Eletroforese Capilar

Microfluídica
27/11/12
Métodos
Eletroforéticos de
Análise Aula 04
Eletroforese Capilar em Solução Livre
Instrumentação
1
2
Objetivos
- Compreender o funcionamento do mecanismo de
separação relacionado à separação eletroforética em
solução livre.
- Compreender os efeitos no fluxo eletrosmótico, a
dependência do potencial elétrico aplicado e os
métodos de determinação.
- Diferenciar os termos: mobilidade aparente,
mobilidade eletroforética e mobilidade eletrosmótica.
- Diferenciar os termos: polaridade normal e polaridade
invertida.
- Familiarizar com a instrumentação básica.
3
Eletroforese Capilar
Detector
Capilar
Controle
Tampão
Amostra
Tampão
Fonte de
Alta Tensão
LT = 30 - 50 cm
1
4
Eletroforese Capilar
Sinal do Detector (U.R.)
1,3
Detector
Capilar
1,2
Controle
1,1
Tampão
1,0
0
2
Tampão
8
Amostra6
4
Tempo (min)
Fonte de
eletroferograma
Alta
Tensão
LT = 30 - 50 cm
5
Efeito do Potencial Aplicado
2,0
+
K
Ca
2+
Na
+
Mg
2+
+
Li
Sinal (U.R)
1,5
5,0 kV
7,5 kV
1,0
10 kV
0,5
20 kV
0,0
25 kV
-0,5
0
2
4
6
8
10
Tempo (min)
6
Íons em solução
Migração
Difusão
Fonte
de
Potencial
+
+
+
+
+
- - +
- -
Migração
F  zeE
2
7
Íons em solução
Migração
F: Força elétrica
FR: Força de relaxação
F´: Força de retardamento
F
FR
+
F’
F’




FTotal  F  ( FR  F ' )
+
Deformação da
atmosfera iônica
Mobilidade Eletroforética (mep)
8
E
F’’
Fe
vep
vep
E
 mep 
ze
6r
Mobilidade Eletroforética
9
1.00
0.95
0.90
0.85
0.75
0.70
0.65
0.60
0.55
0.50
me 
ze
6r
0.45
Ba2+
Ca2+
Cd2+
Ce3+
Co2+
Cs+
Cu2+
Dy3+
Er3+
Eu3+
Gd3+
Ho3+
K+
La3+
Li+
2+
Mg2+
Mn 2+
Na+
Nd3+
NH4+
Ni2+
Pb2+
Pr3+
Rb+
Sm3+
Sr2+
Tm3+
Yb3+
Zn2+
z/r
i i
0.80
3
10
Mobilidade Eletroforética
Detector
n
capilar
plug
l
(comprimento até o detector)
L
(comprimento total)
v
s
t
v
l
tm
11
Mobilidade Eletroforética
v
l
tm
(1)
v  me E  me
V
L
(2)
Combinando-se (1) e (2), temos:
me 
l
V
 me
tm
L
lL
t mV
tm 
lL
meV
12
Tempo de Migração
tempo de migração (min)
20
15
10
5
0
0
5
10
15
Potencial (kV)
4
Quanto maior o potencial, mais rápida a análise?
13
5
Corrente (mA)
4
3
U=Rxi
y = ax + b
a = 1/R
2
1
0
0
5
10
15
20
25
30
Potencial (kV)
14
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
Estrutura da sílica fundida
O
Si
O
Si
O
Si
OH
Si
O
Si
O
Silanol isolado
O
H
O
Si
O
Si
Si
O
Silanóis vicinais
H
O
O-
Silanol dissociado
O
Si
Si
O
O
Si
O
Si
O
O Siloxano
Si
O
OH
Silanóis geminais
Si
OH
15
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
Fenômenos Eletrocinéticos
• Eletrosmose
