tempo mediano de
seguimento após o término do tratamento foi de 27 meses (26-28). Cinqüenta e uma
(46%) pacientes não apresentaram resposta completa. Entre as pacientes que não
apresentaram resposta completa ao tratamento, encontramos: resposta parcial em 13
(12%), progressão em 20 (18%), óbito precoce em 17 (15%) pacientes.
Entre as 60 pacientes com resposta completa, houve 8 recidivas, sendo 6
pélvicas, 1 à distância e 1 pélvica e à distância.
5.1.4 Sobrevida
O tempo mediano de acompanhamento pós-tratamento foi de 27 meses (IC
95%: 25,9 - 28,1). No momento da análise, 53 pacientes (44%) estavam vivas. Para
as pacientes em estádio IIb, a sobrevida foi de 55% em 24 meses . Para aquelas em
estádio IIIb, a sobrevida foi de 31%, para estádio IVA, 29% e para estádio IVb, 0%.
(Figura 2) As medianas de sobrevida e as curvas foram estimadas pelo método de
Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank. A sobrevida livre de progressão
não foi calculada devido à dificuldade de confirmação da recidiva em pacientes com
carcinoma de colo uterino: o intervalo entre o início dos sintomas e a possibilidade de
confirmação da recidiva por biópsia costuma ser longo, e torna impossível precisar a
data de recidiva.
44
Figura 2: Curva de Kaplan-Meier descrevendo a sobrevida, de acordo com estádio
clínico.
45
5.2 Pesquisa de Epstein-Barr Vírus
5.2.1 Pesquisa de EBV pela técnica da PCR, usando diferentes
primers
Pela técnica da PCR, houve amplificação DNA-EBV em 68 amostras (56%)
utilizando-se o primer BamHI M. Com uso do primer BamHI W, houve amplificação em
13 casos dos 52 avaliados (25%). Já a PCR com o uso do primer EBER1 houve
amplificação em 7 de 52 casos (13%). A utilização da PCR com primers para EBNA2
foi ainda menos sensível, com resultado positivo em apenas 1 entre 52 pacientes
(2%). Todos os casos em que houve amplificação usando Bam W também houve com
BamHI M. Todos os casos em que houve amplificação com o primer EBER1 também
amplificaram com o uso dos primers BamHI W e BamHI M. O caso que amplificou
EBNA2 foi positivo para todos os anteriores. (Tabela 21)
.
1
2
3
4
5
6
300 pb
Figura 3: Gel de poliacrilamida, corado pela técnica da prata. Poço 1: controle
positivo, poços 2 a 5:pacientes, poço 6: controle negativo
46
Tabela 21: Resultados de PCR, amplificação conforme primer utilizado.
Número de
casos positivos
Total de
casos
avaliados
%
BamHI M
68
122
56%
BamHI W
13
52
25%
EBER1
7
52
13%
EBNA 2
1
52
2%
PRIMER
5.2.2 Pesquisa de EBV através de hibridização in situ EBER-ISH
Na investigação dos transcritos EBER por ISH não foi detectada a presença
do EBV nas células tumorais.
A
B
C
D
Figura 4: Fotografia de lâmina de TMA com resultados de EBER-ISH. Acima e à
esquerda, controle positivo (A), linfoma não-Hodgkin, mostrado em maior aumento na
seta, com marcação nuclear positiva. Os demais, controle negativo (B) e fragmentos
de carcinoma (C e D) de colo uterino sem marcação.
47
5.2.3 Pesquisa de EBNA1 por Imuno-Histoquímica
Para EBNA 1 foram utilizados anticorpos 2B4 e 1H4 (nos casos de
discordância foi considerado o resultado de 1H4). Em dezessete de 92 casos houve
marcação em células tumorais (19%) como ilustrado na Figura 5. Essa positividade
não se relacionou com os resultados de PCR-BamHIM (p=0,33), PCR-BamHIW
(p=0,174), PCR-EBER (p=0,742) e PCR-EBNA2 (p=0,354).
