12-Pesquisa de vírus do Epstein

Pesquisa de vírus do EpsteinBarr em linfoepiteliomas:
Comparação entre métodos de
Imuno-Histoquímica e
Hibridização in situ
Sementilli L1, Nonogaki S2, Shirata NK2, Paes RAP1.
1. Departamento de Anatomia Patológica da Santa Casa de
Misericórdia de São Paulo.
2. Núcleo de Patologia Quantitativa do Centro de Patologia do IAL.
Suely Nonogaki [email protected]
Introdução
O vírus Epstein-Barr (EBV) é associado a diversas neoplasias, como
Linfomas de Hodgkin e Burkitt e Carcinoma de nasofaringe (CNF). O
CNF apresenta um dos piores prognósticos dentre os tumores
malígnos de cabeça e pescoço e geralmente é descoberto em
estágio avançado. O linfoepitelioma é uma variante morfológica do
carcinoma indiferenciado do CNF. A infecção pelo EBV é considerado
o evento iniciador do CNF onde o DNA-EBV é clonal. Uma única
célula infectada evolui para câncer invasivo. As técnicas de ISH são
utilizadas para localizar sequências específicas de ácidos nucleícos
em amostras celulares ou de tecidos sendo considerada Gold
Standard na identificação da infecção latente pelo EBV.
Objetivo
Comparar a sensibilidade das reações imuno-histoquímica (IHQ) e
hibridização in situ (ISH) cromogênica (CISH) na pesquisa do EBV
em amostras histológicas de linfoepiteliomas.
Metodologia
O EBV pode ser detectado em amostras fixadas em formalina e incluidas
em parafina por imuno-histoquímica, hibridização in situ e reação em cadeia
da polimerase.
IHQ
Recuperação antigênica pelo calor úmido sob pressão, com solução tampão citrato pH 6.
Reação overnight a 4ºC com anticorpo monoclonal anti LMP1 clones CS1-4 (Dako).
Amplificação das ligações antígeno-anticorpo com polímeros de terceira geração (Thermo)
marcados com peroxidase. Revelação com DAB e contracoloração com hematoxilina.
Positividade em membrana/citoplasma de coloração marrom dourado.
ISH
Sonda marcada com digoxigenina (ZytoVision) utilizando protocolo modificado no NPQ.
Denaturação a 75ºC e hibridização a 55ºC por 60 min com sonda RNA em hidridizador
automático (StatSpin,Dako). Híbridos ligados ao anticorpo anti–digoxigenina seguido de
polímeros conjugados com peroxidase (ZytoVision). Revelação com DAB e contracoloração
com hematoxilina. Positividade nuclear de coloração marrom dourado.
Resultados
Métodos
IHQ +
IHQ -
Total
CISH +
06 (27,3%)
09 (40,9%)
15 (68,2%)
CISH -
00
07 (31,8%)
07 (31,8%)
Total
06 (27,3%)
16 (72,7%)
22 (100%)
FIG1. CISH- EBV–EBER–Positivo 40X (NPQ1369)
FIG2. IHQ–EBV-LMP1– Negativo 40X (NPQ1369)
Cinco
casos
com
resultados negativos por
ambos
os
métodos,
afastou o diagnóstico de
linfoepitelioma.
Dois
casos
foram
negativos por ambos os
métodos, mas permaneceu
com o diagnóstico de
linfoepitelioma.
FIG3. CISH-EBV–EBER–Positivo 40X (NPQ1388)
FIG4. IHQ–EBV-LMP1– Positivo 40X (NPQ1388)
Comentários, Discussão e Conclusão
ISH mostrou-se mais sensível do que a IHQ na detecção do EBV
em linfoepitelioma.
A ausência da positividade em dois casos pelo CISH deveu-se,
provavelmente, a fatores pré–analíticos, como a fixação
inadequada das amostras.
Os resultados mostraram que a realização da ISH seria suficiente
para confirmação diagnóstica.
O tratamento convencional é pela quimio/radioterapia. Terapias
como imunoterapia específica, epigenética e indução lítica do
vírus, tendo como alvo o EBV, poderão elevar a taxa de cura.
Necessário métodos sensíveis
que demonstrem a presença
do vírus no tumor, como a ISH
NPQ1389