• Potencial de fluxo
(streaming potential)
Oldham, K. B.; Myland, J. C.; Fundamentals of Electrochemical Science, Academic
Press, San Diego, CA, USA, 1994.
5
16
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
CAPILAR
O
IHP
OHP
O
O
H + H
+
H
O
H
O
H
-
H
+
+
+
+
O
+
H
+
+
+
PC (z )
O
-
+
+
+
-
+
+
+
+
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
17
Fluxo Laminar
(pressão)
EOF
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
18
Fatores que afetam o EOF
 pH (z) 
 Potencial Aplicado (E) 
 Concentração (ou Força Iônica) do Tampão (z)
 Temperatura () 
 Solventes Orgânicos (, e, z)
 Modificação da Superfície do capilar
 Aplicação de um potencial radial externo
6
19
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
Fatores que afetam o EOF
mEOF / 10-4 cm2 V-1 s-1
pH
20
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
mEOF / 10-8 m2 V-1 s-1
Fatores que afetam o EOF
Concentração
2.0
1.5
1.0
0.5
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
21
Modificação e Controle do EOF
Modificação da Superfície do Capilar
 Alterações Dinâmicas
Adição de Tensoativos (Surfactantes)
 Ligação Covalente
Através de reações de silanização
7
22
Modificação e Controle do EOF
Alterações Dinâmicas - Adição de Tensoativos (Surfactantes)
23
Modificação e Controle do EOF
Brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB)
+
O
+
O
+
O
+
O
N
+
N
N
N
N
+
+
N
N
N
+
24
Como medir o EOF ?
• Sinal de um marcador Neutro
• Monitoramento da corrente que flui pelo capilar
m eof 
lL
teof V
8
Monitoramento do EOF
25
Monitoramento do EOF
26
+ HV
Detector
(a)
(b)
0V
(c)
27
Monitoramento do EOF
OPT101
100x Objective
Microchip
HVPS
Diaphragm & Len
Filter
White LED
5,5 Vdc
9
Monitoramento do EOF
28
Monitoramento do EOF
29
40
OPT101
Current
0.4
30
0.3
20
0.2
10
0.1
0
20
40
Current / mA
OPT101 Output / V
0.5
0
80
60
time / s
30
Mobilidade Aparente
ma  mef  meof
meof
ma
mef
ma > 0
meof
ma = 0
mef
meof
ma
ma < 0
mef
10
Controle de Temperatura
31
• Efeito Joule
32
Dispersão (s2)
• Efeito Joule
• Decréscimo no campo elétrico
Efeito proporcional na geração de calor
Reduz a eficiência e resolução
• Redução do diâmetro do capilar
Decréscimo significativo na corrente
Diminui a sensibilidade
Pode causar aumento na adsorção
• Decréscimo na concentração do tampão
Decréscimo proporcional da corrente
Pode causar aumento na adsorção
• Controle ativo da temperatura
Termostatos; remoção de calor do capilar
33
Resolução
t t 
R  2 m 2 m1 
 w1  w2 
R


