CARACTERIZAÇÃO DA REAÇÃO EDEMATOGÊNICA

NEIDE GALVÃO DO NASCIMENTO
CARACTERIZAÇÃO DA REAÇÃO EDEMATOGÊNICA
INDUZIDA PELO VENENO DA SERPENTE Bothrops
moojeni E DOS MEDIADORES ENVOLVIDOS NESSE
EFEITO.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças
da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, para
Obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Área de concentração: Pesquisas Laboratoriais em
Saúde Pública.
Orientador: Profª. Dra Catarina de Fátima P. Teixeira
São Paulo
2008
COORDENADORIA DE CONTROLES DE DOENÇAS – CCD
PESQUISAS LABORATORIAIS EM SAÚDE PÚBLICA
_______________________________________________________________
Candidato(a):
Neide Galvão do Nascimento.
Título da Dissertação:
Caracterização da reação edematogênica induzida pelo
veneno da serpente Bothrops moojeni e dos mediadores
envolvidos nesse efeito.
Orientador(a):
Catarina de Fátima Pereira Teixeira.
A Comissão Julgadora dos trabalhos de defesa da Dissertação de Mestrado, em
sessão pública realizada a ........../........../.........., considerou
( ) Aprovada
( ) Reprovada
Examinador(a):
Assinatura:.........................................................................................
Nome:.................................................................................................
Instituição:..........................................................................................
Examinador(a):
Assinatura:..........................................................................................
Nome:.................................................................................................
Instituição:..........................................................................................
Examinador(a):
Assinatura:.........................................................................................
Nome:................................................................................................
Instituição:.........................................................................................
Trabalho realizado no Laboratório de
Farmacologia do Instituto Butantan, com auxílio
da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de
São Paulo (FAPESP).
A Deus,
Que no seu infinito amor e sabedoria nos permite
viver para apreciar sua obra-prima: a vida...
Ao meu esposo Juarez e aos meus filhos George e Juarez A.
Que estiveram ao meu lado, me incentivando e torcendo
sempre pelo meu sucesso. Por toda paciência e carinho,
em todos os momentos! Vocês fazem toda diferença
para que eu alcançasse mais este objetivo.
Amo muito vocês!
Aos meus queridos pais Maria e Adão (in memorian),
Que foram os pilares da construção
de minha existência...
Aos meus sogros Aparecida e Jerônimo (in memorian),
Que olha e zela por mim...
onde quer que estejam...
Dedico este trabalho.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Minha orientadora
À Profª Dra. Catarina F. P. Teixeira,
Por ter acreditado em mim, oferecendo condições e oportunidades
para que eu aprendesse cada vez mais. Pelo incentivo, compreensão
e apoio em todos os momentos. Hoje eu posso dizer que tenho mais
do que uma orientadora. Obrigada por ser mais que mestre em
minha vida!!!
À Renata, pela ajuda na execução deste trabalho, que me recebeu de forma
carinhosa e sempre presente em todos os momentos, obrigada pelas conversas e
ensinamentos.
Ao Marlos, pela amizade e ajuda sempre disponível em todos os momentos.
À Cristina, pela ajuda valiosa e carinho durante este trabalho.
À Vanessa, obrigado pelas conversas, convivência e ajuda.
Ao meu grande amigo Elbio, obrigado pelas inúmeras críticas construtivas e
calorosas discussões durante o meu mestrado.
À Polly, por contribuir pelo carinho e apoio durante este trabalho.
À Silvia, amiga que sempre tem uma palavra de conforto quando
precisamos.
Ao Sérgio, grande pequeno homem, amigo de todas as horas.
Ao Márcio, obrigado pela amizade e carinho.
Ao Jean, pelo carinho, amizade e todos os momentos de alegria.
Ao Fábio, pela amizade e convívio.
Aos funcionários do Laboratório de Farmacologia, que me ajudaram durante
este trabalho. Aos funcionários do Laboratório de Farmacologia do Instituto
Butantan, pelo carinho, apoio técnico, convívio e colaboração para realização
deste trabalho: Joana, Sônia, Binha, Cléo (‘florzinha”), Wilson, Zelma,
Valério, Vilma, Valquíria, Antônio, Elisa e Wanda (in memorian).
À Elenice e Elisângela, que sempre estiveram ao meu lado durante a
realização deste trabalho.
À Profª Dra Valquiria Coronado Abrão Dorce, pela orientação no início
desta jornada, sem sua generosidade isto não seria possível.
À Emiliana e o pessoal da pós-graduação, pelo carinho, atenção e pelo
trabalho de vocês durante este período.
À Dra. Maria de Fátima Costa Pires – Coordenadora da CpG-CCD pela
ajuda dispensada em todos os momentos desta fase.
Aos professores das disciplinas cursadas ao longo do mestrado, por deixar
um pouco deles em minha vida profissional e, em especial, à Profª Ausônia, que
fez germinar o saber do mestre em mim. Muito obrigado.
Aos professores que constituíram a banca do meu exame de qualificação:
Francisco O. S. França, Stella R. Zamuner e Luiz R. C. Gonçalves, guardo
deste dia o que considero a essência do pensamento científico: a crítica. Deste dia
trago uma grande lição de aprendizado: também faz parte da avaliação mostrar
caminhos.
Ao Biotério Central do Instituto Butantan, pelo fornecimento dos animais,
em especial à Fátima e Juliana pela atenção dispensada sempre que necessário.
Em especial, agradeço a todos os animais que fizeram parte deste trabalho,
sem os quais este estudo não poderia ter se realizado. O meu muito obrigado!
“Os animais são como deuses, ensinam-nos em silêncio, o que não aprendemos em diálogo”
(José A. Ribeiro)
Enfim, a todos que de alguma forma participaram na realização
deste trabalho.
2
Todos os dias Deus nos dá um momento em que é possível mudar tudo que nos
deixa infelizes. O instante mágico é o momento em que um 'sim' ou um 'não'
pode mudar toda a nossa existência.
Paulo Coelho
Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),
pela concessão da Bolsa de Mestrado (processo 06/52793-0).
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas........................................................................................................
i
Lista de figuras.................................................................................................................
ii
Lista de tabelas................................................................................................................
iii
Resumo ............................................................................................................... 01
Abstract ............................................................................................................... 02
1 INTRODUÇÃO................................................................................................. 03
Subitens
Reação inflamatória aguda – Considerações gerais ............................. 06
Mediadores inflamatórios – eicosanóides................................................ 08
Histamina................................................................................................ 11
Fator de necrose tumoral – α.................................................................. 12
Óxido Nítrico........................................................................................... 13
2 OBJETIVOS............................................................................................ 15
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais .............................................................................................. 16
3.2 Veneno .............................................................................................. 16
3.3 Avaliação do edema de pata ............................................................. 16
3.4 Tratamentos farmacológicos ............................................................. 17
3.5 Neutralização da atividade edematogênica....................................... 18
3.6 Fármacos e reagentes....................................................................... 19
3.7 Análise estatística.............................................................................. 20
4 RESULTADOS
4.1 Efeito edematogênico do veneno de B. moojeni em camundongos.... 21
4.2 Efeito de diferentes tratamentos farmacológicos no edema
causado pelo veneno de B. moojeni (VBm)....................................... 23
4.3 Efeito da soroneutralização in vitro no edema induzido pelo
VBm.................................................................................................... 35
4.4 Efeito da aplicação sistêmica do antiveneno no edema induzido pelo
VBm.................................................................................................... 36
5 DISCUSSÃO ................................................................................................... 42
6 CONCLUSÕES ............................................................................................... 51
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 52
LISTA DAS PRINCIPAIS ABREVIATURAS
AA
Ácido araquidônico
CPZ
Clorpromazina
COX
Ciclooxigenase
cNOS
óxido nítrico sintase constitutiva
E.P.M.
erro padrão da média
FLA2
Fosfolipase A2
PG
Prostaglandina
TX
Tromboxana
LT
Leucotrieno
PAF
IL
fator ativador de plaqueta
Interleucina
iNOS
óxido nítrico sintase induzível
IFN-у
interferon-gama
LPS
Lipopolissacarídeo
NO
óxido nítrico
NOS
óxido nítrico sintase
SAB
soro antibotrópico
SNC
Sistema nervoso central
TNF-α
μg
fator de necrose tumoral-alpha
Micrograma
VBm
Veneno de Bothrops moojeni
5-LO
5-lipoxigenase
5-HETE
ácido hidroxieicosatetraenóico
i
LISTA DE FIGURAS
Fig.
Título
Pág.
1
Esquema das vias biossintéticas dos eicosanóides..................................... 10
2
3
Efeito de diferentes concentrações do veneno da serpente Bothrops
moojeni......................................................................................................... 22
Efeito do cetotifeno no edema induzido pelo VBm....................................... 23
4
Efeito do composto 48/80 no edema induzido pelo VBm............................. 24
5
Efeito da prometazina no edema induzido pelo VBm................................... 25
6
Efeito da cimetidina no edema induzido pelo VBm....................................... 26
7
Efeito da tiopiramida no edema induzido pelo VBm..................................... 27
8
Efeito da dexametasona no edema podal induzido pelo VBm..................... 28
9
Efeito da indometacina no edema induzido pelo VBm................................. 29
10
Efeito do eterocoxib no edema induzido pelo VBm...................................... 30
11
Efeito zileuton no edema induzido pelo VBm............................................... 31
12
Efeito da clorpromazina no edema induzido pelo VBm................................ 32
13
Efeito do L-NAME e do D-NAME no edema induzido pelo VBm.................
14
Efeito da aminoguanidina no edema induzido pelo VBm............................. 34
15
Efeito da soroneutralização in vitro do edema induzido pelo
VBm..............................................................................................................
Efeito da aplicação sistêmica do antiveneno no edema induzido pelo VBm
(1 μg)............................................................................................................
Efeito da aplicação sistêmica do antiveneno no edema induzido pelo VBm
(6 μg)............................................................................................................
Efeito da aplicação sistêmica do antiveneno 15 min após a indução do
edema pelo VBm..........................................................................................
Efeito da aplicação sistêmica do antiveneno 60 min após a indução do
edema pelo VBm..........................................................................................
16
17
18
19
33
35
36
37
38
39
ii
LISTA DE TABELAS
Tabela
1
2
Título
Pág.
Quadro resumo do efeito de diferentes tratamentos farmacológicos no
edema induzido pelo VBm...................................................................... 40
Quadro resumo do efeito da soroneutralização do edema induzido
pelo VBm................................................................................................ 41
iii
Resumo
RESUMO
Neste estudo, a reação edematogênica, induzida pelo veneno de B. moojeni
(VBm), foi caracterizada em camundongos, quanto: a) ao decurso temporal e relação
concentração-efeito; b) a participação de mastócitos e de mediadores inflamatórios e
c) ao efeito do soro antibotrópico poliespecífico (SAB). Os dados obtidos demonstram
que a injeção intraplantar do VBm (0,1 - 6 µg/pata) induziu edema, de modo
concentração e tempo dependente, máximo aos 30min. Na concentração de 6 µg do
VBm/pata, observou-se hemorragia pronunciada no local de sua injeção e um
segundo pico de edema na 3a hora. O edema induzido pelo VBm (1 μg/pata) foi
reduzido quando os animais foram pré-tratados com cetotifeno, um inibidor da
desgranulação de mastócitos ou composto 48/80, depletor de mastócitos, ou com
prometazina ou cimetidina ou tiopiramida, antagonistas dos receptores H1, H2 e
H3/H4, respectivamente. A dexametasona, um inibidor de fosfolipase A2, a
indometacina, inibidor não seletivo das COXs, eterocoxibe, inibidor da COX-2,
zileuton, inibidor da 5-lipoxigenase e a clorpromazina, inibidor da síntese do TNF-α,
também reduziram o edema causado pelo VBm. Por outro lado, o tratamento dos
animais com L-NAME ou aminoguanidina, mas não com D-NAME, aumentou o
volume podal induzido pelo VBm, em relação aos controles. Ainda, a incubação do
VBm
com
o
soro
antibotrópico
poliespecifíco
(SAB)
neutralizou
o
efeito
edematogênico do veneno. O pré-tratamento dos animais com este soro neutralizou
o edema a partir da 1ª hora da injeção do VBm (1 ou 6 μg/pata) e reduziu esse efeito
na fase anterior. Por outro lado, a administração do soro após a injeção do VBm,
neutralizou
parcialmente
o
edema.
