Eletroforese Capilar

1
Métodos de Separação
- Análise QUALI e QUANTITATIVA de substâncias.
Métodos Cromatográficos
-Cromatografia em papel
-Cromatografia em camada delgada
-Cromatografia em fase gasosa
-Cromatografia em fase líquida
Métodos Eletroforéticos
-Eletroforese Capilar
-Eletroforese em Microchips
-Eletroforese em gel
-Eletroforese bi-dimensional
Métodos
Eletroforéticos de
Análise
Mecanismos de Separação: Eletroforese Capilar em Solução Livre
2
Eletroforese Capilar - Definições
3
“Técnica de separação baseada nas diferentes velocidades de
migração apresentadas pelos analitos, quando submetidos à ação
de um elevado campo elétrico.”
Técnicas de Eletromigração em Capilares:
Família de técnicas que empregam campo elétrico na separação
e/ou na movimentação dos analitos em sistemas capilares.
“Terminology and Nomenclature in Capillary Electroseparation Systems”
Knox, H. J.; J. Chromatogr. A 1994, 680, 3-13.
“Terminology for Analytical Capillary Electromigration Techniques”
Riekkola, M. L.; Jönsson, J. A.; Smith, R. M.; Pure Appl. Chem. 2004, 76(2),
443-451.
1
4
 Eletroforese em Capilares
 Eletroforese em Microchips
 Eletroforese em Gel
 Focalização Isoelétrica
 Eletroforese Bidimensional
 Aplicações
5
Objetivos
- Compreender o funcionamento do mecanismo
relacionado à separação eletroforética em solução livre.
de
separação
- Compreender os efeitos no fluxo eletrosmótico, a dependência do
potencial elétrico aplicado e os métodos de determinação.
- Diferenciar os termos: mobilidade aparente, mobilidade eletroforética e
mobilidade eletrosmótica.
- Diferenciar os termos: polaridade normal e polaridade invertida.
- Familiarizar com a instrumentação básica.
6
Eletroforese Capilar
Detector
Capilar
Controle
Tampão
Amostra
Tampão
Fonte de
Alta Tensão
LT = 30 - 50 cm
2
7
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
Fluxo Laminar
(pressão)
EOF
8
Eletroforese Capilar
Sinal do Detector (U.R.)
1,3
1,2
1,1
1,0
0
2
4
6
8
Tempo (min)
9
Mobilidade Eletroforética
Detector
n
capilar
plug
l
(comprimento até o detector)
L
(comprimento total)
v
s
t
v
l
tm
3
10
Efeito do Potencial Aplicado
2,0
+
Ca
K
2+
Na
+
Mg
2+
+
Li
5,0 kV
Sinal (U.R)
1,5
7,5 kV
1,0
10 kV
0,5
20 kV
0,0
25 kV
-0,5
0
2
4
6
8
10
Tempo (min)
11
Mobilidade Eletroforética
v
l
tm
(1)
v  e E  e
V
L
(2)
Combinando-se (1) e (2), temos:
e 
l
V
 e
tm
L
lL
t mV
tm 
lL
eV
12
Tempo de Migração
tempo de migração (min)
20
15
10
5
0
0
5
10
15
Potencial (kV)
4
Quanto maior o potencial, mais rápida a análise?
13
5
Corrente (A)
4
3
U=Rxi
y = ax + b
a = 1/R
2
1
0
0
5
10
15
20
25
30
Potencial (kV)
Controle de Temperatura
14
• Efeito Joule
Dispersão (s2)
15
• Efeito Joule
• Decréscimo no campo elétrico
Efeito proporcional na geração de calor
Reduz a eficiência e resolução
• Redução do diâmetro do capilar
Decréscimo significativo na corrente
Diminui a sensibilidade
Pode causar aumento na adsorção
• Decréscimo na concentração do tampão
Decréscimo proporcional da corrente
Pode causar aumento na adsorção
• Controle ativo da temperatura
Termostatos; remoção de calor do capilar
5
16
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
Estrutura da sílica fundida
O
Si
O
Si
OH Silanol isolado
Si
O
Si
O
O
Si
O
H
O
Si
O
Si
Silanóis vicinais
H
O
O-
Silanol dissociado
Si
O
O
Si