1
m
N _ 


4
 m 
tm2
tm1
wb1
wb2




1
V

R
 m  _


4 2
D
m

m



EOF 

 
1/2
11
34
Resolução
PDMS Nativo
Fluorescência
0,1 URF
R=1,9
R=1,8
R=2,7
R=2,6
R=2,4
R=2,7
0
180
360
540
720
R=3,0
900
1080
Tempo (s)
35
Resolução
0,9
Poliéster-toner
Fluorescência (ua)
0,8
0,7
R = 2,3
R = 1,9
R = 1,6
R = 1,4 R = 1,5
0,6
R = 1,6
R = 2,7
0,5
0,4
0,3
0,2
0
150
300
450
600
750
900
Tempo (s)
36
Eficiência da Separação
t 
N  16 m 
 wb 
2
12
37
Eficiência da Separação
t 
N  16 m 
 wb 
2,0
Fluorescência (URF)
0,3
Fluorescência (URF)
2
Toner preto
(Imp. Monoc.)
0,2
0,1
0,0
0
30
60
90
120
150
180
Toner preto
(Imp. Colorida)
1,5
1,0
0,5
0,0
0
30
Tempo (s)
Seletividade (a)
60
90
120
150
180
Tempo (s)
38
Tampão: Borato 100 mM; Capilar 25 mm, 17 cm até o detector; Potencial 30 kV;
Detecção UV em 200 nm.
Análise de Cátions
39
ma  mef  meof
Após uma análise eletroforética, a mobilidade aparente
de uma espécie catiônica foi igual a 1,610-4 cm2 V-1 s-1.
Considerando o valor de meof = 1,010-4 cm2 V-1 s-1,
calcule o valor da mobilidade eletroforética da espécie
analisada.
13
40
Análise de Ânions
ma  mef  meof
ma < 0
???
41
Análise de Ânions
0,6
meof  3Poliéster-toner
,0 x105
0,4
mep  1,0 x104
Fluorescência (URF)
0,4
Poliéster-toner
Fluxo Normal
0,3
Fluxo Invertido
mapp = mep + meof
0,2
FL
CM
map  ???
0,2
0,1
0,0
0,0
0
50
100
Tempo (s)
150
0
200
50
100
150
200
42
Polaridade Normal
CAPILAR
O
O
O
H + H
+
O
H
O
H
-
H
+
+
+
+
O
+
H
+
+
+
O
H
-
+
+
+
-
+
+
+
+
14
43
Polaridade Invertida
CAPILAR
O
O
O
O
H + H
+
H
H
-
-
O
+
H
+
+
-
O
O
H
+
+
H
+
+
+
-
-
+
+
-
-
44
Análise de Ânions
Fluorescência (URF)
0,4
Poliéster-toner
Fluxo Normal
0,3
0,6
Poliéster-toner
Fluxo Invertido
0,4
mapp = mep + meof
0,2
FL
CM
0,2
0,1
0,0
0,0
0
50
100
Tempo (s)
150
0
200
Instrumentação Básica
50
100
150
200
45
Fonte de
Alta Tensão
D
Pt
Reservatórios
15
Instrumentos Comerciais
46
1987 – Perkin Elmer – Applied Biosystems
1989 – P/ACE – Beckman Coulter
1993 – P/ACE 5000
Instrumentos Comerciais
47
P/ACE MDQ – Beckman Coulter
HP 3DCE System
Agilent Technologies
Instrumentos Comerciais
48
Capline System 2010 - Knauer
CE-L1
CE-Resources
16
Instrumentação Básica
49
Capilares
Fonte de Alta Tensão
• Potencial: 0-30 kV
• Corrente: 400 mA
• Potência: 12 W
360 mm
• Materiais: Sílica Fundida, PTFE, PEEK
• Comprimento: 20 a 70 cm
• Diâmetro Interno: 20 a 75 mm
75 mm
Controle de Temperatura
Injeção de Amostra
Detecção
Coleta de Frações
Injeção da Amostra
50
A introdução da amostra no capilar pode ser feita de
duas maneiras:
Aplicando-se pressão ao capilar
 Injeção Hidrodinâmica
Pressão positiva ou negativa
Gravidade
Utilizando-se campo elétrico
 Injeção Eletrocinética
Injeção da Amostra
51
Injeção Hidrodinâmica da Amostra (Pressão)
P
Pr 4t
V
8L
P
V : Volume Injetado
P : Gradiente de Pressão
r : Raio do capilar
t : Tempo de Injeção
 : Viscosidade
L : Comprimento do Capilar
17
Injeção da Amostra
52
Injeção Hidrodinâmica da Amostra (Gravidade)
V
h
rghr 4t
8L
V : Volume Injetado
r : Densidade
g : Aceleração da Gravidade
h : Diferença entre os níveis
r : Raio do capilar
t : Tempo de Injeção
 : Viscosidade
L : Comprimento do Capilar
Injeção da Amostra
53
Injeção Eletrocinética da Amostra
Fonte AT
Q
Vctr 2 mep  meo 
L
Q : Quantidade de Material Injetado
c : Concentração
r : Raio do Capilar
t : Tempo de Injeção
mep : Mobilidade Eletroforética
meo : Mobilidade do FEO
L : Comprimento do Capilar
Injeção da Amostra
54
Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias)
t0 = 0
E
K+
Na+
H20
18
Injeção da Amostra
55
Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias)
t1 > 0
E
K+
Na+
H20
Injeção da Amostra
56
Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias)
Injeção da Amostra
57
Aspectos Práticos
O volume injetado não deve exceder 10 % do volume
total do capilar. Isto corresponde a um volume em torno
de 50 a 100 nL.
Na injeção eletrocinética há a discriminação da amostra.
Variações na composição
quantidade injetada.
da
amostra
afetam
a