A investigação da expressão da proteína latente de membrana 1 (LMP1) foi
realizada por IHQ em dois experimentos independentes, utilizando os controles
adequados. Em nenhum dos experimentos foi detectada a expressão da LMP1 por IHQ
nas células tumorais.
Figura 5: Fotografia de lâmina de caso de câncer de colo estudado por imunohistoquímica com marcação positiva para EBNA1.
48
6. DISCUSSÃO
O câncer de colo uterino é causado pelo HPV, um agente infeccioso passível
de prevenção. Apesar disso, é o segundo câncer ginecológico mais freqüente no
mundo. Os casos diagnosticados em estágios avançados têm taxas de cura limitadas e
são responsáveis por considerável parte da mortalidade feminina no Brasil. A
associação com o EBV, já descrita em tumores não-linfóides como carcinoma
nasofaríngeo (onde o HPV também desempenha papel carcinogênico), tem sido
utilizada como marcador prognóstico para esse tumor, o que nos levou a questionar a
possibilidade de que a mesma associação ocorresse em carcinoma de colo uterino.
Os estudos clínicos publicados explorando a associação entre o EBV e o
carcinoma de colo uterino são poucos e têm resultados diversos. Mesmo em tumores
com associação prognóstica bem documentada e evidência laboratorial da presença do
EBV como o linfoma de Burkitt, os linfomas relacionados à imunosupressão, a Doença
de Hodgkin e o2 carcinoma nasofaríngeo, o papel do EBV na carcinogênese ainda é
discutido.
40, 104
Neste estudo, a presença de EBV nas amostras de carcinoma de colo
uterino de 122 pacientes foi pesquisada por PCR, ISH e IHQ, mas foi demonstrada
somente por PCR e IHQ.
A presença de DNA-EBV por PCR em carcinomas de colo uterino foi avaliada
previamente em algumas séries, com positividade variando de 0 a 55% (tabela 4).
Esses resultados heterogêneos podem representar desde variabilidade de distribuição
geográfica de EBV,170,
171
quanto ser resultado das diferenças metodológicas entre
esses estudos. O material utilizado para extração de DNA variou nas diferentes séries:
biópsias a fresco, esfregaços e material incluído em parafina, o que pode ter
interferido na representatividade tecidual.
No estudo de Yang et al,39 a PCR não identificou EBV nas 18 das amostras
de carcinoma de colo uterino estudadas, tendo sido o DNA extraído de parafina. O
autor afirma que há a possibilidade de que o armazenamento possa ter afetado a
estabilidade do DNA. Além disso, primers diferentes foram utilizados para cada estudo
49
(tabela
4), o que pode
resultar em
diferentes percentuais de amplificação,
relacionados à sensibilidade de cada um. Isso é corroborado pela variação no
percentual de amplificação que encontramos usando primers distintos. Na nossa série,
a sensibilidade foi decrescente: BamHI M (56%), BamHI W (25%), EBER1 (13%) e
EBNA2 (2%), refletindo a sensibilidade analítica desses pares de primers.
A demonstração da presença do Epstein-Barr por PCR em até 56% das
amostras tumorais remete à maior sensibilidade deste método e também ao seu
potencial em produzir resultados falso-positivos.
Ressaltamos que, em todos os casos em que houve amplificação utilizandose os primers de menor sensibilidade também houve amplificação com primers mais
sensíveis: os casos positivos para EBNA2 também o foram para os três primers
anteriores. O mesmo aconteceu para os casos positivos para EBER1 (todos
amplificaram BamHI W e M) e para os casos positivos para BamHI W (todos
amplificaram BamHI M). Estes resultados, utilizando uma estratégia multiloci, indicam
que, ao menos em uma fração dos casos, o EBV encontra-se presente no material
tumoral.
A crítica aos estudos em que se utiliza a pesquisa de DNA de EBV apenas
por PCR é que esse teste não diferencia DNA encontrado em linfócitos infiltrantes ou
nas células epiteliais. Por ISH, a localização do EBV no tecido pode ser determinada e
este método continua sendo considerado o “gold standard” para detectar o EBV em
amostras tumorais.
