Eletroforese Capilar
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Microfluídica 27/11/12 Métodos Eletroforéticos de Análise Aula 04 Eletroforese Capilar em Solução Livre Instrumentação 1 2 Objetivos - Compreender o funcionamento do mecanismo de separação relacionado à separação eletroforética em solução livre. - Compreender os efeitos no fluxo eletrosmótico, a dependência do potencial elétrico aplicado e os métodos de determinação. - Diferenciar os termos: mobilidade aparente, mobilidade eletroforética e mobilidade eletrosmótica. - Diferenciar os termos: polaridade normal e polaridade invertida. - Familiarizar com a instrumentação básica. 3 Eletroforese Capilar Detector Capilar Controle Tampão Amostra Tampão Fonte de Alta Tensão LT = 30 - 50 cm 1 4 Eletroforese Capilar Sinal do Detector (U.R.) 1,3 Detector Capilar 1,2 Controle 1,1 Tampão 1,0 0 2 Tampão 8 Amostra6 4 Tempo (min) Fonte de eletroferograma Alta Tensão LT = 30 - 50 cm 5 Efeito do Potencial Aplicado 2,0 + K Ca 2+ Na + Mg 2+ + Li Sinal (U.R) 1,5 5,0 kV 7,5 kV 1,0 10 kV 0,5 20 kV 0,0 25 kV -0,5 0 2 4 6 8 10 Tempo (min) 6 Íons em solução Migração Difusão Fonte de Potencial + + + + + - - + - - Migração F zeE 2 7 Íons em solução Migração F: Força elétrica FR: Força de relaxação F´: Força de retardamento F FR + F’ F’ FTotal F ( FR F ' ) + Deformação da atmosfera iônica Mobilidade Eletroforética (mep) 8 E F’’ Fe vep vep E mep ze 6r Mobilidade Eletroforética 9 1.00 0.95 0.90 0.85 0.75 0.70 0.65 0.60 0.55 0.50 me ze 6r 0.45 Ba2+ Ca2+ Cd2+ Ce3+ Co2+ Cs+ Cu2+ Dy3+ Er3+ Eu3+ Gd3+ Ho3+ K+ La3+ Li+ 2+ Mg2+ Mn 2+ Na+ Nd3+ NH4+ Ni2+ Pb2+ Pr3+ Rb+ Sm3+ Sr2+ Tm3+ Yb3+ Zn2+ z/r i i 0.80 3 10 Mobilidade Eletroforética Detector n capilar plug l (comprimento até o detector) L (comprimento total) v s t v l tm 11 Mobilidade Eletroforética v l tm (1) v me E me V L (2) Combinando-se (1) e (2), temos: me l V me tm L lL t mV tm lL meV 12 Tempo de Migração tempo de migração (min) 20 15 10 5 0 0 5 10 15 Potencial (kV) 4 Quanto maior o potencial, mais rápida a análise? 13 5 Corrente (mA) 4 3 U=Rxi y = ax + b a = 1/R 2 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Potencial (kV) 14 Fluxo Eletrosmótico (EOF) Estrutura da sílica fundida O Si O Si O Si OH Si O Si O Silanol isolado O H O Si O Si Si O Silanóis vicinais H O O- Silanol dissociado O Si Si O O Si O Si O O Siloxano Si O OH Silanóis geminais Si OH 15 Fluxo Eletrosmótico (EOF) Fenômenos Eletrocinéticos • Eletrosmose • Potencial de fluxo (streaming potential) Oldham, K. B.; Myland, J. C.; Fundamentals of Electrochemical Science, Academic Press, San Diego, CA, USA, 1994. 5 16 Fluxo Eletrosmótico (EOF) CAPILAR O IHP OHP O O H + H + H O H O H - H + + + + O + H + + + PC (z ) O - + + + - + + + + Fluxo Eletrosmótico (EOF) 17 Fluxo Laminar (pressão) EOF Fluxo Eletrosmótico (EOF) 18 Fatores que afetam o EOF pH (z) Potencial Aplicado (E) Concentração (ou Força Iônica) do Tampão (z) Temperatura () Solventes Orgânicos (, e, z) Modificação da Superfície do capilar Aplicação de um potencial radial externo 6 19 Fluxo Eletrosmótico (EOF) Fatores que afetam o EOF mEOF / 10-4 cm2 V-1 s-1 pH 20 Fluxo Eletrosmótico (EOF) mEOF / 10-8 m2 V-1 s-1 Fatores que afetam o EOF