Em
conclusão,
o
VBm
induz
reação
edematogênica de rápida evolução, mediada pela histamina, via receptores H1, H2 e
H4, prostaglandinas, via COX-1 e -2, leucotrienos e TNF-α. Esta reação é regulada
negativamente pelo NO. Os mastócitos são elementos importantes para o efeito do
VBm e devem constituir uma fonte importante dos mediadores envolvidos. Ainda, o
soro antibotrópico reconhece componentes edematogênicos do veneno, sendo mais
eficaz quando administrado previamente ao veneno.
Palavras-chaves: Venenos de serpentes, Bothrops, edema/terapia, mediadores da
inflamação.
1
Abstract
ABSTRACT
In the present study we examined the ability of B. moojeni venom (BmV) to
induce oedema in the mouse hind paw. Moreover, the involvement of mast cells and
some mediators in this response, and the efficacy of bothropic antivenom in
neutralizing the oedema were investigated. Results showed that B. moojeni venom
(0.1 - 6 μg/paw) induced a time and dose-dependent paw oedema Maximal
oedematogenic response occurred at 30min after venom injection, decreasing
thereafter up to 24h. At the highest dose of BmV (6 μg/paw), oedema was
accompanied by haemorrhage and showed a second peak at 3h. Pretreating animals
with selected drugs such as ketotifen or compound 48/80 (mast cell degranulation
inhibitor and mast cell depleting agent, respectively), promethazine or cimetidine or
thiopiramide maleate (H1, H2 and H3/H4 receptor antagonists, respectively),
dexamethasone
(indirect
inhibitor
of
PLA2),
indomethacin
(inhibitor
of
cyclooxygenases), eterocoxib (inhibitor of cyclooxygenase-2), zileuton (inhibitor of 5lipoxygenase) or chlorpromazine (inhibitor of TNF-α), significantly reduced BmVinduced oedema. However, L-NAME (non selective inhibitor of NOS) and
aminoguanidine (inhibitor of iNOS) significantly increased paw oedema induced by
BmV. Previous incubation of BmV with antivenom abrogated venom-induced paw
oedema. Administration of antivenom 30min before BmV injection into the mouse hind
paw inhibited venom-induced oedema from 1h onwards. However, administration of
antivenom 15 or 60min after BmV paw injection attenuated BmV-induced paw
oedema. In conclusion, the present results show that BmV causes oedema in the
mouse hind paw which is mediated by histamine via H1, H2 and H4 receptors, PGs,
via both COX-1 and -2, LTs and TNF-α, but is negatively regulated by NO. Mast cells
are involved in BmV-induced oedema and may be an important source of
inflammatory mediators. Moreover, although the bothropic antivenom recognizes the
venom components responsible for oedema, its administration after venom injection
into paws has little influence on development of BmV-venom-induced oedema.
Key-words: Snake venom, Bothrops, oedema/therapy, inflammatory mediators.
2
Introdução
1 INTRODUÇÃO
Os acidentes causados por serpentes peçonhentas constituem um importante
problema de Saúde Pública em regiões tropicais do mundo. As serpentes
responsáveis pelo maior número de acidentes ofídicos, na América Latina,
pertencem à família Viperidae e ao gênero Bothrops. Estas serpentes estão
distribuídas nas Américas, desde o México até a Argentina (Hoge e Romano-Hoge,
1978).
No Brasil, as serpentes do gênero Bothrops são encontradas em todo o
território e compreendem 22 espécies (Campell e Lamar, 2004). Algumas espécies
apresentam maior importância, por sua extensa distribuição geográfica, como a B.
atrox na Amazônia, a B. erythromelas no Nordeste, a B. jararaca na região Sul e
Sudeste e a B. moojeni na região Centro-Oeste e Sudeste. A serpente Bothrops
moojeni é a maior serpente das áreas de mata ciliar, das regiões central e sudeste
do Brasil (Nogueira et al., 2003). Em função do comportamento agressivo e porte
avantajado, esta serpente é capaz de se adaptar a ambientes modificados, sendo a
principal espécie dos cerrados (Ministério da Saúde, 2005; Melgarejo, 2003). Além
disso, as serpentes dessa espécie são responsáveis por cerca de 90% dos
acidentes ofídicos que ocorrem na região de São José do Rio de Preto, no estado
de São Paulo. Os relatos clínicos desses acidentes mostram que os efeitos locais,
causados por essas serpentes, são graves e com maior número de complicações
do que aqueles causados pela serpente B. jararaca (Kouyoumdjian e Polizelli, 1988,
1990).
Embora os venenos botrópicos apresentem variações quanto à composição e
atividades biológicas, ao serem injetados em humanos ou animais, induzem um
quadro fisiopatológico caracterizado por reações locais imediatas, com edema
proeminente, mionecrose, hemorragia e dor (Rosenfeld, 1971; Gutierrez e Lomonte,
1989, 1995; Kamigute e Sano, 1995; Teixeira et al., 1994; Chacur et al., 2001) e
reações sistêmicas, com alterações da coagulação sangüínea, acarretando,
freqüentemente, incoagulabilidade sangüínea (Mandelbaum et al., 1982). Em casos
mais graves, ocorrem complicações sistêmicas, com alterações do sistema
cardiovascular, choque hipovolêmico e insuficiência renal aguda (Amaral et al.,
1985).
3
Introdução
O tratamento utilizado para os acidentes botrópicos é a soroterapia, com
antiveneno poliespecífico (para revisão vide Chippaux e Goyffon, 1998). Quando a
administração do antiveneno é iniciada imediatamente após a picada, os efeitos
sistêmicos do veneno são, normalmente, revertidos. Por isso, os coeficientes de
letalidade, decorrentes desses acidentes, têm revelado tendência decrescente ao
longo do tempo (Ribeiro et al., 1995; Ministério da Saúde, 2005). No entanto, a
neutralização dos efeitos locais é dificilmente obtida (Gutiérrez et al., 1981) e,
dependendo do grau de envenenamento, essa dificuldade de neutralização resulta
em perda do tecido afetado. Por este motivo, as ações locais, induzidas pelos
venenos botrópicos, constituem, atualmente, um alvo de investigação intensa.
Os venenos botrópicos são constituídos por misturas complexas de proteínas,
com estruturas e atividades biológicas diversas. Parte dessas proteínas são
enzimas, como as fosfolipases A2, as metaloproteinases e serinoproteases,
enquanto outras não possuem atividade enzimática, como as disintegrinas e
lectinas do tipo C (Braud et al., 2000). Acredita-se que o efeito mionecrótico dos
venenos botrópicos seja causado por uma ação direta e indireta de fosfolipases A2
miotóxicas (Gutierrez et al., 1984; Queiroz e Petta, 1984; Gutierrez et al., 1986;
Homsi-Brandeburgo et al., 1988) e que a hemorragia resulte da ação de
metaloproteinases dependentes de zinco (Ohsaka et al., 1975; Ohsaka, 1979;
Ownby e Geren, 1987; Ownby et al., 1990). Por outro lado, a ação edematogênica
dos venenos botrópicos, até o momento, não foi atribuída a nenhuma proteína
isolada, por se tratar, possivelmente, da somatória de efeitos de várias toxinas,
presentes nesses venenos.
Os dados da literatura sugerem que o edema induzido pelo veneno de
serpentes do gênero Bothrops decorre da combinação de diversos fatores, quais
sejam: a) ação direta do veneno ou toxinas sobre a parede dos vasos da
microcirculação, causando extravasamento plasmático, como, por exemplo, os
fatores hemorrágicos; b) ação de componentes do veneno que atuam no endotélio
vascular, aumentando sua permeabilidade e c) ação indireta de toxinas que
induzem a liberação de diversos mediadores inflamatórios, envolvidos no aumento
da permeabilidade vascular e edema (Gutierrez e Lomonte, 1989; Dias da Silva et
al., 1995). Nesse sentido, Trebien e Calixto (1989) demonstraram que o edema
induzido pelo veneno de B. jararaca, em ratos, é multimediado e resulta da ação de
4
Introdução
mediadores α e β-adrenérgicos, de eicosanóides e do PAF, além de serotonina e
histamina. A participação de eicosanóides e PAF também foi observada no
desenvolvimento da resposta hiperalgésica induzida pelo veneno de B. jararaca
(Teixeira et al., 1994). Ainda, Chacur et al., (2001) demonstraram que a hiperalgesia
induzida pelo veneno de B. asper é mediada, ao menos em parte, por bradicinina,
fosfolipase A2 e produtos da lipoxigenase. Além disso, os dados da literatura
mostram um aumento de citocinas, como as interleucinas (IL) -1, -6 e -10, o fator de
necrose tumoral (TNF) e o interferon gama (IFN- γ), no soro de animais injetados
com venenos de serpentes de várias espécies do gênero Bothrops (Lomonte et al.,
1993; Barros et al., 1998; Petricevich et al., 2000). Chaves et al. (1995) observaram
a participação de eicosanóides e de mediadores α-adrenérgicos, no edema induzido
pelo veneno de B. asper em camundongos. Ainda, foi demonstrado que a reação
local inflamatória, desencadeada por venenos botrópicos, é distinta dos demais
processos inflamatórios, por não ser modulada, em sua fase aguda, por
glicocorticóides (Cury et al., 1997). Estes hormônios, dentre outras atividades,
inibem a ativação de fosfolipases que são constituintes abundantes dos venenos
botrópicos. Esse conjunto de informações indica a complexidade da reação
inflamatória, desencadeada por venenos de serpentes do gênero Bothrops. Por
outro lado, é conhecido que a distribuição de algumas toxinas não é uniforme nos
venenos das várias espécies do gênero Bothrops. Variações na composição
química e das atividades biológicas dos venenos podem ocorrer entre famílias,
gêneros, espécies e subespécies desse gênero (Moura da Silva et al., 1991;
Chippaux et al., 1991). Esse fato pode determinar diferenças na evolução clínica
dos indivíduos picados, especialmente no que se refere às ações locais e
determinar, assim, condutas terapêuticas distintas.
Os relatos clínicos, do efeito edematogênico local, causado pelo veneno de B.
moojeni, apresentam sérias complicações (Nogueira et al., 2003; Kouyoumdjian e
Polizelli, 1988, 1990). Apesar da importância médica do acidente causado pela
serpente Bothrops moojeni, nas regiões Centro-Oeste e Sudeste do Brasil
(Nogueira et al., 2003; Rojas et al., 2007), de alta densidade populacional, os
estudos relacionados à reação local inflamatória, causada pelo veneno dessa
serpente, em particular o edema, são escassos e incompletos. Da mesma forma, os
mecanismos envolvidos nesses efeitos não foram estudados até o presente.
5
Introdução
Assim sendo, este estudo visa avaliar efeitos e mecanismos pró-inflamatórios,
causados pelo veneno da serpente Bothrops moojeni. Pretende-se, com este
estudo, contribuir para o conhecimento das ações locais dos venenos de serpentes
brasileiras, do gênero Bothrops, favorececendo propostas terapêuticas mais
eficientes e complementares à soroterapia.
Reação inflamatória aguda e mediadores inflamatórios - Considerações
gerais
A reação inflamatória é uma resposta do tecido vascularizado a estímulos
lesivos, com a finalidade de eliminar o agente agressor e restaurar o tecido à sua
forma e função normais. Essa resposta, apesar de complexa, manifesta-se de
maneira estereotipada e compreende fenômenos vasculares, teciduais e linfáticos
(Garcia Leme, 1989). A natureza sensivelmente padronizada da reação - rubor,
tumor, calor e dor - é a expressão de fenômenos estruturais e funcionais que
ocorrem na microcirculação e no tecido intersticial adjacente, com a participação da
inervação sensitiva local.
Os fenômenos vasculares da reação inflamatória se iniciam com breve
vasoconstrição, seguida de vasodilatação e aumento do fluxo local, aumento de
permeabilidade vascular, com conseqüente extravasamento do fluido e material
protéico, levando à formação de edema (Garcia Leme et al., 1973).
A exsudação plasmática pode ocorrer por diversos mecanismos. Um deles é a
formação de fendas no endotélio, mediada pela ativação de receptores de vários
mediadores inflamatórios tais como a histamina, serotonina, leucotrienos e
substância P. As fendas formadas são intercelulares e próximas às junções. O
aumento da permeabilidade vascular (PV), neste caso, ocorre rapidamente, é
reversível e de curta duração (15-30 minutos). Outro mecanismo que pode levar à
formação de fendas no endotélio é a reorganização do citoesqueleto. Este processo
é, geralmente, induzido por citocinas como a interleucina 1 (IL-1), o fator de necrose
tumoral (TNF) e o interferon-gama (IFN-γ). Em contraste ao efeito causado pela
histamina, este processo aparece tardiamente e é de longa duração. A exsudação
plasmática pode, ainda, ocorrer por transcitose de moléculas através do citoplasma
das células endoteliais. Tal processo ocorre próximo a canais, localizados ao redor
6
Introdução
das junções intercelulares (Lum e Malik, 1996). O aumento de PV pode ocorrer
também por injúria direta sobre as células endoteliais; aparece imediatamente após
a lesão e é sustentado por várias horas. Por fim, pode haver aumento de PV por
injúria endotelial induzida por leucócitos ativados, que aderem ao endotélio e
liberam espécies reativas de oxigênio e enzimas proteolíticas (Lum e Malik, 1996).