Apesar da maior especificidade do método, existe uma grande variabilidade
entre laboratórios no diagnóstico de EBV por ISH172 que pode depender da sonda
utilizada.
Shimakage156
demonstrou
que
sondas
diferentes
têm
diferentes
sensibilidades, em estudo em que encontrou EBV em 14 de 16 casos de carcinoma de
colo uterino utilizando EBNA2 e apenas 10 casos entre os 16 quando utilizou BamHI W
para detecção de EBV por Hibridização in situ-RNA.
Quando se pesquisa presença de RNA-EBV em material tumoral, a sonda
utilizada com maior freqüência é a que detecta a presença de transcritos EBER (tabela
5). Outras sondas também já foram utilizadas para pesquisa de EBV por ISH em
carcinoma de colo uterino: Landers24 encontrou 28% de positividade nas amostras
estudadas por BamHI "w" e Sasagawa157 encontrou 84,6% e Shimakage156 62,5%
utilizando a mesmo sonda. EBNA2 parece ter maior sensibilidade, sendo encontrada
positividade de 87,5% dos casos estudados por Shimakage.
50
Em nossa série, a avaliação por ISH foi negativa para EBER nos 101 casos
estudados. Também encontraram negatividade em pesquisa de transcritos de EBER
por ISH em todos os casos estudados: Oliveira138 (54 casos), O’Leary28 (11 casos),
Seo173 (53 casos) e Shoji154 (60 casos). Utilizando-se a mesmo sonda, encontraram
positividade: Kim149 (34,1%) e Sazagawa157 (46%).
Nos estudos em que foram comparadas, nas mesmas amostras, as duas
técnicas (PCR e ISH), também encontramos maior freqüência de detecção por PCR,
exceto por Sasagawa.157(tabela 6)
Seo153 encontrou positividade em 1 de 53
amostras de carcinoma de colo uterino, pesquisando EBV por PCR (com dois diferentes
pares de primers para BamHI-W), sendo todos os casos negativos para ISH-EBER.
Landers24, encontrou positividade de 44% por PCR e 28% por ISH em 18 casos de
carcinoma de colo uterino. Uma explicação para esses resultados seria um pequeno
número de genomas virais nas células, o que possibilitaria o diagnóstico apenas pelo
método de alta sensibilidade (o PCR).
A positividade por PCR, não comprovada por ISH (o método de detecção
considerado
padrão-ouro
para
tumores
linfóides)
pode
significar
ausência
de
associação, caso se considerem os mesmos padrões aceitos para diagnóstico de EBV
em tumores linfóides.
Após pesquisa por DNA-EBV por PCR e de RNA por IHQ, foram pesquisadas
duas proteínas por IHQ: LPM1 e EBNA1.
LMP1 é encontrada em tumores com padrão de latência II e III, mas não
em tecidos com padrão de latência I, IV. Pesquisa de LMP1 por IHQ foi negativa em
todos
os
casos
estudados
e
também
é
negativa
em
linfoma
de
Burkit,
hepatocarcinoma e carcinoma de mama.
A proteína EBNA1 é responsável pela segregação dos genomas virais às
células filhas durante a replicação latente do EBV e encontrada em todos os tipos de
tecido tumoral associado ao EBV, independente do tipo de latência (tabela 3). No
estudo das amostras pela imuno-histoquímica, encontramos 19% de positividade para
a proteína EBNA1. Não há outros estudos publicados descrevendo a utilização de
avaliação IHQ de EBNA1 em casos de câncer de colo uterino.
Nas amostras em que identificamos proteínas do EBV, essa presença não
foi homogênea no tecido tumoral: algumas células mostraram marcação e outras não.
Isso pode representar um resultado falso-positivo ou uma distribuição não clonal do
51
EBV. Distribuição não-clonal apontaria a infecção das células tardiamente, ou seja,
após a transformação maligna, o que sugere a possível presença do vírus sem,
necessariamente, participação na carcinogênese.