Concentração 2.0 1.5 1.0 0.5 Fluxo Eletrosmótico (EOF) 21 Modificação e Controle do EOF Modificação da Superfície do Capilar Alterações Dinâmicas Adição de Tensoativos (Surfactantes) Ligação Covalente Através de reações de silanização 7 22 Modificação e Controle do EOF Alterações Dinâmicas - Adição de Tensoativos (Surfactantes) 23 Modificação e Controle do EOF Brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) + O + O + O + O N + N N N N + + N N N + 24 Como medir o EOF ? • Sinal de um marcador Neutro • Monitoramento da corrente que flui pelo capilar m eof lL teof V 8 Monitoramento do EOF 25 Monitoramento do EOF 26 + HV Detector (a) (b) 0V (c) 27 Monitoramento do EOF OPT101 100x Objective Microchip HVPS Diaphragm & Len Filter White LED 5,5 Vdc 9 Monitoramento do EOF 28 Monitoramento do EOF 29 40 OPT101 Current 0.4 30 0.3 20 0.2 10 0.1 0 20 40 Current / mA OPT101 Output / V 0.5 0 80 60 time / s 30 Mobilidade Aparente ma mef meof meof ma mef ma > 0 meof ma = 0 mef meof ma ma < 0 mef 10 Controle de Temperatura 31 • Efeito Joule 32 Dispersão (s2) • Efeito Joule • Decréscimo no campo elétrico Efeito proporcional na geração de calor Reduz a eficiência e resolução • Redução do diâmetro do capilar Decréscimo significativo na corrente Diminui a sensibilidade Pode causar aumento na adsorção • Decréscimo na concentração do tampão Decréscimo proporcional da corrente Pode causar aumento na adsorção • Controle ativo da temperatura Termostatos; remoção de calor do capilar 33 Resolução t t R 2 m 2 m1 w1 w2 R 1 m N _ 4 m tm2 tm1 wb1 wb2 1 V R m _ 4 2 D m m EOF 1/2 11 34 Resolução PDMS Nativo Fluorescência 0,1 URF R=1,9 R=1,8 R=2,7 R=2,6 R=2,4 R=2,7 0 180 360 540 720 R=3,0 900 1080 Tempo (s) 35 Resolução 0,9 Poliéster-toner Fluorescência (ua) 0,8 0,7 R = 2,3 R = 1,9 R = 1,6 R = 1,4 R = 1,5 0,6 R = 1,6 R = 2,7 0,5 0,4 0,3 0,2 0 150 300 450 600 750 900 Tempo (s) 36 Eficiência da Separação t N 16 m wb 2 12 37 Eficiência da Separação t N 16 m wb 2,0 Fluorescência (URF) 0,3 Fluorescência (URF) 2 Toner preto (Imp. Monoc.) 0,2 0,1 0,0 0 30 60 90 120 150 180 Toner preto (Imp. Colorida) 1,5 1,0 0,5 0,0 0 30 Tempo (s) Seletividade (a) 60 90 120 150 180 Tempo (s) 38 Tampão: Borato 100 mM; Capilar 25 mm, 17 cm até o detector; Potencial 30 kV; Detecção UV em 200 nm. Análise de Cátions 39 ma mef meof Após uma análise eletroforética, a mobilidade aparente de uma espécie catiônica foi igual a 1,610-4 cm2 V-1 s-1. Considerando o valor de meof = 1,010-4 cm2 V-1 s-1, calcule o valor da mobilidade eletroforética da espécie analisada. 13 40 Análise de Ânions ma mef meof ma < 0 ??? 41 Análise de Ânions 0,6 meof 3Poliéster-toner ,0 x105 0,4 mep 1,0 x104 Fluorescência (URF) 0,4 Poliéster-toner Fluxo Normal 0,3 Fluxo Invertido mapp = mep + meof 0,2 FL CM map ??? 