O componente celular da reação é representado, principalmente, pela
migração
de
leucócitos
polimorfonucleares
(neutrófilos
e
eosinófilos)
e
mononucleares (monócitos, linfócitos e mastócitos) para o tecido adjacente. Este
evento
ocorre,
principalmente,
na
porção
venular
da
microcirculação,
particularmente em vênulas pós-capilares (Majno et al., 1961; Majno e Palade,
1961). A eliminação do agente lesivo, presente no foco inflamatório ocorre por meio
de fagocitose, realizada pelos neutrófilos e macrófagos, bem como da produção de
agentes microbicidas, gerados por estas células (para revisão vide Greenberg,
1995; Aderem e Underhill, 1999). Concomitantemente ao processo de fagocitose,
ocorre um aumento do metabolismo oxidativo dos leucócitos, conhecido como
“burst” respiratório, resultando na produção de agentes microbicidas, como o ânion
superóxido (O2-) e peróxido de hidrogênio (H2O2) (Babior et al., 1973; Babior, 1984;
Ischiropoulos et al., 1996) ou, ainda, de óxido nítrico e derivados reativos de
nitrogênio (Hibbs et al., 1989).
Os diferentes eventos, que caracterizam a reação inflamatória, são regulados
pela liberação e ação coordenada de diversas substâncias endógenas - mediadores
inflamatórios - que alteram a função da microcirculação e coordenam o
desenvolvimento de cada evento. Os mediadores da inflamação são de origem
celular,
como
a
histamina,
serotonina,
eicosanóides
(prostaglandinas
e
leucotrienos), óxido nítrico, fator ativador de plaquetas (PAF), citocinas e outras
proteínas leucocitárias ou de origem plasmática, como as cininas e componentes do
sistema do complemento (Rocha-Silva e Garcia-Leme, 1972; Ferreira e Vane,
1973).
A partir da fase aguda, exsudativa, podem ocorrer fenômenos de regeneração
e reparo. A resolução do processo inflamatório agudo se dá através da eliminação
dos leucócitos recrutados, determinada pela apoptose. A seguir, as células
apoptóticas e os debris celulares são removidos pelos macrófagos, pelo processo
de fagocitose e/ou são drenados pelos vasos linfáticos, através da linfa. No caso de
7
Introdução
persistência do estímulo lesivo, podem ocorrer modificações, marcantes, das
características da resposta, com cronificação da reação, que adquire caráter
proliferativo.
Mediadores inflamatórios:
Eicosanóides
Os eicosanóides são produtos do metabolismo do ácido araquidônico (AA), um
ácido graxo constituinte de membranas celulares. Eicosanóide é um termo genérico,
que designa, coletivamente, as prostaglandinas (PG), as tromboxanas (TX) e os
leucotrienos (LT), produtos gerados a partir de ácidos graxos essenciais que
possuem 20 átomos de carbono e três, quatro ou cinco duplas ligações, como o
ácido - 5, 8, 11, 14 - eicosatetraenóico (ácido araquidônico) (para revisão vide Smith
et al., 2000).
Ao contrário da histamina, os eicosanóides não são encontrados pré-formados
nos tecidos, sendo produzidos a partir de fosfolipídios de membrana. Os
eicosanóides estão envolvidos no controle de muitos processos fisiológicos e estão
entre os mediadores mais importantes da reação inflamatória (Hang et al., 2003).
O aumento do influxo de cálcio para as células, determinado por estímulos
químicos, físicos ou biológicos, acarreta a ativação de enzimas dependentes de
cálcio, como as fosfolipases A2 (FLA2). Estas enzimas catalisam a hidrólise de
fosfolipídios de membranas celulares, liberando quantidades equimolares de ácidos
graxos livres, como o ácido araquidônico e lisofosfolipídios, como o liso-PAF. O AA
livre
é
metabolizado
pelos
sistemas
enzimáticos
das
ciclooxigenases
e
lipoxigenases, originando os prostanóides e leucotrienos, repectivamente. As vias
de metabolização do AA estão representadas na Figura 1.
As ciclooxigenases apresentam duas isoformas, denominadas ciclooxigenase1 (COX-1) e ciclooxigenase-2 (COX-2). A COX-1 é a isoforma expressa
constitutivamente, na maioria das células e tecidos, que incluem o endotélio,
monócitos, plaquetas, túbulos renais e vesículas seminais, sendo responsável pela
formação dos prostanóides em condições fisiológicas, sendo relevantes para a
homeostasia e integridade da mucosa gastrointestinal (Smith, 1989; O’Neill e FordHutchinson, 1990). A COX-2 pode ser expressa constitutivamente ou ser induzida
em vários tipos de células e tecidos, pela ação de mediadores inflamatórios, como o
8
Introdução
TNF-α e a IL-1 e por lipopolissacarνdeos de bactιrias (LPS). Esta isoforma estα
relacionada ΰ resposta inflamatσria e ΰ regulaηγo da diferenciaηγo e crescimento
celular (Smith, 1992; Appleton et al., 1996; Cirino, 1998; Scott et at., 1999). Tanto a
COX-1 quanto a COX-2 estão localizadas na membrana de retículo endoplasmático,
porém, a COX-2 é encontrada também na membrana nuclear (Otto e Smith, 1994).
A atividade da enzima ciclooxigenase, também referida como prostaglandina
G/H sintase (PGH), pode originar uma variedade de produtos. Assim, a PGH2,
através de enzimas denominadas isomerase, é convertida em PGE2, PGF2 e PGD2.
Ainda, a PGH2 pode ser convertida em PGI2 (prostaciclina) e TXA2 através da
prostaciclina- e tromboxana- sintases, respectivamente (Gerritsen, 1996). As PGE2
e PGI2 promovem a vasodilatação. A PGE2 potencializa o aumento da
permeabilidade vascular e o fenômeno da dor, em ação conjunta com a histamina e
a bradicinina; medeia também a glicogenólise, broncoconstrição e inibe agregação
de plaquetas (Hayashi, 1988). A TXA2, em condições fisiológicas, possui ação
vasoconstritora e promove agregação plaquetária; durante processos inflamatórios
é quimiotática para leucócitos, está envolvida no aumento de permeabilidade
vascular e induz aumento da expressão de moléculas de adesão da super família
das imunoglobulinas (Ishizuka et al., 1996). Outra via de metabolização do AA é
determinada pelas 5, 12 ou 15 – lipoxigenases, família de enzimas citoplasmáticas,
que catalisam a oxigenação de ácidos graxos poliêmicos e hidroperóxido
(Samuelsson et al., 1987; Gerristsen, 1996). A 5-lipoxigenase (5-LO) é a primeira
enzima na biossíntese dos leucotrienos e o seu principal produto é o 5-HETE (ácido
hidroxieicosatetraenóico) que, posteriormente, é transformado em leucotrieno B4,
C4, D4 e E4. O LTB4 é um potente ativador das respostas funcionais inflamatórias,
com ação quimiotática e estimulatória potente para leucócitos polimorfonucleares e
monócitos e induz a expressão de moléculas de adesão por leucócitos (Lam et al.,
1990; Samuelsson et al., 1987; Ford-Hutchinson, 1990).
9
Introdução
12/15-LOX
FIGURA 1: Modelo esquemático dos mediadores produzidos a partir do ácido
araquidônico (Bogatheva et al., 2005).
LOX=lipoxigenase, COX=ciclooxigenase, EET=ácido epoxieicosatrienóico, HPETE=ácido
hidroperoxieicosatetranóico,
HETE=ácido
hidroxieicosatetraenóico,
LT=leucotrieno,
PG=prostaglandina, TX=tromboxana, Lx=lipoxina, Hx=hepoxilina, TrX=trioxilina.
10
Introdução
Histamina
As aminas vasoativas, representadas pela histamina e serotonina, são, de
modo geral, os primeiros mediadores a serem liberados no processo inflamatório. A
histamina é uma amina básica, formada a partir da descarboxilação do aminoácido
L-histidina pela ação da histidina-descarboxilase. A histamina é amplamente
distribuída nos tecidos, encontrada em concentrações elevadas no pulmão, trato
gastrintestinal e plaquetas, bem como em grânulos de mastócitos e basófilos, sendo
liberada por desgranulação dessas células, em resposta a estímulos inflamatórios e
alérgicos. Esse mediador produz efeitos biológicos ao interagir com receptores
acoplados à proteína G, denominados H1, H2, H3 e H4 (Cotran, 2000; Hofstra et al.,
2003). As atividades da histamina incluem a vasodilatação, estimulação da
secreção de suco gástrico, quimiotaxia de leucócitos e broncoconstrição (Hang et
al., 2003; Hofstra et al., 2003). Além disso, a histamina é um dos principais
mediadores do aumento da permeabilidade vascular e contribui para formação de
edema, em processos inflamatórios (Joris et al., 1987; Qureshi e Jakschik, 1988;
1999; Jutel et al., 2006). Este mediador atua diretamente sobre as células
endoteliais, do segmento venular da microcirculação e por estimulação de
receptores do tipo H1, principalmente, induz a contração dessas células, com
consequente formação de fendas, através das quais há passagem de material
plasmático (Regoli et al., 1981). Ainda, a ativação destes receptores, pela
histamina, leva a um aumento da síntese de PGE2 e PGI2 por células endoteliais
(Cole e Lewis, 1989) e à expressão das moléculas de adesão P-selectinas,
favorecendo a migração de leucócitos (Asako et al., 1994). Por outro lado, a
ativação dos receptores H2 está relacionada, preferencialmente, ao aumento de
secreção gástrica, por células parietais (Knight et al., 1992; Tamaoki et al., 1997;
Huang et al., 2008). No entanto, a estimulação destes receptores também ocasiona
relaxamento da musculatura lisa e aumento da resistência das vias aéreas
inferiores (Knight et al., 1992; Tamaoki et al., 1997). Em contraste, os receptores H3
funcionam como receptores pré-sinápticos do sistema nervoso central e estão
envolvidos na regulação autócrina da histamina e de outros neurotransmissores
desse sistema (Lovenberg et al., 1999). Já a ativação dos receptores do tipo H4,
pela histamina, resulta na quimiotaxia de mastócitos e na liberação do cálcio
intracelular. Até o presente este subtipo de receptor foi descrito em células da série
11
Introdução
leucocitária, como eosinófilos, células T, células dendriticas, basófilos e mastócitos
(Liu et al., 2001; Gantner et al., 2002; O`Reilly et al., 2002; Hofstra et al., 2003).
Fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α)
O TNF-α é considerado um importante mediador pró-inflamatório. Esta citocina
é uma glicoproteína ligada à membrana celular, sintetizada na forma de um
precursor de 233 aminoácidos, com peso molecular de 26 kDa (Pennica et al.,
1984; Vassali, 1992; Bradley, 2008).
Para exercer seus efeitos biológicos, o TNF-α, necessita ser desligado da
membrana celular, pela ação da enzima TACE (TNF-α Converting Enzime) e uma
vez liberado para o espaço extracelular, interage com dois tipos de receptores de
superfície celular: o TNFR1 e o TNFR2, desencadeando eventos intracelulares
(Pennica et al., 1984). A literatura mostra que a interação do TNF-α com o receptor
TNFR1 ativa uma sinalização intracelular que resulta em eventos pró-inflamatórios e
apoptose, associados à injúria tecidual. Por outro lado, os eventos desencadeados
pela interação do TNF-α com o receptor TNFR2 são pouco conhecidos e têm sido
associados ao reparo de tecidos e à angiogênese (Kondo e Sauder, 1997; Bradley,
2008).
O TNF-α participa de vários eventos inflamatórios, como o aumento da
permeabilidade vascular, a ativação de neutrófilos e conseqüente desgranulação,
produção de intermediários reativos de oxigênio, o aumento da citotoxicidade para
certos patógenos além do aumento da atividade fagocítica e da quimiotaxia por
neutrófilos e monócitos. Além disso, o TNF-α induz a produção de citocinas como a
IL-1 e IL-6, por células endoteliais e por macrófagos, e de INF-γ por linfócitos T
(Akira et al., 1990; Vassali, 1992; Goldblum et al., 1993; Eigler et al., 1997; Alessio
et al., 1998).