Considerando os resultados deste estudo - a maior série explorando a
relação do EBV com carcinoma de colo uterino -, os resultados disponíveis até o
momento em pesquisa de EBV em câncer de colo e os critérios propostos para
determinar associação de vírus a câncer, não se pode determinar associação,
tampouco causalidade, entre presença de EBV e carcinomas de colo uterino.
A presença do EBV, demonstrada por mais de um método diagnóstico, pode
ter outras implicações que não a de participar diretamente da transformação maligna.
O EBV poderia ser cofator na carcinogênese em colo uterino.
Uma das formas como a presença do EBV pode interferir nesse processo,
seria na alteração da imunidade celular no tecido, tornando-o suscetível à infecção e
persistência de HPV, vírus reconhecidamente associado à transformação maligna de
colo
uterino.
Persistência
viral174
e
imunossupressão
causada
por
vírus175
provavelmente são resultantes das propriedades de IL10, produzida pelo EBV. Esse
microambiente com resposta celular inadequada e favorável à infecção por HPV
poderia também permitir a sua replicação e persistência e este é o principal fator de
risco para o desenvolvimento das neoplasias do colo uterino. Dessa forma, o EBV
poderia, indiretamente, participar dos mecanismos de carcinogênese no colo uterino,
hipótese que não pode ser desconsiderada.
Além da participação direta ou indireta na gênese tumoral, a associação
entre vírus e câncer tem interesse pela possibilidade de correlação prognóstica. A
associação da presença viral com evolução da doença e resposta terapêutica abre
perspectivas para possíveis intervenções profiláticas ou terapêuticas interessando vias
moleculares envolvidas nessa associação.
Como, no grupo estudado, fatores
relacionados à qualidade do tratamento podem ter interferido na evolução clínica das
pacientes, não pudemos determinar associação prognóstica de fatores clínicos e
moleculares com os desfechos clínicos como progressão de doença e sobrevida.
O tempo total de tratamento radioterápico em tumores avançados de colo
uterino está claramente associado ao prognóstico da paciente e o tempo prolongado
de tratamento tem sido vastamente descrito na literatura como fator associado a
aumento na recidiva pélvica e diminuição de sobrevida.58-64 Nas pacientes de nosso
52
estudo, o tempo total de tratamento de teve mediana de 140 dias (60-258), quando
não deveria exceder 52 dias63. Esse atraso aconteceu pelo longo intervalo entre final
da radioterapia externa e início da braquiterapia, que teve mediana de 78 dias (0176).
Desta forma, pela duração prolongada do tratamento radioterápico nas
pacientes deste estudo, não foi possível considerar qualquer associação prognóstica de
fatores clínicos e moleculares com os desfechos clínicos das pacientes.
53
7 . CONCLUSÕES
A freqüência da detecção do EBV em câncer epitelial de colo uterino avançado
variou conforme o método utilizado, sendo de 2 a 56% por PCR (dependendo do
primer), 0% por ISH, 19% por IHQ para EBNA e 0% por IHQ para LMP1.
A detecção de EBV por PCR e IHQ, não confirmada pela ISH, remete à
diferença de sensibilidade entre os métodos e é insuficiente para determinar
associação entre EBV e câncer de colo uterino.
Uma vez que não se pode determinar a associação de EBV com carcinoma
avançado de colo uterino, fica limitado o estudo da relação da presença de EBV com
variáveis clínicas e histopatológicas.
Uma possível correlação entre a presença de EBV e os desfechos clínicos no
câncer epitelial de colo uterino avançado não pode ser estabelecida em função do
tratamento irregular oferecido a esse grupo de pacientes.
54
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161. Martins, G. A., C. R. Gattas, and M. G. Costa Carvalho. 2000. Free DNA induces
modification on the protein synthesis profile of human peripheral blood mononuclear cells
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162. Saito, I., B. Servenius, T. Compton, and R. I. Fox. 1989. Detection of Epstein-Barr virus
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Sjogren's syndrome. J.Exp.Med. 169:2191-2198.
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approach for quality control in immunohistochemistry. J.Clin.Pathol. 55:613-615.