Si
O
O Siloxano
O
Si
O
Si
O
Si
O
OH
Silanóis geminais
Si
OH
17
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
Fenômenos Eletrocinéticos
• Eletrosmose
• Potencial de fluxo
(streaming potential)
Oldham, K. B.; Myland, J. C.; Fundamentals of Electrochemical Science, Academic
Press, San Diego, CA, USA, 1994.
18
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
CAPILAR
O
IHP
OHP
O
O
H + H
+
O
O
H
-
H
+
+
+
+
O
+
H
H
+
+
+
PC (z )
O
H
-
+
+
+
-
+
+
+
+
6
19
- Alguns parâmetros...
t 
N  16 m 
 wb 
t t 
R  2 m 2 m1 
 w1  w2 
2
tm2
tm1
wb1
wb2
20
0,35
28,3608
Exemplo 1
0,25
41,9472
Resposta (UR)
0,30
0,20
0,15
0,10
0,05
wb2 = 9,50
wb1 = 7,35
0,00
0
10
20
30
40
50
60
Tempo (s)
21
0,35
8,4888
Exemplo 2
0,25
12,5496
Resposta (UR)
0,30
0,20
0,15
0,10
0,05
wb2 = 4,80
wb1 = 3,56
0,00
0
5
10
15
20
25
30
Tempo (s)
7
22
0,30
18,9
Exemplo 03
27,972
Resposta (UR)
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
wb1 = 5,11
w b2 = 7,07
0,00
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (s)
23
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
Fatores que afetam o EOF
 pH (z) 
 Potencial Aplicado (E) 
 Concentração (ou Força Iônica) do Tampão (z)
 Temperatura (h) 
 Solventes Orgânicos (h, e, z)
 Modificação da Superfície do capilar
 Aplicação de um potencial radial externo
24
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
Fatores que afetam o EOF
EOF / 10-4 cm2 V-1 s-1
pH
8
25
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
EOF / 10-8 m2 V-1 s-1
Fatores que afetam o EOF
Concentração
2.0
1.5
1.0
0.5
26
Como medir o EOF ?
• Sinal de um marcador Neutro
• Monitoramento da corrente que flui pelo capilar
 eof 
lL
teof V
27
Polaridade Normal
CAPILAR
O
O
O
H + H
+
O
H
O
H
-
H
+
+
+
+
O
+
H
+
+
+
O
H
-
+
+
+
-
+
+
+
+
9
28
Eletroforese Capilar
Detector
Capilar
Controle
Tampão
Tampão
Amostra
Fonte de
Alta Tensão
LT = 30 - 50 cm
29
Polaridade Normal
CAPILAR
O
O
O
H + H
+
O
H
O
H
-
H
+
+
+
+
O
+
H
+
+
+
O
H
-
+
+
+
-
+
+
+
+
30
Eletroforese Capilar
- Técnica de separação baseada na diferença
de mobilidade (velocidade) de compostos
iônicos ou ionizáveis sob ação de um campo
elétrico.
vep
E
 ep 
ze
6hr
10
31
Mobilidade Aparente
eof
a  ef  eof
a
ef
a > 0
eof
a = 0
ef
eof
a
a < 0
ef
32
Análise de Cátions
a  ef  eof
Após uma análise eletroforética, a mobilidade aparente
de uma espécie catiônica foi igual a 1,610-4 cm2 V-1 s-1.
Considerando o valor de eof = 1,010-4 cm2 V-1 s-1,
calcule o valor da mobilidade eletroforética da espécie
analisada.
33
Análise de Ânions
a  ef  eof
a < 0
???
11
34
Análise de Ânions
0,6
eof  3Poliéster-toner
,0 x105
0,4
ep  1,0 x104
Fluorescência (URF)
0,4
Poliéster-toner
Fluxo Normal
0,3
Fluxo Invertido
app = ep + eof
0,2
FL
CM
ap  ???
0,2
0,1
0,0
0,0
0
50
100
Tempo (s)
150
0
200
50
100
150
200
35
Análise de Ânions
Fluorescência (URF)
0,4
Poliéster-toner
Fluxo Normal
0,3
0,6
Fluxo Invertido
0,4
app = ep + eof
0,2
Poliéster-toner
FL
CM
0,2
0,1
0,0
0,0
0
50
100
Tempo (s)
150
0
200
50
100
150
36
Eficiência da Separação
t 
N  16 m 
 wb 
2
2,0
Fluorescência (URF)
0,3
Fluorescência (URF)
200
Toner preto
(Imp. Monoc.)
0,2
0,1
0,0
0
30
60
90
120
Tempo (s)
150
180
Toner preto
(Imp. Colorida)
1,5
1,0
0,5
0,0
0
30
60
90
120
150
180
Tempo (s)
12
37
Resolução
t t 
R  2 m 2 m1 
 w1  w2 
R