Diversos tipos celulares são capazes de produzir e secretar o TNF-α, após
estimulação. Assim, monócitos e macrófagos produzem grandes quantidades de
TNF-α (Hofsli et al., 1989). Outra célula importante, que estoca e secreta o TNF-α é
o mastócito (Akira et al., 1990; Gordon et al., 1990).
12
Introdução
Óxido Nítrico
O óxido nítrico (NO) é um mediador de várias funções fisiológicas, como a
vasodilatação (Palmer et al., 1987) e a neurotransmissão (Downen et al., 1999),
além de apresentar atividade tumoricida (Hibbs et al., 1989) e/ou microbicida (Mauel
et al., 1991). O NO é um gás sintetizado a partir do aminoácido L-citrolina, por
reação catalisada pela enzima óxido nítrico sintase (NOS). Até o presente, foram
descritas três isoformas de NOS. Duas isoformas são constitutivas: a isoforma
neuronal (nNOS), localizada predominantemente em neurônio e a isoforma
endotelial (eNOS), expressa predominantemente em células endoteliais. Essas
duas isoformas são dependentes de cálcio. A terceira isoforma é induzivel, NOS
induzível (iNOS), detectada na maioria das células nucleadas, após indução por
citocinas inflamatórias, sendo independente de cálcio (Jorens et al., 1995; 1987).
No que se refere às ações do NO, as evidencias indicam que o NO produzido
pela atividade da eNOS, difunde-se rapidamente para a célula muscular, causando
relaxamento muscular; no lúmem vascular, o NO inibe a agregação plaquetária e a
adesão de leucócitos à parede dos vasos (Moncada et al., 1991). Ainda, o NO
produzido pela e-NOS induz aumento da expressão da enzima superóxido
dismutase (SOD), na camada muscular do vaso, diminuindo a concentração de íons
superóxido, que são radicais reativos e lesivos. Adicionalmente, foi demonstrado
que o NO inibe a expressão de moléculas de adesão, como as VCAM-1, E-selectina
e P-selectina, pela inibição da liberação de citocinas pró-inflamatórias e/ou
diretamente, por interferência no fator de transcrição NF-κB (de Caterina et al.,
1995; Hickey et al., 1997; Peng et al., 1995).
De outra parte, as evidências indicam que o NO, resultante da ativação da
iNOS, contribuir para o desenvolvimento do processo inflamatório e pode exercer
ação citotóxica, promovendo a destruição de microorganismos, parasitas e células
tumorais. Este fato ocorre porque, em processos infecciosos, as células ativadas,
como os macrófagos, neutrófilos e células endoteliais, secretam, simultaneamente,
o NO e intermediários reativos do oxigênio. Estas moléculas, ao reagirem entre si,
formam o ânion peroxinitrito - ONOO−,
mais tóxico que os seus precursores
(Ischiropoulos et al., 1996; Rohn et al., 1999; Wolin, 2000).
Finalmente, as diversas ações dos mediadores acima mencionados, que
determinam o desenvolvimento de parâmetros distintos e/ou similares da resposta
13
Introdução
inflamatória, apontam a necessidade de estudos que investiguem a participação
desses mediadores na reação edematogênica induzida pelo veneno de Bothrops
moojeni.
14
Objetivos
2 OBJETIVOS
Este estudo tem por objetivo avaliar e caracterizar a reação edematogênica
induzida pela injeção intraplantar do veneno de Bothrops moojeni, em
camundongos, quanto:
1) ao perfil temporal,
2) à relação concentração-efeito,
3) á participação de mastócitos neste evento,
4) aos mediadores inflamatórios envolvidos e
5) à neutralização pelo soro antibotrópico polivalente.
15
Material e Métodos
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados camundongos Swiss machos, de peso compreendido entre 18
e 20 gramas, mantidos em condições padronizadas de biotério e de acordo com os
princípios éticos de experimentação animal, adotados pelo COBEA, com aprovação
da Comissão de Ética no Uso de Animais Experimentais do Instituto Butantan,
protocolo n° 235/05.
3.2 Veneno
Foi utilizada uma partida de pool de veneno, extraído de vários exemplares
adultos da serpente Bothrops moojeni (Bm), fornecida pelo Instituto Butantan
(Laboratório de Herpetologia). O veneno, liofilizado, foi mantido a - 20°C até o
momento de sua utilização.
3.3 Avaliação do edema de pata
Para este estudo, o veneno, dissolvido em solução salina apirogênica, foi
filtrado em filtros esterilizantes, de poro de 0,22 μm de diâmetro e injetado no coxim
plantar de uma das patas posteriores de camundongos, nas concentrações de 0,1;
0,3; 1; 3 ou 6 μg/pata, em volume constante de 50 μL. A pata contralateral (controle)
recebeu igual volume de solução salina apirogênica.
Os volumes das patas posteriores foram determinados em um pletismômetro,
conectado a um transdutor de pressão, acoplado a um registrador digital (Ugo
Basile), de acordo com o método descrito por Van Arman et al. (1965). Para tanto,
cada pata foi imersa até a articulação tíbio-társica, em uma solução de lauril sulfato
de sódio (500 mg/L), em NaCl 18,6%, em vários intervalos de tempo (15 e 30
minutos, 1, 3, 6 e 24 horas) após a injeção do veneno ou de salina. O edema foi
expresso em porcentagem do aumento do volume das patas, em relação ao volume
inicial. O aumento percentual do volume podal foi determinado a partir da razão entre
os volumes da pata experimental (injetada com veneno) e da pata controle (injetada
16
Material e Métodos
com solução salina apirogênica), corrigidos a partir dos volumes das patas intactas,
como demonstrado abaixo:
% de aumento do volume podal = Ve - Vs x 100
Vs
Ve = volume da pata injetada com veneno;
Vs = volume da pata injetada com salina.
3.4 Tratamentos farmacológicos
A participação de diversos mediadores inflamatórios, na reação edematogênica
induzida pelo veneno de Bothrops moojeni (VBm), foi avaliada a partir de diferentes
tratamentos farmacológicos, com fármacos inibidores da síntese ou antagonistas de
diversos mediadores, prévios à injeção intraplantar do VBm. As doses e tempos de
latência, empregados nos tratamentos farmacológicos aqui propostos, baseiam-se
em dados da literatura, que demonstraram a eficiência de cada fármaco. Os animais
dos grupos controles, receberam volumes equivalentes dos veículos utilizados para
os diferentes fármacos. Abaixo estão apresentados os protocolos utilizados para os
diferentes tratamentos farmacológicos:
• Cetotifeno (5 mg/kg), dissolvido em solução fisiológica apirogênica, administrado
por via intraperitoneal (i.p.), 30 minutos antes da injeção do veneno – inibidor da
desgranulação de mastócito e anti-histamínico;
• Composto 48/80 (0,6; 1,0; 1,2 e 2,4 mg/kg), dissolvido em solução fisiológica
apirogênica, administrado em 2 doses diárias, durante 4 dias consecutivos, em
concentrações crescentes, via i.p., sendo a última injeção administrada 24 horas
antes da injeção do veneno - ativador da desgranulação de mastócitos;
• Prometazina
(5
mg/kg),
dissolvida
em
solução
fisiológica
apirogênica,
administrada por via intravenosa (i.v.), 30 minutos antes da injeção do veneno antagonista de receptor H1 da histamina;
• Cimetidina (15 mg/kg), diluída em solução fisiológica apirogênica, administrada
por via i.p., 2 horas antes da injeção do veneno - antagonista de receptor H2 da
histamina;
17
Material e Métodos
• Tiopiramida (20 mg/kg), diluído em solução fisiológica apirogênica, administrada
por via i.p., 30 minutos antes da injeção do veneno – antagonista de receptores
H3/H4 da histamina.
• Dexametasona
(1 mg/kg), dissolvida em solução fisiológica apirogênica,
administrada por via i.p., 2 horas antes da injeção do veneno - inibidor da fosfolipase
A2 e estabilizador de membrana de mastócitos;
• Indometacina (1 mg/kg), dissolvida em Tris/HCl/solução fisiológica, administrada
por via i.v., 30 minutos antes da injeção do veneno - inibidor não seletivo de
ciclooxigenases;
• Eterocoxibe (6 mg/kg), suspenso em carboximetil-celulose, administrado por via
oral (p.o.), duas horas antes do veneno – inibidor da ciclooxigenase-2;
• Zileuton (100 mg/kg), dissolvido em solução fisiológica apirogênica, administrado
por via oral, 1 hora antes do veneno – inibidor da 5-lipoxigenase.
• L-NAME (15 mg/kg), dissolvido em solução fisiológica apirogênica, administrado
por via i.v., 24 horas e 30 minutos, respectivamente, antes da injeção do veneno inibidor inespecífico de NO sintase;
• D-NAME (15 mg/kg), dissolvida em solução fisiológica apirogênica, administrada
por via i.v., 24 horas e 30 minutos, respectivamente, antes da injeção do veneno –
composto racêmico sem atividade sobre a NO;
• Aminoguanidina (50 e 100 mg/kg), dissolvida em solução fisiológica apirogênica,
administrada por via intraperitoneal (i.p.), 24 horas e 30 minutos, respectivamente,
antes do veneno – inibidor específico da NO sintase induzível;
• Clorpromazina (1,25 mg/kg), dissolvida em solução fisiológica apirogênica,
administrada por via intraperitoneal, 30 minutos antes do veneno – inibidor não
específico da síntese de TNF-α (Bertini et al., 1991).
3.5 Neutralização da atividade edematogênica
Para o estudo da neutralização da atividade edematogênica do veneno de
Bothrops moojeni, foram desenvolvidos 2 protocolos experimentais: in vitro e in vivo,
tendo por base a especificação do fabricante, em que 1 mL de soro antibotrópico
poliespecifíco neutraliza 5 mg de veneno botrópico (FUNED).
18
Material e Métodos
a) Para a neutralização in vitro, 1 µg de VBm foi incubado com 0,2 µL de soro
antibotrópico, por 30 minutos, a 37oC. Após este período, a mistura foi injetada via
intraplantar (i.pl.);
b) Para a neutralização in vivo, o antiveneno (60 ou 100 µL/animal) foi administrado por
via i.v., 30 minutos antes do VBm (1 ou 6 µg/pata) ou 15 ou 60 minutos após a
injeção i.pl. deste veneno.
3.6 Fármacos e reagentes
Tris (Sigma Chemical Company, USA);
HCl (Nuclear, Br);
NaCl (Mallinckrodt Ar);
Lauril sulfato de sódio (Br);
Cloreto de sódio 0,9 % - salina (Beker, Br);
Carboximetil-celulose (Sigma Chemical Company, USA);
Indometacina (Sigma Chemical Company, USA);
Dexametasona (Sigma Chemical Company, USA);
Cimetidina (Sigma Chemical Company, USA);
Prometazina (Sigma Chemical Company, USA);
Composto 48/80 (Sigma Chemical Company, USA);
Cetotifeno (Sigma Chemical Company, USA).
Zileuton - Zyflo® (Critical Therapeutics Inc., USA);
Eterocoxibe (Merck Sharp & Dohme Farmacêutica Ltda, Br).
Tris (Sigma Chemical Company, USA);
Tiopiramida (Sigma Chemical Company, USA);
L-NAME (Sigma Chemical Company, USA);
D-NAME (Sigma Chemical Company, USA).
Aminoguanidina (Sigma Chemical Company, USA);
Clorpromazina - HCl (Sigma Chemical Company, USA)
Soro Antibotrópico, lote no 051012-31 (FUNED, Br).
19
Material e Métodos
3.7 Análise Estatística
Os dados foram analisados estatisticamente a partir do programa computacional
Instat®. Os dados foram representados como média ± erro padrão da média (E.P.M.)
e analisados por análise de variância (ANOVA), seguida do teste de Tukey, nas
comparações múltiplas.
Em todos os cálculos, foi fixado o nível crítico igual ou
menor que 0,05 (p≤0,05).
20
Resultados
4 RESULTADOS
4.1
Efeito
edematogênico
do
veneno
de
B.
moojeni
(VBm)
em
camundongos.