165. Zu, Y., S. M. Steinberg, E. Campo, C. P. Hans, D. D. Weisenburger, R. M. Braziel, J.
Delabie, R. D. Gascoyne, K. Muller-Hermlink, S. Pittaluga, M. Raffeld, W. C. Chan, and E.
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interpretation in diffuse large B-cell lymphoma. Leuk.Lymphoma 46:693-701.
166. Simon, R., M. Mirlacher, and G. Sauter. 2003. Tissue microarrays in cancer diagnosis.
Expert.Rev.Mol.Diagn. 3:421-430.
167. Chu, P. G., Y. Y. Chen, W. Chen, and L. M. Weiss. 2001. No direct role for Epstein-Barr
virus in American hepatocellular carcinoma. Am.J.Pathol. 159:1287-1292.
168. Murray, P. G., G. Niedobitek, E. Kremmer, F. Grasser, G. M. Reynolds, A. Cruchley, D. M.
Williams, N. Muller-Lantzsch, and L. S. Young. 1996. In situ detection of the Epstein-Barr
virus-encoded nuclear antigen 1 in oral hairy leukoplakia and virus-associated carcinomas.
J.Pathol. 178:44-47.
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169. Kaplan E, M. P. 1958. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Am Stat
Assoc 53:457-481.
170. Young, L. S., Q. Y. Yao, C. M. Rooney, T. B. Sculley, D. J. Moss, H. Rupani, G. Laux, G.
W. Bornkamm, and A. B. Rickinson. 1987. New type B isolates of Epstein-Barr virus from
Burkitt's lymphoma and from normal individuals in endemic areas. J.Gen.Virol. 68 ( Pt
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171. Sixbey, J. W., P. Shirley, P. J. Chesney, D. M. Buntin, and L. Resnick. 1989. Detection of a
second widespread strain of Epstein-Barr virus. Lancet 2:761-765.
172. Sugawara, Y., Y. Mizugaki, T. Uchida, T. Torii, S. Imai, M. Makuuchi, and K. Takada. 1999.
Detection of Epstein-Barr virus (EBV) in hepatocellular carcinoma tissue: a novel EBV
latency characterized by the absence of EBV-encoded small RNA expression. Virology
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173. Seo, S. S., W. H. Kim, Y. S. Song, S. H. Kim, J. W. Kim, N. H. Park, S. B. Kang, and H. P.
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174. Gredmark, S. and C. Soderberg-Naucler. 2003. Human cytomegalovirus inhibits
differentiation of monocytes into dendritic cells with the consequence of depressed
immunological functions. J.Virol. 77:10943-10956.
175. Spencer, J. V., K. M. Lockridge, P. A. Barry, G. Lin, M. Tsang, M. E. Penfold, and T. J.
Schall. 2002. Potent immunosuppressive activities of cytomegalovirus-encoded interleukin10. J.Virol. 76:1285-1292.
66
ANEXOS
67
ANEXO 1: Termo de consentimento livre e esclarecido
CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO DO PACIENTE
Versão emenda 1 do protocolo de 03/10/2006
ESTUDO PRÉ-CLÍNICO E APLICADO PARA AVALIAÇÃO DA COMBINAÇÃO DE
EMD-72000 COM RADIOTERAPIA E/OU CISPLATINA NO CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE
CÉRVIX UTERINA.
INFORMAÇÕES GERAIS E OBJETIVOS DO ESTUDO
Você tem um tumor no colo do útero, para o qual o tratamento indicado é a
radioterapia.
Você está sendo convidado a participar voluntariamente de um estudo que
possui duas partes, uma chamada de pré-clínica e que envolve somente experimentos
de laboratório, e uma parte aplicada da qual você vai efetivamente participar através
do material que será coletado do tumor localizado no seu colo do útero, também
chamado de cérvix uterina. O objetivo desse estudo é o de tentar entender melhor o
comportamento biológico do tumor de colo uterino e a sua resposta à radioterapia.
Antes de concordar em participar desse estudo de pesquisa, é importante que você
leia e compreenda este documento. Ele descreve o propósito do estudo, os
procedimentos, precauções, desconforto e possíveis riscos associados com o estudo..