1

N _ 


4
  
tm2
tm1
wb1
wb2




1
V


R
   _


4 2
D



 
EOF  

 
1/2
38
Seletividade (a)
Outros fatores que
afetam a seletividade:
-EOF
-Temperatura
-Composição do tampão
-Adsorção à parede do capilar
Tampão: Borato 100 mM; Capilar 25 m, 17 cm até o detector; Potencial 30 kV;
Detecção UV em 200 nm.
Instrumentação Básica
39
Fonte de
Alta Tensão
D
Pt
Reservatórios
13
Instrumentação Básica
40
Capilares
Fonte de Alta Tensão
• Potencial: 0-30 kV
• Corrente: 400 A
• Potência: 12 W
360 m
• Materiais: Sílica Fundida, PTFE, PEEK
• Comprimento: 20 a 70 cm
• Diâmetro Interno: 20 a 75 m
75 m
Controle de Temperatura
Injeção de Amostra
Detecção
Coleta de Frações
Injeção da Amostra
41
A introdução da amostra no capilar pode ser feita de
duas maneiras:
Aplicando-se pressão ao capilar
 Injeção Hidrodinâmica
Pressão positiva ou negativa
Gravidade
Utilizando-se campo elétrico
 Injeção Eletrocinética
Injeção da Amostra
42
Injeção Hidrodinâmica da Amostra (Pressão)
P
Pr 4t
V
8hL
P
V : Volume Injetado
P : Gradiente de Pressão
r : Raio do capilar
t : Tempo de Injeção
h : Viscosidade
L : Comprimento do Capilar
14
Injeção da Amostra
43
Injeção Hidrodinâmica da Amostra (Gravidade)
V
h
rghr 4t
8hL
V : Volume Injetado
r : Densidade
g : Aceleração da Gravidade
h : Diferença entre os níveis
r : Raio do capilar
t : Tempo de Injeção
h : Viscosidade
L : Comprimento do Capilar
Injeção da Amostra
44
Injeção Eletrocinética da Amostra
Fonte AT
Q
Vctr 2 ep  eo 
L
Q : Quantidade de Material Injetado
c : Concentração
r : Raio do Capilar
t : Tempo de Injeção
ep : Mobilidade Eletroforética
eo : Mobilidade do FEO
L : Comprimento do Capilar
Injeção da Amostra
45
Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias)
t0 = 0
E
K+
Na+
H20
15
Injeção da Amostra
46
Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias)
t1 > 0
E
K+
Na+
H20
Introdução
47
Detecção Direta ou Indireta ??
Métodos Ópticos
48
16
49
Absorção UV-vis
b
Io
T
I
I
I0
A   log T  ebc
Absorção UV-vis
50
Absorção UV-vis
51
Detecção UV-vis mono-canal
17
52
Absorção UV-vis
Detecção UV-vis mono
canal - Exemplos
Absorção UV-vis
53
Detecção UV-vis multi-canal
Absorção UV-vis
54
Detecção UV-vis multi-canal - Exemplos
18
55
Absorção UV-vis
Detecção UV-vis multi-canal - Exemplos
Eletroforese em Microchips
56
LT = 3 - 5 cm
57
Eletroforese em Microssistemas
19
58
59
60
Exemplos
20