O edema foi avaliado aos 15, 30, 60, 180, 360 minutos e 24 horas (1440
minutos) após a injeção intraplantar de VBm, em diferentes concentrações (0,1;
0,3; 1; 3 e 6 μg/pata) ou salina apirogênica (controle). A Figura 2 mostra que o
VBm, em todas as concentrações, causou um aumento significativo do volume
das patas (edema), a partir dos 15 minutos, com resposta máxima aos 30
minutos, exceto para a concentração de 0,1 μg/pata, que causou alteração
insipiente. Na concentração de 6 μg/pata, o veneno causou um segundo pico de
aumento do volume podal aos 180 minutos que foi estatisticamente diferente
daquele causado pela concentração de 3 μg/pata. No caso das concentrações de
0,3 a 1 μg/pata, o efeito edematogênico desapareceu na 24ª hora, porém, nas
concentrações de 3 e 6 μg/pata, o veneno ainda causou um efeito
edematogênico significativamente maior que o da concentração de 0,3 μg/pata,
na 24ª hora. É importante observar que a maior concentração do veneno (6
μg/pata) causou hemorragia pronunciada no local de sua injeção (dado não
demonstrado). Ainda, foi observado uma relação concentração-efeito entre as
concentrações avaliadas, com incremento do volume podal de 80,9; 114,7; 310,5
e 462,9%, para as doses de 0,3; 1; 3 e 6 µg, respectivamente, em relação à
menor concentração, na 3a hora.
21
Resultados
160
VBm 6 μg/pata
VBm 3 μg/pata
#
Aumento do vol. podal (%)
VBm 1 μg/pata
VBm 0,3 μg/pata
120
VBm 0,1 μg/pata
Salina 50 μL/pata
80
40
*
*
0
**
15 30 60
180
360
1440
Tempo (minutos)
Figura 2: Efeito edematogênico de diferentes concentrações do veneno da
serpente Bothrops moojeni. Diferentes grupos de animais receberam injeção de VBm
(0,1; 0,3; 1; 3 e 6 µg /animal), na pata direita e salina apirogênica na pata contralateral
(controle), em volume de 50 µL/pata. O edema foi avaliado por pletismografia, como
descrito em Material e Métodos e os valores representados como aumento percentual do
volume das patas. Cada valor representa a média ± E.P.M. de 5 animais. *p≤0,05 em
relação à curva/VBm 0,1 μg/pata. #p≤0,05 em relação ao VBm 3 μg/animal (ANOVA).
22
Resultados
4.2
Efeito de diferentes tratamentos farmacológicos no edema causado
pelo veneno de B. moojeni.
Para os estudos da modulação farmacológica, foi escolhida a concentração
submaximal de 1 μg/pata de VBm. Nesta concentração, o veneno de B. moojeni
não é hemorrágico e, não sendo maximal, um eventual incremento do volume das
patas pode ser verificado. As figuras, a seguir, representam os resultados obtidos
com diferentes grupos de animais, que foram pré-tratados com diferentes
fármacos, inibidores de síntese ou antagonistas de alguns mediadores
inflamatórios ou com os respectivos veículos, em volumes equivalentes
(controles).
A Figura 3 mostra que quando animais foram pré-tratados com cetotifeno,
inibidor da desgranulação de mastócitos, houve redução do efeito edematogênico
do VBm, nos períodos de 15 a 360 minutos. Essa redução foi de 25,3; 49,2; 42,4;
31,5 e 27,2%, respectivamente, aos 15, 30, 60, 180 e 360 minutos em relação ao
controle.
100
Aumento do vol. Podal (%)
Veículo + VBm
Cetotifeno + VBm
80
Salina 50 µL/pata
60
40
* *
*
20
*
*
0
15 30
60
180
360
1440
Tempo (minutos)
Figura 3: Efeito do cetotifeno no edema induzido pelo veneno da serpente B.
moojeni. Diferentes grupos de animais foram pré-tratados com cetotifeno (5 mg/kg, i.p.)
ou seu veículo, em volume e via correspondentes (controle), 30min antes da injeção
intraplantar de VBm (1 µg/pata) na pata direita e salina apirogênica na pata contralateral
i.pl. (controle), em volume de 50 µL/pata. O edema foi avaliado por pletismografia, como
descrito em Material e Métodos e expresso como aumento percentual do volume das
patas. Cada valor representa a média ± E.P.M. de 8 animais *p≤0,05 em relação ao
grupo controle (ANOVA).
23
Resultados
A Figura 4 mostra que animais pré-tratados com doses consecutivas do
composto 48/80, para depleção de mastócitos, apresentaram uma redução
significativa do efeito edematogênico do VBm, entre 30 e 360 minutos. Esta
redução foi de 34,7; 55,5; 74,7 e 25,3%, aos 30, 60, 180 e 360 minutos,
respectivamente, em relação aos animais controles. Aos 15 minutos, o fármaco
não afetou a reação edematogênica causada pelo veneno.
Veículo + VBm
100
Composto 48/80 + VBm
Aumento do vol. Podal (%)
Salina 50 µL/pata
80
60
*
40
*
20
*
*
0
15 30
60
180
360
1440
Tempo (minutos)
Figura 4: Efeito do composto 48/80 no edema induzido pelo veneno da serpente B.
moojeni. Diferentes grupos de animais foram pré-tratados com composto 48/80 (0,6; 1,0;
1,2 e 2,4 mg/kg, i.p., consecutivamente), em duas doses diárias, por 4 dias consecutivos
ou salina apirogênica, em volume e via correspondentes (controle), 24h antes da injeção
intraplantar de VBm (1 µg/pata) na pata direita e salina apirogênica na pata contralateral
i.pl. (controle), em volume de 50 µL/pata. O edema foi avaliado por pletismografia, como
descrito em Material e Métodos e os valores representados como aumento percentual do
volume das patas. Cada valor representa a média ± E.P.M. de 7-8 animais *p≤0,05 em
relação ao grupo controle (ANOVA).
24
Resultados
Como demonstra a Figura 5, o tratamento dos animais com prometazina,
antagonista do receptor H1 da histamina, reduziu significativamente o efeito
edematogênico do VBm, entre 15 e 180 minutos. Essa redução foi de 47,7; 53;
48,9 e 41,7%, aos 15, 30, 60 e 180 minutos, respectivamente, em relação ao
controle. No período de 360 minutos, o fármaco não afetou a reação
edematogênica causada pelo VBm.
100
Veículo + VBm
Prometazina + VBm
Salina 50 µL/pata
Aumento do vol. Podal (%)
80
60
40
*
*
*
*
20
0
15 30
60
180
360
1440
Tempo (minutos)
Figura 5: Efeito da prometazina no edema induzido pelo veneno da serpente B.
moojeni. Diferentes grupos de animais foram pré-tratados com prometazina (5 mg/kg,
i.v.) ou seu veículo em volume e via correspondentes (controle), 30min antes da injeção
intraplantar de VBm (1 µg/pata), na pata direita e salina apirogênica na pata contralateral
i.pl. (controle), em volume de 50 µL/pata. O edema foi avaliado por pletismografia, como
descrito em Material e Métodos e expresso como aumento percentual do volume das
patas. Cada valor representa a média ± E. P. M. de 6-7 animais *p≤0,05 em relação ao
grupo controle (ANOVA).
25
Resultados
A Figura 6 mostra que o pré-tratamento dos animais com cimetidina,
antagonista do receptor H2 da histamina, reduziu o edema, de forma significativa,
entre 15 e 180 minutos. Essa redução foi de 26,6; 28,6; 56,4 e 30,7%, aos 15, 30,
60 e 180 minutos, respectivamente, em relação ao controle. Aos 360 minutos, o
fármaco não afetou a reação edematogênica induzida pelo VBm.
Aumento do vol. podal (%)
100
Veículo + VBm
Cimetidina + VBm
Salina 50 µL/pata
80
*
60
40
*
*
*
20
0
15 30
60
180
360
1440
Tempo (minutos)
Figura 6: Efeito da cimetidina no edema induzido pelo veneno da serpente B.
moojeni. Diferentes grupos de animais foram pré-tratados com cimetidina (15 mg/kg, i.p)
ou seu veículo em volume e via correspondente (controle), 2h antes da injeção
intraplantar de VBm (1 µg/pata), na pata direita e salina apirogênica na pata contralateral
i,pl. (controle), em volume de 50 µL/pata. O edema foi avaliado por pletismografia, como
descrito em Material e Métodos e expresso como aumento percentual do volume das
patas. Cada valor representado a média ± E. P. M. de 6 de animais *p≤0,05 em relação
ao grupo controle (ANOVA).
26
Resultados
A Figura 7 mostra que o pré-tratamento dos animais com tiopiramida,
antagonista dos receptores H3/H4 da histamina, reduziu o edema, de forma
significativa, aos 30 e 60 minutos. Essa redução foi de 54,5 e 42,3%, aos 30 e 60
minutos, respectivamente, em relação ao controle. Nos demais períodos de
tempo, o fármaco não afetou a reação edematogênica induzida pelo VBm.
Veículo + VBm
100
Tiopiramida + VBm
Salina 50 µL/ pata
Aumento do vol. podal (%)
80
60
40
*
*
20
0
15 30 60
180
360
1440
Tempo (minutos)
Figura 7: Efeito da tiopiramida no edema induzido pelo veneno da serpente B.
moojeni. Diferentes grupos de animais foram pré-tratados com tiopiramida (20 mg/kg,
i.p) ou seu veículo em volume e via correspondente (controle), 30min antes da injeção
intraplantar de VBm (1 µg/pata), na pata direita e salina apirogênica na pata contralateral
i.pl. (controle), em volume de 50 µL/pata. O edema foi avaliado por pletismografia, como
descrito em Material e Métodos e expresso como aumento percentual do volume das
patas. Cada valor representa a média ± E. P. M. de 4 de animais *p≤0,05 em relação ao
grupo controle (ANOVA).
27
Resultados
A Figura 8 mostra que o tratamento prévio dos animais com a
dexametasona, um inibidor de fosfolipase A2 (PLA2) e estabilizador de membrana
de mastócitos, reduziu, significantemente, o edema causado pelo VBm, entre 30
e 360 minutos. Esta redução foi de 28,4; 32,7; 37,3 e 35,1%, aos 30, 60, 180 e
360 minutos, respectivamente, se comparado ao controle. Aos 15 minutos,
porém, não houve alteração significante do efeito do veneno.
100
Veículo + VBm
Aumento do vol. Podal (%)
Dexametasona + VBm
Salina 50 µL/pata
80
60
*
*
40
*
20
*
0
15 30
60
180
360
1440
Tempo ( minutos)
Figura 8: Efeito da dexametasona no edema induzido pelo veneno de B. moojeni.
Diferentes grupos de animais foram tratados com dexametasona (1 mg/kg, i.p.) ou seu
veículo i.p., em volume correspondente (controle), 2h antes da injeção intraplantar de
VBm (1 μg/animal), na pata direita e salina apirogênica na pata contralateral i.pl.
(controle), em volume de 50 µL/pata. O edema foi avaliado por pletismografia, como
descrito em Material e Métodos e expresso como aumento percentual do volume das
patas. Cada valor representa a média ± E.P.M de 6-7 animais *p≤0,05 em relação ao
grupo controle (ANOVA).
28
Resultados
A Figura 9 demonstra que o pré-tratamento dos animais com a
indometacina, um inibidor não seletivo das COX-1 e COX-2, causou redução
marcante do edema podal induzido pelo VBm, entre os 15 e 60 minutos de
reação,
com
percentual
médio
de
redução
de
46%.
Este
efeito
foi
estatisticamente significativo em relação ao controle. Nos demais períodos de
tempo, o fármaco não afetou a reação edematogênica causada pelo VBm.
100
Veículo + VBm
Aumento do vol. Podal (%)
Indometacina + VBm
Salina 50 µL/pata
80
60
*
*
40
*
20
0
15 30
60
180
360
1440
Tempo (minutos)
Figura 9: Efeito da indometacina no edema induzido pelo veneno de B. moojeni.
Diferentes grupos de animais foram pré-tratados com indometacina (1 mg/kg, i.v.) ou seu
veículo i.v., em volume correspondente (controle), 30min antes da injeção intraplantar de
VBm (1 μg/animal), na pata direita e salina apirogênica na pata contralateral i.pl.
(controle), em volume de 50 µL/pata. O edema foi avaliado por pletismografia, como
descrito em Material e Métodos e expresso como aumento percentual do volume das
patas. Cada valor representa a média ± E.P.M. de 6-7 animais *p≤0,05 em relação ao
grupo controle (ANOVA).
29
Resultados
A Figura 10 mostra que o tratamento prévio dos animais com o inibidor
seletivo da ciclooxigenase-2, eterocoxibe, reduziu o edema promovido pelo
veneno de B. moojeni, de forma significativa, aos 60 e 180 minutos de sua
injeção, em percentuais de 32,6 e 37,8%, respectivamente, se comparados ao
controle. Nos demais períodos de tempo, o fármaco não afetou a reação
edematogênica causada pelo veneno.