Ele também descreve o seu direito de sair do estudo a qualquer momento. Se você for
participar, você receberá uma cópia deste documento para manter em seus arquivos.
Os objetivos do estudo são:
•
Investigar em laboratório a presença de uma molécula chamada EGFR
nos
tumores de colo uterino , e se há alguma relação entre a presença de EGFR e
a resposta ou benefício da radioterapia.
•
Descobrir
se
há
alguma
relação
entre
a
infecção
pelo
vírus
HPV e Epstein-Barr (EBV), comum em tumores do colo uterino, e a presença
da molécula EGRF.
68
CARACTERÍSTICAS DO ESTUDO
Você será avaliada por meio de exames de sangue, eletrocardiograma e
exames de imagem (ultrassonografia e Rx de tórax) para saber se todos os critérios
para a inclusão no estudo foram preenchidos. Esses exames são normalmente
realizados em todas as pacientes com tumor do colo uterino, mesmo que não estejam
participando de estudos clínicos.
Além desses exames, você também será submetida a biópsias (retirada de
pequenos fragmentos) do tumor do colo do útero. Este procedimento será realizado no
ambulatório antes e depois da radioterapia.
Os fragmentos retirados serão estudados de várias maneiras: será feito exame
pelo patologista confirmando a presença de tumor e qual o tipo; serão feitos exames
adicionais para saber outras características do seu tumor (se há presença do vírus
HPV, qual a quantidade de moléculas EGFR).
Você receberá o tratamento padronizado no hospital para tumores de colo
uterino no seu estádio: radioterapia. O seu tratamento será o mesmo das pacientes
que não participarem do estudo. Você não usará drogas experimentais.
OUTRAS PESQUISAS RELACIONADAS AO ESTUDO
Este estudo clínico que você está sendo convidado a participar proporcionará
que pesquisas sejam realizadas em laboratório, mais especificadamente em parte do
material retirado do seu tumor antes da radioterapia. A realização dessa pesquisa
laboratorial não implicará em nenhum tratamento adicional para você.
A realização de biópsias e envio do material para anatomia patológica já faz
parte da rotina para o início do tratamento do tumor de colo uterino. No caso desse
estudo que você está sendo convidado a participar, você fará uma biópsia adicional
após o final do tratamento, que normalmente não é feita para todas as pacientes
quando terminam a radioterapia. Essa biópsia será realizada durante o próprio exame
ginecológico de revisão após a radioterapia. Esse é um procedimento simples, mas
que em raros casos pode ser acompanhado de desconforto e seguido de sangramento
leve.
Estas pesquisas laboratoriais com os fragmentos retirados do seu tumor
servirão para compreendermos os mecanismos que levam à redução do tumor pelo
tratamento com radioterapia, permitindo assim, que possamos no futuro, prever
quais são as pacientes que podem ter maior ou menor benefício com o tratamento
(aquelas que vão responder mais ou menos ao tratamento). Os conhecimentos
69
adquiridos com a realização desse estudo podem vir a favorecer o tratamento de
outras pacientes que no futuro venham a ter um tumor no colo uterino.
Além disso, você comparecerá periodicamente ao consultório do seu médico
para exames de acompanhamento.
DEMAIS ESCLARECIMENTOS SOBRE O ESTUDO
O médico responsável por este estudo ou um membro de sua equipe discutirá
com você os requisitos para a participação neste estudo. É importante que você seja
extremamente sincero(a) com o médico e sua equipe sobre sua história de saúde.
Você não pode participar deste estudo se:
•
Estiver grávida ou amamentando.
•
Puder engravidar. Se você deseja participar do estudo você deve discutir com
o médico do estudo sobre o método contraceptivo que você usará para evitar a
gravidez durante o estudo e por três (3) meses após o término de tratamento.
Se você for participar deste estudo, você irá visitar seu médico para fazer sua
história clínica completa e exames físicos que incluirá sua altura, peso, pressão
arterial, pulso e temperatura assim como exames de sangue e urina. Perguntarão
sobre sua história médica e que outras medicações você está tomando. Você realizará
exames de imagens, que podem incluir uma ultrassonografia de abdome e uma
radiografia que avaliarão a extensão de sua doença.