Padrão interno
19
Estratégias de Detecção
58
59
Introdução
10-100 nL
 Quantidade de amostra :
pmol-fmol
 Dimensões da cela de detecção :
20-100 mm
< 2 mm
360 mm
 Volume de amostra :
Introdução
75 mm
60
 Fotométrica
Absorção UV-visível
Fluorescência
Quimiluminescência
Índice de Refração
Lentes Térmicas
SPR
Infravermelho
 Eletroquímica
Amperométrica
Condutométrica
Potenciométrica
Voltamétrica
 Radiométrica
 Acoplamento com outras técnicas
ICP, ICP-MS, RMN, MS
20
61
Introdução
LD / mol L-1
Detector
10-5 – 10-7
UV-vis
10-4 – 10-6
UV-vis (indireto)
10-7 – 10-9
Fluorescência
10-6 – 10-8
Fluorescência (Indireto)
Fluorescência Induzida por Laser (LIF) 10-13 – 10-16
10-8 – 10-10
Espectrometria de Massa
10-7 – 10-10
Amperometria
10-7 – 10-9
Condutividade
10-6 – 10-8
Índice de Refração
62
Introdução
• Tempo de resposta do detector
• Taxa de aquisição de dados
• Tempo de integração
600.00
500.00
400.00
300.00
200.00
100.00
0.00
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 ponto a cada 16
1 segundos.
2
4
8
segundo.
segundos.
Introdução
63
Detecção Direta ou Indireta ??
21
Métodos Ópticos
64
65
Absorção UV-vis
b
Io
T
I
I
I0
Absorção UV-vis
A   log T  ebc
66
22
67
Absorção UV-vis
Detecção UV-vis mono-canal
Absorção UV-vis
68
Detecção UV-vis mono
canal - Exemplos
Absorção UV-vis
69
Detecção UV-vis multi-canal
23
Absorção UV-vis
70
Detecção UV-vis multi-canal - Exemplos
Absorção UV-vis
71
Detecção UV-vis multi-canal - Exemplos
Métodos Eletroquímicos
72
24
73
Métodos Eletroquímicos
Manipulação
dos eletrodos
Influência do campo
elétrico de separação
Reprodutibilidade
Detecção
eletroquímica em CE
Adsorção
irreversível
Seletividade
74
Métodos Eletroquímicos
 Amperométricos
• Constante
• Pulsado
 Voltamétricos
 Potenciométricos
 Condutométricos
•
Com contato
•
Sem contato
75
Métodos Eletroquímicos
Células Eletroquímicas
On-Column
End-Column
e2
wall-jet
Capilar
Capilar
Off-Column
WE
e1
Desacoplador
On-Capillary
Contato
Capilar
WE
Capilar
Cola
WE
WE
Capilar
Membrana
25
76
Métodos Eletroquímicos
Detectores Condutométricos
Universais
Com contato (baixa freqüência)
Sem Contato (alta freqüência)
LD – 10-5 10-7 mol L-1
Baixo Custo de implementação
Opera em condições de alta eletrodispersão
Com Contato
V
i(t)
Sem Contato
R
V
t
t
R
i(t)
V0 (t )  Ri (t )
V0 (t )  Ri (t )
77
Métodos Eletroquímicos
Detecção Condutométrica sem Contato
da Silva, J. A. F.; Guzman, N.; do Lago, C. L.;
J. Chromatogr. A 2002, 942, 249-258.
78
Detecção Condutométrica sem Contato
160
Ce
140
120
Xc / k
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
f / Hz
Cw2
Cw1
Rs
XC 
1
2fC
Capilar
26
79
Detecção Condutométrica sem Contato
da Silva, J. A. F.; do Lago, C. L.; Anal. Chem. 1998, 70, 4339-4343.
80
Detecção Condutométrica sem Contato
Separação de alguns álcoois alifáticos por MEKC
Resposta / V
Picos
1. 2-propanol
2. 1-propanol
3. 2-metil-2-propanol
4. 2-butanol
5. 2-metil-1-propanol
6. 1-butanol
7. 2-metil-2-butanol
8. 3-metil-1-butanol
9. 1-pentanol
EOF
0.2
0.1
0.0
1
2
5
34 6
7
8
-0.1
9
4
5
6
7
Tempo / min
8
9
10
Tampão: fosfato 50 mM, SDS 50 mM, pH 6,9. Injeção por gravidade (10 cm por 30 s)
da Silva, J. A. F.; do Lago, C. L.; Electrophoresis 2000, 21, 1405.
Detecção Amperométrica
81
Materiais dos Eletrodos
• Carbono (Fibra, disco, vítreo)
• Diamante dopado
• Metais (Pt, Cu, Ni, Au)
• Modificados (Hg, Pd, Sn, Ru, Co Ftalocianinas, óxidos, enzimas, etc.)
Número e Tipo dos Eletrodos
• Simples
• Duplo
• Array
• Microdisco
• Tubular
• Banda
Configuração da Celula Eletroquímica
2 Eletrodos : WE, RE
3 Eletrodos : WE, RE, AE
Sinal de Estímulo (Potencial)
• Contínuo (AD)
• Pulso (PAD)
27
82
Detecção Amperométrica
83
Detecção Amperométrica
Detecção Amperométrica
84
28
Detecção Amperométrica
85
DA: Dopamina
NE: Norepinefrina
Epi: Epinefrina
IP: Isoproterenol
Detecção Amperométrica
86
Métodos Acoplados
 CE-MS
87
29
88
CE- Espectrometria de Massas
Electrospray
0
1
-
concentração local
de cargas
+
cela eletroquímica
CE- Espectrometria de Massas
89
Electrospray
solução
capilar metálico
eletrodo metálico
CE- Espectrometria de Massas
90
Electrospray
30
91
CE- Espectrometria de Massas
Electrospray
92
CE- Espectrometria de Massas
Electrospray
evaporação
fissão
CE- Espectrometria de Massas
93
31