Veículo + VBm
100
Eterocoxibe + VBm
Aumento do vol. Podal (%)
Salina 50 µL/pata
80
60
*
40
*
20
0
15 30
60
180
360
1440
Tempo (minutos)
Figura 10: Efeito do eterocoxibe no edema induzido pelo veneno de B. moojeni.
Diferentes grupos de animais foram pré-tratados com eterocoxibe (6 mg/kg, p.o.) ou seu
veículo p.o. em volume correspondente (controle), 2h antes da injeção intraplantar de
VBm (1 μg/animal), na pata direita e salina apirogênica na pata contralateral i.pl.
(controle), em volume de 50 µL/pata. O edema foi avaliado por pletismografia, como
descrito em Material e Métodos e expresso como aumento percentual do volume das
patas. Cada valor representa a média ± E.P.M. de 8 animais *p≤0,05 em relação ao
grupo controle (ANOVA).
30
Resultados
A Figura 11 mostra que o pré-tratamento dos animais com zileuton, um
inibidor da 5-lipoxigenase, reduziu, significativamente, o edema causado pelo
VBm, aos 30 e 60 minutos após a sua injeção. A redução do edema foi de 18,2 e
34,9%, aos 30 e 60 minutos, respectivamente, em relação ao controle. Nos
demais períodos de tempo, o fármaco não afetou a reação edematogênica
causada pelo veneno.
100
Veículo + VBm
Zileuton + VBm
Salina 50 µL/pata
Aumento do vol. Podal (%)
80
*
*
60
40
20
0
15 30
60
180
360
1440
Tempo (minutos)
Figura 11: Efeito do zileuton no edema induzido pelo veneno de B. moojeni.
Diferentes grupos de animais foram pré-tratados com zileuton (100 mg/kg, p.o.) ou seu
veículo p.o., em volume correspondente (controle), 1h antes da injeção intraplantar de
VBm (1 μg/animal), na pata direita e salina apirogênica na pata contralateral i.pl.
(controle), em volume de 50 µL/pata. O edema foi avaliado por pletismografia, como
descrito em Material e Métodos e expresso como aumento percentual do volume das
patas. Cada valor representa a média ± E.P.M. 6-8 animais *p≤0,05 em relação ao grupo
controle (ANOVA).
31
Resultados
A Figura 12 mostra que animais pré-tratados com clorpromazina, um inibidor
da síntese de TNF-α, apresentaram diminuição significativa do edema induzido
pelo VBm, desde os 15 até os 360 minutos de sua injeção intraplantar, A redução
foi de 32; 58,9; 76,6; 83,2 e 81,4%, aos 15, 30, 60, 180 e 360 minutos
respectivamente, se comparado ao controle.
Ve ículo + VBm
100
Clorpromazina
+ VBm
Aumento do vol. Podal (%)
Salina i.pl.
80
60
40
*
*
20
*
*
*
0
15 30 60
180
360
1440
Tempo (minutos)
Figura 12: Efeito da clorpromazina no edema induzido pelo veneno de B. moojeni.
Diferentes grupos de animais foram pré-tratados com clorpromazina (1,25 mg/kg, i.p.) ou
seu veículo, na via correspondente (grupo controle), 30min antes da injeção intraplantar
de VBm (1 μg/animal), na pata direita e salina apirogênica na pata contralateral i.pl.
(controle), em volume de 50 µL/pata. O edema foi avaliado por pletismografia, como
descrito em Material e Métodos e expresso como aumento percentual do volume das
patas. Cada valor representa a média ± E.P.M. de 6 animais *p≤0,05 em relação ao
controle (ANOVA).
32
Resultados
A Figura 13 mostra que os animais controles, pré-tratados com salina
apirogênica e com VBm (1 μg/pata), apresentaram reação edematogênica
marcante, que foi máxima aos 30 minutos, com declínio após 60 minutos,
retornando aos níveis basais na 24ª hora. Os animais pré-tratados com o LNAME, um inibidor não específico da NO sintase, apresentaram aumento
significativo (média de 149,5%) do edema induzido pelo VBm, dos 180 minutos
até a 24ª hora, se comparado ao grupo controle. O maior aumento ocorreu aos
360 minutos. Por outro lado, os animais que receberam pré-tratamento com DNAME, composto racêmico do L-NAME, não apresentaram diferenças em
relação ao controle.
Veículo
í
+ VBm
Aumento do vol. podal (%)
100
D-NAME
+ VBm
L-NAME
+ VBm
Salina i.pl.
80
60
*
*
40
20
*
0
15 30 60
180
360
1440
Tempo (minutos)
Figura 13: Efeito do L-NAME e do D-NAME no edema induzido pelo veneno de B.
moojeni. Diferentes grupos de animais foram pré-tratados com L-NAME (15 mg/kg, i.v.)
ou do D-NAME (15 mg/kg, i.v.) ou seus veículos, na via correspondente (controle), 24h e
30min antes da injeção intraplantar de VBm (1 μg/pata), na pata direita e salina
apirogênica na pata contralateral i.pl. (controle), em volume de 50 µL/pata. O edema foi
avaliado por pletismografia, como descrito em Material e Métodos e expresso como
aumento percentual do volume das patas. Cada valor representa a média ± E.P.M. de 6
animais *p≤0,05 em relação ao controle (ANOVA).
33
Resultados
A Figura 14 mostra que animais pré-tratados com a aminoguanidina,
inibidor da NO sintase induzida, apresentaram aumento significativo (média de
96,6%) do edema induzido pelo VBm, desde os 180 minutos até a 24a hora, se
comparado ao grupo controle.
Aumento do vol. Podal (%)
120
Veículo + VBm
100
Aminoguanidina + VBm
Salina i.pl.
80
*
60
*
40
20
*
0
15 30 60
180
360
1440
Tempo (minutos)
Figura 14: Efeito da aminoguanidina no edema induzido pelo veneno de B.
moojeni. Diferentes grupos de animais foram pré-tratados com aminoguanidina (50 e
100 mg/kg, i.p.), ou com seu veículo, na via correspondente (grupo controle), 30min
antes da injeção intraplantar de VBm (1 μg/animal), na pata direita e salina apirogênica
na pata contralateral i.pl. (controle), em volume de 50 µL/pata. O edema foi avaliado por
pletismografia, como descrito em Material e Métodos e expresso como aumento
percentual do volume das patas. Cada valor representa a média ± E.P.M. de 6 animais
*p≤0,05 em relação ao controle (ANOVA).
34
Resultados
4.3 Efeito da soroneutralização in vitro no edema podal induzido pelo VBm.
A Figura 15 mostra que os animais controles, que receberam injeção
intraplantar
de
VBm,
previamente
incubado
com
salina
apirogênica,
apresentaram resposta edematogênica típica, com efeito máximo aos 30 minutos
e declínio nas 24 horas. Quando o veneno (1 µg) foi incubado com 0,2 µL de
soro, por 30 minutos, a 37oC e injetado no coxim plantar da pata posterior dos
animais, ocorreu reação edematogênica significativamente inferior àquela
causada pelo veneno incubado apenas com salina.
100
Salina + VBm
Aumento do vol. das patas (%)
Soro + VBm
80
60
40
20
*
* *
*
*
0
15 30
60
180
360
1440
Tempo (minutos)
Figura 15: Efeito da soroneutralização in vitro no edema induzido pelo veneno de
B. moojeni. Diferentes grupos de animais receberam injeção intraplantar de veneno (1
µg), pré-incubado com salina ou com soro antibotrópico poliespecífico (0,2 µL), na pata
direita ou seu veículo, na pata contralateral (controle), em volume de 50 µL/pata. O
edema foi avaliado por pletismografia, como descrito em Material e Métodos e expresso
como aumento percentual do volume das patas. Cada valor representa a média ± E.P.M.
de 6 animais *p≤0,05 em relação ao controle (ANOVA).
35
Resultados
4.4 Efeito da aplicação sistêmica do antiveneno edema podal induzido pelo
VBm.
A Figura 16 mostra que o tratamento dos animais com o soro antibotrópico
(60 ou 100 µL), 30 minutos antes da injeção intraplantar do VBm (1 µg/pata),
causou diminuição significativa do edema induzido pelo veneno, desde os 15 até
os 360 minutos, se comparado ao controle.
Salina + VBm
100
Aumento do vol. Podal (%)
Soro (60 µL) + VBm
Soro (100 µL) + VBm
80
Salina i.pl.
60
40
20
0
*
*
*
*
*
*
15 30 60
**
180
**
360
1440
Tempo (minutos)
Figura 16: Efeito da aplicação sistêmica do antiveneno no edema induzido pelo
veneno de B. moojeni. Diferentes grupos de animais foram pré-tratados com soro
antibotrópico (60 ou 100 µL/animal, i.v.), ou com salina, na via correspondente (controle),
30min antes da injeção intraplantar de VBm (1 μg/pata), na pata direita e salina
apirogênica na pata contralateral (controle), em volume de 50 µL/pata. O edema foi
avaliado por pletismografia, como descrito em Material e Métodos e expresso como
aumento percentual do volume das patas. Cada valor representa a média ± E.P.M. de 6
animais *p≤0,05 em relação ao controle (ANOVA).
36
Resultados
A Figura 17 mostra que o tratamento dos animais com o soro antibotrópico (60
µL), 30 minutos antes da injeção intraplantar do VBm (6 µg/pata), induziu
diminuição significativa do edema induzido pelo veneno, desde os 15 até os 360
minutos, se comparado ao controle.
Salina + VBm
Soro + VBm
Salina i.pl.
Aumento do vol. podal (%)
120
100
80
60
40
*
*
*
20
*
*
0
15 30
60
180
360
Tempo (minutos)
Figura 17: Efeito da aplicação sistêmica do antiveneno no edema induzido pelo
veneno de B. moojeni. Diferentes grupos de animais foram pré-tratados com soro
antibotrópico (60 µL/animal, i.v.), ou salina, na via correspondente (controle), 30min
antes da injeção intraplantar de VBm (6 μg/pata), na pata direita e salina apirogênica na
pata contralateral (controle), em volume de 50 µL/pata. O edema foi avaliado por
pletismografia, como descrito em Material e Métodos e expresso como aumento
percentual do volume das patas. Cada valor representa a média ± E.P.M. de 6 animais
*p≤0,05 em relação ao controle (ANOVA).
37
Resultados
A Figura 18 mostra que quando animais foram tratados com o soro
antibotrópico (60 µL/animal), 15 minutos após a injeção do veneno (6 µg/pata),
apresentaram redução significativa do efeito edematogênico do veneno, entre 30
e 360 minutos, se comparado ao controle.
Salina + VBm
Soro + VBm
Salina i.pl.
Aumento do vol. podal (%)
120
100
80
60
*
*
*
40
*
20
0
30
60
180
360
Tempo (minutos)
Figura 18: Efeito da aplicação sistêmica do antiveneno no edema induzido pelo
veneno de B. moojeni. Diferentes grupos de animais foram tratados com soro
antibotrópico (60 µL/animal, i.v.), ou salina, na via correspondente (controle), 15min após
a injeção intraplantar de VBm (6 μg/pata), na pata direita e salina apirogênica na pata
contralateral (controle), em volume de 50 µL/pata. O edema foi avaliado por
pletismografia, como descrito em Material e Métodos e expresso como aumento
percentual do volume das patas. Cada valor representa a média ± E.P.M. de 6 animais
*p≤0,05 em relação ao controle (ANOVA).
38
Resultados
A Figura 19 mostra que quando animais foram tratados com o soro
antibotrópico (60 µL/animal), 60 minutos após a injeção intraplantar do VBm (6
µg/pata), ocorreu uma diminuição do edema podal aos 360 minutos após a
injeção do veneno, se comparado ao controle. Aos 180 minutos, esse tratamento
não modificou a ação local do veneno. O efeito edematogênico do veneno foi
reduzido significantemente, a partir dos 360 minutos, se comparado ao controle.
Salina + VBm
Aumento do vol. podal (%)
120
Soro + VBm
Salina i.pl.
100
80
*
60
40
20
0
15
30
180
360
Tempo (minutos)
Figura 19: Efeito da aplicação sistêmica do antiveneno no edema induzido pelo
veneno de B. moojeni. Diferentes grupos de animais foram pós-tratados com soro
antibotrópico (60 µL/animal, i.v.), ou salina, na via correspondente (controle), 60min após
a injeção intraplantar de VBm (6 μg/pata), na pata direita e salina apirogênica na pata
contralateral (controle), em volume de 50 µL/pata. O edema foi avaliado por
pletismografia, como descrito em Material e Métodos e expresso como aumento
percentual do volume das patas. Cada valor representa a média ± E.P.M. de 6 animais
*p≤0,05 em relação ao controle (ANOVA).