0,2 0,1 0,0 0,0 0 50 100 Tempo (s) 150 0 200 50 100 150 200 42 Polaridade Normal CAPILAR O O O H + H + O H O H - H + + + + O + H + + + O H - + + + - + + + + 14 43 Polaridade Invertida CAPILAR O O O O H + H + H H - - O + H + + - O O H + + H + + + - - + + - - 44 Análise de Ânions Fluorescência (URF) 0,4 Poliéster-toner Fluxo Normal 0,3 0,6 Poliéster-toner Fluxo Invertido 0,4 mapp = mep + meof 0,2 FL CM 0,2 0,1 0,0 0,0 0 50 100 Tempo (s) 150 0 200 Instrumentação Básica 50 100 150 200 45 Fonte de Alta Tensão D Pt Reservatórios 15 Instrumentos Comerciais 46 1987 – Perkin Elmer – Applied Biosystems 1989 – P/ACE – Beckman Coulter 1993 – P/ACE 5000 Instrumentos Comerciais 47 P/ACE MDQ – Beckman Coulter HP 3DCE System Agilent Technologies Instrumentos Comerciais 48 Capline System 2010 - Knauer CE-L1 CE-Resources 16 Instrumentação Básica 49 Capilares Fonte de Alta Tensão • Potencial: 0-30 kV • Corrente: 400 mA • Potência: 12 W 360 mm • Materiais: Sílica Fundida, PTFE, PEEK • Comprimento: 20 a 70 cm • Diâmetro Interno: 20 a 75 mm 75 mm Controle de Temperatura Injeção de Amostra Detecção Coleta de Frações Injeção da Amostra 50 A introdução da amostra no capilar pode ser feita de duas maneiras: Aplicando-se pressão ao capilar Injeção Hidrodinâmica Pressão positiva ou negativa Gravidade Utilizando-se campo elétrico Injeção Eletrocinética Injeção da Amostra 51 Injeção Hidrodinâmica da Amostra (Pressão) P Pr 4t V 8L P V : Volume Injetado P : Gradiente de Pressão r : Raio do capilar t : Tempo de Injeção : Viscosidade L : Comprimento do Capilar 17 Injeção da Amostra 52 Injeção Hidrodinâmica da Amostra (Gravidade) V h rghr 4t 8L V : Volume Injetado r : Densidade g : Aceleração da Gravidade h : Diferença entre os níveis r : Raio do capilar t : Tempo de Injeção : Viscosidade L : Comprimento do Capilar Injeção da Amostra 53 Injeção Eletrocinética da Amostra Fonte AT Q Vctr 2 mep meo L Q : Quantidade de Material Injetado c : Concentração r : Raio do Capilar t : Tempo de Injeção mep : Mobilidade Eletroforética meo : Mobilidade do FEO L : Comprimento do Capilar Injeção da Amostra 54 Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias) t0 = 0 E K+ Na+ H20 18 Injeção da Amostra 55 Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias) t1 > 0 E K+ Na+ H20 Injeção da Amostra 56 Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias) Injeção da Amostra 57 Aspectos Práticos O volume injetado não deve exceder 10 % do volume total do capilar. Isto corresponde a um volume em torno de 50 a 100 nL. Na injeção eletrocinética há a discriminação da amostra. Variações na composição quantidade injetada. da amostra afetam a Padrão interno 19 Estratégias de Detecção 58 59 Introdução 10-100 nL Quantidade de amostra : pmol-fmol Dimensões da cela de detecção : 20-100 mm < 2 mm 360 mm Volume de amostra : Introdução 75 mm 60 Fotométrica Absorção UV-visível Fluorescência Quimiluminescência Índice de Refração Lentes Térmicas SPR Infravermelho Eletroquímica Amperométrica Condutométrica Potenciométrica Voltamétrica Radiométrica Acoplamento com outras técnicas ICP, ICP-MS, RMN, MS 20 61 Introdução LD / mol L-1 Detector 10-5 – 10-7 UV-vis 10-4 – 10-6 UV-vis (indireto) 10-7 – 10-9 Fluorescência 10-6 – 10-8 Fluorescência (Indireto) Fluorescência Induzida por Laser (LIF) 10-13 – 10-16 10-8 – 10-10 Espectrometria de Massa 10-7 – 10-10 Amperometria 10-7 – 10-9 Condutividade 10-6 – 10-8 Índice de Refração 62 Introdução • Tempo de resposta do detector • Taxa de aquisição de dados • Tempo de integração 600.00 500.00 400.00 300.00 200.00 100.00 0.00 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 ponto a cada 16 1 segundos. 