Antes do início do tratamento você fará um exame físico (incluindo seu peso) e
serão feitas perguntas sobre seu estado geral e todas as medicações que você está
tomando. Seu médico ou outro membro de sua equipe perguntará algumas questões
específicas sobre seus sintomas relacionados à doença.
A resposta de sua doença ao tratamento será avaliada periodicamente, por
meio de exames, de avaliação de sintomas (queixas) e possíveis reações ao
tratamento. A resposta da sua doença ao tratamento também será avaliada através
de um exame ginecológico.
Exames laboratoriais e de imagem, bem como retornos em consultas com seu
médico ginecologista e oncologista clínico serão repetidos a cada 03 meses durante 3
anos após o término de seu tratamento e a cada 6 meses no período entre 3 a 5 anos
para que a avaliação do tratamento e seus efeitos sejam completos, e investigar
possíveis recidivas (retorno) da doença.
70
CARACTERÍSTICAS DO SEU TRATAMENTO
A radioterapia externa será feita diariamente durante 8 semanas. Esse tipo de
tratamento pode acarretar irritação da pele no local da aplicação de uma maneira
semelhante a uma queimadura de sol. Caso essa irritação da pele no local da
aplicação se torne muito intensa, a radioterapia pode ser temporariamente suspensa
até a melhora dos sintomas. Além disso, a radioterapia pode causar diarréia, a qual
também é revertida com a interrupção do tratamento. Após a radioterapia externa,
você será avaliada para receber braquiterapia (uma tipo de radioterapia “interna”).
Se você seguir as instruções do médico e equipe do estudo e ocorrer algum
dano físico devido a qualquer procedimento adequadamente realizado e que tenha
sido determinado no plano deste estudo, o INCa se responsabilizará pelas despesas
médicas do seu tratamento.
Você não precisa participar deste estudo para ser tratado da sua doença. O seu
tratamento será o mesmo se você participar ou não do estudo. O médico do estudo
pode discutir seu tratamento com você.
SEUS DIREITOS EM RELAÇÃO AO ESTUDO
Sua participação é voluntária. Você pode se recusar a participar do estudo ou
pode interromper sua participação quando quiser, sem qualquer penalidade ou perda
dos benefícios aos quais já tinha direito.
Sua participação também pode ser interrompida pelo médico do estudo sem o
seu consentimento. Se isso ocorrer, pode ser devido a uma reação ruim ao tratamento
proposto que você tenha apresentado ou devido a novas informações sobre a
segurança ou eficácia.
Se você não quiser mais participar do estudo, o médico do estudo ou um dos
membros da equipe médica conversará com você sobre os problemas médicos
relacionados com o término da sua participação.
• Você poderá solicitar a interrupção da sua participação no estudo se assim o
desejar, sem prejuízo do tratamento convencional do Hospital ,sendo este a
radioterapia.
• Todas as medicações utilizadas durante o tratamento, bem como exames
complementares, internações hospitalares e atendimento de emergência no
71
Hospital do Câncer II serão de responsabilidade do INCa, devendo ser mantido este
suporte mesmo após o término do tratamento.
• Em caso de necessidade de ressarcimento ou indenização conseqüente a algum
procedimento relacionado a este estudo clínico, este será de responsabilidade do
Instituto Nacional de Câncer.
IMPLICAÇÕES DA SUA PARTICIPAÇÃO NO ESTUDO
Os procedimentos do estudo serão fornecidos sem nenhum custo para você. Você
receberá informações sobre sua saúde provenientes de todos os exames físicos e
testes de laboratório feitos neste estudo.
Você será informado pelo seu médico de qualquer nova descoberta ocorrida a
respeito de sua doença ou do seu tratamento.
Suas informações médicas serão mantidas confidenciais pelo médico do estudo e
sua equipe e não serão disponibilizadas para publicidade a menos que sua violação
seja exigida por lei. Os dados obtidos deste estudo que não o identificam
individualmente
poderão
ser
tornados
públicos
ou
entregues
às
autoridades
regulatórias do seu país ou outros países.