39
Resultados
Tabela 1: Quadro resumo do efeito de diferentes tratamentos farmacológicos no
edema induzido pelo VBm.
Tratamentos
Farmacológicos
Tempo (min)
15
30
60
180
360
Cetotifeno (5 mg/kg)
↓
↓
Composto 48/80 (0,6; 1,0; 1,2 e
2,4 mg/kg)
Ø
Prometazina (5 mg/kg)
1440
↓
↓
↓
Ø
↓
↓
↓
↓
Ø
↓
↓
↓
↓
Ø
Ø
Cimetidina (15 mg/kg)
↓
↓
↓
↓
Ø
Ø
Tiopiramida (20 mg/kg)
Ø
↓
↓
Ø
Ø
Ø
Dexametasona (1 mg/kg)
Ø
↓
↓
↓
↓
Ø
Indometacina (1 mg/kg)
↓
↓
↓
Ø
Ø
Ø
Eterocoxibe (6 mg/kg)
Ø
Ø
↓
↓
Ø
Ø
Zileuton (100 mg/kg)
Ø
↓
↓
Ø
Ø
Ø
↓
↓
Ø
Clorpromazina (1,25 mg/kg)
↓
↓
↓
L-NAME (15 mg/kg
Ø
Ø
Ø
↑
↑
↑
D-NAME (15 mg/kg)
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Aminoguanidina (50 e 100 mg/kg)
Ø
Ø
Ø
↑
↑
↑
Ø = ausência de efeito; ↓ = diminuição do efeito;  = aumento do efeito
40
Resultados
Tabela 2: Quadro resumo do efeito da soroneutralização no edema induzido
pelo VBm.
Tempo (min)
Soroneutralização
15
30
60
180
360
1440
↓↓
↓↓
↓↓
↓↓
↓↓
Ø
↓
↓
↓↓
↓↓
↓↓
Ø
Animais tratados com soro 30min
antes do veneno (6 μg/pata)
↓
↓
↓↓
↓↓
↓↓
n.t.
Animais tratados com soro 15min
após o veneno (6 μg VBm/pata)
Ø
↓
↓
↓
↓
n.t.
Animais tratados com soro 1h após o
veneno (6 μg VBm/pata)
Ø
Ø
Ø
Ø
↓
n.t.
VBm pré-incubado com soro
Animais tratados com soro 30min
antes do veneno (1 μg/pata)
Ø = ausência de efeito;
↓= dimunuição do efeito; ↓ ↓ = inibição do efeito;
n.t. = não testado.
41
Discussão
5 DISCUSSÃO
No presente estudo, avaliamos o desenvolvimento da reação edematogênica
causada pela injeção intraplantar do veneno de B. moojeni, em camundongos e a
mediação deste efeito.
Os resultados obtidos, inicialmente, mostraram que o VBm desencadeia uma
reação edematogênica marcante. A intensidade dessa reação foi proporcional às
concentrações injetadas do veneno. Ainda, após a injeção intraplantar de
concentrações maiores deste veneno, principalmente o de 6 μg/pata, o edema foi
acompanhado de hemorragia local, visualizada macroscopicamente.
A cinética do edema induzido pelo veneno bruto de B. moojeni, em concentrações
menores que 6 µg/pata, mostrou um período de instalação muito rápido, com efeito
máximo aos 30 minutos após a sua injeção, que persistiu em níveis elevados até a 3ª
hora; o decaimento do edema foi iniciado na 6a hora e retornou aos níveis basais, 24h
após a injeção. Este perfil temporal apresenta características análogas às encontradas
com outras espécies de venenos botrópicos, descritos na literatura, como o de B.
jararaca (Olivo et al., 2007) e o de B. asper, da América Central (Chaves et al., 1995).
A duração do fenômeno apresentou um comportamento equivalente ao desses
venenos, com redução parcial na 6a hora (Perales et al., 1992; Olivo et al., 2007). A
partir, deste estudo, selecionou-se uma concentração edematogênica submaximal, de
1 μg/pata, isenta de fenômenos hemorrágicos macroscópicos, para a análise
farmacológica do mecanismo de ação do veneno, em termos de mediadores
envolvidos no desenvolvimento do edema.
Para a investigação dos mediadores da ação edematogênica do veneno de B.
moojeni, diferentes grupos de animais foram pré-tratados com fármacos inibidores da
desgranulação de mastócitos ou da síntese de alguns mediadores inflamatórios ou,
ainda, com antagonistas de seus receptores. Os resultados obtidos mostraram que o
cetotifeno, um estabilizador de membrana de mastócitos, reduziu, de modo marcante,
o edema induzido pelo VBm, sugerindo a participação dessas células no efeito do
VBm. Estes dados foram confirmados pela depleção dos grânulos de mastócitos, pelo
composto 48/80, que acarretou uma redução comparável à causada pelo cetotifeno. O
fato deste composto ter inibido o efeito do VBm aos 30 minutos e não aos 15 minutos,
como o cetotifeno, pode ser resultante da reposição de parte dos grânulos dos
42
Discussão
mastócitos, no período decorrido entre a injeção do composto 48/80 e a do VBm, que
foi de 24h. Em apoio a estes resultados, a participação de mastócitos, na resposta
inflamatória desencadeada por toxinas ou venenos, foi relatada por vários autores,
embora não haja consenso sobre o mecanismo pelo qual esses agentes ativam tais
células (Damerau et al., 1975; Chiu et al., 1989; Cirino et al., 1989; Wang e Teng,
1990a, 1990b; Tan et al., 1991; Moreno et al., 1993; Landucci et al., 1998).
Os mastócitos estão amplamente distribuídos no tecido conectivo, principalmente
na superfície epitelial da pele, no sistema respiratório, nos tratos gastrointestinal e
genitourinário, adjacentes aos vasos sangüíneos e linfáticos, e próximos a nervos
periféricos (Flier, 1993). Por sua distribuição particular, estão expostos a parasitas e a
outros agentes exógenos, o que indica o seu papel importante, tanto em reações
alérgicas imediatas, quanto em reações inflamatórias agudas e crônicas (Stevens e
Austen, 1989; Galli, 1997; Metcalfe et al., 1997). Os mastócitos estão entre as células
mais relevantes do processo inflamatório, pela sua propriedade de liberar uma grande
variedade de mediadores inflamatórios intragranulares e neoformados, incluindo
aminas vasoativas (histamina e serotonina), mediadores lipídicos e citocinas, sendo a
histamina o representante mais importante.
A histamina, dentre várias propriedades, induz aumento da permeabilidade
vascular e contribui para a formação de edema (Jutel et al., 2006). Neste sentido, a
hipótese da participação dos mastócitos, no efeito edematogênico do VBm, implica a
participação da histamina e de outros mediadores intragranulares neste efeito. De fato,
observamos uma redução significativa do edema de pata, em animais pré-tratados com
a prometazina, indicando a participação deste mediador neste efeito do veneno. Uma
vez que prometazina é um antagonista do receptor do tipo H1 da histamina, este
resultado indica que receptores H1 são relevantes para o desenvolvimento do edema
induzido pelo VBm. Nesse contexto, vale mencionar dados da literatura, mostrando
que os receptores H1 estão presentes em densidade elevada nas células endoteliais
de vênulas pós-capilares e que a sua ativação resulta na contração do citoesqueleto de
células endoteliais, levando à formação de fendas, que favorecem o extravasamento
plasmático e promovem a formação do edema (Hang et al., 2003). Em adição, os
resultados do presente estudo mostraram que a cimetidina, antagonista de receptores
do tipo H2 da histamina, reduziu, de forma significativa, o edema causado pelo VBm,
indicando que a ativação dos receptores do tipo H2 também contribui para o efeito
43
Discussão
deste veneno. Esta é a primeira demonstração da participação dos receptores H2, da
histamina, na reação inflamatória induzida por venenos de serpentes. Embora a
ativação dos receptores H2 esteja classicamente relacionada ao controle da secreção
gástrica, por células parietais (Knight et al., 1992; Tamaoki et al., 1997), a literatura
mostra que estes receptores também estão envolvidos no aumento da permeabilidade
vascular na microcirculação pulmonar e cerebral, induzida por agentes inflamatórios
(Goromuru et al., 2002; Bouachour et al., 1991; Serker et al., 2007), o que apóia os
dados de nosso estudo. Além disso, a observação de que a tiopiramida, antagonista
dos receptores H3/H4 da histamina reduziu o edema podal induzido pelo VBm, no
período inicial de seu efeito, sugere que os receptores do tipo H3/H4 estejam
envolvidos nesse efeito do veneno. Dados da literatura demonstram que os receptores
H3 são expressos em neurônios pré-sinápticos do sistema nervoso central (SNC), mas
não são encontrados em células hematopiéticas. No SNC, o receptor H3 inibe a
liberação de histamina a partir de neurônios histaminérgicos e de outros
neurotransmissores, como a acetilcolina, noradrenalina, dopamina e serotonina, de
neurônios não histaminérgicos (Godlewski et al., 1997). Além disso, foi demonstrado
que a ativação do receptor H3 inibiu a reação inflamatória no SNC (Teuscher et al.,
2007). Por outro lado, a literatura mostra que o receptor H4 é expresso em várias
células inflamatórias, como os mastócitos, eosinófilos, basófilos, células dendríticas e
linfócitos T, induz a produção das citocinas IL-1, IL-6 e TNF-α e está envolvido na
inflamação pulmonar e asma (Thurmond et al., 2008; Dunford et al., 2006). Desse
modo, as informações acima permitem sugerir que o receptor H4, mais não o receptor
H3, esteja envolvido no efeito edematogênico do veneno de B. moojeni.
A participação de histamina, na ação local edematogênica de venenos botrópicos,
parece não ser uma regra, pois Chaves et al. (1995) e Cirino et al. (1989) não
observaram alteração significativa da reação edematogênica, causada pelo veneno de
B. asper ou pela FLA2 de Naja m. mocambique, respectivamente, após o tratamento
dos animais com antagonistas dos receptores H1 e H2, desse mediador. De outra
parte, considerando que o efeito das aminas vasoativas, como a histamina, é
caracterizado por rápida instalação e curta duração e que o veneno de B. moojeni
exibe um perfil edematogênico de longa duração, é plausível supor que outros
mediadores inflamatórios também participem deste processo.
44
Discussão
Os eicosanóides representam um outro grupo importante de mediadores
inflamatórios, dentre os quais destacam-se as prostaglandinas e os leucotrienos,
derivados do metabolismo do ácido araquidônico, pelas vias das ciclooxigenases e
lipoxigenases, respectivamente. Como mencionado na introdução o AA, é liberado a
partir de ácidos graxos de membranas celulares, por ação das enzimas FLA2,
relevantes para a iniciação da cascata dos eicosanóides (Serhan, 1994).
Os resultados aqui obtidos demonstraram que, de maneira análoga ao descrito
para os venenos de B. jararaca (Olivo et al., 2007) e B. lanceolatus (Araújo et al.,
2000), o efeito do veneno da B. moojeni foi significativamente reduzido pelo tratamento
prévio dos animais com a dexametasona, sugerindo a ativação de FLA2s por este
veneno e a participação de eicosanóides na formação do edema. Desse modo, foram
avaliados, a seguir, os efeitos de inibidores da formação de prostanóides e de
leucotrienos, no edema induzido pelo VBm. Os resultados obtidos mostraram que o
edema, provocado pelo veneno de B. moojeni, foi inibido pela indometacina, um
inibidor não seletivo das ciclooxigenases, entre 15 e 60 minutos após a injeção do
veneno. Estes dados sugerem o envolvimento de metabólitos do ácido araquidônico,
via COX -1 e -2, como as prostaglandinas e/ou a tromboxana, na formação do edema
induzido pelo VBm. Alem disso, verificamos que o eterocoxibe, um inibidor específico
da COX-2, reduziu a formação do edema, a partir da 1ª hora, sugerindo que o veneno
de B. moojeni, de alguma forma, induziu a expressão da COX-2. Assim, o perfil
temporal, da inibição do edema causado pelos inibidores de COXs, sugere que o VBm
acarreta uma estimulação inicial da COX-1, seguida da indução da expressão da COX2, em períodos subseqüentes da resposta. Estes dados corroboram aqueles
observados com os venenos de B. jararaca (Trebien e Calixto, 1989; Perales et al.,
1992; Olivo et al., 2007), de B. lanceolatus (Araujo et al., 2000) e de B. insularis
(Barbosa et al., 2003). Nesse contexto, é interessante observar que concentrações
elevadas de PGE2 foram detectadas no exsudato inflamatório induzido pelo veneno de
B. jararaca, em camundongos (Moreira et al., 2007). Considerando que a PGE2 é um
mediador importante para o desenvolvimento do edema e da hiperalgesia, com a
capacidade de potenciar o efeito de substâncias que aumentam a permeabilidade
vascular, como a histamina e a bradicinina (Matsumoto et al., 2007; Kolaczkowska et
al., 2006; Qureshi e Jakschik, 1988; Galli et al., 1999), sugerimos o envolvimento deste
mediador no efeito edematogênico do veneno de B. moojeni. No entanto, são
45
Discussão
necessários estudos adicionais, que investiguem esta hipótese e permitam discriminar
as prostaglandinas envolvidas no efeito do veneno de B. moojeni, em particular a
PGE2.