2 4 8 segundo. segundos. Introdução 63 Detecção Direta ou Indireta ?? 21 Métodos Ópticos 64 65 Absorção UV-vis b Io T I I I0 Absorção UV-vis A log T ebc 66 22 67 Absorção UV-vis Detecção UV-vis mono-canal Absorção UV-vis 68 Detecção UV-vis mono canal - Exemplos Absorção UV-vis 69 Detecção UV-vis multi-canal 23 Absorção UV-vis 70 Detecção UV-vis multi-canal - Exemplos Absorção UV-vis 71 Detecção UV-vis multi-canal - Exemplos Métodos Eletroquímicos 72 24 73 Métodos Eletroquímicos Manipulação dos eletrodos Influência do campo elétrico de separação Reprodutibilidade Detecção eletroquímica em CE Adsorção irreversível Seletividade 74 Métodos Eletroquímicos Amperométricos • Constante • Pulsado Voltamétricos Potenciométricos Condutométricos • Com contato • Sem contato 75 Métodos Eletroquímicos Células Eletroquímicas On-Column End-Column e2 wall-jet Capilar Capilar Off-Column WE e1 Desacoplador On-Capillary Contato Capilar WE Capilar Cola WE WE Capilar Membrana 25 76 Métodos Eletroquímicos Detectores Condutométricos Universais Com contato (baixa freqüência) Sem Contato (alta freqüência) LD – 10-5 10-7 mol L-1 Baixo Custo de implementação Opera em condições de alta eletrodispersão Com Contato V i(t) Sem Contato R V t t R i(t) V0 (t ) Ri (t ) V0 (t ) Ri (t ) 77 Métodos Eletroquímicos Detecção Condutométrica sem Contato da Silva, J. A. F.; Guzman, N.; do Lago, C. L.; J. Chromatogr. A 2002, 942, 249-258. 78 Detecção Condutométrica sem Contato 160 Ce 140 120 Xc / k 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 f / Hz Cw2 Cw1 Rs XC 1 2fC Capilar 26 79 Detecção Condutométrica sem Contato da Silva, J. A. F.; do Lago, C. L.; Anal. Chem. 1998, 70, 4339-4343. 80 Detecção Condutométrica sem Contato Separação de alguns álcoois alifáticos por MEKC Resposta / V Picos 1. 2-propanol 2. 1-propanol 3. 2-metil-2-propanol 4. 2-butanol 5. 2-metil-1-propanol 6. 1-butanol 7. 2-metil-2-butanol 8. 3-metil-1-butanol 9. 1-pentanol EOF 0.2 0.1 0.0 1 2 5 34 6 7 8 -0.1 9 4 5 6 7 Tempo / min 8 9 10 Tampão: fosfato 50 mM, SDS 50 mM, pH 6,9. Injeção por gravidade (10 cm por 30 s) da Silva, J. A. F.; do Lago, C. L.; Electrophoresis 2000, 21, 1405. Detecção Amperométrica 81 Materiais dos Eletrodos • Carbono (Fibra, disco, vítreo) • Diamante dopado • Metais (Pt, Cu, Ni, Au) • Modificados (Hg, Pd, Sn, Ru, Co Ftalocianinas, óxidos, enzimas, etc.) Número e Tipo dos Eletrodos • Simples • Duplo • Array • Microdisco • Tubular • Banda Configuração da Celula Eletroquímica 2 Eletrodos : WE, RE 3 Eletrodos : WE, RE, AE Sinal de Estímulo (Potencial) • Contínuo (AD) • Pulso (PAD) 27 82 Detecção Amperométrica 83 Detecção Amperométrica Detecção Amperométrica 84 28 Detecção Amperométrica 85 DA: Dopamina NE: Norepinefrina Epi: Epinefrina IP: Isoproterenol Detecção Amperométrica 86 Métodos Acoplados CE-MS 87 29 88 CE- Espectrometria de Massas Electrospray 0 1 - concentração local de cargas + cela eletroquímica CE- Espectrometria de Massas 89 Electrospray solução capilar metálico eletrodo metálico CE- Espectrometria de Massas 90 Electrospray 30 91 CE- Espectrometria de Massas Electrospray 92 CE- Espectrometria de Massas Electrospray evaporação fissão CE- Espectrometria de Massas 93 31