Seus registros médicos originais podem ser revisados pelo colaborador e/ou seus
representantes, pelo Comitê de Ética do estudo e pelas autoridades regulatórias com o
objetivo de verificar os procedimentos do estudo clínico e/ou os dados. Suas
informações médicas serão arquivadas e processadas em computador.
Assinando este documento de consentimento, você autoriza a revisão dos registros,
o arquivamento das informações e a transferência dos dados como descrito acima.
Para participar do estudo, você ou seu representante legal deve assinar e datar a
página de assinaturas .
Se tiver alguma queixa quanto algum efeito do tratamento que você ache que a
equipe deste hospital não esteja conduzindo de maneira adequada, pode telefonar
para o Serviço de Ginecologia do Hospital de Oncologia II : Tel.: 021-2276-4800
(contato Dra. Giulliana Martines Moralez)
Em caso de emergência você deverá se dirigir sempre a emergência do
Hospital do Câncer II, localizada no 1º andar e que está aberta para atendimento 24
horas por dia.
72
Em caso de qualquer dúvida sobre o estudo entre em contato com os tel. 0212276-4940 ou 3970-7919. Em caso de dúvida sobre os seus direitos, entre em contato
com o Dr. Luiz Otávio Olivatto no telefone 3970-8025.
RESPONDA AS PERGUNTAS A SEGUIR, CIRCULANDO A RESPOSTA SIM OU
NÃO:
1. Você leu o Termo de Consentimento?
SIM
NÃO
SIM
NÃO
3. Você se sente completamente esclarecida sobre o estudo?
SIM
NÃO
4. Você entendeu que pode sair do estudo a qualquer momento?
SIM
NÃO
SIM
NÃO
SIM
NÃO
SIM
NAO
SIM
NÃO
2. Foram respondidas todas as suas perguntas sobre o estudo e sua
doença?
5. Você entendeu que se sair do estudo isso não afetará seu
tratamento médico nessa instituição?
6. Você entendeu e concorda que o INCA e o colaborador revisará seu
prontuário com seus dados médicos e que será respeitada a sua
confidencialidade e que seu nome não aparecerá em nenhuma
publicação?
7. Você recebeu uma cópia deste Consentimento Livre e Esclarecido do
Paciente para guardar com você.
8. Você concorda em fazer parte desse estudo?
73
Você está sendo informado sobre todos os aspectos significativos sobre o estudo;
sabendo que de nenhum modo seu nível de cuidados será afetado. Se durante o seu
tratamento novas descobertas sobre a sua doença ocorrerem você será devidamente
informada. Em caso de dúvidas não hesite em consultar seu médico, você poderá
entrar em contato com os responsáveis pelo estudo pelo tel 021-3970-7916 (Dr.
Carlos Gil Ferreira) ou 021-2276-4811 (Dra. Giulliana Martines Moralez)
Nome do Paciente (à mão ou impresso)
Iniciais
do
Paciente
_____________________________________________
Favor preencher a data quanto assinar seu nome:
Assinatura do Paciente ou Representante Legal
Data:
Nome e Assinatura de quem obteve o Consentimento
Data:
Assinatura do Investigador (caso não tenha assinado acima)
Data:
e
Número:
74
ANEXO 2: Aprovação do Comitê de ética em pesquisa
75
ANEXO 3: Ficha clínica
76
ANEXO 4: Definições em Terapêutica Oncológica no câncer de colo uterino.
Radioterapia Exclusiva: tratamento exclusivamente com radioterapia. Inclui
radioterapia pélvica externa diária (25 a 30 sessões) e 3 a 4 sessões de braquiterapia
(radioterapia interna) com intervalo semanal.
Tratamento combinado: associa quimioterapia (ciclos semanais) à radioterapia
pélvica.
Tratamento paliativo: não tem intenção curativa. Exemplo: quimioterapia feita em
paciente que já recebeu tratamento radioterápico e apresentou recidiva de tumor na pelve.
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