Outros mediadores lipídicos, relevantes para a inflamação, são os leucotrienos.
Ao analisarmos o efeito da inibição da via 5-lipoxigenase, no edema induzido pelo
veneno de B. moojeni, verificamos uma redução discreta do edema podal, entre 30min
e 1h. Estes dados sugerem que os leucotrienos contribuem para a fase aguda da
reação edematogênica causada pelo VBm. O envolvimento dos leucotrienos
peptídicos, no aumento da permeabilidade vascular foi anteriormente descrita
(Samuelsson, 1983; Hui et al., 2004; Hui e Funk, 2002). Por outro lado, foi descrito que
o LTB4, um dos mediadores mais potentes da quimiotaxia e ativação de neutrófilos
(Crooks e Stockley, 1998; Dahlén, 2000; Toda et al., 2002; Haeggstrom et al., 2007),
também aumenta o extravasamento plasmático (Palmblad et al., 1990). Além disso, a
participação dos produtos da lipoxigenase também foi verificada no edema induzido
pelo veneno de B. jararaca, em ratos (Trebien e calixto, 1989) e de B. lanceolatus, em
camundongos (Faria et al., 2001).
O TNF-α representa um outro mediador importante em processos inflamatórios,
(Stein e Gordon, 1991). Diversos tipos celulares, quando estimulados, são capazes de
produzir e secretar este mediador. Nesse sentido, mastócitos e macrófagos produzem
grandes quantidades de TNF-α (Hofsli et al., 1989). A literatura mostra que esta
citocina pode induzir a diferenciação de macrófagos, desgranulação de neutrófilos e
liberação de leucotrienos, além da expressão de moléculas de adesão da família das
selectinas e integrinas, estimulando o processo de migração de leucócitos (Hubbard e
Rothlein, 2000; Ebnet e Vestweber, 1999). Os resultados, aqui obtidos, demonstraram
que o pré-tratamento dos animais com a clorpromazina, um inibidor da produção de
TNF-α (Jansen et al., 1998; Gadina et al., 1991), reduziu o edema podal induzido pelo
VBm, desde os 15 até os 360 minutos da sua injeção intraplantar. Estes dados indicam
a contribuição do TNF-α na reação edematogênica local induzida por este veneno.
A
clorpromazina
(CPZ)
apresenta
um
grande
espectro
de
atividades
farmacológicas, porém, o seu mecanismo de ação, como inibidor de TNF, ainda não
está bem esclarecido. Alguns relatos apontam que este fármaco inibe a expressão de
RNAm de TNF em timócitos (Schleuning et al., 1991). Adicionalmente, Ghezzi et al.
46
Discussão
(1996) identificaram que a atividade antioxidante da CPZ é essencial para a inibição da
produção de TNF induzida por lipopolissacarídeo (LPS).
As células responsáveis pela liberação de TNF-α, no presente modelo
experimental, não foram estabelecidas. No entanto, considerando a participação desse
mediador desde os 15 minutos da injeção do VBm, os mastócitos são candidatos
potenciais, uma vez que estas células mantém estoques desse mediador em seus
grânulos (Flier, 1993). Dessa forma, os dados obtidos com o tratamento com a
clorpromazina e aqueles que mostraram a eficiência do tratamento com cetotifeno,
contra a ação edematogênica do VBm, reforçam a hipótese da ação deste veneno em
mastócitos, para o desenvolvimento da reação edematogênica. Por outro lado,
contrariamente
ao
observado
no
presente
estudo,
foi
demonstrado
que
a
clorpromazina inibiu a ação hemolítica e anticoagulante, mas não as atividades
miotóxica e edematogênica de uma FLA2 isolada do veneno da serpente Vipera russelli
(Babu e Gowda, 1994).
É conhecido que os mediadores inflamatórios atuam em sistema de cascata e
modulam a síntese e a atividade uns dos outros, para o desenvolvimento pleno da
resposta inflamatória. Desse modo, considerando que as citocinas ativam a produção
de óxido nítrico (NO), no foco inflamatório, foi de interesse avaliar a participação deste
mediador, no edema podal induzido pelo VBm.
O óxido nítrico participa de diversos mecanismos fisiológicos e patológicos,
atuando na comunicação intra e intercelular, integridade celular, homeostasia da
pressão sangüínea e neurotransmissão (Lions, 1995). Além disso, o NO é um potente
agente vasodilatador, podendo potenciar a ação de mediadores da permeabilidade
vascular e contribuir para a formação do edema. Os resultados deste estudo
mostraram que os animais tratados com L-NAME, um inibidor não específico da NOS,
aumentou, de modo marcante, o edema induzido pelo VBm, entre 3 e 24 horas após a
sua injeção. Como esperado, o tratamento dos animais com o D-NAME, um composto
racêmico, sem atividade sobre a NOS, não modificou o perfil edematogênico do
veneno, indicando que o efeito do L-NAME está relacionado especificamente à inibição
da NOS. Adicionalmente, esses dados foram confirmados pelo tratamento dos animais
com aminoguanidina, um inibidor da NO sintase induzida. Este tratamento, de modo
similar àquele com L-NAME, aumentou o efeito edematogênico do VBm, entre a 3ª e a
24ª hora após a injeção. Estes dados, em conjunto, sugerem que o NO modula
47
Discussão
negativamente a reação edematogênica desencadeada pelo VBm. Em apoio estes
dados foi relatado que o NO desempenha papel regulatório sobre os mastócitos
(Koranteng et al., 2000; Coleman, 2002), modulando negativamente a síntese e a
secreção de novo de alguns mediadores inflamatórios (McCauley et al., 2005).
Resultados opostos foram observados quanto ao efeito edematogênico dos venenos
das serpentes Lachesis muta rhombeata (Moura et al., 1998), Bothrops insularis
(Barbosa et al., 2003) e Bothrops asper (Chaves et al., 2006), que foram reduzidos
pelo tratamento dos animais com L-NAME. Nesse sentido, ainda, Zamuner et al. (2001)
mostraram que o veneno de Bothrops asper induz a produção de NO por macrófagos
peritoneais, via iNOS, com conseqüente formação de peroxinitrito. Estes autores
sugeriram, inclusive, a sua participação no desenvolvimento da lesão local induzida
pelo veneno total de B. asper. Os motivos para essas discrepâncias não são
conhecidos. No entanto, é possível que a maior importância dos obstáculos para o
efeito edematogênico do veneno de B. moojeni; em relação às outras espécies de
Bothrops, seja um fator relevante. Estudos adicionais são necessários para esclarecer
essas diferenças.
Como mencionado na introdução, os efeitos locais, provocados pelos venenos de
serpentes do gênero Bothrops, não são neutralizadas, de modo eficiente, pelo
antivenenos disponíveis. Mesmo quando o antiveneno é administrado imediatamente
após o veneno, os efeitos sistêmicos são revertidos enquanto o edema e a necrose
são pouco neutralizados, podendo levar à perda do membro afetado (Rosenfeld, 1971;
Gutiérrez et al., 1981, 1986; Lomonte, 1985).
Os estudos relacionados à soroneutralização da atividade edematogênica do
veneno de Bm, mostraram que este efeito é plenamente revertido quando o antiveneno
é previamente incubado com o veneno. Estes dados indicam que o soro antibotrópico
utilizado é capaz de reconhecer as toxinas presentes no veneno de B. moojeni, com
atividade edematogênica. Por outro lado, quando o antiveneno foi administrado
previamente à injeção intraplantar do VBm, houve redução do edema nos primeiros 30
minutos e neutralização eficiente deste efeito a partir dos 60 minutos da ação deste
veneno. Efeito semelhante foi verificado em relação ao edema causado pela maior
concentração do veneno, que também induz hemorragia. Estes dados, sugerem que
alguns dos componentes do veneno, responsáveis pela fase inicial do processo
edematogênico não sejam neutralizados pelo antiveneno, quando este é administrado
48
Discussão
separadamente do veneno. Tais componentes podem atuar, por exemplo, sobre
mastócitos e acarretar a liberação imediata de mediadores que aumentem a
permeabilidade vascular, como a histamina. Contudo, a presença de agentes
edematogênicos não antigênicos, no próprio veneno, não pode ser descartada. De
outra parte, os dados obtidos sugerem que os componentes do veneno, responsáveis
pelo desenvolvimento do edema, a partir da primeira hora de sua ação, que foram
reconhecidos pelo antiveneno sejam estruturalmente diferentes daqueles responsáveis
pela fase de evolução rápida do edema. Em adição, os resultados obtidos mostraram
que quando o antiveneno foi administrado 15 minutos após a injeção intraplantar do
VBm, ocorreu uma redução importante do edema podal, a partir dos 60 minutos,
porém, não houve reversão completa deste efeito, como o observado com o tratamento
prévio. Este resultado aponta a potência e a rapidez do veneno para desencadear o
fenômeno edematogênico. Nesse sentido, o tratamento com o antiveneno 1h após a
injeção do VBm apóia este ponto de vista, uma vez que o edema foi reduzido, mas não
neutralizado, apenas na 6ª hora após o inicio da reação inflamatória. Estes dados, se
relacionados aos obtidos com os tratamentos farmacológicos, reforçam a hipótese da
participação
de
diferentes
mediadores,
nos
diferentes
períodos
da
reação
edematogênica causada pelo veneno em estudo.
Em conjunto, os dados obtidos, indicam que o veneno de B. moojeni é capaz de
induzir uma resposta edematogênica, de modo tempo e concentração-dependente.
Este evento é mediado por diversos mediadores inflamatórios, dentre os quais a
histamina, via ativação de receptores H1, H2 e H4, o TNF-α, os eicosanóides derivados
da COX-1 e da 5-lipoxigenase, nos períodos iniciais, e da COX-2, subseqüentemente.
Além disso, os mastócitos são elementos importantes para o efeito do VBm e devem
constituir uma das principais fontes dos mediadores inflamatórios envolvidos no edema
causado pelo veneno. Por outro lado, o NO modula negativamente o edema induzido
pelo VBm. Além disso, pode-se inferir que o soro antibotrópico poliespecífico, embora
neutralize
os
componentes
edematogênicos
do
veneno,
neutraliza
apenas
parcialmente a reação local edematogênica quando administrado sistemicamente,
após o início do efeito do veneno.
Os mecanismos pelos quais o VBm induz a produção e liberação dos diferentes
mediadores inflamatórios, evidenciados neste estudo, não foram esclarecidos. No
entanto, o conhecimento dos fatores relacionados ao desencadeamento, evolução e
49
Discussão
regulação da reação edematogênica, induzida pelo veneno de Bm, constitui um
aspecto relevante, que poderá trazer implicações clínicas importantes. Este
conhecimento, associado ao efeito neutralizante, parcial, do soro antibotrópico, quando
aplicado até 60 minutos após a injeção do veneno, pode favorecer a utilização de
esquemas terapêuticos mais eficientes para o tratamento das ações locais, graves,
causadas pelo veneno de B. moojeni.
50
Conclusões
6 CONCLUSÕES
Os dados obtidos permitem concluir que:
•
A
injeção
intraplantar
de
VBm,
em
camundongos,
induz
uma
reação
edematogênica, de modo concentração e tempo-dependente;
•
Os mastócitos são células relevantes para o efeito edematogênico do veneno da
serpente B. moojeni;
•
A histamina, via receptores H1, H2 e H4, está envolvida no efeito edematogênico do
veneno de B. moojeni, sendo que os receptores H1 são mais importantes para este
efeito;
•
Os mediadores lipídicos, derivados do metabolismo do ácido araquidônico, pelas
vias COX-1, COX-2 e 5-lipoxigenase, participam do edema causado pelo VBm;
•
O fator de necrose tumoral-α (TNF-α) contribui para o desenvolvimento dessa
reação;
•
O óxido nítrico (NO) modula, de forma negativa, o edema causado pelo VBm;
•
O soro antibotrópico poliespecífico neutraliza parcialmente a reação edematogênica
induzida pelo veneno de B. moojeni.
51
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